專利名稱：果膠磺化的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種果膠磺化的方法，屬于高分子領(lǐng)域。該類磺化果膠多糖有顯著的抗凝血活性。作為藥物開發(fā)、保健品研發(fā)等都有較好的前景。
背景技術(shù)：
磺化多糖是多糖分子中某些羥基被硫酸酯基取代而形成的一類帶有負電荷的生物大分子，廣泛存在于自然界的各種生物體中，具有廣泛的生物活性。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)多數(shù)硫酸多糖具有顯著的抗凝血、抗腫瘤和抗病毒等活性(Smorenburg等人,2001 ； Mao, W.等人，2009 ；Huashi, C.，1988)。目前，國內(nèi)外對酸性多糖的研究主要集中在海洋領(lǐng)域，如海帶巖藻聚糖硫酸酯，海參中的酸性粘多糖，綠藻酸性多糖等；以及動物體內(nèi)的肝素， 硫酸軟骨素等，但是對陸生植物中酸性多糖的結(jié)構(gòu)和活性研究尚未引起重視。而果膠多糖是一類以重復(fù)的聚半乳糖醛酸為主鏈的酸性多糖，其結(jié)構(gòu)與海洋藥物藻酸雙酯鈉(PSS) (Smorenburg等人，2001)的主要差別為其糖環(huán)羥基上未被硫酸基取代，而目前國內(nèi)外有關(guān)其磺化化修飾方法及酯化后產(chǎn)物仍少有報道，而開展這方面的工作對進一步提高果膠產(chǎn)品的保健和醫(yī)療價值具有重要的意義。磺化多糖同時是肝素替代藥物重要來源。肝素用于預(yù)防和治療血栓性疾病已有數(shù)十年的歷史，但由于較大的出血副作用而限制了其臨床應(yīng)用。而且近年來發(fā)生的肝素污染事件也迫使人們尋找新的肝素類候選藥物。當(dāng)前研究者更有興趣從非哺乳動物來源制備治療性藥物，以減少病原體污染的危險性，而天然酸性多糖是肝素類候選藥物的重要來源。管華詩等對海藻中的褐藻酸鈉分子的羥基及羧基上分別引入硫酸酯基及丙二醇酯基所形成的藻酸雙酯鈉(Propylene Glycol Alginate Sulphate Sodium, PSS),進一步研究表明其磺化衍生物具有良好的抗凝血、降血脂和抗血栓活性。同樣類似的，甘糖酯 (Propylene glycol mannuronate sulfate, PGMS)是聚甘露糖醒酸磺化的衍生物，已作為防治心腦血管疾病的新藥在臨床上使用多年。趙峽等發(fā)現(xiàn)褐藻中另一種多糖聚古羅糖醛酸經(jīng)硫酸化后在抗凝血和尿路結(jié)石癥的預(yù)防和治療方面顯示出了良好的應(yīng)用前景。陳士國等的研究則發(fā)現(xiàn)，巖藻糖基化的美國肉參硫酸軟骨素在抗凝、抑制血栓生成方面活性甚至由于肝素，且其出血副作用低于肝素。趙雪等對海帶中的硫酸化巖藻多糖和及其低分子量產(chǎn)物的研究也表明不同分子量海帶硫酸巖藻多糖均具有抗凝活性，且分子量越大，硫酸根含量越高，抗凝效果越好。而同樣作為酸性多糖的果膠與這些果糖相比，具有復(fù)雜的毛發(fā)支鏈區(qū)，只是支鏈未發(fā)生磺化。國內(nèi)外對多糖的磺化方法主要包括氯磺酸-吡啶法，濃硫酸法，三氧化硫吡啶法
坐寸ο現(xiàn)國內(nèi)外對果膠的磺化方面的研究還沒成熟，資料也相對較少。相比于傳統(tǒng)抗凝血藥物，磺化果膠在抗腫瘤，免疫調(diào)節(jié)活性，凝血性方面表現(xiàn)不僅更為優(yōu)越，并且可以減少傳統(tǒng)抗凝血劑的一系列如出血、過敏反應(yīng)、血小板減少、潛在的人畜疾病傳播等等副作用。 果膠磺化多糖有著很大的開發(fā)潛力。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種果膠磺化的方法，該方法是以果膠多糖為原料，制備出相應(yīng)的磺化果膠多糖；該方法具有操作較為簡單、磺化效果較好等特點。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種果膠磺化的方法，由果膠(果膠多糖)或者三乙胺果膠鹽在二甲亞砜的環(huán)境下，由三氧化硫-吡啶復(fù)合物磺化，制得磺化果膠多糖。作為本發(fā)明的果膠磺化的方法的改進,采用三氧化硫吡啶復(fù)合物-DMSO體系，包括以下步驟I)、制備磺化試劑按照2 5g三氧化硫-吡啶復(fù)合物/IOml的二甲亞砜的用量比，將三氧化硫-吡啶復(fù)合物溶解于二甲亞砜中，得磺化試劑；2)、稱取果膠放入二甲亞砜中攪拌溶脹，得果膠懸浮液；所述果膠與二甲亞砜的料液比為10 40mg果膠/Iml 二甲亞砜；3)、在60 100°C的水浴條件下，按照步驟I)中的三氧化硫-吡啶復(fù)合物與步驟 2)中的果膠為10 O. 9 I. I的質(zhì)量比，將磺化試劑加入果膠懸浮液中，反應(yīng)I 3h ;4)、將步驟3)所得的反應(yīng)產(chǎn)物滴加(緩慢)于冰水中，所得的溶液置于透析袋中于蒸餾水中透析20 30小時；5)、將步驟4)所得的截留產(chǎn)物冷凍干燥，得磺化果膠多糖。作為本發(fā)明的果膠磺化的方法的進一步改進步驟2)的攪拌時間為O. 5 24h ；步驟4)為將步驟3)所得的反應(yīng)產(chǎn)物冷卻至室溫后滴加于5 10體積倍的冰水中；所述透析袋的截留分子量為7000Da。作為本發(fā)明的果膠磺化的方法的另一種改進采用TBA-三氧化硫吡啶復(fù)合物-DMSO體系，包括以下步驟I)、制備磺化試劑按照2 5g三氧化硫-吡啶復(fù)合物/Iml的二甲亞砜的用量比，將三氧化硫-吡啶復(fù)合物溶解于二甲亞砜中，得磺化試劑；2)、按照10 30mg果膠/Iml的超純水的料液比，稱取果膠放入超純水中，攪拌溶
脹，使果膠完全溶解；得果膠溶液；將上述果膠溶液過凝膠(過濾)層析柱，取分離后的果膠于培養(yǎng)皿中，用三乙胺滴定至pH為6. 0-6. 5,冷凍干燥,得三乙胺果膠鹽；3)、將步驟2)所得的三乙胺果膠鹽放入二甲亞砜中，攪拌溶脹，制成果膠懸浮液； 所述三乙胺果膠鹽與二甲亞砜的料液比為20 40mg的三乙胺果膠鹽/Iml 二甲亞砜；4)、按照步驟I)中的三氧化硫-吡啶復(fù)合物與步驟2)中的果膠為10 O. 9
I.I的質(zhì)量比，于室溫下，在果膠懸浮液中加入磺化試劑，反應(yīng)時間為I 3h ;5)、將步驟4)所得的反應(yīng)產(chǎn)物滴加(緩慢)于冰水中，所得的溶液置于透析袋中于蒸餾水中進行透析20 30小時；6)、將步驟5)所得的截留產(chǎn)物冷凍干燥，得磺化果膠多糖。作為本發(fā)明的果膠磺化的方法的進一步改進步驟3)的攪拌時間為O. 5 24h ；步驟5)為將步驟4)所得的反應(yīng)產(chǎn)物冷卻至室溫后滴加入5 10體積倍的冰水中；透析袋的截留分子量7000Da。在本發(fā)明中，將果膠(特別為柑橘果膠)用二甲亞砜溶解，由三氧化硫-吡啶復(fù)合物對其進行磺化修飾，經(jīng)過透析凍干，獲得磺化果膠多糖。在本發(fā)明中，二甲亞砜使用純二甲亞砜(即事先作過干燥除水處理的二甲亞砜)，本發(fā)明反應(yīng)條件較易控制，得率高，重復(fù)性好。利用本方法制備而得的磺化果膠多糖，在反應(yīng)過程中降解小，副反應(yīng)少，具有較好的抗凝血、抗腫瘤和抗病毒活性，應(yīng)用范圍很廣。本發(fā)明的磺化果膠多糖實際用法和用量如下口服，每天I 20mg/Kg。相比現(xiàn)有的其他方法，本發(fā)明所使用的方法更溫和，具有較好的實用性。


下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實施方式
作進一步詳細說明。圖I為實施例2制備而得的磺化果膠多糖的紅外譜圖；圖2為實施例4制備而得的磺化果膠多糖的紅外譜圖；圖3為實施例I制備而得的磺化果膠多糖的紅外譜圖；圖4為實施例3制備而得的磺化果膠多糖的紅外譜圖。
具體實施例方式以下通過具體的實施例對本發(fā)明上述內(nèi)容作進一步的詳細說明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下實例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的技術(shù)范圍。以下每個實施例的每個步驟中，沒有明確告知溫度的，均為在室溫下進行。二甲亞砜均為無水二甲亞砜。實施例I、一種果膠磺化的方法，依次進行如下步驟(I)酯化試劑的制備將2g三氧化硫-吡啶復(fù)合物溶解于4ml無水二甲亞砜中， 得磺化試劑；(2)自提果膠懸浮液的制備將柑橘干果皮烘干后(含水率<90%)粉碎成粉(過60目的篩)，然后加30體積倍的水浸泡過夜(即浸泡12小時),3000r/min的轉(zhuǎn)速下離心40min分鐘，所得的上清液加3體積倍的無水乙醇沉淀。反復(fù)用相同用量的乙醇沉淀兩次，即可得到水溶性果膠，烘干 (于50°C烘干至恒重)后，得柑橘果膠。將200mg柑橘果膠放入IOml無水二甲亞砜中，攪拌O. 5小時,得果膠懸浮液。(3)進行酯化反應(yīng)將所得果膠懸浮液于60°C下水浴，磁力攪拌，緩慢滴加入三氧化硫-吡啶復(fù)合物溶液(即步驟(I)所得的磺化試劑)，反應(yīng)lh。(4)純化將步驟(3)所得的反應(yīng)產(chǎn)物冷卻至室溫后滴加于5體積倍的冰水中。將所得溶液收集，置于截留分子量為7000Da的透析袋中，蒸餾水中透析24h，從而通過透析袋上的透析膜除去雜質(zhì)和鹽等物質(zhì)。將所得的截留產(chǎn)物冷凍(_40°C )真空冷凍干燥48h，得磺化果膠多糖97mg(其為DMSO體系下自提果膠硫酸酯產(chǎn)品)。該磺化果膠多糖的紅外譜圖如圖3所示。實施例2、一種果膠磺化的制備方法，依次進行如下步驟(I)酯化試劑的制備將2g三氧化硫-吡啶復(fù)合物溶解于4ml無水二甲亞砜中， 得磺化試劑；(2)商品果膠懸浮液的制備先將商品柑橘果膠(可購自購自sigma公司)通過乙醇和丙酮的分級沉淀純化, 得純化后的商品果膠；具體如下取50ml的商品柑橘果膠,倒入50ml的無水乙醇,超聲溶解后進入離心機以3000r/ min的轉(zhuǎn)速離心40分鐘；將離心后所得的位于上層的乙醇層倒掉，取下層沉淀加入50ml的 80% (體積濃度)的乙醇，超聲溶解后進入離心機以3000r/min的轉(zhuǎn)速離心40分鐘，取下層沉淀加入50ml的丙酮溶解，超聲溶解后進入離心機以3000r/min的轉(zhuǎn)速離心30分鐘，所得的沉淀為純化后的柑橘果膠。取200mg純化后的柑橘果膠放入20ml無水二甲亞砜中，攪拌O. 5小時，得果膠懸浮液。(3)進行酯化反應(yīng)將所得果膠懸浮液于70°C下水浴，磁力攪拌，緩慢滴加入三氧化硫吡啶復(fù)合物溶液(即步驟(I)所得的磺化試劑)，反應(yīng)I. 5h。(4)純化將步驟(3)所得的反應(yīng)產(chǎn)物冷卻至室溫后滴加于8體積倍的冰水中。將所得溶液收集，置于截留分子量為7000Da的透析袋中，蒸餾水中透析24h，從而通過透析袋上的透析膜除去雜質(zhì)和鹽等物質(zhì)；將所得的截留產(chǎn)物冷凍(_40°C )干燥48h，得磺化果膠多糖105mg(為DMSO體系下商品果膠硫酸酯產(chǎn)品)。實施例3、一種果膠磺化的制備方法，依次進行如下步驟(I)、酯化試劑的制備將2g三氧化硫-吡啶復(fù)合物溶解于4ml無水二甲亞砜中，得磺化試劑；(2)、將200mg柑橘果膠放入IOml超純水中，攪拌O. 5小時，使果膠完全溶解；得果膠溶液。
柑橘果膠的制備方法同實施例I。將上述果膠溶液過凝膠層析柱，具體如下采用Sephacryl S_300column (I. 6cmX 100cm)葡聚糖凝膠柱，以 ρΗ3· 5 的鹽酸溶液作流動相，流速為O. 5ml/min，第160分鐘后開始采集，采集至750min，800分鐘后停止洗
脫。得采集液。在上述采集液中滴加三乙胺(TBA)直至pH為6. 0-6. 5，冷凍(_40°C )干燥后，得三乙胺果膠鹽102mg。取三乙胺果膠鹽102mg于圓底燒瓶中，加入5ml的無水二甲亞砜攪拌溶脹(攪拌 O. 5小時)，得果膠懸浮液。(3)進行酯化反應(yīng)
在上述果膠懸浮液中，于磁力攪拌下加入步驟(I)制得的三氧化硫吡啶復(fù)合物的二甲亞砜溶液(即步驟(I)所得的磺化試劑)，室溫下反應(yīng)lh。(4)純化將步驟(3)所得的反應(yīng)物滴加于6體積倍的冰水中。將所得溶液收集， 置于截留分子量為7000Da的透析袋中，蒸餾水中透析24h，將透析后的樣品冷凍干燥48h， 得磺化果膠多糖113mg(為TBA體系制備自提果膠硫酸酯產(chǎn)品)。實施例4、一種果膠磺化的制備方法，依次進行如下步驟(I)將2g三氧化硫-吡啶復(fù)合物溶解于4ml無水二甲亞砜中，得磺化試劑；(2)自提果膠懸浮液的制備取200mg純化后的柑橘果膠放入IOml超純水中，攪拌O. 5小時，使柑橘果膠全部
溶解；得果膠溶液。由商品柑橘果膠獲得純化后的純化后的柑橘果膠的方法同實施例2。將上述果膠溶液過凝膠層析柱(操作方式同實施例3)，得采集液。在上述采集液中滴加三乙胺直至pH為6. 0-6. 5，冷凍(_40°C )干燥后，得三乙胺果膠鹽98mg。取三乙胺果膠鹽98mg于圓底燒瓶中，加入4. 9ml的二甲亞砜溶解，完全攪拌后 (攪拌0.5小時)，得果膠懸浮液。(3)進行酯化反應(yīng)取已制備好的果膠懸浮液，在磁力攪拌下加入步驟(I)制得的磺化試劑中，室溫下反應(yīng)Ih。(4)純化將步驟3)所得的反應(yīng)物滴加于10體積倍的冰水中。將所得溶液收集， 置于截留分子量為7000Da的透析袋中，蒸餾水中透析24h，將透析后的樣品冷凍干燥48h， 得橫化果I父多糖102mg(為TBA體系制備商品果I父硫酸酷廣品)。實驗I、將實施例I 實施例4所得的磺化果膠多糖進行抗凝血活性檢測以實施例I 實施例4所得的磺化果膠多糖作為待測樣品，以諾伊肝素和血漿作為對照樣品；分別稱取待測樣品和對照樣品用Tris-HCl pH7. 4緩沖液溶解，稀釋到系列待測濃度。參照人凝血因子試劑盒所附說明書方法進行。在37°C預(yù)溫比色杯中加入5ul樣品/對照品溶液，然后加入45ul凝血質(zhì)控血漿，37°C下預(yù)熱2min，用力加50ul APTT試劑(試劑盒附帶)入測定血漿中，37°C孵育3min，加入50ul 37°C預(yù)溫的CaCl2，同時開始計時。結(jié)果如表I所示。表I、本發(fā)明所得的磺化果膠多糖對APTT (活化部分凝血活酶時間)的影響
權(quán)利要求
1.果膠磺化的方法，其特征是由果膠或者三乙胺果膠鹽在二甲亞砜的環(huán)境下，由三氧化硫-吡啶復(fù)合物磺化，制得磺化果膠多糖。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的果膠磺化的方法，其特征是采用三氧化硫吡啶復(fù)合物-DMSO 體系，包括以下步驟.1)、制備磺化試劑按照2 5g三氧化硫-吡啶復(fù)合物/IOml的二甲亞砜的用量比，將三氧化硫-吡啶復(fù)合物溶解于二甲亞砜中，得磺化試劑；.2)、稱取果膠放入二甲亞砜中攪拌溶脹，得果膠懸浮液；所述果膠與二甲亞砜的料液比為10 40mg果膠/ Iml 二甲亞砜；.3)、在60 100°C的水浴條件下，按照步驟I)中的三氧化硫-吡啶復(fù)合物與步驟2)中的果膠為10 O. 9 I. I的質(zhì)量比，將磺化試劑加入果膠懸浮液中，反應(yīng)1 3h ;.4)、將步驟3)所得的反應(yīng)產(chǎn)物滴加于冰水中，所得的溶液置于透析袋中于蒸餾水中透析20 30小時；.5)、將步驟4)所得的截留產(chǎn)物冷凍干燥，得磺化果膠多糖。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的果膠磺化的方法，其特征是所述步驟2)的攪拌時間為O. 5 24h ；所述步驟4)為將步驟3)所得的反應(yīng)產(chǎn)物冷卻至室溫后滴加于5 10體積倍的冰水中；所述透析袋的截留分子量為7000Da。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的果膠磺化的方法，其特征是采用TBA-三氧化硫吡啶復(fù)合物-DMSO體系，包括以下步驟.1)、制備磺化試劑按照2 5g三氧化硫-吡啶復(fù)合物/Iml的二甲亞砜的用量比，將三氧化硫-吡啶復(fù)合物溶解于二甲亞砜中，得磺化試劑；.2)、按照10 30mg果膠/Iml的超純水的料液比,稱取果膠放入超純水中，攪拌溶脹， 使果膠完全溶解；得果膠溶液；將上述果膠溶液過凝膠層析柱，取分離后的果膠于培養(yǎng)皿中，用三乙胺滴定至PH為.6.0-6. 5，冷凍干燥，得三乙胺果膠鹽；.3)、將步驟2)所得的三乙胺果膠鹽放入二甲亞砜中，攪拌溶脹，制成果膠懸浮液；所述三乙胺果膠鹽與二甲亞砜的料液比為20 40mg的三乙胺果膠鹽/lml 二甲亞砜；.4)、按照步驟1)中的三氧化硫-吡啶復(fù)合物與步驟2)中的果膠為10 O. 9 1. 1的質(zhì)量比，于室溫下，在果膠懸浮液中加入磺化試劑，反應(yīng)時間為I 3h ;.5)、將步驟4)所得的反應(yīng)產(chǎn)物滴加于冰水中，所得的溶液置于透析袋中于蒸餾水中進行透析20 30小時；.6)、將步驟5)所得的截留產(chǎn)物冷凍干燥，得磺化果膠多糖。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的果膠磺化的方法，其特征是所述步驟3)的攪拌時間為O. 5 24h ；所述步驟5)為將步驟4)所得的反應(yīng)產(chǎn)物冷卻至室溫后滴加入5 10體積倍的冰水中；透析袋的截留分子量7000Da。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種果膠磺化的方法，由果膠或者三乙胺果膠鹽在二甲亞砜的環(huán)境下，由三氧化硫-吡啶復(fù)合物磺化，制得磺化果膠多糖。本發(fā)明的方法采用以下兩種體系三氧化硫吡啶復(fù)合物-DMSO體系、TBA-三氧化硫吡啶復(fù)合物-DMSO體系。本發(fā)明的方法具有操作較為簡單、磺化效果較好等特點。利用本方法制備而得的磺化果膠多糖，在反應(yīng)過程中降解小，副反應(yīng)少，具有較好的抗凝血、抗腫瘤和抗病毒活性，應(yīng)用范圍很廣。
文檔編號A61P35/00GK102585034SQ201210012638
公開日2012年7月18日 申請日期2012年1月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月16日
發(fā)明者劉東紅, 葉興乾, 吳丹, 孫玉敬, 尹馨梓, 胡亞芹, 陳士國, 陳建初 申請人:浙江大學(xué)