專利名稱：一種殼聚糖支載阿霉素-有機(jī)熒光染料fret靶向復(fù)合探針的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及化學(xué)及藥物交叉領(lǐng)域，特別是一種殼聚糖支載阿霉素-有機(jī)熒光染料FRET靶向復(fù)合探針。
背景技術(shù)：
癌癥是一類嚴(yán)重危害人類健康的重大疾病，在對(duì)癌癥患者的治療過程中，化學(xué)藥物治療是對(duì)癌癥患者手術(shù)后徹底殺滅體內(nèi)癌細(xì)胞的有效方法。但抗癌藥在抑制或殺滅腫瘤癌細(xì)胞的同時(shí)，對(duì)機(jī)體內(nèi)的某些正常器官細(xì)胞，如骨髓造血細(xì)胞、消化道粘膜上皮細(xì)胞和生殖細(xì)胞等同樣造成嚴(yán)重傷害，并且對(duì)某些組織器官如肝、腎、心、肺等也造成嚴(yán)重?fù)p害，影響到癌癥患者的治愈效果和生活質(zhì)量。同時(shí)，傳統(tǒng)的抗癌藥對(duì)實(shí)體瘤治療療效評(píng)價(jià)方法一般采用治療前后腫瘤最長(zhǎng)徑尺 度變化評(píng)價(jià)疾病的發(fā)展情況。通過胸部X片(適用于肺部)，計(jì)算機(jī)斷層掃描(CT )及核磁共振成像(MRI)，超聲波檢查(適用于體表或淺層，不適合腹腔)，內(nèi)窺鏡及腹腔鏡，腫瘤標(biāo)記，細(xì)胞學(xué)及組織學(xué)檢查等手段實(shí)現(xiàn)。這些方法是腫瘤變化過程中的一種狀態(tài)的靜態(tài)刻畫，難于原位實(shí)時(shí)評(píng)價(jià)抗癌藥對(duì)患者腫瘤變化情況及抗癌藥與癌病灶作用過程的動(dòng)力學(xué)，對(duì)化療藥物與癌病灶的作用程度和藥效評(píng)價(jià)具有一定的滯后性。向腫瘤癌細(xì)胞病灶靶向投遞藥物是有效治療癌癥的有效方法之一，它可克服化學(xué)藥物治療所帶來的副作用。這一系統(tǒng)可將藥物最大限度地運(yùn)送到靶區(qū)，使藥物在靶區(qū)濃集，可超出普通試劑的數(shù)倍乃至數(shù)百倍，直接作用于病變組織、器官和細(xì)胞，延長(zhǎng)藥物與靶部位的作用時(shí)間，治療效果明顯提高；同時(shí)可減少藥物用量，降低了藥物在其他部位的濃度，達(dá)到高效低毒的治療效果。而在眾多實(shí)體瘤治療療效評(píng)價(jià)方法中，熒光探針法較傳統(tǒng)的同位素檢測(cè)法相比，表現(xiàn)出速度快、重復(fù)性好、用量少及無輻射等優(yōu)點(diǎn)，在疾病診斷、抗癌藥分析、抗體免疫分析等方面已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用。與葉酸分子偶聯(lián)的熒光體通過葉酸受體的特異性作用進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，使腫瘤組織明顯區(qū)別于臨近正常組織。與放射成像技術(shù)相比，熒光成像無創(chuàng)傷，也使人體免受粒子輻射。研究如何將腫瘤癌細(xì)胞病灶靶向藥物投遞系統(tǒng)和熒光探針技術(shù)有機(jī)結(jié)合，同時(shí)實(shí)現(xiàn)抗癌藥對(duì)癌病灶的靶向投遞和抗癌藥在機(jī)體內(nèi)的傳輸過程以及與癌細(xì)胞作用的原位信息傳感，對(duì)實(shí)現(xiàn)化療藥與癌細(xì)胞作用的電子輸運(yùn)本質(zhì)規(guī)律的揭示、藥效評(píng)價(jià)、提高化療藥療效并減少患者正常組織損傷均具有重要意義。熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)是一種新型熒光研究方法，由于FRET對(duì)于距離和熒光基團(tuán)的空間取向高度靈敏，可以通過FRET效率的測(cè)量，觀察生物分子間相互作用的改變情況，反應(yīng)兩分子團(tuán)的距離信息。從理論上講，在分子水平上研究任何生物學(xué)機(jī)制都可以通過FRET技術(shù)，關(guān)鍵在于找到合適的熒光探針。阿霉素是治療乳腺癌等癌癥的廣譜化療藥，藥物本身具有一定的突光強(qiáng)度，表現(xiàn)出一定的突光表達(dá)特性，其激發(fā)波長(zhǎng)為490nm,發(fā)射波長(zhǎng)為545nm。但是，由于其熒光量子產(chǎn)率低，熒光強(qiáng)度不高，不具有同時(shí)實(shí)現(xiàn)抗癌藥效和與癌細(xì)胞作用的熒光原位表達(dá)特性。因而，將適當(dāng)波長(zhǎng)的熒光染料與具有熒光特性的阿霉素耦合在葉酸修飾的載體上，利用抗癌藥與熒光染料之間的FRET特性研究，可實(shí)現(xiàn)在阿霉素殺滅癌細(xì)胞的同時(shí)，實(shí)時(shí)熒光表達(dá)癌細(xì)胞作用形態(tài)，實(shí)現(xiàn)阿霉素與腫瘤癌細(xì)胞作用過程及藥物療效原位影像評(píng)價(jià)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的提供殼聚糖支載阿霉素-有機(jī)熒光染料FRET靶向復(fù)合探針，該探針將具有一定波長(zhǎng)的有機(jī)熒光染料與抗癌藥阿霉素相耦合，形成具有熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)特性的復(fù)合結(jié)構(gòu)，在紫外光或可見光量激發(fā)下表達(dá)FRET特性的復(fù)合探針。采用葉酸對(duì)該探針進(jìn)行修飾構(gòu)建成一種靶向作用于腫瘤癌細(xì)胞的阿霉素-有機(jī)熒光染料FRET復(fù)合探針。利用葉酸-受體的介導(dǎo)作用實(shí)現(xiàn)該探針對(duì)腫瘤癌細(xì)胞靶向投遞作用，利用探針的FRET特性，通過對(duì)探針與癌病灶相互作用過程中，F(xiàn)RET現(xiàn)象結(jié)構(gòu)變化信息的監(jiān)控，實(shí)現(xiàn)探針與腫瘤癌細(xì)胞的相互作用過程的原位影像評(píng)價(jià)特性。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是提供一種殼聚糖支載阿霉素-有機(jī)熒光染料FRET靶向復(fù)合探針，其中該復(fù)合探針包括有葉酸修飾殼聚糖、有機(jī)熒光染料和抗癌藥阿霉素；所述有機(jī)熒光染料為具有一定波長(zhǎng)，并能與抗癌藥阿霉素相耦合，形成具有熒·光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)特性的復(fù)合探針結(jié)構(gòu)，在紫外光或可見光激發(fā)下，能有效地產(chǎn)生振蕩偶極子，并與阿霉素的偶極子產(chǎn)生共振，通過偶極子與偶極子之間的相互作用將能量非放射性地轉(zhuǎn)移到阿霉素上而表達(dá)FRET特性的一類有機(jī)熒光染料。本發(fā)明的效果為I.本發(fā)明一種殼聚糖支載阿霉素-有機(jī)熒光染料FRET靶向復(fù)合探針，構(gòu)建了阿霉素-有機(jī)熒光染料FRET復(fù)合探針結(jié)構(gòu)，有機(jī)熒光染料的能量轉(zhuǎn)移到阿霉素上，阿霉素的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，使其具有與癌細(xì)胞作用的熒光原位表達(dá)特性。2.本發(fā)明一種殼聚糖支載阿霉素-有機(jī)熒光染料FRET靶向復(fù)合探針，通過葉酸-受體介導(dǎo)作用靶向投遞至腫瘤癌細(xì)胞并對(duì)其進(jìn)行染色，根據(jù)熒光行為觀察復(fù)合探針在腫瘤癌細(xì)胞各區(qū)域的作用過程及分布規(guī)律；在阿霉素釋放并與腫瘤癌細(xì)胞作用過程中，復(fù)合探針的FRET復(fù)合結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，通過復(fù)合探針熒光強(qiáng)度變化大小和熒光強(qiáng)度變化速率等信息的實(shí)時(shí)監(jiān)控，可實(shí)現(xiàn)阿霉素與腫瘤癌細(xì)胞作用過程的原位影像評(píng)價(jià)。


圖I為本發(fā)明的復(fù)合探針的組成結(jié)構(gòu)及作用示意圖。圖中I、殼聚糖 2、有機(jī)熒光染料 3、葉酸 4、阿霉素5、腫瘤癌細(xì)胞6、藥物釋放過程
具體實(shí)施例方式結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的一種殼聚糖支載阿霉素-有機(jī)熒光染料FRET靶向復(fù)合探針結(jié)構(gòu)及作用過程加以說明。本發(fā)明的一種殼聚糖支載阿霉素-有機(jī)熒光染料FRET靶向復(fù)合探針，該復(fù)合探針包括有葉酸修飾殼聚糖、有機(jī)熒光染料和抗癌藥阿霉素；所述有機(jī)熒光染料為具有一定波長(zhǎng)，并能與抗癌藥阿霉素相耦合，形成具有熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)特性的復(fù)合探針結(jié)構(gòu)，并在紫外光或可見光激發(fā)下能表達(dá)FRET特性的一類有機(jī)熒光染料。所述復(fù)合探針結(jié)構(gòu)在紫外光或可見光激發(fā)下，有機(jī)熒光染料會(huì)有效地產(chǎn)生振蕩偶極子，與阿霉素的偶極子產(chǎn)生共振，通過偶極子與偶極子之間的相互作用將有機(jī)熒光染料的能量非放射性地轉(zhuǎn)移到阿霉素上，表達(dá)FRET特性，增強(qiáng)阿霉素?zé)晒鈴?qiáng)度。所述殼聚糖為兩親性殼聚糖，其分子量為200(T4000。所述FRET復(fù)合結(jié)構(gòu)中，有機(jī)熒光染料為能量供體，阿霉素為能量受體。有機(jī)熒光染料的發(fā)射波長(zhǎng)為48(T500nm。如圖I所示，本發(fā)明所涉及的一種殼 聚糖支載阿霉素-有機(jī)熒光染料FRET靶向復(fù)合探針功能是這樣實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明的一種殼聚糖支載阿霉素-有機(jī)熒光染料FRET靶向復(fù)合探針，該探針由抗癌藥阿霉素4、有機(jī)熒光染料2和葉酸3修飾的殼聚糖I構(gòu)成。所選抗癌藥阿霉素4是一種廣譜化療藥，其激發(fā)波長(zhǎng)為490nm，發(fā)射波長(zhǎng)為545nm ;所選有機(jī)熒光染料2為具有一定波長(zhǎng)，能與阿霉素4形成具有熒光共振能量轉(zhuǎn)移FRET復(fù)合結(jié)構(gòu)，并在紫外光或可見光激發(fā)下能表達(dá)FRET特性；所選葉酸3修飾的殼聚糖I為兩親性殼聚糖，其分子量大小為200(T4000 ;有機(jī)熒光染料2通過鍵合的方式接于殼聚糖I表面，阿霉素4通過包裹方式組裝在殼聚糖I內(nèi)部。將具有一定波長(zhǎng)的有機(jī)熒光染料2與抗癌藥阿霉素4耦合，使有機(jī)熒光染料2的發(fā)射波長(zhǎng)與阿霉素的激發(fā)波長(zhǎng)相匹配，形成具有熒光共振能量轉(zhuǎn)移FRET復(fù)合結(jié)構(gòu)。在紫外光或可見光激發(fā)下，有機(jī)熒光染料會(huì)有效地產(chǎn)生振蕩偶極子，與阿霉素的偶極子產(chǎn)生共振，通過偶極子與偶極子之間的相互作用將有機(jī)熒光染料的能量非放射性地轉(zhuǎn)移到阿霉素上，表達(dá)FRET特性，增強(qiáng)阿霉素?zé)晒鈴?qiáng)度。該探針載體選擇為殼聚糖1，殼聚糖為兩親性并用葉酸3進(jìn)行了修飾。利用葉酸-受體的介導(dǎo)作用實(shí)現(xiàn)該探針對(duì)腫瘤癌細(xì)胞5靶向投遞作用；利用該復(fù)合探針的FRET特性，通過對(duì)探針與癌病灶相互作用過程中，F(xiàn)RET現(xiàn)象結(jié)構(gòu)變化信息的監(jiān)控，實(shí)現(xiàn)復(fù)合探針與腫瘤癌細(xì)胞5的相互作用過程的原位影像評(píng)價(jià)特性。構(gòu)建的殼聚糖支載阿霉素-有機(jī)熒光染料FRET靶向復(fù)合探針進(jìn)入活體組織后，通過葉酸-受體的介導(dǎo)作用運(yùn)輸至腫瘤癌細(xì)胞5的細(xì)胞膜上，殼聚糖I本身所帶的正電荷與腫瘤癌細(xì)胞5的細(xì)胞膜上負(fù)電荷結(jié)合，形成內(nèi)涵體，通過細(xì)胞的內(nèi)吞作用進(jìn)入腫瘤癌細(xì)胞5細(xì)胞漿中，ATP酶驅(qū)動(dòng)的質(zhì)子泵將質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入內(nèi)涵體，使內(nèi)涵體表面呈酸性，pH值約為5，殼聚糖I構(gòu)型發(fā)生變化，抗癌藥阿霉素4得到釋放，并作用于細(xì)胞核而發(fā)揮藥效。在這一過程中，復(fù)合探針的FRET熒光特性表達(dá)可對(duì)腫瘤癌細(xì)胞5進(jìn)行染色，通過熒光行為變化可觀察復(fù)合探針在腫瘤癌細(xì)胞5的細(xì)胞膜、細(xì)胞漿、細(xì)胞核中作用過程及分布規(guī)律。在藥物釋放過程6中，由于FRET靶向復(fù)合探針對(duì)于距離和熒光基團(tuán)的空間取向具有高度敏感性，阿霉素4與有機(jī)熒光染料2之間的距離變大(>10nm)，復(fù)合探針的FRET體系發(fā)生變化，其表達(dá)的熒光強(qiáng)度發(fā)生變化，通過熒光強(qiáng)度變化速率和熒光強(qiáng)度變化大小的實(shí)時(shí)監(jiān)控，實(shí)現(xiàn)腫瘤癌細(xì)胞5的變化情況、阿霉素4與腫瘤癌細(xì)胞5作用過程和阿霉素4治療療效的原位影像評(píng)價(jià)。所述腫瘤癌細(xì)胞5為細(xì)胞膜上能表面高度表達(dá)葉酸受體的腫瘤癌細(xì)胞，如卵巢癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、宮頸癌細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞、直腸癌細(xì)胞、鼻咽癌細(xì)胞。實(shí)施例I)用PEG和長(zhǎng)鏈酸酐對(duì)殼聚糖進(jìn)行改性，使其具有雙親性。用葉酸3對(duì)其進(jìn)行修飾，并在其表面通過鍵合的方式接上發(fā)射波長(zhǎng)在48(T500nm之間的吲哚咔唑類染料，最后包裹抗癌藥阿霉素，組成阿霉素-吲哚咔唑類染料FRET靶向復(fù)合探針，其中阿霉素為能量供體，吲哚咔唑類染料為能量受體。用其治療老鼠體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，探針能夠選擇性地標(biāo)記進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，其熒光圖像清晰，隨著阿霉素藥效在腫瘤癌細(xì)胞內(nèi)的發(fā)揮，復(fù)合探針的熒光強(qiáng)度逐漸下降。當(dāng)阿霉素全部釋放并發(fā)揮藥效后，熒光強(qiáng)度下降309^50%，變化明顯。 根據(jù)復(fù)合熒光強(qiáng)度的變化情況，很好地跟蹤了阿霉素與腫瘤細(xì)胞的作用過程，實(shí)現(xiàn)了原位影像評(píng)價(jià)功能。
權(quán)利要求
1.一種殼聚糖支載阿霉素-有機(jī)熒光染料FRET靶向復(fù)合探針，其特征是該復(fù)合探針包括有葉酸修飾殼聚糖、有機(jī)熒光染料和抗癌藥阿霉素； 所述有機(jī)熒光染料為具有一定波長(zhǎng)，并能與抗癌藥阿霉素相耦合，形成具有熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)特性的復(fù)合探針結(jié)構(gòu)，在紫外光或可見光激發(fā)下，能有效地產(chǎn)生振蕩偶極子，并與阿霉素的偶極子產(chǎn)生共振，通過偶極子與偶極子之間的相互作用將能量非放射性地轉(zhuǎn)移到阿霉素上而表達(dá)FRET特性的一類有機(jī)熒光染料。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述一種殼聚糖支載阿霉素-有機(jī)熒光染料FRET靶向復(fù)合探針，其特征是所述殼聚糖為兩親性殼聚糖，其分子量為200(T4000。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述一種殼聚糖支載阿霉素-有機(jī)熒光染料FRET靶向復(fù)合探針，其特征是所述有機(jī)熒光染料的發(fā)射波長(zhǎng)為48(T500nm。
全文摘要
本發(fā)明提供一種殼聚糖支載阿霉素-有機(jī)熒光染料FRET靶向復(fù)合探針，該探針將具有一定波長(zhǎng)的有機(jī)熒光染料與抗癌藥阿霉素相耦合殼聚糖上，形成具有熒光共振能量轉(zhuǎn)移特性的復(fù)合結(jié)構(gòu)，并在紫外光或可見光激發(fā)下表達(dá)FRET特性的熒光探針。有益效果是通過該復(fù)合探針結(jié)構(gòu)的構(gòu)建，將有機(jī)熒光染料的能量轉(zhuǎn)移到阿霉素上，增強(qiáng)阿霉素的熒光強(qiáng)度，使其具有與癌細(xì)胞作用的熒光原位表達(dá)特性。通過復(fù)合探針靶向投遞過程中熒光行為觀察復(fù)合探針在腫瘤癌細(xì)胞各區(qū)域的作用過程及分布規(guī)律；在阿霉素釋放并與腫瘤癌細(xì)胞作用過程中，通過復(fù)合探針熒光強(qiáng)度變化大小和熒光強(qiáng)度變化速率等信息的實(shí)時(shí)監(jiān)控，可實(shí)現(xiàn)阿霉素與腫瘤癌細(xì)胞作用過程和藥物療效的原位影像評(píng)價(jià)。
文檔編號(hào)A61K49/00GK102716502SQ20121021680
公開日2012年10月10日 申請(qǐng)日期2012年6月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月28日
發(fā)明者張寶蓮, 曹凌云, 谷迎春, 費(fèi)學(xué)寧 申請(qǐng)人:天津城市建設(shè)學(xué)院