專利名稱：一種hpei包裹的氧化鐵磁性納米顆粒的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于氧化鐵磁性納米顆粒的制備領(lǐng)域，特別涉及一種HPEI包裹的氧化鐵磁性納米顆粒的制備及改性方法。
背景技術(shù)：
近年來，四氧化三鐵磁性納米顆粒(Fe3O4)被廣泛地應(yīng)用于各種生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，如細(xì)胞分離與純化、磁控抗癌藥物輸送、腫瘤磁熱療以及核磁共振成像(MRI)。迄今為止，F(xiàn)e3O4大致可以分為液相法和固相法兩種合成方法，其區(qū)別是液相法在液相中進(jìn)行合成反應(yīng)，而固相法則在沒有溶液過程就能夠生成目標(biāo)產(chǎn)物。固相法又分為球磨法和高溫?zé)岱纸夥?。但所制備的樣品產(chǎn)品純度不高，顆粒分布雜亂，易發(fā)生氧化反應(yīng)。液相法有水熱合成法、溶膠-凝膠法、化學(xué)共沉淀法、水解法和電化學(xué)法四種類型。液相法制備的納米微粒通常顆粒度不大，操作方法容易，且有著較低的生產(chǎn)成本。而近年來發(fā)展的水熱法已被證明是合成高 質(zhì)量磁性晶粒的有效方法之一。在其反應(yīng)和晶體生長過程中，水熱條件下減少了聚集的發(fā)生，從而形成單晶的四氧化三鐵晶粒。所合成的納米粒子在溶液中具有良好分散性、粒徑分布窄、晶形好和副產(chǎn)品少等優(yōu)點(diǎn)。另外，在反應(yīng)溶劑中添加表面活性劑，可以有效地分離晶核，并在隨后的晶體生長過程中干預(yù)晶化過程，從而縮小顆粒大小分布范圍和減小顆粒直徑。裸露的四氧化三鐵納米顆粒因?yàn)楦叩幕瘜W(xué)反應(yīng)活性非常容易氧化，同時(shí)大的比表面積使納米顆粒容易聚集而導(dǎo)致磁性和分散性降低，此外，在與人體內(nèi)PH值相當(dāng)?shù)沫h(huán)境中，納米級(jí)的鐵氧化物顆粒也易聚集，限制了其推廣及應(yīng)用。迄今為止，解決方法是用物理、化學(xué)方法處理納米顆粒表面，在粒子表面通常包覆一層無機(jī)或有機(jī)物，提升其穩(wěn)定性、水分散性與生物相容性?，F(xiàn)在通常的改性方法還有表面化學(xué)改性法、溶膠-凝膠改性法、沉淀反應(yīng)改性法、聚合物包覆改性法、自組裝改性法等。之前用一步水熱合成法合成了一種APTS修飾的氧化鐵磁性納米材料，該方法工藝簡單，反應(yīng)條件溫和，易于操作分離；制備的氧化鐵磁性納米顆粒能夠長時(shí)間地分散在水基溶液中，沒有團(tuán)聚現(xiàn)象發(fā)生，在MRI成像診斷中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值(沈明武，蔡紅東，史向陽。一種APTS修飾的氧化鐵磁性納米顆粒的制備方法。中國發(fā)明專利，申請(qǐng)?zhí)?01110104443. 1，申請(qǐng)日期2011/4/26)。但制備的APTS修飾的氧化鐵磁性納米材料尺寸太小(6. 5nm),顆粒直徑難以控制。而超支化聚乙烯亞胺(Hyperbranched Polyethyleneimine, HPEI)不僅能夠提高納米顆粒的水溶液分散性，而且有眾多的表面氨基，可用于納米材料表面的進(jìn)一步官能化修飾。Shen等用HPEI修飾羧基化的多壁碳納米管，改善了碳納米管的水溶液分散性，同時(shí)又通過乙?；汪然?，以改變其表面電荷性能，得到表面電中性和攜帶負(fù)電荷的碳納米管材料，并研究了其體外細(xì)胞毒性，結(jié)果表明HPEI修飾的碳納米管由于氨基的作用顯示出細(xì)胞毒性，而經(jīng)過乙酰化和羧基化后的衍生物則沒有明顯的細(xì)胞毒性(Shen，J. Phys. Chem.C 2009. MWCNTs)。
PEG (聚乙二醇)是一種生物相容良好的聚合物，作為包覆材料修飾納米顆粒表面可以減少蛋白質(zhì)的吸附和巨噬細(xì)胞的攝取，從而延長納米顆粒在體內(nèi)的半衰期，PEG已被廣泛地應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。PEG的引入能增強(qiáng)納米顆粒的親水性及水溶性，提升其生物相容性及延長血液循環(huán)時(shí)間。Peng等利用PEG修飾樹狀大分子，以此為模板，制備樹狀大分子包裹金納米顆粒用于CT成像，有效地提高了金的上載量，并改善了材料的生物相容性，能較好地用于荷瘤鼠體內(nèi) CT成 像(Peng, Biomaterials, 2011, [(Au°)n-G5. NHAc-mPEGjDENPs)。檢索國內(nèi)外有關(guān)HPEI保護(hù)的Fe3O4納米顆粒合成的文獻(xiàn)和專利結(jié)果表明，用一步水熱合成法合成HPEI保護(hù)的Fe3O4納米粒子并對(duì)其表面有效地修飾和改性的研究還未見相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種HPEI包裹的氧化鐵磁性納米顆粒的制備方法，該法工藝簡單，反應(yīng)條件溫和，易于操作分離，制備的氧化鐵磁性納米顆粒能夠長時(shí)間地分散在水溶液中，沒有團(tuán)聚現(xiàn)象發(fā)生；所用的修飾劑HPEI為廉價(jià)和環(huán)境友好材料，具有產(chǎn)業(yè)化實(shí)施的前景；此法形成的Fe304/HPEI表面還可進(jìn)一步功能化和改性，提高其穩(wěn)定性以及生物相容性，在MRI成像診斷中有潛在的應(yīng)用價(jià)值。本發(fā)明的一種HPEI包裹的氧化鐵磁性納米顆粒的制備方法，包括(I)將Fe源加入超純水中，再加入NH3 -H2O并于空氣中攪拌，再加入O. 02-0. 12g/mL的超支化聚乙烯亞胺HPEI水溶液，于13Γ140 反應(yīng)3小時(shí)；反應(yīng)結(jié)束后，自然冷卻至室溫，將沉淀洗滌磁分離后，即得HPEI包裹的四氧化三鐵納米顆粒Fe304/HPEI ；(2)Fe304/HPEI與甲氧基聚乙二醇羧酸(mPEG_C00H)進(jìn)行PEG化反應(yīng)將甲氧基聚乙二醇羧酸(mPEG-COOH)和I- (3- 二甲氨基丙基)-3-乙基-碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)分別溶解于3-6mL DMSO中，攪拌活化3h后，再加入步驟(I)制備的Fe304/HPEI，振蕩3天，再用水磁分離洗滌，再分散入水或PBS中，得到PEG化的Fe304/HPEI. PEG納米顆粒；或Fe304/HPEI與乙酸酐進(jìn)行乙酰化反應(yīng)將步驟(I)制備的Fe304/HPEI納米顆粒均勻分散在水中，與三乙胺充分混合后，逐滴加入乙酸酐。攪拌反應(yīng)2Γ48小時(shí)，用水磁分離洗滌，制得乙酰化的Fe304/HPEI. Ac納米顆粒；或Fe304/HPEI與琥珀酰酐進(jìn)行羧基化反應(yīng)將步驟(I)制備的Fe304/HPEI納米顆粒均勻分散在DMSO中，逐滴加入含琥珀酸酐的DMSO溶液，攪拌反應(yīng)24 48小時(shí)，用水磁分離洗滌，制得羧基化的表面為負(fù)電荷的Fe304/HPEI. SAH納米顆粒。所述步驟(I)中的Fe源為FeCl2 · 4H20。所述步驟(I)中的Fe源、超純水、NH3 · H2O的配比為lg: 6_51mL: 5mL。所述步驟(I)中的鐵源與超支化聚乙烯亞胺HPEI質(zhì)量比為1-5:1。所述步驟(I)中的NH3 · H2O質(zhì)量百分比濃度為25-28%。所述步驟(I)中的超支化聚乙烯亞胺HPEI的分子量Mw=25000。所述步驟(2)中的甲氧基聚乙二醇羧酸(mPEG-COOH)的分子量為2000。所述步驟(2)中的甲氧基聚乙二醇羧酸(mPEG-COOH)與包裹在四氧化三鐵磁性納米顆粒表面的氨基的摩爾比為1:5-10。
所述步驟(2)中的乙酸酐或琥珀酸酐與Fe304/PEI中的-NH2的摩爾比為5_10:1。所述步驟(2)中的三乙胺、乙酸酐與Fe304/PEI中的-NH2摩爾比為5:5:1。本發(fā)明利用聚乙烯亞胺進(jìn)行一步水熱法合成尺寸可控的HPEI包裹的四氧化三鐵磁性納米顆粒，并可進(jìn)一步對(duì)其表面進(jìn)行修飾和功能化。利用超支化聚合物超支化聚乙烯亞胺HPEI來修飾和穩(wěn)定化氧化鐵磁性材料，有望通過HPEI和鐵鹽的投料比控制合成納米氧化鐵顆粒的尺寸，同時(shí)利用聚乙烯亞胺HPEI的氨基可被修飾的優(yōu)點(diǎn)可對(duì)氧化鐵納米顆粒表面進(jìn)一步修飾改性。本發(fā)明研究不同參數(shù)對(duì)Fe3O4材料表面修飾、尺寸、形狀、結(jié)構(gòu)、以及穩(wěn)定性的影響，如不同體積的水和氨水，不同質(zhì)量比例的FeCl2 · 4H20和超支化聚乙烯亞胺，首先將FeCl2 ·4Η20在空氣中氧化后，在高壓下于134°C并在HPEI存在下，水熱合成HPEI保護(hù)的四氧化三鐵納米顆粒。合成的HPEI保護(hù)的Fe3O4納米顆粒尺寸為ll_22nm，隨后將納米顆粒外圍HPEI的氨基進(jìn)行PEG化、乙?；汪然?，以提高其生物相容性，該方法制備的氧化鐵納米顆?？蓾撛谟糜贛RI分子影像診斷。本發(fā)明使用透射電子顯微鏡(TEM)、X-射線衍射(XRD)、傅里葉變換紅外光譜(FTIR)、熱重分析(TGA)、電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法(ICP-AES)以及Zeta電勢及光散射動(dòng)力學(xué)等方法表征制備的磁性納米顆粒，納米顆粒T2弛豫性能通過磁共振成像儀測得，同時(shí)利用穩(wěn)定性測試、血液相容性、MTT法來檢驗(yàn)納米顆粒的穩(wěn)定性、血液相容性以及細(xì)胞毒性，具體測試結(jié)果如下(I)X-射線衍射(XRD)的測試結(jié)果通過對(duì)衍射圖譜的比較和分析，所合成的材料和Fe3O4的圖譜(ICSD 20-596)一致，表明HPEI修飾的Fe3O4晶體結(jié)構(gòu)沒有改變，產(chǎn)物為四氧化三鐵。另外，根據(jù)Debye-Scherrer 公式(D=k λ / β cos θ , λ =0. 15406nm),取最大峰處(311)計(jì)算得到:·Fe304/HPEI (I) :11. 5nm ；Fe304/HPEI ⑵17. 5nm ； Fe304/HPEI (3) : 18. 3nm ；Fe304/HPEI (4) : 18. 9nm。參考附圖I和表I ;(2)熱重分析(TGA)測試結(jié)果為了比較四種不同原料配比一步法所合成的Fe3O4納米顆粒表面HPEI的修飾量，對(duì)水熱法合成的Fe3O4和一步法合成的Fe304/HPEI進(jìn)行了 TGA測試。由圖2可以看出，跟純氧化鐵比較，I號(hào)樣品中HPEI的上載率最高，為9. 69%，3號(hào)樣品中HPEI的上載率最低，為
7.34%，從圖3可看出，I號(hào)和3號(hào)樣品按HPEI表面氨基與PEG摩爾比例5:1反應(yīng)后進(jìn)行熱重測試；1 號(hào) Fe304/HPEI. PEG (圖 3a)失重為 14. 87% ；3 號(hào) Fe304/HPEI. PEG (圖 3b)失重為
10.70%ο因此可計(jì)算出，I號(hào)Fe304/HPEI. PEG和3號(hào)Fe304/HPEI. PEG的PEG的上載率分別為5. 18%和3. 36%，由此表明I和3號(hào)樣品已成功地被PEG修飾上去?？梢姡杀痉ê铣傻腍PEI修飾的納米顆粒表面含有更加密集的氨基，可按照不同的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用要求進(jìn)一步進(jìn)行功能化或表面修飾。TGA測試結(jié)果表明HPEI和PEG成功地修飾在Fe3O4納米顆粒表面上。參考附圖2和3 ;(3)傅里葉變換紅外光譜(FTIR)的測試結(jié)果
Fe304/HPEI及純Fe3O4的FTIR譜圖如圖4所示。對(duì)于Fe304/HPEI納米顆粒來說，2930和2850cm-1為C-H的伸縮振動(dòng)，1126cm-1為C-N鍵伸縮振動(dòng)。此外，3450和1630cm-1處的吸收峰則歸因于-NH2和樣品中的殘余水。和純Fe3O4納米顆粒相比，由于-NH2的存在，F(xiàn)e304/HPEI在3450和1630CHT1處吸收峰面積較大。FTIR結(jié)果表明HPEI成功地修飾在Fe3O4納米顆粒表面上。參考附圖4;(4)透射電子顯微鏡(TEM)測試結(jié)果TEM測試結(jié)果顯示Fe304/HPEI的形貌為球形或準(zhǔn)球形，通過對(duì)Fe304/HPEI納米顆粒分別隨機(jī)測量200-300個(gè)納米顆粒的直徑計(jì)算得到I號(hào)樣品的平均直徑為11. 50Hnm ；2號(hào)樣品平均直徑為20. 2nm ；3號(hào)樣品平均直徑為16. 7nm ；4號(hào)樣品平均直徑為21. 8nm。結(jié)果表明I號(hào)樣品的尺寸較小，2-4號(hào)樣品的平均直徑相對(duì)較大，不同用量的HPEI對(duì)材料的尺寸大小影響不大，但FeCl2'4H20的用量對(duì)顆粒的結(jié)構(gòu)和尺寸有一定的影響，相對(duì)I號(hào)樣品，2-4號(hào)的結(jié)構(gòu)晶型更規(guī)整均一，尺寸更大。這些尺寸結(jié)果與XRD測試結(jié)果相一致。TEM圖中可以看出顆粒外圍有一層大分子殼層包圍，表明HPEI均勻地修飾在Fe3O4納米顆粒表面。參考附圖5和表I ;·IH相對(duì)于未修飾PEG的I和3號(hào)樣品，因?yàn)轭w粒外圍的PEG的修飾，導(dǎo)致Fe3O4/HPEI. PEG尺寸略微增大，且從TEM圖可以肉眼看出顆粒外圍的大分子層增厚，結(jié)合TG (圖2,3)結(jié)果，都證明了 PEG成功修飾到顆粒表面。參考附圖6和表2 ;(5)納米顆粒Zeta電勢及光散射測試結(jié)果納米顆粒的外圍氨基可產(chǎn)生細(xì)胞毒性并與細(xì)胞膜非特異性結(jié)合，從而限制了這些納米顆粒的生物應(yīng)用。我們以前的研究發(fā)現(xiàn)，中和修飾在多壁碳納米管表面的聚乙烯亞胺的氨基，可以有效降低多壁碳納米管的毒性(Shen, J. Phys. Chem. C 2009. MWCNTs，113(8) : 3150-3156)。同樣，我們通過對(duì)Fe304/HPEI外圍氨基進(jìn)行PEG化、乙?；汪然?，使其表面電勢呈中性或帶負(fù)電荷，改善納米顆粒的生物相容性。電勢測定結(jié)果(表3)表明，由于外圍存在大量的氨基，I號(hào)Fe304/HPEI的表面電勢約為38mV。經(jīng)過乙酰化反應(yīng)之后，電勢降至約為26mV，電勢有明顯下降，但是還未達(dá)到電中性，可能是由于HPEI部分氨基和氧化鐵相互作用，使得他們的反應(yīng)活性減弱，無法完全乙酰化，所以還呈現(xiàn)一部分正電性，但是由于他們和氧化鐵作用，所以對(duì)細(xì)胞的毒性并不會(huì)像單純的HPEI —樣。而羧基化反應(yīng)后顆粒表面電勢呈負(fù)電，I號(hào)Fe304/HPEI電勢從38. 07mV降為-17. 3mV，結(jié)果顯示，羧基化反應(yīng)成功，氨基充分反應(yīng)。而經(jīng)過PEG化反應(yīng)后，F(xiàn)e304/HPEI.PEG的電勢也下降。這些結(jié)果說明了 PEG化、乙?；汪然磻?yīng)的成功實(shí)施。參考附表3 ；(6)穩(wěn)定性測試穩(wěn)定性測試研究表面經(jīng)過不同修飾及帶不同電荷材料在不同介質(zhì)中的穩(wěn)定性。首先分別將 I 號(hào)的 Fe304/HPEI、Fe304/HPEI. Ac、Fe304/HPEI. SAH 以及 Fe304/HPEI. PEG 四種材料，放置于純水、PBS緩沖液(pH 7. 4)和培養(yǎng)基中放置一個(gè)星期后，F(xiàn)e304/HPEI、Fe304/HPEI·Ac、Fe304/HPEI. PEG分散穩(wěn)定，沒有沉淀和聚集發(fā)生，說明Fe304/HPEI，乙?；蠹癙EG化后的衍生物在溶液中具有良好的分散性和穩(wěn)定性。而表面帶負(fù)電的羧基化材料出現(xiàn)一定的聚集現(xiàn)象，但在水溶液中仍很容易地被分散。(7) T2弛豫率測量結(jié)果
Fe3O4納米材料為一種MRI陰性造影劑，能降低信號(hào)強(qiáng)度。弛豫率(r2)反映了納米粒子作為MRI造影劑的效率，為每毫摩爾鐵的橫向弛豫時(shí)間，可通過弛豫時(shí)間(T2)的倒數(shù)計(jì)算得到。圖7a和b分別為I號(hào)和3號(hào)Fe3CVHPEI材料相應(yīng)的線性擬合圖，可以看出Fe304/HPEI材料的弛豫率隨著鐵濃度的增加(在0-0. 02mM濃度范圍內(nèi))具有很好的線性相關(guān)系數(shù)。從線性關(guān)系圖可知，F(xiàn)e3CVHPEI材料即使外圍修飾上PEG，也沒有阻擋了其與質(zhì)子的接觸率，對(duì)弛豫率沒太大影響，且都具有良好的弛豫率(OO-ieOmT1 S—1)。因此，本發(fā)明所合成的Fe304/HPEI和Fe304/HPEI. PEG納米材料可作為優(yōu)良T2信號(hào)衰減造影劑，有望應(yīng)用于MRI分子影像學(xué)診斷；參考附圖7。(8)血液相容性為了便于材料能更好地用于體內(nèi)生物成像，本試驗(yàn)測定了 I號(hào)Fe304/HPEI材料經(jīng)過不同修飾和帶不同電荷后的血液相容性。圖8中顯示了 I號(hào)Fe304/HPEI (圖8a)、Fe3O4/HPEI. PEG (圖 8b)、Fe304/HPEI. Ac (圖 8c)以及 Fe304/HPEI. SAH (圖 8d)在不同濃度 50、100、200,400 μ g/mL下的溶血性測試結(jié)果。通過對(duì)上層清液的吸光度進(jìn)行測量來定量評(píng)價(jià)樣品 的溶血性。如圖8右上角紫外圖譜顯示，在達(dá)到400μ g/mL條件下，F(xiàn)e304/HPEI、Fe304/HPEI.PEG和Fe304/HPEI. Ac的溶血百分率都小于5%，但Fe304/HPEI. SAH的溶血率為7. 65%。而在低于200 μ g/mL時(shí)，所有材料的溶血率都非常低，因而可使它們成功地用于生物體內(nèi)成像；參考附圖8。(9) MTT細(xì)胞活力測試結(jié)果通過MTT比色法測定KB細(xì)胞(一種人類上皮癌的細(xì)胞株)的活力檢測所合成材料以及表面經(jīng)過不同功能化修飾后的細(xì)胞毒性。KB細(xì)胞分別與Fe304/HPEI、Fe304/HPEI. PEG、Fe304/HPEI. Ac 以及 Fe304/HPEI. SAH 在濃度為 10、25、50 和 100 μ g/mL 和 37°C下共培養(yǎng) 24小時(shí)。然后，經(jīng)MTT處理后在570nm處測量吸光值，并根據(jù)此值計(jì)算細(xì)胞的增殖及活力。不同濃度下材料對(duì)細(xì)胞增殖的影響與對(duì)照組(緩沖液PBS，pH 7. 4)的統(tǒng)計(jì)比較，則通過單因素方差分析方法實(shí)施。與對(duì)照組相比，表面經(jīng)過修飾和功能化的Fe304/HPEI. PEG、Fe304/HPEI.Ac和Fe304/HPEI. SAH在試驗(yàn)濃度O到100 μ g/mL范圍內(nèi)對(duì)KB細(xì)胞的存活率沒有顯著性差異。而Fe304/HPEI在劑量達(dá)到50 μ g/mL時(shí)開始出現(xiàn)細(xì)胞毒性(p〈0. 05)，這表明其在高濃度時(shí)不利于細(xì)胞的增殖，可能是由于表面的HPEI對(duì)細(xì)胞有毒性以及表面高正電荷對(duì)細(xì)胞生長有一定影響。而表面經(jīng)過修飾和功能化的Fe304/HPEI. PEG、Fe304/HPEI. Ac和Fe304/HPEI.SAH則具有良好的生物相容性，便于各種生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用；參考附圖9。有益效果(I)本發(fā)明采用簡單的、HPEI輔助的“一步”水熱法來合成水溶性良好的HPEI保護(hù)的Fe3O4納米粒子，此法還可通過控制不同原料配比來合成不同尺寸的氧化鐵磁性納米顆粒，工藝簡單，反應(yīng)條件溫和，易于操作分離，所用的修飾劑為廉價(jià)和環(huán)境友好的聚乙烯亞胺材料，具有產(chǎn)業(yè)化實(shí)施的前景；(2)本發(fā)明制備的氧化鐵磁性納米顆粒能夠長時(shí)間地分散在水基溶液中，沒有團(tuán)聚現(xiàn)象發(fā)生，且PEG化、乙?；汪然难趸F磁性納米顆粒具有良好的生物相容性和較高的T2弛豫率，可潛在地應(yīng)用于MRI成像診斷。


圖I是本發(fā)明制備的Fe304/HPEI的X射線衍射圖；Fe304/HPEI (1-4)分別為1_4號(hào)樣品；圖2是本發(fā)明制備的Fe3O4及Fe304/HPEI的熱重分析圖；Fe304/HPEI (1-4)分別為1-4號(hào)樣品；Naked Fe3O4為對(duì)比例I制備的未保護(hù)的純Fe3O4 ；圖3是本發(fā)明制備的I和3號(hào)Fe304/HPEI經(jīng)過PEG化后Fe304/HPEI. PEG的熱重分析圖；Fe304為對(duì)比例I制備的未保護(hù)的純Fe3O4 ；圖4是本發(fā)明制備的Fe3O4及Fe304/HPEI的傅里葉變換紅外光譜圖，a、b、C、d及e分別為I號(hào)，2號(hào)，3號(hào)，4號(hào)Fe304/HPEI的紅外譜圖及未保護(hù)的純Fe3O4的紅外譜圖；圖5是本發(fā)明制備的I (a)，2 (b)，3 (C)和4(d)號(hào)Fe304/HPEI的透射電鏡圖和尺寸分布圖；圖6是本發(fā)明制備的I (a)和3 (b)號(hào)樣品經(jīng)PEG化得到Fe304/HPEI. PEG的透射電鏡圖和尺寸分布圖；圖7是本發(fā)明制備的I (a)和3 (b)號(hào)Fe304/HPEI及Fe304/HPEI. PEG的弛豫率的線性關(guān)系圖；圖8 是本發(fā)明制備的 I 號(hào) Fe304/HPEI (a)、Fe304/HPEI. PEG (b)、Fe304/HPEI. Ac (c)以及Fe304/HPEI. SAH (d)(濃度范圍50-400 μ g/mL)的溶血實(shí)驗(yàn)紫外圖譜；圖9是MTT法測試的KB細(xì)胞經(jīng)過PBS緩沖液(對(duì)照)、？6304/!^1{6304/!^1· PEG、Fe304/HPEI. Ac和Fe304/HPEI. SAH納米顆粒(濃度范圍在0-100 μ g/mL)處理24小時(shí)后的細(xì)胞活力。
圖10是超支化聚乙烯亞胺HPEI的分子結(jié)構(gòu)式。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。實(shí)施例I·將I. 2519g FeCl2 ·4Η20加入燒杯中，加入7. 75mL的超純水(電阻率大于18. 2ΜΩ.cm)，在不斷攪拌中，加入6. 25mL NH3 · H2O,將上述混合液在空氣中連續(xù)攪拌10分鐘，從而保證二價(jià)鐵充分被氧化，接著將反應(yīng)物轉(zhuǎn)移到反應(yīng)釜中。將O. 53879g HPEI溶于5mL水溶液中，超聲溶解后，用移液槍將其轉(zhuǎn)入反應(yīng)釜中，與反應(yīng)釜中溶液充分混勻，于13Γ140 反應(yīng)約3小時(shí)；反應(yīng)結(jié)束后，自然冷卻至室溫，將所得到的黑色沉淀Fe304/HPEI分散于超純水中、磁分離，再次分散、磁分離，如此重復(fù)五次純水洗滌，以去除過量的反應(yīng)試劑，重新分散于水相中，即得聚乙烯亞胺保護(hù)的四氧化三鐵納米顆粒(I號(hào)Fe3(VHPEI);參考表I ;通過XRD、TG、FTIR、TEM、Zeta 測試方法表征 I 號(hào) Fe304/HPEI 材料，XRD 結(jié)果顯示了 I號(hào)Fe3CVHPEI納米顆粒的晶體結(jié)構(gòu)沒有改變，產(chǎn)物為四氧化三鐵。另外，根據(jù)Debye-Scherrer 公式(D=k λ / β cos θ，λ =0. 15406]1111),取最大峰處(311)計(jì)算得到 I 號(hào)Fe304/HPEI尺寸11. 5nm (參考表I和附圖I);跟純氧化鐵比較，I號(hào)Fe304/HPEI中HPEI的上載率為9. 69%，由此表明I號(hào)Fe304/HPEI的HPEI成功地修飾上去(參考附圖2)。并進(jìn)一步通過FTIR譜圖表征I號(hào)Fe304/HPEI及純Fe3O4樣品，對(duì)于I號(hào)Fe304/HPEI納米顆粒來說，2930和2850cm-1為C-H的伸縮振動(dòng)，1126cm-1為C-N鍵伸縮振動(dòng)。此外，3450和1630cm-1處的吸收峰則歸因于-NH2和樣品中的殘余水。和純Fe3O4納米顆粒相比，由于-NH2的存在，I號(hào)Fe304/HPEI在3450和1630CHT1處吸收峰面積較大，定性地表明HPEI成功地修飾上去(參考附圖4a和4e)。TEM結(jié)果顯示Fe304/HPEI的形貌為球形或準(zhǔn)球形，通過對(duì)I號(hào)Fe3O4/HPEI納米顆粒隨機(jī)測量200-300個(gè)納米顆粒的直徑，計(jì)算得到I號(hào)Fe304/HPEI的平均直徑為11. 53Hnm，尺寸結(jié)果與XRD結(jié)果相一致，氧化鐵外圍有層大分子透明物質(zhì)包裹也進(jìn)一步表明HPEI成功地修飾在氧化鐵表面(參考附圖5a和表I)。Zeta測試結(jié)果顯示I號(hào)Fe3O4/HPEI帶正電(38. 07mV)，水動(dòng)力學(xué)直徑約為310. 4nm (參考附表3)。這些結(jié)果都表明HPEI均勻地修飾在Fe3O4納米顆粒表面上。實(shí)施例2(I)將0.252g FeCl2 · 4H20加入燒杯中，再加入12. 75mL的超純水(電阻率大于18. 2ΜΩ. cm)中，在不斷攪拌中，加入I. 25mL NH3 · H2O,將上述混合液在空氣中連續(xù)攪拌10分鐘，從而保證二價(jià)鐵充分被氧化，接著將反應(yīng)物轉(zhuǎn)移到反應(yīng)釜中。將0.05153g HPEI·于5mL水溶液中，超聲溶解后，用移液槍將其轉(zhuǎn)入反應(yīng)釜中，與反應(yīng)釜中溶液充分混勻，于13Γ140 反應(yīng)約3小時(shí)；參考表I ;反應(yīng)結(jié)束后，自然冷卻至室溫，將所得到的黑色沉淀Fe304/HPEI分散于超純水中、磁分離，再次分散、磁分離，如此重復(fù)五次純水洗滌，以去除過量的反應(yīng)試劑，重新分散于水相中。即得聚乙烯亞胺包裹的四氧化三鐵納米顆粒2號(hào)Fe3O4/HPEI ;參考附表I ；通過XRD、TG、FTIR、TEM測試方法表征材料2號(hào)Fe304/HPEI，XRD結(jié)果顯示了 HPEI修飾的2號(hào)Fe3CVHPEI納米顆粒的晶體結(jié)構(gòu)沒有改變，產(chǎn)物為四氧化三鐵。另外，根據(jù)Debye-Scherrer 公式(D=k λ / β cos θ , λ =0. 15406nm),取最大峰處(311)計(jì)算得到 2 號(hào)Fe304/HPEI尺寸17. 5nm (參考表I和附圖I);跟純氧化鐵比較，2號(hào)Fe304/HPEI中HPEI的上載率為8. 13%，由此表明2號(hào)Fe304/HPEI的HPEI成功地修飾上去(參考附圖2)。并進(jìn)一步通過FTIR譜圖表征2號(hào)Fe304/HPEI及純Fe3O4樣品，對(duì)于2號(hào)Fe304/HPEI納米顆粒來說，2930和2850CHT1為C-H的伸縮振動(dòng)，1126cm-1為C-N鍵伸縮振動(dòng)。此外，3450和1630CHT1處的吸收峰則歸因于-NH2和樣品中的殘余水。和純Fe3O4納米顆粒相比，由于-NH2的存在，2號(hào)Fe304/HPEI在3450和1630CHT1處吸收峰面積較大，定性地表明HPEI成功地修飾上去(參考附圖4b和4e)。TEM結(jié)果顯示Fe304/HPEI的形貌為球形或準(zhǔn)球形，外圍通過對(duì)2號(hào)Fe3O4/HPEI納米顆粒隨機(jī)測量200-300個(gè)納米顆粒的直徑，計(jì)算得到2號(hào)Fe304/HPEI的平均直徑為20. 24Hnm，氧化鐵外圍有層大分子透明物質(zhì)包裹也進(jìn)一步表明HPEI成功地包裹在氧化鐵表面(參考附圖5b和表I)。這些結(jié)果都表明HPEI均勻地修飾在Fe3O4納米顆粒表面上。實(shí)施例3(I)將0.25294g FeCl2 · 4H20加入燒杯中，在加入12. 75mL的超純水(電阻率大于18. 2ΜΩ. cm)中，在不斷攪拌中，加入I. 25mLNH3 · H2O,將上述混合液在空氣中連續(xù)攪拌10分鐘，從而保證二價(jià)鐵充分被氧化，接著將反應(yīng)物轉(zhuǎn)移到反應(yīng)釜中。將O. 1037g HPEI溶于5mL水溶液中，超聲溶解后，用移液槍將其轉(zhuǎn)入反應(yīng)釜中，與反應(yīng)釜中溶液充分混勻，于134 140°C反應(yīng)約3小時(shí)；參考表I ；(2)反應(yīng)結(jié)束后，自然冷卻至室溫，將所得到的黑色沉淀Fe304/HPEI分散于超純水中、磁分離，再次分散、磁分離，如此重復(fù)五次純水洗滌，以去除過量的反應(yīng)試劑，重新分散于水相中。即得聚乙烯亞胺包裹的四氧化三鐵納米顆粒3號(hào)Fe304/HPEI ;參考附表I ;通過XRD、TG、FTIR、TEM、Zeta電勢等測試方法表征材料3號(hào)Fe304/HPEI，XRD結(jié)果顯示了 HPEI修飾的3號(hào)Fe304/HPEI納米顆粒的晶體結(jié)構(gòu)沒有改變，產(chǎn)物為四氧化三鐵。另夕卜，根據(jù) Debye-Scherrer 公式(D=k λ / β cos θ , λ =0. 15406nm),取最大峰處(311)計(jì)算得到3號(hào)Fe304/HPEI尺寸18. 3nm(參考表I和附圖I);跟純氧化鐵比較，3號(hào)Fe304/HPEI中HPEI的上載率為7. 34%，由此表明3號(hào)Fe304/HPEI的HPEI成功地修飾上去(參考附圖2)。并進(jìn)一步通過FTIR譜圖表征3號(hào)Fe304/HPEI及純Fe3O4樣品，對(duì)于3號(hào)Fe304/HPEI納米顆粒來說，2930和2850cm-1為C-H的伸縮振動(dòng)，1126cm_1為C-N鍵伸縮振動(dòng)。此外，3450和1630cm-1處的吸收峰則歸因于-NH2和樣品中的殘余水。和純Fe3O4納米顆粒相比，由于-NH2的存在，3號(hào)Fe304/HPEI在3450和1630CHT1處吸收峰面積較大，定性地表明HPEI成功地修飾上去(參考附圖4c和4e)。TEM結(jié)果顯示Fe304/HPEI的形貌為球形或準(zhǔn)球形，外圍通過對(duì)3號(hào)Fe304/HPEI納米顆粒隨機(jī)測量200-300個(gè)納米顆粒的直徑，計(jì)算得到3號(hào)Fe304/HPEI的平均直徑為16. 75Hnm，尺寸結(jié)果與XRD結(jié)果相一致，氧化鐵外圍有層大分子透明物質(zhì)包裹 也進(jìn)一步表明HPEI成功地包裹在氧化鐵表面(參考附圖5c和表I)。Zeta測試結(jié)果顯示3號(hào)Fe304/HPEI帶正電(39. 2mV)，水動(dòng)力學(xué)直徑約為116. 3nm。這些結(jié)果都表明HPEI均勻地修飾在Fe3O4納米顆粒表面上。實(shí)施例4(I)將0.25278g FeCl2 · 4H20加入燒杯中，在加入12. 75mL的超純水(電阻率大于18. 2ΜΩ. cm)中，在不斷攪拌中，加入I. 25mLNH3 · H2O,將上述混合液在空氣中連續(xù)攪拌10分鐘，從而保證二價(jià)鐵充分被氧化，接著將反應(yīng)物轉(zhuǎn)移到反應(yīng)釜中。將O. 21512g HPEI溶于5mL水溶液中，超聲溶解后，用移液槍將其轉(zhuǎn)入反應(yīng)釜中，與反應(yīng)釜中溶液充分混勻，于134 140°C反應(yīng)約3小時(shí)；參考表I ；(2)反應(yīng)結(jié)束后，自然冷卻至室溫，將所得到的黑色沉淀Fe304/HPEI分散于超純水中、磁分離，再次分散、磁分離，如此重復(fù)五次純水洗滌，以去除過量的反應(yīng)試劑，重新分散于水相中。即得聚乙烯亞胺包裹的四氧化三鐵納米顆粒4號(hào)Fe304/HPEI ;參考表I ;通過XRD、TG、FTIR、TEM等測試方法表征材料4號(hào)Fe304/HPEI，XRD結(jié)果顯示了HPEI修飾的4號(hào)Fe304/HPEI納米顆粒的晶體結(jié)構(gòu)沒有改變，產(chǎn)物為四氧化三鐵。另外，根據(jù)Debye-Scherrer 公式(D=k λ / β cos θ , λ =0. 15406nm),取最大峰處(311)計(jì)算得到 4 號(hào)Fe304/HPEI尺寸18. 9nm (參考表I和附圖I);跟純氧化鐵比較，4號(hào)Fe304/HPEI中HPEI的上載率為8. 31%，由此表明4號(hào)Fe304/HPEI的HPEI成功地修飾上去(參考附圖2)。并進(jìn)一步通過FTIR譜圖表征4號(hào)Fe304/HPEI及純Fe3O4樣品，對(duì)于4號(hào)Fe304/HPEI納米顆粒來說，2930和2850CHT1為C-H的伸縮振動(dòng)，1126cm-1為C-N鍵伸縮振動(dòng)。此外，3450和1630CHT1處的吸收峰則歸因于-NH2和樣品中的殘余水。和純Fe3O4納米顆粒相比，由于-NH2的存在，4號(hào)Fe304/HPEI在3450和1630CHT1處吸收峰面積較大，定性地表明HPEI成功地修飾上去(參考附圖4d和4e)。TEM結(jié)果顯示4號(hào)Fe304/HPEI的形貌為球形或準(zhǔn)球形，與1_3號(hào)Fe3O4/HPEI比較，4號(hào)Fe304/HPEI晶體結(jié)構(gòu)更加規(guī)整，均一。并通過對(duì)4號(hào)Fe304/HPEI納米顆粒隨機(jī)測量200-300個(gè)納米顆粒的直徑，計(jì)算得到4號(hào)Fe304/HPEI的平均直徑為21. 86Hnm (參考附圖5d和表I)。這些結(jié)果都表明HPEI均勻地修飾在Fe3O4納米顆粒表面上。
表I不同材料配比合成不同尺寸的Fe304/HPEI
權(quán)利要求
1.一種HPEI包裹的氧化鐵磁性納米顆粒的制備方法，包括 (1)將Fe源加入超純水中，再加入NH3-H2O并于空氣中攪拌，再加入O. 02-0. 12g/mL的超支化聚乙烯亞胺HPEI水溶液，于13Γ140 反應(yīng)3小時(shí)；反應(yīng)結(jié)束后，自然冷卻至室溫，將沉淀洗滌磁分離后，即得HPEI包裹的四氧化三鐵納米顆粒Fe304/HPEI ； (2)Fe304/HPEI與甲氧基聚乙二醇羧酸進(jìn)行PEG化反應(yīng)將甲氧基聚乙二醇羧酸和I- (3- 二甲氨基丙基)-3-乙基-碳二亞胺鹽酸鹽分別溶解于3-6mL DMSO中，攪拌活化3h后，再加入步驟(I)制備的Fe304/HPEI，振蕩，再用水磁分離洗滌，再分散入水或PBS中，得到PEG化的Fe304/HPEI. PEG納米顆粒； 或Fe304/HPEI與乙酸酐進(jìn)行乙?；磻?yīng)將步驟(I)制備的Fe304/HPEI納米顆粒均勻分散在水中，與三乙胺充分混合后，逐滴加入乙酸酐，攪拌反應(yīng)2Γ48小時(shí)，用水磁分離洗滌，制得乙?；腇e304/HPEI. Ac納米顆粒； 或Fe304/HPEI與琥珀酰酐進(jìn)行羧基化反應(yīng)將步驟(I)制備的Fe304/HPEI納米顆粒均勻分散在DMSO中，逐滴加入含琥珀酸酐的DMSO溶液，攪拌反應(yīng)24 48小時(shí)，用水磁分離洗滌，制得羧基化的表面為負(fù)電荷的Fe304/HPEI. SAH納米顆粒。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種HPEI包裹的氧化鐵磁性納米顆粒的制備方法，其特征在于所述步驟(I)中的Fe源為FeCl2 · 4H20。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種HPEI包裹的氧化鐵磁性納米顆粒的制備方法，其特征在于所述步驟(I)中的Fe源、超純水、NH3 · H2O的配比為lg: 6_51mL: 5mL。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種HPEI包裹的氧化鐵磁性納米顆粒的制備方法，其特征在于所述步驟(I)中的Fe源與超支化聚乙烯亞胺HPEI質(zhì)量比為1_5:1。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種HPEI包裹的氧化鐵磁性納米顆粒的制備方法，其特征在于所述步驟(I)中的NH3 · H2O質(zhì)量百分比濃度為25-28%。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種HPEI包裹的氧化鐵磁性納米顆粒的制備方法，其特征在于所述步驟(I)中的超支化聚乙烯亞胺HPEI的分子量Mw=25000。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種HPEI包裹的氧化鐵磁性納米顆粒的制備方法，其特征在于所述步驟(2)中的甲氧基聚乙二醇羧酸的分子量為2000。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種HPEI包裹的氧化鐵磁性納米顆粒的制備方法，其特征在于所述步驟(2)中的甲氧基聚乙二醇羧酸與包裹在四氧化三鐵磁性納米顆粒表面的氨基的摩爾比為1:5-10。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種HPEI包裹的氧化鐵磁性納米顆粒的制備方法，其特征在于所述步驟(2)中的乙酸酐或琥珀酸酐與Fe304/PEI中的-NH2的摩爾比為5-10:1。
10.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種HPEI包裹的氧化鐵磁性納米顆粒的制備方法，其特征在于所述步驟(2)中的三乙胺、乙酸酐與Fe304/PEI中的-NH2摩爾比為5:5:1。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種HPEI包裹的四氧化三鐵磁性納米顆粒的制備方法，包括將Fe源加入超純水中，再加入NH3·H2O并于空氣中攪拌，再加入HPEI，鐵源與HPEI質(zhì)量比為1-5:1，于134～140℃反應(yīng)3小時(shí)；冷卻，將沉淀洗滌磁分離后，即得HPEI包裹的四氧化三鐵納米顆粒Fe3O4/HPEI；然后對(duì)Fe3O4/PEI納米顆粒進(jìn)行不同的表面修飾，如聚乙二醇(PEG)化、乙?；汪然?，增加其生物相容性用于MRI成像診斷。本發(fā)明工藝簡單，反應(yīng)條件溫和，易于操作分離；制備的氧化鐵磁性納米顆粒具有良好的生物相容性和T2弛豫效應(yīng)，在MRI成像診斷領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)A61K49/12GK102911373SQ20121027762
公開日2013年2月6日 申請(qǐng)日期2012年8月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月6日
發(fā)明者史向陽, 蔡紅東, 沈明武, 崔君, 張貴祥, 李康安, 鄭林豐 申請(qǐng)人:東華大學(xué), 上海市第一人民醫(yī)院