專利名稱：一種蒲公英多糖提取物及其制備方法和用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種蒲公英多糖提取物及其制備方法和用途，屬于中藥技術領域。
背景技術：
蒲公英(Herba Taraxaci )是菊科多年生草本,別名黃花地丁,黃花三七。具有清熱解毒，消腫散結，利尿通淋，用于疔瘡腫毒，乳癰，瘰疬，目赤，咽痛，肺癰，腸癰，濕熱黃疸，熱淋澀痛?，F(xiàn)代藥理研究表明，蒲公英具有利膽保肝，抗內(nèi)毒素，抗癌，降血糖，抗凝血，利尿，健脾胃，益生元，廣譜抑菌和免疫促進等作用。蒲公英作為藥用植物在國內(nèi)外研究已有很久的歷史，蒲公英有豐富的營養(yǎng)價值， 含有蛋白質、脂肪、碳水化合物及維生素等。(許丹等，蒲公英的化學研究，中國中藥雜志，2004，29 (3) : 229-230)。迄今為止，已見報道的蒲公英化學成分主要有黃酮類、三萜類、植物甾醇類、香豆素類、長鏈脂肪族類、倍半萜內(nèi)酯類、色素類、揮發(fā)油、膽堿、乙酰酯類、酚酸類、綠原酸、咖啡酸、有機酸、氨基酸以及礦物質等(袁瑾等，野生植物蒲公英營養(yǎng)成分的研究，氨基酸和生物資源，2006，28 (2) : 22-23)，具體如蒲公英留醇(Taraxasterol)、膽堿(Choline)、菊糖(Inulin)、果膠(Pectin);蒲公英醇(Taraxol)、豆甾醇(Stigmasterol)、β-香樹脂醇(β-Amyrin)、β-谷甾醇(β-Sitosterol)、蒲公英賽醇(taraxerol)、蒲公英素(Taraxacerin)、蒲公英苦素(Taraxacin)和維生素A、B、C等。補體系統(tǒng)是人體重要的免疫防御系統(tǒng)之一。補體系統(tǒng)的正常激活在消滅外來微生物、清除肌體內(nèi)損傷或死亡的細胞和組織以及維持機體的平衡等生理過程中起著重要作用。然而該系統(tǒng)的非正常激活會引起人體免疫系統(tǒng)的過度反應，導致人體自身正常組織的損傷和炎癥反應，是炎癥反應的重要介質。研究表明，與補體過度激活相關的疾病涉及類風濕性關節(jié)炎、老年性癡呆、急性呼吸窘迫綜合征以及系統(tǒng)性紅斑狼瘡等多種疾病。有報道，重癥非典型肺炎(SARS)和由H5N1型病毒感染引起的禽流感，臨床上可發(fā)現(xiàn)免疫系統(tǒng)的過度反應癥狀，如ARDS，敗血癥休克及Reyes綜合征等，上述反應癥狀被人與細胞免疫、體液免疫過度激活有關。鑒于補體過度激活在引發(fā)人類許多危重疾病中的重要作用，因此，對補體系統(tǒng)激活的抑制性治療具有十分重要的臨床意義。天然藥物中廣泛存在具有抗補體作用的活性成分，國內(nèi)外已完成部分天然藥物如麻黃、人參、杜仲等的篩選，發(fā)現(xiàn)自然界中廣泛存在的某些多糖、蛋白質、多肽、留類、萜類和生物堿等化學物具有顯著的抗補體活性，其中以糖基化蛋白和多聚糖化合物為多。肝素是有糖醛酸和氨基葡萄糖聚合而成的一個硫酸化多糖，是研究較早、較成熟的補體抑制齊U。但由于肝素具有抗凝血作用，在生物體內(nèi)需較高濃度才能發(fā)揮藥效，且副作用大，限制了其臨床用途。申請?zhí)枮?00710046222. 7的中國專利文獻公開了一種具有抗補體活性的植物多糖，采用五種多糖的雜多糖，由魚腥草、野菊花、茵陳、佩蘭和草果制備，作用于補體Clq, Clr, Cls, C2、C3、C4、C5、C9組分，且不具有抗凝血作用。申請?zhí)枮?00710044099. 5的中國專利文獻公開了一種自杜仲提取的木制素在制備抗補體藥物的用途。申請?zhí)枮?00910201362.6的中國專利文獻公開了一種自苦參提取的黃酮類在制備抗補體藥物的用途，所得的黃酮類化合物對補體系統(tǒng)的經(jīng)典途徑和旁路途徑均有較強的抑制作用。但至今未見蒲公英及其多糖提取物的抗補體活性的相關研究報道
發(fā)明內(nèi)容

針對現(xiàn)有技術存在的上述問題，本發(fā)明的目的是提供一種具有抗補體活性的蒲公英多糖提取物及其制備方法，以改進現(xiàn)有技術中蒲公英多糖的提取工藝和完善對蒲公英多糖的藥理作用研究。為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術方案如下一種蒲公英多糖提取物，由蒲公英全草經(jīng)水提醇沉、透析截取分子量大于10000道爾頓的組分，然后經(jīng)陰離子交換柱層析分離而得；所述多糖提取物中含有7 8wt%的多糖A、22 23wt%的多糖B、17 18wt%的多糖C、6 7wt%的多糖D、1 2wt%的多糖Ε、0· 5 I. 5wt% 的多糖 F ;其中多糖 A 的單糖組成為 Ara:Man:Glc:Gal=2:1. O: I. 7:4 ；多糖B的單糖組成為Rha:Ara:Gal=1.0:1.8:2. 2 ;多糖C的單糖組成為Rha:Ara:Glc:Gal=L 1:4. 5:1. 0:5 ;多糖 D 的單糖組成為 Rha:Ara:Man:Glc:Gal=L 4:7. 9:1:2. 6:10. 6 ;多糖E的單糖組成為Ara:Glc:Gal=L 4:1. 0:2. 7 ;多糖F的單糖組成為Rha:Ara:Man:Glc:Gal=L 7:4. 5:1:2. 7:5. 2 ;上述的單糖組成比例均為摩爾比。一種所述蒲公英多糖提取物的制備方法，包括如下步驟a)首先將蒲公英全草用乙醇回流脫脂，然后過濾，揮干藥渣中的乙醇；加水浸泡、煎煮提??；合并提取液，濃縮，離心，收集上清液；加入乙醇進行沉析；離心得沉淀，并揮干其中的乙醇；用水溶解沉淀，所得溶液用截留分子量為10000道爾頓的透析袋在水中透析24 72小時；濃縮透析液，冷凍干燥，得蒲公英多糖提取物粗品；b)將上述蒲公英多糖提取物粗品加水溶解，離心；將沉淀再加水加熱溶解，離心；合并兩次離心所得上清液，上樣于二乙胺基乙基(DEAE)陰離子交換柱，依次用蒸餾水、O. 2、
O.5,0. 8、I. Omol/L的NaCl溶液及O. 2mol/L的NaOH溶液階梯式洗脫，分管收集；收集液用苯酚-硫酸法檢測多糖，繪制洗脫曲線，根據(jù)洗脫曲線收集各部位多糖洗脫液；減壓濃縮所得各部位多糖洗脫液，用截留分子量為3500道爾頓的透析袋進行流水透析24小時；濃縮透析液，冷凍干燥，即得所述的蒲公英多糖提取物。作為進一步優(yōu)選方案，所述回流脫脂的操作如下向蒲公英全草中加入體積百分含量為95%的乙醇，加入的乙醇體積為蒲公英全草質量的2 4倍；然后進行回流I 3小時。作為進一步優(yōu)選方案，所述提取的操作如下向藥渣中加入去離子水，于室溫浸泡I 3小時，然后加熱煮沸進行煎煮2 4小時，過濾，對所得藥渣再重復上述操作I 3次；每次加水體積為藥渣質量的8 10倍。作為進一步優(yōu)選方案，將提取液濃縮到在60 80°C的相對密度為I. O I. 5。作為進一步優(yōu)選方案，所述沉析的操作如下在不斷攪拌下向上清液中加入體積百分含量為95%的乙醇，乙醇的加入體積為上清液體積的2 4倍；加畢，在O 5°C靜置12 24小時。本發(fā)明所述的蒲公英多糖提取物的一種用途，是以所述蒲公英多糖提取物作為抗補體活性成分用于制備保健食品。
本發(fā)明所述的蒲公英多糖提取物的另一種用途，是以所述蒲公英多糖提取物作為抗補體活性成分用于制備藥物制劑。所述的藥物制劑可以是任何一種適合于臨床使用的劑型，包括固體制劑(如膠囊、片劑、顆粒劑等)、半固體制劑(如軟膏等)、液體制劑(如□服液、混懸劑、乳劑等)、注射劑等。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下有益效果本發(fā)明所提供的蒲公英多糖提取物具有顯著抗補體活性，可作為預防和/或治療系統(tǒng)性免疫缺陷疾病的藥物和功能性食品，使用安全，無副作用之憂，且制備工藝簡單，質量穩(wěn)定，適于規(guī)?；a(chǎn)，具有廣闊的應用前景和市場價值。


圖I為本發(fā)明中所述的洗脫曲線圖；
圖2為本發(fā)明所述的蒲公英多糖提取物中的多糖A的GC-MS圖；圖3為本發(fā)明所述的蒲公英多糖提取物中的多糖B的GC-MS圖；圖4為本發(fā)明所述的蒲公英多糖提取物中的多糖C的GC-MS圖；圖5為本發(fā)明所述的蒲公英多糖提取物中的多糖D的GC-MS圖；圖6為本發(fā)明所述的蒲公英多糖提取物中的多糖E的GC-MS圖；圖7為本發(fā)明所述的蒲公英多糖提取物中的多糖F的GC-MS圖。
具體實施例方式下面結合實施例對本發(fā)明作進一步詳細、完整地說明。實施例中所述的單糖組成比例均為摩爾比；文中各單糖縮寫含義如下Rha表示a -D-鼠李糖；Ara表示a -D-阿拉伯糖；Man表不a -D-甘露糖；Glc表不a -D-匍萄糖；Gal表不a -D-半乳糖。實施例I取蒲公英全草置于提取器內(nèi)，加入體積百分含量為95%的乙醇，加入的乙醇體積為蒲公英全草質量的2倍；進行回流脫脂2小時，過濾，揮干藥渣中的乙醇；向藥渣中加入去離子水，于室溫浸泡3小時，然后加熱煮沸進行煎煮4小時，過濾，對所得藥渣再重復上述操作3次；每次加水體積為藥渣質量的10倍；合并提取液，將提取液濃縮到在80°C的相對密度為I. 2，離心，收集上清液；在不斷攪拌下向上清液中加入體積百分含量為95%的乙醇，乙醇的加入體積為上清液體積的4倍；加畢，置入4°C冰箱靜置12小時；離心得沉淀，并揮干其中的乙醇；用水溶解沉淀，所得溶液用截留分子量為10000道爾頓的透析袋在水中透析72小時，以除去其中的小分子多糖、蛋白、乙醇及鹽和一些水溶性雜質；濃縮透析液，冷凍干燥，得蒲公英多糖提取物粗品，得率約為全草質量的7. 13%。將上述蒲公英多糖提取物粗品加水溶解，于8500rpm離心IOmin ;將沉淀再加水加熱溶解，再次于8500rpm離心IOmin ;合并兩次離心所得上清液,上樣于二乙胺基乙基(DEAE)陰離子交換柱，依次用蒸餾水、O. 2,0. 5,0. 8、I. Omol/L的NaCl溶液及O. 2mol/L的NaOH溶液階梯式洗脫，分管收集；收集液用苯酚-硫酸法檢測多糖，繪制洗脫曲線，根據(jù)洗脫曲線(如圖I所示)分別收集各部位多糖洗脫液；減壓濃縮所得各部位多糖洗脫液，用截留分子量為3500道爾頓的透析袋分別進行流水透析24小時；濃縮透析液，冷凍干燥，即得組成所述蒲公英多糖提取物的各多糖多糖A (得率為7. 5wt%)、多糖B (得率為22. 9wt%)、多糖c (得率為17. 3wt%)、多糖D (得率為6. 5wt%)、多糖E (得率為I. 2wt%)、多糖F (得率為 O. 85wt%)0對上述各多糖進行單糖組成分析取2mg多糖置于試管中，加入新鮮配制的濃度為80mg/mL的4-甲基嗎啡啉硼烷水溶液50 μ L和3mol/L的三氟乙酸水溶液(TFA)200 μ L，混勻后于80°C水浴加熱5分鐘；待溶液冷卻后再加入50 μ L 4-甲基嗎啡啉硼烷水溶液，于120°C油浴還原I小時；待溶液冷卻后再加入100μ L4-甲基嗎啡啉硼烷水溶液，于50°C旋蒸蒸干，再加2mL乙腈蒸干3次；等其冷卻至室溫后，加入醋酐和三氟乙酸各200 μ L，于50°C水浴中密封乙?；?0分鐘，加2mL蒸餾水終止反應，再加氯仿3mL萃取，然后用蒸餾水洗多次，過無水硫酸鈉柱干燥，裝瓶進行GC-MS分析。GC-MS 分析條件為TR-5MS(Thermo)，色譜柱(60mX0. 25mmX0. 25 μ m);程序升溫 條件升溫從140°C開始，以2V /min升溫至198°C,保溫4min,再以4°C /min升溫至214°C,再以1°C /min升溫至217°C，保持4min，最后以3°C /min升溫至250°C，保持5min ;進樣口 溫度為250°C ;載氣為He，流速為lmL/min。圖2是所述多糖A的GC-MS圖，由圖2可見所述多糖A的單糖組成為Ara:Man:Glc:Gal=2:1:1. 7:4 ；圖3是所述多糖B的GC-MS圖，由圖3可見所述多糖B的單糖組成為Rha:Ara:Gal=L O: I. 8:2. 2 ；圖4是所述多糖C的GC-MS圖，由圖4可見所述多糖C的單糖組成為Rha: Ara:Glc:Gal=L 1:4. 5:1. 0:5 ；圖5是所述多糖D的GC-MS圖，由圖5可見所述多糖D的單糖組成為Rha:Ara:Man: Glc: Gal=L 4:7. 9:1:2. 6:10. 6 ；圖6是所述多糖E的GC-MS圖，由圖6可見所述多糖E的單糖組成為Ara:Glc:Gal=L 4:1. 0:2. 7 ；圖7是所述多糖F的GC-MS圖，由圖7可見所述多糖多糖F的單糖組成為Rha:Ara:Man:Glc:Gal=L 7:4. 5:1:2. 7:5. 2。實施例2取蒲公英全草置于提取器內(nèi)，加入體積百分含量為95%的乙醇，加入的乙醇體積為蒲公英全草質量的3倍；進行回流脫脂2小時，過濾，揮干藥渣中的乙醇；向藥渣中加入去離子水，于室溫浸泡2小時，然后加熱煮沸進行煎煮3小時，過濾，對所得藥渣再重復上述操作2次；每次加水體積為藥渣質量的9倍；合并提取液，將提取液濃縮到在70°C的相對密度為I. 1，離心，收集上清液；在不斷攪拌下向上清液中加入體積百分含量為95%的乙醇，乙醇的加入體積為上清液體積的3倍；加畢，置入4°C冰箱靜置12小時；離心得沉淀，并揮干其中的乙醇；用水溶解沉淀，所得溶液用截留分子量為10000道爾頓的透析袋在水中透析72小時，以除去其中的小分子多糖、蛋白、乙醇及鹽和一些水溶性雜質；濃縮透析液，冷凍干燥，得蒲公英多糖提取物粗品，得率約為全草質量的6. 54%。將上述蒲公英多糖提取物粗品加水溶解，于8500rpm離心IOmin ;將沉淀再加水加熱溶解，再次于8500rpm離心IOmin ;合并兩次離心所得上清液,上樣于二乙胺基乙基(DEAE)陰離子交換柱，依次用蒸餾水、O. 2,0. 5,0. 8、I. Omol/L的NaCl溶液及O. 2mol/L的NaOH溶液階梯式洗脫，分管收集；收集液用苯酚-硫酸法檢測多糖，繪制洗脫曲線，根據(jù)洗脫曲線(如圖I所示)分別收集各部位多糖洗脫液；減壓濃縮所得各部位多糖洗脫液，用截留分子量為3500道爾頓的透析袋分別進行流水透析24小時；濃縮透析液，冷凍干燥，即得組成所述蒲公英多糖提取物的各多糖多糖A (得率為7. 7wt%)、多糖B (得率為22. 6wt%)、多糖C (得率為17.5wt%)、多糖D (得率為6.9wt%)、多糖E (得率為1.4wt%)、多糖F (得率為 O. 75wt%)。實施例3取蒲公英全草置于提取器內(nèi)，加入體積百分含量為95%的乙醇，加入的乙醇體積為蒲公英全草質量的4倍；進行回流脫脂2小時，過濾，揮干藥渣中的乙醇；向藥渣中加入去離子水，于室溫浸泡I小時，然后加熱煮沸進行煎煮2小時，過濾，對所得藥渣再重復上述操作I次；加水體積為藥渣質量的8倍；合并提取液，將提取液濃縮到在60°C的相對密度為
I.5，離心，收集上清液；在不斷攪拌下向上清液中加入體積百分含量為95%的乙醇，乙醇的加入體積為上清液體積的2倍；加畢，置入4°C冰箱靜置12小時；離心得沉淀，并揮干其中 的乙醇；用水溶解沉淀，所得溶液用截留分子量為10000道爾頓的透析袋在水中透析72小時，以除去其中的小分子多糖、蛋白、乙醇及鹽和一些水溶性雜質；濃縮透析液，冷凍干燥，得蒲公英多糖提取物粗品，得率約為全草質量的6. 07%。將上述蒲公英多糖提取物粗品加水溶解，于8500rpm離心IOmin ;將沉淀再加水加熱溶解，再次于8500rpm離心IOmin ;合并兩次離心所得上清液,上樣于二乙胺基乙基(DEAE)陰離子交換柱，依次用蒸餾水、O. 2,0. 5,0. 8、I. Omol/L的NaCl溶液及O. 2mol/L的NaOH溶液階梯式洗脫，分管收集；收集液用苯酚-硫酸法檢測多糖，繪制洗脫曲線，根據(jù)洗脫曲線(如圖I所示)分別收集各部位多糖洗脫液；減壓濃縮所得各部位多糖洗脫液，用截留分子量為3500道爾頓的透析袋分別進行流水透析24小時；濃縮透析液，冷凍干燥，即得組成所述蒲公英多糖提取物的各多糖多糖A (得率為7. 9wt%)、多糖B (得率為22. 3wt%)、多糖C (得率為17.7wt%)、多糖D (得率為6. 2wt%)、多糖E (得率為1.7wt%)、多糖F (得率為 O. 95wt% )。實施例4檢測本發(fā)明所述蒲公英多糖提取物及其所含的各多糖的經(jīng)典途徑抗補體的CP5tl值，補體經(jīng)典途徑的溶血活性(CP5tl)測定取確定臨界濃度的補體與供試品混勻，按抗補體實驗經(jīng)典方法學操作。具體為37°C水浴30min后低溫離心lOmin，取每管上清液離心后取O. 2mL，用酶標儀在405nm下測定吸收度。以樣品濃度作為X軸，溶血抑制率作為Y軸作圖，計算CP5tl值。具體檢測結果見表I所示。表I蒲公英多糖提取物及其所含的各多糖的經(jīng)典途徑抗補體的CP5tl值
樣品CPM(mg/mL)
多糖提取物O. 027
多糖A173權利要求
1.ー種蒲公英多糖提取物，其特征在干由蒲公英全草經(jīng)水提醇沉、透析截取分子量大于10000道爾頓的組分，然后經(jīng)陰離子交換柱層析分離而得；所述多糖提取物中含有7 8wt%的多糖A、22 23wt%的多糖B、17 18wt%的多糖C、6 7wt%的多糖D、1 2wt%的多糖E、0. 5 I. 5wt%的多糖F;其中多糖A的單糖組成為Ara: Man: Glc: Gal=2:1:1. 7:4;多糖 B 的單糖組成為 Rha: Ara: Gal=L 0:1.8:2. 2;多糖 C 的單糖組成為 Rha:Ara:Glc:Gal=L 1:4. 5:1. 0:5 ;多糖 D 的單糖組成為 Rha:Ara:Man:Glc:Ga1=1. 4:7. 9:1:2. 6:10. 6 ;多糖 E 的單糖組成為 Ara:Glc:Gal=l. 4:1. 0:2. 7 ;多糖 F 的單糖組成為Rha:Ara:Man:Glc:Gal=L 7:4. 5:1:2. 7:5. 2 ;上述的單糖組成比例均為摩爾比。
2.—種權利要求I所述的蒲公英多糖提取物的制備方法，其特征在于，包括如下步驟 a)首先將蒲公英全草用こ醇回流脫脂，然后過濾，揮干藥渣中的こ醇；加水浸泡、煎煮提取；合并提取液，濃縮，離心，收集上清液；加入こ醇進行沉析；離心得沉淀，并揮干其中的こ醇；用水溶解沉淀，所得溶液用截留分子量為10000道爾頓的透析袋在水中透析24 72小時；濃縮透析液，冷凍干燥，得蒲公英多糖提取物粗品； b)將上述蒲公英多糖提取物粗品加水溶解，離心；將沉淀再加水加熱溶解，離心；合并兩次離心所得上清液，上樣于ニこ胺基こ基(DEAE)陰離子交換柱，依次用蒸餾水、O. 2,0. 5、O.8、I. Omol/L的NaCl溶液及O. 2mol/L的NaOH溶液階梯式洗脫，分管收集；收集液用苯酚-硫酸法檢測多糖，繪制洗脫曲線，根據(jù)洗脫曲線收集各部位多糖洗脫液；減壓濃縮所得各部位多糖洗脫液，用截留分子量為3500道爾頓的透析袋進行流水透析24小吋；濃縮透析液，冷凍干燥，即得所述的蒲公英多糖提取物。
3.根據(jù)權利要求2所述的蒲公英多糖提取物的制備方法，其特征在于，所述回流脫脂的操作如下向蒲公英全草中加入體積百分含量為95%的こ醇，加入的こ醇體積為蒲公英全草質量的2 4倍；然后進行回流I 3小時。
4.根據(jù)權利要求2所述的蒲公英多糖提取物的制備方法，其特征在于，所述提取的操作如下向藥渣中加入去離子水，于室溫浸泡I 3小時，然后加熱煮沸進行煎煮2 4小時，過濾，對所得藥渣再重復上述操作I 3次；每次加水體積為藥渣質量的8 10倍。
5.根據(jù)權利要求2所述的蒲公英多糖提取物的制備方法，其特征在于將提取液濃縮到在60 80°C的相對密度為I. O I. 5。
6.根據(jù)權利要求2所述的蒲公英多糖提取物的制備方法，其特征在干，所述沉析的操作如下在不斷攪拌下向上清液中加入體積百分含量為95%的こ醇，こ醇的加入體積為上清液體積的2 4倍；加畢，在O 5°C靜置12 24小吋。
7.—種權利要求I所述的蒲公英多糖提取物的用途，其特征在于以所述蒲公英多糖提取物作為抗補體活性成分用于制備保健食品。
8.—種權利要求I所述的蒲公英多糖提取物的用途，其特征在干以所述蒲公英多糖提取物作為抗補體活性成分用于制備藥物制劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種蒲公英多糖提取物及其制備方法和用途。所述多糖提取物是由蒲公英全草經(jīng)水提醇沉、透析截取分子量大于10000道爾頓的組分，然后經(jīng)陰離子交換柱層析分離而得；所述多糖提取物中含有7～8wt%的多糖A、22～23wt%的多糖B、17～18wt%的多糖C、6～7wt%的多糖D、1～2wt%的多糖E、0.5～1.5wt%的多糖F。本發(fā)明所提供的蒲公英多糖提取物具有顯著抗補體活性，可作為預防和/或治療系統(tǒng)性免疫缺陷疾病的藥物和功能性食品，使用安全，無副作用之憂，且制備工藝簡單，質量穩(wěn)定，適于規(guī)?；a(chǎn)，具有廣闊的應用前景和市場價值。
文檔編號A61K31/715GK102659958SQ20121016930
公開日2012年9月12日 申請日期2012年5月28日 優(yōu)先權日2012年5月28日
發(fā)明者劉飛, 施松善, 王宏偉, 王崢濤, 王順春, 胡之璧, 范洪偉, 鮑斌 申請人:上海中醫(yī)藥大學