專利名稱：一種紅景天苷嵌段共聚物脂質(zhì)納米粒制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及紅景天苷嵌段共聚物脂質(zhì)納米粒制劑及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
目前,腫瘤治療是目前世界醫(yī)學(xué)難題之一，治療方法主要有手術(shù)、化療、放療、免疫、生物、中藥等綜合措施。由于腫瘤患者具有病死率高、治愈率低的特點(diǎn)，腫瘤治療成為當(dāng)
前醫(yī)學(xué)研究中最受重視的領(lǐng)域之一。盡管腫瘤生物治療應(yīng)用于臨床試驗(yàn)已有10余多年的時(shí)間，但還存在著不良反應(yīng)較大及臨床療效不夠顯著等主要問(wèn)題。一些腫瘤化療藥物不但具有心血管系統(tǒng)毒性，而且還可引起靜脈炎、惡心嘔吐、腹瀉、黏膜壞死、脫發(fā)、過(guò)敏、骨髓抑制等不良反應(yīng)。紅景天苷(Salidroside)是薔薇目景天科(Crassulaceae)紅景天屬(Rhodiola)
植物的主要有效成分，結(jié)構(gòu)如下
CH2OH
P0PCH2CHjr^ Voh
OH IOH
紅景天苷 Salidroside紅景天苷具有抗腫瘤、抗氧化、抗衰老、抗輻射、抗疲勞等作用。據(jù)研究顯示，紅景天苷具有廣泛的抗腫瘤活性，其對(duì)乳腺癌、肺癌、肝癌、膀胱癌、胃癌、以及血癌、唾液腺腺樣囊性癌等均表現(xiàn)出優(yōu)異的殺傷性能。通過(guò)惡性腫瘤的研究表明，紅景天苷可通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯、細(xì)胞凋亡等機(jī)制抑制Levis肺癌細(xì)胞、HL60白血病細(xì)胞、肝癌細(xì)胞和小鼠移植性肝癌等腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖。然而，臨床應(yīng)用的紅景天苷注射劑存在半衰期短、代謝快、血藥濃度不穩(wěn)定、生物利用度低等缺點(diǎn)；因此，研發(fā)具有緩釋功能的紅景天苷的新型載藥系統(tǒng)對(duì)于推進(jìn)其臨床應(yīng)用具有重要意義。近年來(lái)，各種可控的載藥系統(tǒng)相繼被研發(fā)，它們可以增加藥物的溶解度、降低毒副作用、例如聚合物納米微球、脂質(zhì)體、膠束、乳劑、環(huán)糊精和前體藥物等。其中，脂質(zhì)體和聚合物納米粒的研究最為深入，已經(jīng)得到臨床的認(rèn)可。脂質(zhì)體是將藥物包埋在類脂質(zhì)雙分子層內(nèi)而形成的微型泡囊體，這種微粒具有類細(xì)胞結(jié)構(gòu)，進(jìn)入人體內(nèi)主要被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬而激活機(jī)體的自身免疫功能,并改變被包封藥物的體內(nèi)分布，使藥物主要在肝、脾等處蓄積，從而提高藥物的治療指數(shù)，減少藥物的治療劑量和降低藥物毒副作用。由于脂質(zhì)體的天然類細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)具有細(xì)胞親和性與組織相容性，因此可以提高藥效，但是由于脂質(zhì)體的疏水性，用其包載親水性藥物會(huì)出現(xiàn)包封率低的問(wèn)題，因而大大限制了其在親水性藥物載藥領(lǐng)域的運(yùn)用。目前，粒徑為100納米尺度的可生物降解的聚合物納米粒也已成為學(xué)術(shù)和產(chǎn)業(yè)研究的熱點(diǎn)，顯示出其顯著的療效。嵌段共聚物納米粒是由具有親水性片段和疏水性片段的兩親性嵌段共聚物在水溶液中自發(fā)形成的一種自組裝結(jié)構(gòu)，具有粒徑小、粒度分布窄、載藥范圍廣、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、 體內(nèi)滯留時(shí)間長(zhǎng)、可降解等特點(diǎn)。最常用的就是脂肪族聚酯類poly (d，1-lactic-co-glycolicacid) (PLGA)與聚乙二醇(PEG)形成的衍生物如 PEG-PLGA 和PLGA-PEG-PLGA等。PLGA在體內(nèi)降解成乳酸和羥基乙酸，最終代謝成水和二氧化碳，無(wú)毒性及免疫原性，已被美國(guó)FDA批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床研究。雖然，用PLGA或PLGA衍生物的納米粒包載藥物已有文獻(xiàn)報(bào)道，但是實(shí)際使用中表明，此類納米粒對(duì)水溶性藥物的包封率較低。綜上，研發(fā)適于水溶性藥物尤其是紅景天苷的具有緩釋功能的新型載藥系統(tǒng)成為目前臨場(chǎng)的迫切需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種紅景天苷脂質(zhì)納米粒的新型制劑，引入脂質(zhì)材料在納米粒表面形成脂質(zhì)體包裹，防止納米粒內(nèi)層水溶性藥物泄露，實(shí)現(xiàn)PLGA及其衍生物納米粒對(duì)更多難于包封的水溶性藥物的高效包載。迄今為止，國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)有關(guān)于紅景天苷緩釋脂質(zhì)納米粒制備的報(bào)道。在添加脂質(zhì)成分磷脂和/或膽固醇的前提下，制備PLGA及PLGA衍生嵌段共聚的物脂質(zhì)納米粒。所述脂質(zhì)納米粒兼有脂質(zhì)體和聚合物納米粒的優(yōu)點(diǎn)，不但可以提高納米粒對(duì)水溶性藥物紅景天苷的包封率，且可使紅景天苷在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)緩釋，實(shí)現(xiàn)組織靶向，并能提高紅景天苷與細(xì)胞的親和性，達(dá)到更高的抗癌效果。為了提高紅景天苷的抗癌效果，本發(fā)明的目的之一是提供一種紅景天苷嵌段共聚物脂質(zhì)納米粒。本發(fā)明所述的一種紅景天苷嵌段共聚物脂質(zhì)納米粒，S卩，全文所述的紅景天苷脂質(zhì)納米粒。本發(fā)明所述的一種紅景天苷嵌段共聚物脂質(zhì)納米粒，主要由磷脂和/或膽固醇，以及嵌段聚合物制成。。本發(fā)明所述的嵌段聚合物選自PLGA及其衍生物；例如PEG-PLGA或PLGA-PEG-PLGA
坐寸o本發(fā)明所述的磷脂選自大豆磷脂、卵磷脂、二油?；蚜字?DOPC)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二油酰三甲基銨丙烷(DOTAP)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)。本發(fā)明的目的之一是提供一種紅景天苷嵌段共聚物脂質(zhì)納米粒，基于重量份計(jì)，其包含紅景天苷0. 5 10份，磷脂0. 25 20份，膽固醇0. 25 5份，嵌段聚合物20 100份；優(yōu)選地，包含紅景天苷0. 5 6. 25份，磷脂0. 25 10份，膽固醇0. 25 2份，嵌段聚合物20 80份。本發(fā)明的進(jìn)一步目的，是提供了一種制備紅景天苷嵌段共聚物脂質(zhì)納米粒的方法，包括如下步驟(I)取上述嵌段聚合物、磷脂和膽固醇，溶于適量有機(jī)溶劑溶液中，加入紅景天苷，超聲混勻；(2)探頭超聲，形成油包水初乳(W/0)；(3)再加入3 8倍體積的表面活性劑溶液，探頭超聲，形成復(fù)乳(W/0/W)，在約30 45°C下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)揮去有機(jī)溶劑，即得。作為具體的實(shí)施方案之一，嵌段聚合物采用有機(jī)溶劑溶解，使嵌段聚合物的濃度為 5 100mg/ml ；優(yōu)選地，有機(jī)溶劑選自二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯以及上述三者與丙酮的混合液。進(jìn)一步優(yōu)選地，水相/ 二氯甲烷體積比為1/4 1/10，油相/外水相為1/4 1/10。作為本發(fā)明的具體實(shí)施方案之一，制備本發(fā)明的紅景天苷納米粒采用W/0/W復(fù)乳法制備，常用的表面活性劑為聚乙烯醇(PVA)、泊洛沙姆188 (F68)、維生素E1000聚乙二醇琥珀酸酯(TPGS)?，F(xiàn)有技術(shù)中，雖然存在采用磷脂、膽固醇和嵌段聚合物制備的制劑的技術(shù)方案，例如CN1326525A(10-羥基喜樹堿長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體及其凍干制劑)雖然也用了脂質(zhì)和PEG-PLGA，但其采用薄膜法，該方法最終形成的是一個(gè)表面由PEG-PLGA修飾了的脂質(zhì)體即PLGA潛入脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)中，而PEG暴露在脂質(zhì)體表面。本申請(qǐng)采用的是復(fù)乳法，制成的脂質(zhì)納米粒是有核膜結(jié)構(gòu)形成即內(nèi)核為PEG-PLGA等嵌段聚合物包載紅景天苷形成的納米球，外部被脂質(zhì)體雙層膜包覆(見(jiàn)說(shuō)明書附圖的脂質(zhì)納米粒的結(jié)構(gòu))。本申請(qǐng)的制備工藝、成型原理及最終形成的產(chǎn)品結(jié)構(gòu)與CN1326525A截然不同，因此，此制備工藝才能用于水溶性極高的紅景天苷的高效包載。CN101836961A(復(fù)合載藥微球、鹽酸米諾環(huán)素納米緩釋復(fù)合載藥微球體系及其制備方法)雖然也是形成的由PLGA為核，脂質(zhì)為外殼的結(jié)構(gòu)，但是存在多個(gè)技術(shù)問(wèn)題未解決1)該法首先制得載藥PLGA微球，凍干以后再次復(fù)溶，再采用薄膜分散法在微球外層修飾脂質(zhì)體，該方法不僅制備工藝復(fù)雜，且存在微球凍干及復(fù)溶過(guò)程中的穩(wěn)定性差的問(wèn)題，并且該法所制備的微球粒徑較大，且該方法不適于用來(lái)包載水溶性極高的藥物；而本申請(qǐng)采用復(fù)乳法，一次性制備出脂質(zhì)納米粒，方法簡(jiǎn)便，產(chǎn)物穩(wěn)定，且粒徑較??；2)CN101836961A的終產(chǎn)物微球表面帶正電荷，靜脈注射會(huì)導(dǎo)致血管內(nèi)壁靜電吸附，帶來(lái)過(guò)敏等副作用，甚至?xí)鹦菘说葒?yán)重不良反應(yīng)，而本申請(qǐng)制備的產(chǎn)物不帶正電荷，不存在此種安全隱患，具有更好的臨床應(yīng)用前景。CN. 1733298A(血紅蛋白為基礎(chǔ)的微囊型血液代用品及其制備方法)制備的微囊結(jié)構(gòu)是脂質(zhì)體與PEG-PLGA等聚合物混合作為外殼、大分子量的蛋白和酶作為芯材。盡管該微囊所用載體材料與本申請(qǐng)的相近，但從該微囊的透射照片可見(jiàn)其結(jié)構(gòu)與本申請(qǐng)所制備的脂質(zhì)納米粒的雙層結(jié)構(gòu)截然不同，該微囊的制備工藝不適于高效包載水溶性極高的小分子藥物。本申請(qǐng)制備的脂質(zhì)納米粒是用嵌段共聚物包載藥物形成內(nèi)核，脂質(zhì)作為外殼的雙層結(jié)構(gòu)，內(nèi)核中的PEG主要是提高材料的親水性，增加水溶性藥物與材料的相互作用，脂質(zhì)體包裹以后，可進(jìn)一步防止泄露，從而提高包封率。且CN. 1733298A中的微囊制備工藝較為 復(fù)雜，在復(fù)乳制備以后尚需分散在含有聚乙烯醇或明膠的溶液中，不利于質(zhì)量控制。另外，CN. 1733298A中的微囊采用聚乙烯醇或明膠硬化表面，該種表面不利于與腫瘤細(xì)胞的親和；而本申請(qǐng)中的脂質(zhì)納米粒采用具有天然類細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)為外殼，具有極好的細(xì)胞親和性與組織相容性，易于被腫瘤細(xì)胞內(nèi)化，從而發(fā)揮更高的抗癌效力。本發(fā)明有益.效果I、紅景天苷是中藥提取物，本發(fā)明的上述制備方法可以應(yīng)用于載小分子中藥提取物或水溶性藥物的PLGA嵌段共聚物的制備。2、本發(fā)明制備的載紅景天苷的PLGA嵌段共聚物脂質(zhì)納米粒，表面光滑圓整，無(wú)粘連，粒徑在100 300nm,粒度分布均勻,適合靜脈注射,能有效到達(dá)腫瘤生長(zhǎng)部位。3、使用PLGA嵌段共聚物脂質(zhì)納米粒作為載體材料，包封率較高，可達(dá)到70 90%,使得轉(zhuǎn)載藥物的能力增強(qiáng)，載藥量高。4、緩釋效果好，采用W/0/W復(fù)乳法制備的載紅景天苷的PLGA、PEG-PLGA或PLGA-PEG-PLGA脂質(zhì)納米粒在體外條件下可緩釋I天以上,能夠穩(wěn)定的釋放藥物。
5、該方法制備的PLGA、PEG-PLGA或PLGA-PEG-PLGA嵌段共聚物脂質(zhì)納米粒能緩慢的釋放藥物，同時(shí)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的內(nèi)吞，更有利于紅景天苷發(fā)揮其抗癌作用。


以下，結(jié)合附圖來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方案，其中圖I紅景天苷-PLGA脂質(zhì)納米粒的掃描電鏡圖。 圖2紅景天苷-PEG-PLGA脂質(zhì)納米粒的掃描電鏡圖。圖3紅景天苷-PLGA-PEG-PLGA脂質(zhì)納米粒的掃描電鏡圖。圖4紅景天苷脂質(zhì)納米粒的實(shí)施例和及對(duì)比例樣品的體外釋放曲線。圖5紅景天苷脂質(zhì)納米粒的實(shí)施例和對(duì)比例樣品對(duì)小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞的體外生長(zhǎng)抑制活性。圖6紅景天苷脂質(zhì)納米粒的實(shí)施例和對(duì)比例樣品對(duì)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞的體外生長(zhǎng)抑制活性。圖7紅景天苷脂質(zhì)納米粒的實(shí)施例和對(duì)比例樣品對(duì)小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞的體外生長(zhǎng)抑制活性。圖8紅景天苷脂質(zhì)納米粒的實(shí)施例和對(duì)比例樣品對(duì)人黑色素瘤A375細(xì)胞的體外生長(zhǎng)抑制活性。圖9紅景天苷脂質(zhì)納米粒的實(shí)施例和對(duì)比例樣品對(duì)人肺癌A549細(xì)胞的體外生長(zhǎng)抑制活性。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明，但絕不是對(duì)本發(fā)明范圍的限制。下面參照實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)闡述本發(fā)明，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明并不限于這些實(shí)施例以及使用的制備方法。而且，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的描述可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行等同替換、組合、改良或修飾，但這些都將包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。一、紅景天苷脂質(zhì)納米粒的粒徑測(cè)定采用激光散射粒徑分析儀或透射電子顯微鏡測(cè)定或觀察紅景天苷脂質(zhì)納米粒的粒徑。取紅景天苷脂質(zhì)納米粒膠體溶液用純化水稀釋100倍，于25°C用激光散射粒徑分析儀測(cè)定(Zetsizer Nano ZS90),重復(fù)測(cè)定三次,記錄粒徑均值。將紅景天苷脂質(zhì)納米粒膠體溶液稀釋5倍以后，滴在銅網(wǎng)上，2%磷鎢酸鈉染色后，HITACHI H-600透射電子顯微鏡觀察粒子形態(tài)。二、紅景天苷脂質(zhì)納米粒的包封率測(cè)定采用離心法測(cè)定紅景天苷脂質(zhì)納米粒的包封率。取紅景天苷-PLGA脂質(zhì)納米粒膠體溶液，4°C條件下超速冷凍離心Ih(離心機(jī)轉(zhuǎn)速45000rpm),得納米粒沉淀。取納米粒沉淀，加一定量DMSO消解至澄明，離心，取上清液20 ill注入HPLC，用甲醇-水(25 75, v/v)作為流動(dòng)相，流速為lml/min,柱溫為30°C,檢查波長(zhǎng)為278nm,采用外標(biāo)法計(jì)算紅景天苷的濃度。并按下式計(jì)算包封率包封率(％ )=納米粒沉淀中的紅景天苷量/紅景天苷的投料量X 100%。三、紅景天苷脂質(zhì)納米粒的緩釋特性測(cè)定采用體外釋放試驗(yàn)研究紅景天苷脂質(zhì)納米粒的緩釋特性。依據(jù)中國(guó)藥典，分別配制pH為7. 4的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)，并以此作為游離紅景天苷和紅景天苷脂質(zhì)納米粒的體外釋放試驗(yàn)的介質(zhì)。取紅景天苷游離藥物水溶液或紅景天苷脂質(zhì)納米粒膠體溶液，轉(zhuǎn)入經(jīng)純化水浸泡煮沸處理過(guò)的透析袋中，將透析袋兩端扎緊，懸置于盛有IOml不同pH PBS的具塞錐形瓶中，保持漏槽狀態(tài)，37土1°C恒速振蕩(70r/min)。定時(shí)取樣0. 5ml，同時(shí)補(bǔ)加相同體積的PBS。HPLC測(cè)定，計(jì)算累積釋藥百分率，繪制紅景天苷的體外釋藥曲線。四、紅景天苷脂質(zhì)納米粒對(duì)腫瘤細(xì)胞體外生長(zhǎng)抑制活性的測(cè)定通過(guò)體外細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)考察紅景天苷脂質(zhì)納米粒對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的體外生長(zhǎng)抑制活性。于_150°C冰箱取出腫瘤細(xì)胞，37°C水浴迅速解凍，轉(zhuǎn)入離心管中，加RPMI-1640培養(yǎng)液10ml，1500rpm離心洗滌兩次。然后轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶中，加入含青鏈霉素和10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，在37°C，5% C02的孵箱中培養(yǎng)，細(xì)胞密度達(dá)70 80%時(shí)，用0. 25%胰蛋白酶-0. 02% EDTA消化液消化，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，制成適宜濃度的細(xì)胞懸液，取IOOiU接種于96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24h，細(xì)胞貼壁后，分成多個(gè)試驗(yàn)組。加入游離紅景天苷和紅景天苷脂質(zhì)納米粒，每個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。37°C、5% C02培育一定時(shí)間后，每孔加AMTT(5mg/ml)20u I繼續(xù)培養(yǎng)4h，吸棄培養(yǎng)液，加入二甲基亞砜(DMSO) 150 yl，置振蕩器振蕩IOmin后，于酶標(biāo)儀測(cè)定570nm波長(zhǎng)處的吸光值(A)。每株細(xì)胞重復(fù)試驗(yàn)三次。按下式
計(jì)算細(xì)胞抑制率。
權(quán)利要求
1.一種紅景天苷嵌段聚合物脂質(zhì)納米粒的制劑，其特征在于主要由磷脂和/或膽固醇，以及嵌段聚合物制成。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的紅景天苷嵌段聚合物脂質(zhì)納米粒的制劑，其特征在于所述嵌段聚合物選自PLGA及其衍生物，如PEG-PLGA或PLGA-PEG-PLGA等。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的紅景天苷嵌段聚合物脂質(zhì)納米粒的制劑，其特征在于所述磷脂選自大豆磷脂、卵磷脂、二油酰基卵磷脂(DOPC)、DOPE、DOTAP, DSPE。
4.一種紅景天苷嵌段共聚物脂質(zhì)納米粒，其特征在于基于重量份計(jì)，其包含紅景天苷.0.5 10份，磷脂0. 25 20份，膽固醇0. 25 5份，嵌段聚合物20 100份；優(yōu)選地，包含紅景天苷0. 5 6. 25份，磷脂0. 25 10份，膽固醇0. 25 2份，嵌段聚合物20 80份。
5.一種制備紅景天苷嵌段共聚物脂質(zhì)納米粒的方法，其特征在于包括如下步驟 (1)取上述嵌段聚合物、磷脂和膽固醇，溶于適量有機(jī)溶劑溶液中，加入紅景天苷，超聲混勻； (2)探頭超聲，形成油包水初乳(W/0)； (3)再加入3 8倍體積的表面活性劑溶液，探頭超聲，形成復(fù)乳(W/0/W)，在約30 .45°C下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)揮去有機(jī)溶劑，即得。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其特征在于所述有機(jī)溶劑選自二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯以及上述三者與丙酮的混合液。
7.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其特征在于所述表面活性劑為PVA、F68、TPGS。
8.權(quán)利要求書1-7任一項(xiàng)所述的紅景天苷嵌段共聚物納米粒制劑在制備抗腫瘤藥物中的用途，所述腫瘤包括乳腺癌、肺癌、肝癌、膀胱癌、胃癌、以及血癌、唾液腺腺樣囊性癌
9.權(quán)利要求書1-7任一項(xiàng)所述的紅景天苷嵌段共聚物納米粒制劑在制備靜脈注射的紅景天苷的緩釋制劑中的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供一種供靜脈注射用的紅景天苷嵌段聚合物脂質(zhì)納米粒制劑及其制備方法，以及該制劑在制備抗癌藥物中的用途；其包含紅景天苷、嵌段共聚物、脂質(zhì)、表面活性劑等。
文檔編號(hào)A61P35/00GK102697721SQ20121022926
公開日2012年10月3日 申請(qǐng)日期2012年7月4日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月4日
發(fā)明者何黎黎, 宋相容 申請(qǐng)人:西南民族大學(xué)