專利名稱：一種廣譜抗菌肽的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明為一種橋石短芽孢桿菌X23外泌新型非核糖體抗菌肽Tyrocidine T及其發(fā)酵制備，屬于微生物發(fā)酵和生物分離領(lǐng)域，本發(fā)明涉及新型非核糖體抗菌肽TyrocidineT的微生物發(fā)酵、分離鑒定及其在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
橋石短芽孢桿菌是芽孢桿菌屬的一個種，菌體呈短桿狀，細胞壁厚，廣泛分布于自然界。公開號為CN 的中國專利公開了一種橋石短芽孢桿菌X23及其應(yīng)用，該菌對茄科作物青枯病菌的抑制能力強。除此之外，還對多種病原真菌和病原細菌具有拮抗作用。本發(fā)明通過大量的實驗證明橋石短芽孢桿菌X23菌株能夠有效地抑制茄科作物青枯病菌的生長；此外，對煙草黑脛病菌、水稻稻瘟病菌、煙草赤星病菌和馬鈴薯晚疫病菌也具有明顯的拮抗作用。該菌在生長過程中可以向外界分泌種類豐富、數(shù)量可觀的蛋白質(zhì)和NRPs等次 生代謝產(chǎn)物。NRPs 由非核糖體妝合成酶(non-ribosomal peptide synthetases, NRPSs)催化合成。NRPSs是由多個酶按模塊化(module)組成的大的復(fù)合體，每個酶含一個或多個模塊，每個模塊激活一個特定的氨基酸并將其整合到新生的肽鏈中。典型的模塊由腺苷?；Y(jié)構(gòu)域(A結(jié)構(gòu)域)、巰基化結(jié)構(gòu)域(T結(jié)構(gòu)域)和縮合結(jié)構(gòu)域(C結(jié)構(gòu)域)等三個核心結(jié)構(gòu)域組成，模塊的數(shù)量、排列順序和方向與其產(chǎn)物的氨基酸數(shù)量、排列順序和方向之間存在嚴格的共線性關(guān)系，如短桿菌酪肽(tyrocidine)等。此后還發(fā)現(xiàn)了另外2種合成NRPs的方式iterative NRPSs 和 nonlinear NRPSs0 Iterative NRPSs 是指同一個模塊或結(jié)構(gòu)域在妝鏈合成過程中不止一次地往新生肽鏈上重復(fù)激活和添加某個氨基酸，導(dǎo)致肽鏈由多個小的重復(fù)序列組成；Nonlinear NRPSs方式合成的肽鏈順序與其合成酶的模塊之間并不存在嚴格的共線性關(guān)系。在NRPSs的最后一個模塊的C-末端通常有起終止延伸和釋放產(chǎn)物功能的硫酯(thioesterase, TE)結(jié)構(gòu)域。除了上述核心結(jié)構(gòu)域，在同一個模塊內(nèi)可能還存在一些附加的結(jié)構(gòu)域，如差向異構(gòu)結(jié)構(gòu)域(E結(jié)構(gòu)域)和甲基化結(jié)構(gòu)域(M結(jié)構(gòu)域)等，它們在肽鏈合成過程中對氨基酸底物進行修飾；乙?；⑻腔椭|(zhì)化等結(jié)構(gòu)域則對肽鏈骨架進行修飾。如果不具有這些結(jié)構(gòu)域，修飾作用則由獨立于NRPSs的酶催化完成。NRPs在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)和生物學(xué)等領(lǐng)域具有極大的研究價值和應(yīng)用潛力，除了可以殺死或抑制病原菌，NRPs還被廣泛用于抗腫瘤和抑制免疫反應(yīng)等。目前臨床應(yīng)用最多的10種抗生素類產(chǎn)品中有8種為NRPs，在抗感染和抗腫瘤等領(lǐng)域的市場份額分別達到了 68. 3%和79.8%。NRPs也可以抑制或殺死作物病原微生物，在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域也具有良好的應(yīng)用潛力。因此，新的NRPs的分離與鑒定是當前天然產(chǎn)物研究的熱點領(lǐng)域之一。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及非核糖體抗菌肽tyrocidine T的分離純化和鑒定的方法及其用途。本發(fā)明采用的微生物菌種，橋石短芽孢桿菌X23 (Brevibacillus choshinensisX23)來源于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，編號為=CGMCC NO 45340橋石短芽孢桿菌X23是一種能分泌對多種病原微生物具有抑制殺傷作用的非核糖體抗菌肽的根際微生物。這些非核糖體抗菌肽具有熱穩(wěn)定性高、耐受蛋白酶水解的能力強和不易誘導(dǎo)靶標微生物產(chǎn)生選擇性抗性等特點。由于此類抗菌肽通常以多種結(jié)構(gòu)類似物的形式共同存在于其發(fā)酵液中，并且有環(huán)狀結(jié)構(gòu)和非編碼氨基酸，可以耐受高溫、蛋白酶和有機溶劑處理等嚴苛條件而不影響其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性及生物學(xué)活性。根據(jù)上述特點，優(yōu)選本發(fā)明的分離、純化及鑒定方法為(I)橋石短芽孢桿菌X23菌株的發(fā)酵培養(yǎng)將_80°C保存的橋石短芽孢桿菌X23菌種接種于裝有NB液體培養(yǎng)基的三角瓶中，28 200 rpm過夜培養(yǎng)至對數(shù)生長期，即為發(fā)酵培養(yǎng)的種子液，將該種子液以體積比10%接種于新鮮的NB液體培養(yǎng)基，280C >200 rpm培養(yǎng)32h，得到X23的發(fā)酵液。 (2)無菌發(fā)酵液的制備X23發(fā)酵液經(jīng)7，600 rpm離心，取上清液經(jīng)孔徑為O. 22 μ m的過濾器(Millipore公司，Cat. No. GPWP04700)過濾，得到無菌發(fā)酵液。(3) X23外泌非核糖體抗菌肽粗制備液的制備取步驟(2)制備的無菌發(fā)酵液，冷凍真空干燥濃縮50倍后用氯仿抽提，11000 rpm離心10 min后收集上層水相，經(jīng)80°C水浴IOmin后IlOOOrpm離心IOmin,水相即為X23外泌非核糖體抗菌肽粗制備液。氯仿和高溫處理的目的是為了簡化樣品組成。(4)固相萃取分離為了進一步簡化樣品組成，并富集非核糖體抗菌肽，將經(jīng)第(3)步處理的粗制備液經(jīng)固相萃取處理。具體步驟為固相萃取法(SPE)富集非核糖體抗菌肽tyrocidine T選用華譜新創(chuàng)科技有限公司EMERALD產(chǎn)品，柱活化(見說明書)后將非核糖體抗菌肽粗制備液過柱，依次采用5%甲醇-水洗、甲醇洗和1%甲酸-甲醇洗脫，去除非活性組分，富集非核糖體抗菌肽。至此，樣品被大大簡化。(5)色譜分離利用親水色譜法(HILIC,Bio-Amide, 150X4. 6 mm, i. d. 5 μ m)對非核糖抗菌肽粗提液制備分離，流動相為AO. 1%TFA乙腈，BO. 1%TFA溶液，梯度洗脫(0_60 min, 5-50%
A)，檢測波長為254 nm。共獲得16個分離組分(圖I)，分別收集每個組分，冷凍真空干燥后與青枯病菌進行平板對峙試驗，結(jié)果表明，第7、第8和第9三個樣品組分在與青枯病菌的平皿對峙實驗時表現(xiàn)出明顯的抑菌圈(圖2)，其中8號組分的抑菌圈大且明顯，說明該組分抑制青枯病菌的效果最好；而第7號和第9號組分的抑菌圈小，且隨著時間的延長，抑菌圈逐漸變小，直至模糊消失，說明第7號和第9號組分對青枯病菌的抑制效果弱于第8號樣品O收集第7、第8兩個分離組分，進一步優(yōu)化分離條件，利用親水色譜(HILIC，Bio-Amide, 150X10 mm, i. d. 5 μ m)進行非核糖體抗菌肽的制備分離(Bio-Amide,150X10 mm)，流動相為 A O. 1%TFA 乙腈，B O. 1%TFA 溶液，梯度洗脫(0-60 min, 5-50% A)，檢測波長為254 nm。結(jié)果表明，7號和9號樣品組成成份復(fù)雜，而8號峰為單一物質(zhì)。(6)非核糖體抗菌肽tyrocidine T的鑒定收集8號樣品,冷凍真空干燥后進行MALDI-T0F-T0F 和 MS/MS 串聯(lián)質(zhì)譜鑒定。MALDI-T0F-T0F 結(jié)果表明，tyrocidine T 的分子量為1270. 73(圖3) ；MS/MS鑒定結(jié)果表明，非核糖體抗菌肽的一級結(jié)構(gòu)為DPhe-PiO-Tyr-DPhe-Asn-Gln-Tyr-Val-Orn-Leu (D型苯丙氨酸一脯氨酸一酪氨酸一D型苯丙氨酸一天冬酰胺一谷氨酰胺一酪氨酸一纈氨酸一鳥氨酸一亮氨酸，見圖3)，生物信息學(xué)預(yù)測的分子結(jié)構(gòu)如圖4所示。在一個具體實施方案中，X23非核糖體抗菌肽在作物生產(chǎn)中用于抑制青枯病菌等多種病菌的用途。在一個具體實施方案中，其中步驟(4)中不同溶液進行洗脫是指先用3柱體積5%甲醇水溶液沖洗、2柱體積再用100%甲醇溶液沖洗、最后用4柱體積1%甲酸-99%甲醇溶液進行洗脫，其中1%甲酸-99%甲醇溶液中比例是指體積體積比。 四

圖1-2為X23非核糖體抗菌肽的分離及活性檢測圖I :X23外泌抗菌肽粗制備液的親水色譜分析，其中7-12為親水色譜法制備分離的第7至第12號樣品組分。圖2:親水色譜法制備的樣品組分與青枯病菌GMI1000的平板對峙培養(yǎng)，其中PCK為X23的無菌發(fā)酵液。圖3 X23非核糖體抗菌肽tyrocidine T的質(zhì)譜鑒定圖4 X23非核糖體抗菌肽tyrocidine T的分子結(jié)構(gòu)
五具體實施例方式(一 )本發(fā)明新型非核糖體抗菌肽的微生物發(fā)酵和分離鑒定方法如下I.橋石短芽孢桿菌X23的發(fā)酵培養(yǎng)將_80°C保存的橋石短芽孢桿菌X23菌種接種于裝有NB液體培養(yǎng)基的三角瓶中，280C >200 rpm過夜培養(yǎng)至對數(shù)生長期，即為發(fā)酵培養(yǎng)的種子液。將該種子液以體積比10%接種于新鮮的NB液體培養(yǎng)基，28°C、200rpm培養(yǎng)32h，得到X23的發(fā)酵液。X23發(fā)酵液經(jīng)7，600 rpm離心，取上清液經(jīng)孔徑為O. 22 μ m的過濾器(Millipore公司，Cat. No. GPWP04700)過濾，即為無菌發(fā)酵液。2.橋石短芽孢桿菌X23非核糖體抗菌肽tyrocidine T的分離取上述無菌發(fā)酵液，冷凍真空干燥濃縮50倍后用等體積氯仿抽提，11，000 rpm離心10 min后收集上層水相，經(jīng)80°C水浴IOmin后再11，OOOrpm離心lOmin，上層水相即為X23外泌非核糖體抗菌肽粗制備液。選用固相萃取法(SPE)富集非核糖體抗菌肽，柱活化(華譜新創(chuàng)科技有限公司EMERALD產(chǎn)品，操作參照廠家使用說明)后將非核糖體抗菌肽粗制備液過柱，依次采用5%甲醇-水洗、甲醇洗和1%甲酸-甲醇洗脫，去除非活性組分，富集非核糖體抗菌肽。收集固相萃取富集的1%甲酸-甲醇洗脫液，經(jīng)冷凍真空干燥后用ddH20溶解，反相色譜分析發(fā)現(xiàn)活性組分具有較強的極性，在反相色譜柱(Bio-C18，150X4.6 mm)上保留較弱；基于此，隨后采用親水色譜法(HILIC)對該組分分別進行分析(Bio-Amide，150X4.6 mm)和制備(Bio-Amide, 150X10 mm),平板對峙實驗發(fā)現(xiàn)第7、第8和第9號樣品均表現(xiàn)出明顯的抑菌活性(圖2)，其中第8號組分的抑菌圈大且明顯，說明該組分抑制青枯病菌的效果最好；而第7號和第9號樣品組分的抑菌圈小，且隨著時間的延長，抑菌圈逐漸變小，直至模糊消失，說明第7號和第9號組分對青枯病菌的抑制效果弱于第8號樣品。3.橋石短芽孢桿菌X23非核糖體抗菌肽tyrocidine T的分子量及結(jié)構(gòu)鑒定收集8號樣品，冷凍真空干燥后進行MALDI-T0F-T0F和MS/MS串聯(lián)質(zhì)譜鑒定。MALDI-T0F-T0F結(jié)果表明，tyrocidine T的分子量為1270.73 ;MS/MS鑒定結(jié)果表明，非核糖體抗菌肽的一級結(jié)構(gòu)為DPhe-Pro-Tyr-DPhe-Asn-Gln-Tyr-Val-Orn_Leu。數(shù)據(jù)庫比對結(jié)果說明，該抗菌肽是已知tyrocidine類非核糖體抗菌肽的同系物,但第三個氨基酸殘基為tyr,與其它tyrocidine均不相同，因此將其命名為tyrocidine T。(二)橋石短芽孢桿菌X23非核糖體抗菌肽tyrocidine T的抑菌試驗I.抑菌試驗指示菌1.1細菌指示菌抑菌實驗采用的指示細菌為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中重要的病原菌和人類 及動物的機會主義致病菌。煙草青枯病菌(Ralstonia Solanacearum GMI1000)、大腸桿菌(Escherichia coli DH5 α )、大白菜軟腐病菌(Erwinia carotovora)、水稻白葉枯病菌(Xanthomonas oryzae)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ASl. 2465)。1.2真菌指示菌抑菌實驗所采用的指示菌為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中3種重要的病原菌，馬鈴薯晚疫病菌(Phytophthora infestans)、煙草黑胚病菌(P. parasitica var.nicotianae)和水稻稻痕病菌(Magnaporthe grisea)。2.抗菌肽的抑菌試驗2.1細菌抑菌試驗方法將培養(yǎng)到對數(shù)生長期的各細菌用無菌LB培養(yǎng)基稀釋至IO6 cfu/ml，取60 μ I加入20 ml冷卻到50°C的固體LB培養(yǎng)基，充分振蕩混勻后倒入培養(yǎng)皿。培養(yǎng)基完全冷卻凝固后用打孔器打孔，每孔加入50 μ I濃度為10 μ g/ml的抗菌肽tyrocidine T，37°C培養(yǎng)20 h后記錄抑菌圈大小。抑菌實驗重復(fù)三次，抑菌圈直徑取平均值(表I)。2. 2真菌抑菌試驗方法將各真菌從斜面接種至新鮮的平皿，待菌絲進入旺盛生長期時切取O. 7 cmX0.7 cm的菌絲塊，置于另一新鮮制備的平皿中央。于菌絲塊兩側(cè)等距的地方用打孔器打孔，每孔加入50 μ I濃度為30 μ g/ml抗菌肽tyrocidine T。48 h后記錄抑菌圈直徑大小，實驗重復(fù)三次，抑菌圈直徑取平均值(表I)。馬鈴薯晚疫病菌和煙草黑脛病菌用黑麥培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度分別為18°C和28°C ;水稻稻瘟病菌用PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為28 °C。研究結(jié)果表明，抗菌肽對上述5種細菌和3種真菌均具有顯著的抑菌作用。由于橋石短芽孢桿菌抗菌肽tyrocidine T對多種植物甚至動物的病原菌都具有明顯的抑制作用，表現(xiàn)出高效廣譜特性，因此可以開發(fā)成為一種新型的殺菌制劑，用于植物和動物病原菌的控制，對于減少因病原菌危害造成的經(jīng)濟和生態(tài)損失具有重要的意義。表I橋石短芽孢桿菌X23非核糖體抗菌肽tyrocidine T對病原細菌和真菌的抑菌效果
權(quán)利要求
1.一種廣譜抗菌肽的制備方法，其具體步驟包括 (1)橋石短芽孢桿菌X23菌株的發(fā)酵培養(yǎng)將-80°c保存的橋石短芽孢桿菌X23菌種接種于裝有NB液體培養(yǎng)基的三角瓶中，280C >200 rpm過夜培養(yǎng)至對數(shù)生長期，即為發(fā)酵培養(yǎng)的種子液，將該種子液以體積比10%接種于新鮮的NB液體培養(yǎng)基，28°C,200 rpm培養(yǎng)32h，得到X23的發(fā)酵菌液； (2)無菌發(fā)酵液的制備X23發(fā)酵菌液經(jīng)7，600rpm離心，取上清液經(jīng)孔徑為O. 22 μπι的過濾器(Mi IIipore公司，Cat. No. GPWP04700)過濾，得到無菌發(fā)酵液； (3)X23外泌非核糖體抗菌肽粗制備液的制備取步驟(2)制備的無菌發(fā)酵液，冷凍真空干燥濃縮50倍后用氯仿抽提，11000 rpm離心10 min后收集上層水相，經(jīng)80°C水浴IOmin后IlOOOrpm離心lOmin，水相即為X23外泌非核糖體抗菌肽粗制備液； (4)固相萃取分離固相萃取法(SPE)富集非核糖體抗菌肽tyiOcidineT選用華譜新創(chuàng)科技有限公司EMERALD產(chǎn)品，柱活化后將非核糖體抗菌肽粗制備液過柱，依次采用不同溶液進行洗脫，去除非活性組分，富集非核糖體抗菌肽； (5)色譜分離X23外泌非核糖體抗菌肽tyiOcidineT的高效液相色譜分析(HPLC)洗脫液經(jīng)冷凍真空干燥后用ddH20溶解，反相色譜分析發(fā)現(xiàn)活性組分具有較強的極性，在反相色譜柱(Bio_C18，150X4.6 mm，i. d. 5 μ m)上保留較弱；基于此，隨后采用親水色譜法(HILIC)對該組分分別進行分析(Bio-Amide, 150X4.6 mm, i. d. 5 μπι)和制備(Bio-Amide, 150 X 10 mm, i. d. 5 μ m)，流動相為 AO. 1%TFA 乙腈，BO. 1%TFA 溶液，梯度洗脫(0-60 min, 5-50% A)，檢測波長為 254 nm ； (6)非核糖體抗菌肽tyrocidine T的鑒定選取有明顯的抑菌活性的樣品組分進行MALDI-TOF-TOF和MS/MS串聯(lián)質(zhì)譜鑒定，結(jié)果顯示，tyrocidine T的分子量為1270. 73，其一級結(jié)構(gòu)為 DPhe-Pro-Tyr-DPhe-Asn-Gln-Ty:r-Val-0;rn-Leu。
2.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，其中步驟(4)中依次采用不同溶液進行洗脫是指先用3柱體積5%甲醇水溶液沖洗、2柱體積再用100%甲醇溶液沖洗、最后用4柱體積1%甲酸-99%甲醇溶液進行洗脫。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種廣譜抗菌肽的制備方法，采用橋石短芽孢桿菌進行發(fā)酵，得到發(fā)酵液后離心，取上清液過濾，得到無菌發(fā)酵液，再經(jīng)過固相萃取，親水色譜分離，X23非核糖體抗菌肽經(jīng)質(zhì)譜鑒定。該方法操作簡單，分離效率高，分離X23非核糖體抗菌肽的活性高。
文檔編號A61P31/04GK102911988SQ20121029288
公開日2013年2月6日 申請日期2012年8月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月16日
發(fā)明者陳武, 周清明, 王運生, 肖啟明, 黎定軍, 曾靜 申請人:湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)