專利名稱：人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在制備治療強直性脊柱炎藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在制備治療強直性脊柱炎藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
強直性脊柱炎(ankylosing spondylitis, AS)是一種常見的自身免疫性疾病,主要累及中軸關(guān)節(jié)及肌腱附著點，以炎性背痛和不對稱外周關(guān)節(jié)炎為主要癥狀，好發(fā)于青年，大多數(shù)23 30歲發(fā)病，男女比例約為2 :1。來自歐洲的報道稱AS患病率為0. 15%-1.8%，我國對12個省、市的120，451漢族人的流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)顯示AS的患病率為0. 2%-0. 54%。AS主要病理特征為自身免疫性炎癥和病理性成骨，屬高致殘性疾病，隨著疾病的發(fā)展可導(dǎo)致嚴(yán)重的功能障礙，給患者帶來了沉重的心理和經(jīng)濟負(fù)擔(dān)，但至今仍無治愈性治療手段。現(xiàn) 有的治療手段主要包括I.癥狀緩解藥物I. I非甾體抗炎藥(NSAIDs)NSAIDs通過抑制環(huán)氧化酶(COX)活性以減少花生四烯酸代謝成為前列腺素，從而控制炎癥和減輕關(guān)節(jié)腫痛。雖然NSAID消腫止痛起效快，是傳統(tǒng)治療AS的一線藥物，但是個體差異較大，并且停藥后癥狀易反跳，長期使用胃腸道反應(yīng)較重。更為重要的是NSAIDs僅能緩解癥狀，并不能減緩患者病理性成骨，改變疾病進程。I. 2糖皮質(zhì)激素(GC)其作用機制為抑制細(xì)胞及體液免疫，能迅速有效地減輕炎癥。本藥應(yīng)用于癥狀明顯且不能被NSAID藥物控制的患者，但其副作用較NSAID更為嚴(yán)重，長期應(yīng)用可干擾下丘腦一垂體一腎上腺軸，使患者出現(xiàn)免疫力低下、向心性肥胖，以及增加患者心血管風(fēng)險。2.改善病情抗風(fēng)濕藥物(DMARD)2. I 甲氨喋呤(MTX):本品通過競爭性抑制二氫葉酸還原酶，使二氫葉酸不能被還原成活性的四氫葉酸，導(dǎo)致DNA合成受阻，抑制腫瘤壞死因子(TNF-a)、白介素I(IL-I)等細(xì)胞因子的表達，發(fā)揮抗炎作用。但該藥起效緩慢(4飛周起效)，用藥至少維持半年，同時該藥可造成葉酸缺乏，從而產(chǎn)生骨髓移植以及口腔潰瘍等副作用。2. 2柳氮磺胺吡啶(SASP)SASP為5-氨基水楊酸和磺胺吡啶通過偶氮鍵連結(jié)的酸性化合物，該藥抗炎作用好，可減緩關(guān)節(jié)破壞的進程，并可降低血清IgA水平。但兩項大規(guī)模多中心臨床研究證實除非AS患者伴有嚴(yán)重的外周關(guān)節(jié)癥狀，否則SASP并不能改善患者情況，同時SASP還會造成惡心、嘔吐、頭痛、皮疹、造血功能障礙降低、肝腎功能異常等。3生物制劑TNF- a拮抗劑的問世被認(rèn)為是近年來AS治療最重要的進展，TNF- a拮抗劑通過中和TNF，抑制其與TNF受體結(jié)合，從而實現(xiàn)其抗炎作用?，F(xiàn)階段主要應(yīng)用的TNF-a拮抗劑主要有2種依那西普和英夫利昔單抗。但TNF-a拮抗劑價格高昂，同時其療效個體差異較大。而且可造成感染，引發(fā)視神經(jīng)炎、多發(fā)性硬化等神經(jīng)系統(tǒng)病變，并加重充血性心力衰竭等。相關(guān)研究表明TNF-a拮抗劑并不能減緩AS患者病理性成骨過程。但它們均為非治愈性藥物，且可造成胃腸道反映、感染，甚至骨髓抑制，肝腎功能異常等嚴(yán)重副作用。正因為現(xiàn)存治療方法存在以上諸多不足。因此找到一種安全、有效且可改變疾病進程的治療方法顯得尤為重要。1976年Friedenstein等首次描述骨髓中存在間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stemcells，MSC)并證實其對造血干細(xì)胞的增殖和分化具有支持作用。MSC主要存在于全身的結(jié)締組織中，以骨髓的含量最豐富，其具有向中胚層多種組織如骨組織、軟骨組織、脂肪組織、肌肉組織甚至神經(jīng)外胚層的神經(jīng)組織等分化的潛能。目前尚未篩選到MSC特有的標(biāo)記分子，但一致的觀點認(rèn)為SH2、SH3、⑶29、⑶44、⑶71、⑶90、⑶102等呈陽性，而⑶14、⑶34和⑶45等造血譜系分子表達陰性。由于MSC不·表達主要組織相容性復(fù)合體(MHC) II分子、⑶40、⑶80、⑶86等共刺激分子，不表達或極低水平表達MHC I，MSC不易被宿主T細(xì)胞識別，并能逃脫宿主免疫系統(tǒng)的排斥，因此認(rèn)為MSC具有低免疫原性，并將其廣泛應(yīng)用于心肌病、肝臟疾病及神經(jīng)系統(tǒng)疾病中。Strauer等選擇18例陳舊性心肌梗死患者，病程5個月 8. 5年，經(jīng)冠狀動脈注射自體MSC(間充質(zhì)干細(xì)胞)，3個月后復(fù)查時發(fā)現(xiàn)梗死區(qū)面積減少30%，左心室射血分?jǐn)?shù)升高15%，梗死壁運動速率升高57%，而對照組的以上三個指標(biāo)與治療前相比無明顯變化。Moham adnejad等利用MSC治療4例晚期肝硬化患者，患者平均年齡47歲，且都具有慢性肝衰竭，門脈高壓癥狀，彩超顯示患者肝硬化，血清白蛋白、膽紅素明顯異常，晚期肝病模型(model for end stage liverdisease, MELD)評分大于16。抽取患者自體骨髓，并培養(yǎng)至細(xì)胞量為10. 2X IO6 6. 0X IO6后，用20ml生理鹽水混懸細(xì)胞，經(jīng)肘靜脈緩慢注射。隨訪I年發(fā)現(xiàn)所有患者均存活，且所有患者均未出現(xiàn)急性腎衰竭、肝臟失代償加重及肝臟腫塊等并發(fā)癥。其中3例患者的肝功能明顯改善，MELD評分下降，并以術(shù)后6個月時效果最顯著。Mazzini等治療一組肌萎縮側(cè)索硬化患者，取骨髓培養(yǎng)MSC，溶于2ml自體腦脊液后注射入脊髓，隨訪3年，無死亡、腦脊髓的容積、結(jié)構(gòu)改變和異常細(xì)胞增殖現(xiàn)象發(fā)生。于此同時越來越多的證據(jù)表明MSCs具有強大的免疫調(diào)節(jié)及抑制炎癥反應(yīng)的能力，早在2002年人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)MSCs可通過抑制T細(xì)胞的增殖發(fā)揮其免疫抑制作用，近期的研究已證明MSCs還可通過調(diào)節(jié)B淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞來發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)作用，其免疫調(diào)節(jié)及炎癥抑制功能的發(fā)揮有賴于其分泌的各種因子和/或細(xì)胞間接觸。MSCs被廣泛用于輸注治療自身免疫相關(guān)疾病，國內(nèi)外眾多科研院所不僅證明了 MSCs輸注的安全性，同時證明了其對自身免疫性疾病的可靠療效。2005年Garcia-Olmod等對5例合并瘺管的克羅恩病(Cronh disease)患者進行了自體MSC治療的I期臨床試驗，除I例患者由于MSC體外培養(yǎng)受到細(xì)菌污染而退出試驗，其余4例共8處瘺管接受了自體MSC瘺管局部注射，隨訪12 30個月(平均22個月)后，6處瘺管完全閉合，另2處部分閉合。Le Blanc K等人在歐洲進行的一項多中心的II期臨床試驗證明對55例對激素耐藥的急性GVHD患者使用了MSC,盡管使用的MSC來源不同，包括HLA全相合、半相合或HLA完全不相合的第三方供者，而且有的患者接受了多名供者的MSC，但經(jīng)治療后30例患者獲得了完全反應(yīng)，2年后，獲得完全反應(yīng)的患者中有53%仍存活，而對MSC治療無反應(yīng)的2年生存率僅有16%，結(jié)果還顯示，MSC供者的不同來源并不影響治療結(jié)果。同樣，強直性脊柱炎AS患者也存在著免疫紊亂的情況Yang等人的實驗證明，與正常人相比，AS患者體內(nèi)的IL-23及IL-17水平明顯上升，而這可能是HLA-B27陽性等遺傳因素及各種環(huán)境因素綜合作用產(chǎn)生。Wendling D等人也發(fā)現(xiàn)IL-17在RA患者和AS患者的關(guān)節(jié)滑液中有著較高的表達。而且在AS和RA患者外周血的研究中也發(fā)現(xiàn)了 Thl7細(xì)胞的增多。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在制備治療強直性脊柱炎藥物中的應(yīng) 用。本發(fā)明人在體外實驗發(fā)現(xiàn)強直性脊柱炎AS患者的外周血及壞死股骨頭局部IL-17和IL-23等炎性因子的含量明顯高于正常人；同時還觀察到AS患者外周血Thl7細(xì)胞增多，Treg細(xì)胞降低，Thl7/Treg比例升高，全身處于炎性狀態(tài)。另外經(jīng)實驗證實雖然AS患者MSC在增殖、分化及遷移能力等方面與正常人MSC沒有任何差異，但是AS患者MSC存在明顯的免疫調(diào)節(jié)能力異常，表現(xiàn)為混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(mixed lymphocyte reaction, MLR)中AS患者MSC較正常人MSC抑制淋巴細(xì)胞增殖的能力明顯下降。因此，經(jīng)體內(nèi)試驗和體外試驗研究，AS患者體內(nèi)確實存在免疫紊亂，并且患者自身體內(nèi)MSC也發(fā)生了免疫調(diào)節(jié)的異常，導(dǎo)致AS患者體內(nèi)免疫紊亂不能得到干預(yù)和糾正，體內(nèi)炎性情況得以持續(xù)和加劇，反過來又進一步惡化和加重病情。本發(fā)明通過對AS患者靜脈輸注健康人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞BMSCs，患者的治療效果十分明顯，病人病情改善情況令人滿意絕大多數(shù)AS患者全身炎性情況明顯降低、病變關(guān)節(jié)疼痛程度明顯減弱、個人活動范圍和強度明顯增強；部分原先服藥的AS患者在接受細(xì)胞治療后停藥數(shù)月病情仍不復(fù)發(fā)；少數(shù)對NSAIDs和TNF拮抗劑(如益賽普)等無效的AS患者經(jīng)過輸注正常人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞BMSCs治療后臨床癥狀改善情況顯著。另外，靜脈輸注正常人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞BMSCs治療AS患者起效快、持續(xù)時間久病人在接受細(xì)胞輸注I個月后治療效果十分明顯，相當(dāng)長時間可持續(xù)發(fā)揮治療作用。臨床試驗也證實靜脈輸注正常人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞BMSCs治療AS患者具有安全有效、無任何不良副作用的特點目前為止尚未發(fā)現(xiàn)任何一例接受靜脈輸入健康人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞BMSCs治療的AS病人發(fā)生排斥反應(yīng)、過敏反應(yīng)、休克甚至出現(xiàn)死亡。由此可見，人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞BMSCs能應(yīng)用在制備治療強直性脊柱炎藥物中。本發(fā)明的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞BMSCs屬于現(xiàn)有技術(shù)，可通過現(xiàn)有技術(shù)的方法得到人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞BMSCs。本發(fā)明針對AS患者MSC免疫調(diào)節(jié)能力下降，不能抑制Thl7和上調(diào)Treg，使Thl7/Treg比例失平衡導(dǎo)致全身處于炎性狀態(tài)，同時AS患者MSC成骨能力增強，造成AS患者病理性成骨，而這都是造成強直性脊柱炎的潛在病因。基于以上兩點本發(fā)明通過對AS患者靜脈輸注健康人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞BMSCs，調(diào)節(jié)紊亂的免疫功能，并通過抑制MSC的病理性成骨，減緩或改變疾病進程?；颊咝Ч置黠@，病人病情改善情況令人滿意，可幫助患者減少甚至停用NSAID等藥物，并且安全有效、無任何不良副作用。人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞BMSCs來源廣，治療費用較為合理。因此將人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞BMSCs應(yīng)用在制備治療強直性脊柱炎藥物中具有巨大的社會和經(jīng)濟效益。
具體實施例方式以下實施例是對本發(fā)明的進一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。實施例I :一、人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞BMSCs的制備人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞BMSCs取自2(T30歲的健康志愿者，行髂后上棘骨髓穿刺，每次采集20ml。根據(jù)梯度離心原理，在445g、20°C的條件下采用Ficoll離 心30min，分離骨髓中的有核細(xì)胞，通過對人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞BMSCs在培養(yǎng)皿的附壁特性進行篩選、培養(yǎng)及純化，具體步驟為培養(yǎng)液為低糖型DMEM培養(yǎng)基，含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清，以及2U/L青霉素、鏈霉素。在37°C，5%C02條件下培養(yǎng)48h后，更換培養(yǎng)液并去除懸浮細(xì)胞，并在以后每3^4天進行一次相似操作。當(dāng)細(xì)胞融合度到80%時進行細(xì)胞傳代用PBS對上述細(xì)胞洗滌，之后使用胰酶消化，當(dāng)貼壁細(xì)胞變?yōu)橛坞x時，終止消化，離心后棄去上清，用PBS洗滌一次后，將細(xì)胞接種于培養(yǎng)液中，在37°C，5%C02條件下進行傳代培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞擴增進入第3代時，使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0. 25% 的胰蛋白酶 +lmmol/L EDTA(Sigma, USA)消化后混懸于 L_DMEM+10%FBS(美國 GIBCO公司及中國杭州四季清公司)培養(yǎng)液中，由此得到人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞BMSCs，待用。二、人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞BMSCs輸注對AS患者進行連續(xù)4周的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞BMSCs靜脈注射，每周I次，人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞BMSCs的用量為lX106MSCs/kg (體重)，于IOml生理鹽水中懸混，并由患者肘靜脈緩慢注入。之后根據(jù)患者臨床癥狀和實驗室檢查適當(dāng)調(diào)整治療方案。三、人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞BMSCs輸注治療AS患者療效評價體系I、主觀評價Pain-VAS (疼痛視覺模擬評分)——評估治療前后患者疼痛改善情況；BAS-G (Bath強直性脊柱炎總體評分)——評估治療前后患者病情總體改善情況；BASFI (Bath強直性脊柱炎功能指數(shù)評分)——評估治療前后患者機體功能改善情況；BASDAI (Bath強直性脊柱炎病情活動指數(shù)評分)——評估治療前后患者病情活動程度變化情況；2、臨床指標(biāo)外周血檢測CRP、ESR、TNF- a、IL-17, IL-23、BMP——評價治療前后患者全身炎性狀態(tài)變化情況；流式細(xì)胞術(shù)分析⑶4+T細(xì)胞、⑶8+T細(xì)胞、Thl7細(xì)胞、Treg細(xì)胞、NK細(xì)胞比例——評價治療前后患者淋巴細(xì)胞數(shù)量及亞群比例變化情況；脊柱活動度(包括擴胸度、枕墻距、耳墻距、踝間距、頸椎活動度、腰椎側(cè)彎度、修訂版Schober檢查)一評估治療前后患者脊柱活動度改善情況；3、影像學(xué)檢查全脊柱及雙側(cè)骶髂關(guān)節(jié)正側(cè)位X片——影像學(xué)評估治療前后患者中軸關(guān)節(jié)病情改善情況；全脊柱及雙側(cè)骶髂關(guān)節(jié)MRI——影像學(xué)評估治療前后患者中軸關(guān)節(jié)病情改善情況；ASspiMRI評估(強直性脊柱炎MRI評估)——評價治療前后患者影像學(xué)上病情改
善情況。四、應(yīng)用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞BMSCs治療強直性脊柱炎納入標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)New York Diagnostic Criteria確診強直性脊柱炎。排除標(biāo)準(zhǔn)1、感染或有感染高風(fēng)險的；2、腫瘤及腫瘤前期；3、嚴(yán)重伴隨癥狀，如心
腦血管疾病、肝腎及血液疾?。?、孕婦及哺乳期婦女。治療方案連續(xù)4周給予患者靜脈輸注I X 106/kg (體重)的BMSCs。檢測指標(biāo)完成4周的BMSCs注射后，檢測患者的CRP、ESR、ASDAS-CRP、BASDAI、BASFI及血、大便、尿常規(guī)等。I、應(yīng)用人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞BMSCs治療15個TNF a拮抗劑抵抗的強直性脊柱炎患者對15個TNF a拮抗劑抵抗的強直性脊柱炎患者分別第0天、第I周、第2周、第3周給予患者肘靜脈輸注lX106BMSCs/kg (體重)的上述人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞BMSCs后?；颊逜SDAS-CRP評分從治療前的4. 0±0. 5降到2. 4±0. 5。而BASFI評分也從5. 3±1. I降到3. 7±0. 9，關(guān)節(jié)腫脹數(shù)從治療前的21個降至IJ 13個。ASAS20達到100%，ASAS40達到60%(見表I)。對輸注人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞BMSCs的患者進行了為期8周的隨訪，在隨訪中除了個別患者有注射點疼痛的癥狀外，無其他不適。同時包括血常規(guī)、尿常規(guī)、大便常規(guī)、肝功能在內(nèi)的相關(guān)實驗室和影像學(xué)檢查也未發(fā)現(xiàn)明顯異常。由此說明，AS患者靜脈注射人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞BMSCs，其治療效果十分明顯，病人病情改善情況令人滿意，可幫助患者減少甚至停用NSAID等藥物，并且安全有效、無任何不良副作用。表I :MSC治療后患者各項指標(biāo)改變
ASDAS-CRP~~BASDAI ~BASFI~ESR(mm/h) CRP mg/L
基礎(chǔ)值4. 0 + 0. 53. 5 + 1. 35. 3+1. I52. 6 + 24. 0 50. 4 + 24. I
~Iw3. 7 + 0. 53.0 + 1.24.9+1.47.8 + 22.4 46. 5 + 23.0
2w3. 4 + 0. 52. 6 + 1. I4. 4+1. I42. 1 + 22. I 40. 9 + 21. 7
3w2. 9 + 0. 52. 0+1. I4. 0+1. 037. 3+19. 3 31. 1 + 19. 7
4w2. 4 + 0. 5I. 4+1. 03. 7 + 0. 933. 1 + 17. 8 21. 9+18. 2
8w2. 6 + 0. 6I. 7+1. 03. 8 + 0. 931. 5+17. 4 26. 1 + 19. 02、患者麥XX，男，32歲，工人。因“腰背部僵硬雙膝腫脹7月余，加重伴乏力3天”來我院就診。患者7月前無明顯誘因出現(xiàn)腰背部僵硬，晨起明顯，活動后好轉(zhuǎn)，每次持續(xù)約45min。同時自覺雙膝腫脹，活動受限。查體患者脊柱各向活動受限，雙側(cè)膝關(guān)節(jié)均一腫大，屈曲困難。實驗室檢查ESR57mm/h、CRP54mg/L。X線顯示雙側(cè)骶髂關(guān)節(jié)間隙模糊，骨橋生成，腰椎小關(guān)節(jié)模糊。ASDAS-CRP評分5. 1，BASDAI4. O，BASFI5. 9。連續(xù)3周給予患者 輸注I X IOVkg (體重)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞BMSCs后，患者腰背部僵硬及雙膝腫脹情況明顯減輕，復(fù)查 ESR35mm/h、CRP29mg/L, ASDAS-CRP 評分 2. 5，BASDAI2. 0，BASFI3. 9。
權(quán)利要求
1.人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在制備治療強直性脊柱炎藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在制備治療強直性脊柱炎藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明針對AS患者MSC免疫調(diào)節(jié)能力下降，不能抑制Th17和上調(diào)Treg，使Th17/Treg比例失平衡導(dǎo)致全身處于炎性狀態(tài)，同時AS患者MSC成骨能力增強，造成AS患者病理性成骨，而這都是造成強直性脊柱炎的潛在病因。本發(fā)明通過對AS患者靜脈輸注健康人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞BMSCs，調(diào)節(jié)紊亂的免疫功能，并通過抑制MSC的病理性成骨，減緩或改變疾病進程?；颊咝Ч置黠@，病人病情改善情況令人滿意，可幫助患者減少甚至停用NSAID等藥物，并且安全有效、無任何不良副作用。人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞BMSCs來源廣，治療費用較為合理。因此將人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞BMSCs應(yīng)用在制備治療強直性脊柱炎藥物中具有巨大的社會和經(jīng)濟效益。
文檔編號A61K35/28GK102793721SQ20121025572
公開日2012年11月28日 申請日期2012年7月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月23日
發(fā)明者沈慧勇 申請人:沈慧勇