專利名稱：一種治療鼻咽癌藥物遞送系統(tǒng)及其構(gòu)建和應(yīng)用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種基因治療鼻咽癌藥物遞送系統(tǒng)的構(gòu)建及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
鼻咽癌(na sopharyngeal carcinoma,NPC)是一種具有種族和地理分布差異的上皮細(xì)胞性惡性腫瘤，在中國南方人群中發(fā)病率比白種人群高100倍以上，為25-30/10萬。該腫瘤是一個(gè)與遺傳易感性、EBV感染相關(guān)的多基因疾病。流行病學(xué)研究顯示EBV感染十分廣泛，成年人的感染率可達(dá)98%;在大多數(shù)情況下，EBV感染宿主后以潛伏感染狀態(tài)存在，在鼻咽癌中主要表達(dá)EBNA1、LMPU LMP2等病毒蛋白和非編碼RNA(EBV-encoded RNA, EBER)。 研究證實(shí)LMPl (Latent membrane protein I)主要介導(dǎo)NF- k B、AP_1和STAT三條信號(hào)傳導(dǎo)通路及信號(hào)傳導(dǎo)通路之間的cross-talk，導(dǎo)致細(xì)胞周期紊亂、凋亡阻滯、細(xì)胞增殖失控， 是EBV編碼的目前已被確證的具有瘤基因功能的致瘤蛋白，在EBV相關(guān)腫瘤的發(fā)病中起著重要作用。脫氧核酶(deoxyribozyme/DNAzyme)是利用體外分子進(jìn)化技術(shù)獲得的一種具有催化功能的短片段單鏈DNA，具有高效的催化活性和結(jié)構(gòu)識(shí)別能力。脫氧核酶將高效的催化降解能力與反義的靶向識(shí)別能力結(jié)合，能夠特異性結(jié)合和切割靶基因mRNA，從而調(diào)控目標(biāo)蛋白質(zhì)的表達(dá)。具有極大的治療、靶標(biāo)驗(yàn)證、診斷潛力。我們研究團(tuán)隊(duì)以EBV陽性的細(xì)胞系及其裸鼠移植瘤為研究模型，以LMPl為研究靶標(biāo)，建立了應(yīng)用脫氧核酶從mRNA水平關(guān)閉致病基因的技術(shù)平臺(tái)。在細(xì)胞和動(dòng)物水平篩選出有活性的脫氧核酶；并首次將脫氧核酶與放療聯(lián)合應(yīng)用，證實(shí)了靶向LMPl的脫氧核酶能夠增強(qiáng)鼻咽癌細(xì)胞對(duì)放療的敏感性。目前基因治療臨床試驗(yàn)中采用的載體大多數(shù)為病毒載體，但因病毒載體存在安全性、倫理學(xué)以及免疫原性等諸多問題，非病毒載體(如脂質(zhì)體、高分子聚合物等)的轉(zhuǎn)染效果不理想。本發(fā)明采用生物相容性良好的羥基磷灰石為載體，將能靶向鼻咽癌致瘤蛋白LMPl的脫氧核酶包裝在HA顆粒上，再將脫氧核酶/HA復(fù)合物與細(xì)胞穿透肽相結(jié)合，構(gòu)建出能靶向鼻咽癌致瘤蛋白LMPl的藥物遞送系統(tǒng)。實(shí)驗(yàn)表明該藥物遞送系統(tǒng)能轉(zhuǎn)染脫氧核酶，介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染的效率均優(yōu)于其他藥物遞送系統(tǒng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是構(gòu)建一種能夠靶向LMPl的藥物遞送系統(tǒng)，并將該藥物遞送系統(tǒng)應(yīng)用于制備基因治療鼻咽癌的制劑。一種治療鼻咽癌藥物遞送系統(tǒng)，其特征在于，所述的藥物遞送系統(tǒng)由靶向LMPl的脫氧核酶(DZl)、羥基磷灰石(HA)和細(xì)胞穿透肽(CPPs)組成；其中靶向LMPl的脫氧核酶和羥基磷灰石形成復(fù)合體，然后與細(xì)胞穿透肽結(jié)合形成能靶向LMPl的藥物遞送系統(tǒng)。上述藥物遞送系統(tǒng)中DZl吸附、包裹在HA表面形成復(fù)合體，或者DZl填充在納米 HA空心球或介孔HA顆粒的孔隙里形成復(fù)合體，然后在HA/DZ1復(fù)合體表面枝結(jié)或包裹細(xì)胞穿透肽。 所述的靶向LMPl的脫氧核酶序列為Sequence (5，to3，) gCA AAg gAA ggC TAg CTA CAA CgA AgA ggA Ckk。所述的羥基磷灰石為桿狀、球狀(包括實(shí)心球、空心球或介孔納米球)、片狀或蜂窩狀。所述的輕基磷灰石粒徑為5nm_1000nm。所述的羥基磷灰石可以在使用前采用聚乙烯亞胺(PEI)、聚乙二醇或精氨酸修飾。所述的細(xì)胞穿透肽含量為0-5 u g/lmg羥基磷灰石。所述的細(xì)胞穿透肽的序列為以下任一種PEP-I KETffffETffffTEffSQPKKKRKVHIV-Iprotein Tat(48-60) GRKKRRQRRRPPQQPenetrat in =RQIKIffFQNRRMKffKKplsl =RVIRVffFQNKRCKDKKTransportan=GffTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKILP-b e t a =GALFLGFLGAAGSTMGAffSQPKKKRKVP-al pha :GALFLAFLAAALSLMGLWSQPKKKRRV。所述的藥物遞送系統(tǒng)的構(gòu)建方法將靶向LMPl的脫氧核酶加入高壓滅菌后的HA 溶液，搖勻、孵育，得到靶向LMPl的脫氧核酶和羥基磷灰石復(fù)合物；將靶向LMPl的脫氧核酶和羥基磷灰石復(fù)合物洗脫后加入細(xì)胞穿透肽，室溫下放置至少20min后即可。所述的藥物遞送系統(tǒng)用于制備基因治療鼻咽癌的制劑。本發(fā)明所構(gòu)建的藥物遞送系統(tǒng)是以生物相容性良好的HA為載體的、能夠靶向 LMPl的藥物遞送系統(tǒng)，其避免了病毒性載體系統(tǒng)存在的安全性、倫理學(xué)以及免疫原性等諸多問題，也避免了其他載體系統(tǒng)存在的代謝問題，其不僅能在體外轉(zhuǎn)染，而且能夠體內(nèi)轉(zhuǎn)染靶向LMPl的脫氧核酶，轉(zhuǎn)染效率高，可用于鼻咽癌的基因治療。


圖I :本發(fā)明的納米HA透射電鏡圖；圖2 :靶向LMPl的脫氧核酶DZl質(zhì)譜圖；圖3 :本發(fā)明的藥物遞送系統(tǒng)的轉(zhuǎn)染圖。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例旨在進(jìn)一步說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明。實(shí)施例I主要包括HA/DZI/CPPs藥物遞送系統(tǒng)構(gòu)建(HA混懸液制備、納米羥基磷灰石顆粒與脫氧核酶的結(jié)合實(shí)驗(yàn)、脫氧核酶/HA復(fù)合物與細(xì)胞穿透肽的結(jié)合)和基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)組成。HA/DZI/CPPs藥物遞送系統(tǒng)構(gòu)建
I、HA納米?；鞈乙褐苽鋵⒅苽涞腍A納米粒分成3組，一組為空白HA顆粒，一組為PEI修飾，一組為精氨酸修飾。HA納米粒用去離子水配成25mg/ml溶液。用超聲波分散60min(UltrasonicHemogenizer-4710, USA)，靜置2h。HA納米?；鞈乙簾o分層，呈乳狀。將混懸液置入50ml 玻璃瓶，高壓滅菌后保存。2、納米羥基磷灰石顆粒與脫氧核酶、細(xì)胞穿透肽的結(jié)合實(shí)驗(yàn)HA/DZI 復(fù)合物 A 液 80 U I HA(25mg/ml)+170U I RPMI1640(RPMI 是 Roswell Park Memorial Institute的縮寫，代指洛斯維公園紀(jì)念研究所。RPMI是該研究所研發(fā)的一類細(xì)胞培養(yǎng)基， 1640是培養(yǎng)基代號(hào)。B 液 8 ii I DZl (濃度為 5 u g/ml-60 u g/ml) +242 u I RPMI 1640將B液加入A液中，用滅菌的移液槍吹打2min，在搖勻機(jī)上孵育(500rpm，室溫， Ih)得到HA/DZ1復(fù)合物溶液。將HA/DZI復(fù)合物洗脫(采用D-hanks液對(duì)HA/DZI復(fù)合物進(jìn)行流洗使樣品中其他組分分離而流洗出來)后分別加入O、Iii l、5ii I細(xì)胞穿透肽(濃度為g/ml-60 u g/ml)， 室溫下放置20min得到HA/DZI/CPPs藥物遞送系統(tǒng)?；蜣D(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)I)細(xì)胞培養(yǎng)以2X105/ml、2. 5X105/ml 和 3X105/ml 的 CM 細(xì)胞CM 細(xì)胞是 CNEl 細(xì)胞(人鼻咽癌細(xì)胞)穩(wěn)轉(zhuǎn)LMPl建的細(xì)胞系密度接種到兩塊6孔培養(yǎng)板上，用無三抗小牛培養(yǎng)基培養(yǎng)，24小時(shí)后用做細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。2)基因轉(zhuǎn)染將6孔板中的細(xì)胞用RPMI 1640培養(yǎng)基沖洗細(xì)胞兩遍，將本發(fā)明制備的HA/DZI/ CPPs藥物遞送系統(tǒng)逐滴加入孔中(本發(fā)明制備的HA/DZI/CPPs藥物遞送系統(tǒng)的加入量
l-5ii g)，每孔再加入I. 5ml 1640培養(yǎng)基，搖動(dòng)培養(yǎng)板，輕輕混勻。放入飯盒中避光，在 37°C,5% CO2培養(yǎng)箱中保溫4小時(shí)。4小時(shí)后，更換含有血清的完全培養(yǎng)基，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染結(jié)果(見圖3)。(注意避光)在37°C、5% 0)2培養(yǎng)箱中12h-24h，然后做 FCM流式細(xì)胞術(shù)，檢測(cè)轉(zhuǎn)染水平。3)流式細(xì)胞術(shù)(I).收集細(xì)胞用D-hanks液洗2次，加I滴胰酶消化，再加入2ml/孔無三抗小牛培養(yǎng)基，吹打均勻，收集到試管內(nèi)；(2).離心(800rpm,室溫，5min)(3).用IOOiU IXPBS緩沖液重懸細(xì)胞，用微量移液器吸出，加入1.5ml的EP管內(nèi)，做流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用HA/DZI/CPPs藥物遞送系統(tǒng)轉(zhuǎn)染CM 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染率最高可達(dá)40%。
權(quán)利要求
1.一種治療鼻咽癌藥物遞送系統(tǒng)，其特征在于，所述的藥物遞送系統(tǒng)由靶向LMPl的脫氧核酶、羥基磷灰石和細(xì)胞穿透肽組成；其中靶向LMPl的脫氧核酶和羥基磷灰石形成復(fù)合體，然后與細(xì)胞穿透肽結(jié)合形成能靶向LMPl的藥物遞送系統(tǒng)。
2.如權(quán)利要求I所述的藥物遞送系統(tǒng)，其特征在于，所述的靶向LMPl的脫氧核酶序列為Sequence (5，to3’ ) gCA AAg gAA ggC TAg CTA CAA CgA AgA ggA Ckk。
3.如權(quán)利要求I所述的藥物遞送系統(tǒng)，其特征在于，所述的羥基磷灰石為桿狀、球狀、 片狀或蜂窩狀。
4.如權(quán)利要求3所述的藥物遞送系統(tǒng)，其特征在于，所述的羥基磷灰石粒徑為 5nm-1000nmo
5.如權(quán)利要求I所述的藥物遞送系統(tǒng)，其特征在于，所述的羥基磷灰石采用聚乙烯亞胺、聚乙二醇或精氨酸修飾。
6.如權(quán)利要求I所述的藥物遞送系統(tǒng)，其特征在于，所述的細(xì)胞穿透肽含量為0-5 V- g/ Img輕基磷灰石。
7.如權(quán)利要求I或6所述的藥物遞送系統(tǒng)，其特征在于，所述的細(xì)胞穿透肽的序列為以下任一種PEP-I =KETffffETffffTEffSQPKKKRKV HIV-Iprotein Tat (48-60) GRKKRRQRRRPPQQ Penetratin =RQIKIffFQNRRMKffKK plsl =RVIRVffFQNKRCKDKK Transportan =GffTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL P-beta=GALFLGFLGAAGSTMGAffSQPKKKRKV P-alpha :GALFLAFLAAALSLMGLWSQPKKKRRV。
8.權(quán)利要求1-7任意一項(xiàng)所述的藥物遞送系統(tǒng)的構(gòu)建方法，其特征在于，將靶向LMPl 的脫氧核酶加入高壓滅菌后的HA溶液，搖勻、孵育，得到靶向LMPl的脫氧核酶和羥基磷灰石復(fù)合物；將靶向LMPl的脫氧核酶和羥基磷灰石復(fù)合物洗脫后加入細(xì)胞穿透肽，室溫下放置至少20min后即可。
9.權(quán)利要求1-7任意一項(xiàng)所述的藥物遞送系統(tǒng)的應(yīng)用方法，其特征在于，用于制備基因治療鼻咽癌的制劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種治療鼻咽癌藥物遞送系統(tǒng)及其構(gòu)建和應(yīng)用方法。本發(fā)明采用生物相容性良好的的羥基磷灰石為載體，將能靶向鼻咽癌致瘤蛋白LMP1的脫氧核酶包裝在HA顆粒上，再將脫氧核酶/HA復(fù)合物與細(xì)胞穿透肽相結(jié)合，構(gòu)建出能靶向鼻咽癌致瘤蛋白LMP1的藥物遞送系統(tǒng)。該藥物遞送系統(tǒng)能介導(dǎo)脫氧核酶，對(duì)基因治療鼻咽癌起到關(guān)鍵作用。
文檔編號(hào)A61K48/00GK102614529SQ20121012646
公開日2012年8月1日 申請(qǐng)日期2012年4月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月26日
發(fā)明者周科朝, 孫侖泉, 楊力芳, 陳燕, 黃蘇萍 申請(qǐng)人:中南大學(xué)