用于治療肝癌的Robo1-Fc融合蛋白的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及Robo1-Fc重組蛋白治療癌癥具體是肝癌的用途。
【專利說(shuō)明】用于治療肝癌的Robol-Fc融合蛋白
[0001]本發(fā)明涉及重組蛋白R(shí)obol-Fc和其治療其中Slit蛋白過(guò)量表達(dá)的疾病的用途。具體而言，本發(fā)明涉及Robo-Fc蛋白治療癌癥尤其是肝癌的用途。它還涉及包含此類重組蛋白的組合物。本發(fā)明的另一方面由Robol-Fc分子作為診斷工具檢測(cè)患者中Slit家族分子的過(guò)量表達(dá)的用途組成。
[0002]最初描述Slit配體為它們?cè)谏窠?jīng)發(fā)育中抵制軸突生長(zhǎng)的作用。從那時(shí)起，Robo/Slit調(diào)控途徑也已經(jīng)被描述于腫瘤血管發(fā)生中。具體地，已經(jīng)描述了 Robo4/Slit2途徑抑制內(nèi)皮細(xì)胞對(duì) VEGF 的應(yīng)答(Jones C.A.等 Nat.Med 14，448 - 453 (2008))。由 Robo/Slit途徑的調(diào)控使引導(dǎo)內(nèi)皮未成熟新血管或芽的過(guò)度增殖(非生產(chǎn)性血管發(fā)生)以及使這些血管成熟成為可能。已經(jīng)在幾種人類癌癥系中證明了 Slit2在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)，所述人類癌癥系具體為源自結(jié)腸癌的HCT116、源自卵巢癌的Skov-3、源自子宮頸癌的HeLa、源自黑素瘤的MDA-MB-435、源自子宮癌的Hec-1A和最后源自腎癌的769-P (Stella MC等，Mol Biol Cell.2009 Vol.20, Issue 2，642-657)。也已經(jīng)證明 Slit2 蛋白在源自以下癌癥的人組織中的過(guò)量表達(dá):口腔癌(Wang等2008, Cancer Sc1.2008 Mar; 99(3):510-7)、前列腺癌(Latil 等 2003 Int J Cancer.2003 Jan 20; 103(3): 306-15)、結(jié)腸癌(Wang 等 2003，Cancer Cell, Volume 4, Issue I, July 2003, Pages 19-29)和肝癌(Avci等2008，BMC cancer, 8: 392)。更近些時(shí)候，Slit2蛋白的過(guò)量表達(dá)已經(jīng)顯示在子宮內(nèi)膜異位的樣品中(Shen等，2009，AJP 175 (2): 479)。
[0003]Robol蛋白以兩個(gè)同種型a和b存在。Robol蛋白同種型b (NP_598334)的胞外結(jié)構(gòu)域包含5個(gè)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域:Igl、Ig2、Ig3、Ig4和Ig5。Robo蛋白與Slit配體在Igl和Ig2結(jié)構(gòu)域的水平上相互作用。Liu等(2004, Mol.Cell Neurosci, 26: 232-240)已經(jīng)證明了 I g2結(jié)構(gòu)域在與Slit的相互作用中以及在Robo活性(化學(xué)排斥)中的重要性。
[0004]對(duì)Robol和Slit2蛋白特異性的抗體的用途已描述于申請(qǐng)W02003/075860中。這些抗體使得抑制腫瘤血管發(fā)生成為可能。
[0005]然而，提出治療癌癥的替代方法具體是能夠抑制Slit2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的分子將是有利的。
[0006]本發(fā)明人已經(jīng)開(kāi)發(fā)了能夠結(jié)合Slit配體并且因此抑制Robo/Slit途徑的胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的可溶性嵌合Robol受體的策略。令人驚訝的是，本發(fā)明的Robol-Fc分子通過(guò)阻止成熟血管的形成，而不是通過(guò)抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，以具有抗血管發(fā)生的作用。
[0007]本發(fā)明人已顯示Robol-Fc分子還在肺癌和肝癌中具有抗腫瘤作用。
[0008]發(fā)明詳述
本發(fā)明的主題是Robo-Fc重組蛋白，其包含Robol蛋白同種型b的胞外結(jié)構(gòu)域或該結(jié)構(gòu)域的部分、連接區(qū)(接頭)和免疫球蛋白Fe結(jié)構(gòu)域。
[0009]在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，Robol蛋白同種型b的胞外結(jié)構(gòu)域由Igl和Ig2結(jié)構(gòu)域組成。這些結(jié)構(gòu)域?qū)?yīng)由核苷酸序列SEQ ID N0.1編碼的SEQ ID N0.2的肽、或與序列SEQ ID N0.2具有至少80%、85%、90%、95%或99%同一性的序列。
[0010]融合蛋白還包含連接區(qū)，也稱為“接頭”。在本發(fā)明的上下文中，接頭使得給予重組蛋白穩(wěn)定性，其具體通過(guò)限制體內(nèi)切割，成為可能。可以用于Robol-Fc分子中的接頭例如是GluArgProSerPheVal和GlyGlyGlyGlySer。本領(lǐng)域技術(shù)人員具有足夠的知識(shí)來(lái)選擇適合于此用途的接頭。
[0011]根據(jù)本發(fā)明的Robol-Fc重組分子的Fe結(jié)構(gòu)域?qū)?yīng)免疫球蛋白的可結(jié)晶片段。該Fe片段可以來(lái)自多種免疫球蛋白IgGl、IgG2、IgG3或IgG4。它負(fù)責(zé)免疫應(yīng)答的效應(yīng)子功能(W02008/065543)。
[0012]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，F(xiàn)e結(jié)構(gòu)域來(lái)自IgG4免疫球蛋白。在一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，至少一點(diǎn)突變或缺失已經(jīng)被引入到IgG4 Fe結(jié)構(gòu)域中，從而提高了分子的穩(wěn)定性，具體是通過(guò)穩(wěn)定由兩個(gè)Fe結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的鉸鏈區(qū)(Angla等，1993，Mol.1mmunol., 30:105-108)來(lái)降低或消除IgG4-Fc的殘留活性，具體為效應(yīng)子活性(WO 97/09351)，并且提高重組蛋白生產(chǎn)過(guò)程中的同質(zhì)性。具體而言，至少兩點(diǎn)突變優(yōu)選三點(diǎn)突變已經(jīng)被引入IgG4Fe結(jié)構(gòu)域中。在本發(fā)明的Robol-Fc LURobol-Fc L2和Robol-Fc L3分子中，優(yōu)選的突變?nèi)缦?
-S241P (Kabat編號(hào))，以穩(wěn)定Fe鉸鏈區(qū)中的二硫鍵；
-L248E (Kabat編號(hào))，以消除IgG4_Fc結(jié)構(gòu)域的殘留效應(yīng)子活性；
-C末端賴氨酸缺失，以降低蛋白的異質(zhì)性。
[0013]如上所述的包含Robol同種型b的Igl和Ig2結(jié)構(gòu)域、接頭和突變的IgG4結(jié)構(gòu)域的本發(fā)明的 Robol-Fc 分 子是 Robol-Fc Ll> Robol-Fc L2 和 Robo 1-Fe L3。
[0014]Robol-Fc LI對(duì)應(yīng)序列SEQ ID N0.4的蛋白，由核苷酸序列SEQ ID N0.3編碼。
[0015]Robol-Fc L2對(duì)應(yīng)序列SEQ ID N0.6的蛋白，由核苷酸序列SEQ ID N0.5編碼。
[0016]Robol-Fc LI和Robol-Fc L2區(qū)別在于接頭的性質(zhì)。
[0017]Robol-Fc L3對(duì)應(yīng)序列SEQ ID N0.24的蛋白，由核苷酸序列SEQ ID N0.23編碼。
[0018]在本發(fā)明的一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，已經(jīng)引入一個(gè)或多個(gè)點(diǎn)突變或缺失來(lái)提高生產(chǎn)過(guò)程中的同質(zhì)性。具體而言，已經(jīng)在N末端位置上截短了一個(gè)氨基酸優(yōu)選兩個(gè)氨基酸。本發(fā)明這樣的Robo-1-Fc分子是Robol-Fc L3分子,其中兩個(gè)氨基酸(Ser20和Arg21)已被截短，并且其中氨基酸Leu22已經(jīng)與白細(xì)胞介素2的信號(hào)肽融合。
[0019]如之前描述，本發(fā)明的Robol-Fc分子的同質(zhì)性還通過(guò)缺失C末端Lys來(lái)提高。
[0020]本發(fā)明的主題還是這樣的蛋白，所述蛋白的蛋白序列對(duì)應(yīng)于序列SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.6 或 SEQ ID N0.24，或者與序列 SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.4、SEQID N0.6或SEQ ID N0.24具有至少80%、85%、90%、95%或99%同一性。這些蛋白變體具有與具有序列SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.6或SEQ ID N0.24的蛋白相同的生物學(xué)活性，具體為它們與Slit家族的蛋白相互作用的能力。
[0021]本發(fā)明的Robol-Fc蛋白可以通過(guò)將編碼這些蛋白的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入任何適合于真核重組蛋白表達(dá)的細(xì)胞類型:HEK293、CHO等中來(lái)生產(chǎn)，并且隨后根據(jù)常規(guī)方法在培養(yǎng)上清液中回收并且純化。
[0022]本發(fā)明的Robol-Fc LURobol-Fc L2和Robol-Fc L3蛋白的定性已經(jīng)使確認(rèn)它們具有作為生物治療劑對(duì)于其施用所必需的性質(zhì)成為可能。
[0023]本發(fā)明的Robol-Fc蛋白具有與Slit家族的蛋白相互作用的能力。
[0024]本發(fā)明的Robol-Fc蛋白具體通過(guò)與它們的D2結(jié)構(gòu)域相互作用來(lái)特定地識(shí)別人SlitU Slit2和Slit3蛋白以及鼠Slit2蛋白。它們對(duì)于Slit家族的3個(gè)成員的親和力是相似的。
[0025]本發(fā)明的另一主題對(duì)應(yīng)編碼本發(fā)明的蛋白的核酸分子。
[0026]因此，對(duì)應(yīng)于序列SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.5 或 SEQ ID N0.23 或者與具有序列SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.5或SEQ ID N0.23的分子具有至少80%、85%、90%、95%或99%同一性的核酸分子是本發(fā)明的一部分。
[0027]本發(fā)明的另一主題由本發(fā)明的Robol-Fc蛋白治療其中Slit家族的蛋白過(guò)量表達(dá)的疾病的用途組成。 [0028]可以被本發(fā)明的Robol-Fc靶向的Slit家族的蛋白是Slitl、Slit2或Slit3。
[0029]已顯示Robol能夠與Slit家族的多個(gè)成員相互作用。因此，有利地注意到本發(fā)明的Robol-Fc蛋白能夠同時(shí)抑制由Slitl、Slit2和Slit3介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，其使得與僅對(duì)這些途徑之一是特異性的抗體相比拓寬治療范圍成為可能。
[0030]在另一個(gè)實(shí)施方式中，Robol-Fc蛋白用于治療其中Slit家族的蛋白過(guò)量表達(dá)的疾病，其通過(guò)抑制血管發(fā)生而不抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖來(lái)進(jìn)行。將這種與血管成熟缺陷相關(guān)的抗血管發(fā)生活性稱為“非生產(chǎn)性血管發(fā)生”。
[0031]具體而言，實(shí)驗(yàn)研究已經(jīng)顯示本發(fā)明的Robol-Fc分子能夠抑制小管的形成，而不抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖。它們使得在肺癌的小鼠模型中非常顯著地降低腫瘤體積成為可能。
[0032]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，可以用于治療其中Slit蛋白過(guò)量表達(dá)的疾病的Robol-Fc蛋白是Robol-Fc LU Robol-Fc L2和Robol-Fc L3，并且源自其中的分子具體包括旨在提高生產(chǎn)過(guò)程中的同質(zhì)性而不會(huì)顯著改變這些分子的生物學(xué)特性的點(diǎn)突變或缺失。
[0033]通常，可以用本發(fā)明的Robo-1-Fc蛋白治療的疾病是所有其中Slit途徑的抑制可以具有治療作用的疾病，具體是其中Slit家族的蛋白過(guò)量表達(dá)的疾病，并且具體是其中Slit2過(guò)量表達(dá)的疾病。
[0034]由于本發(fā)明的Robol-Fc分子具體結(jié)合Slit2分子,有趣的是注意到所述分子能夠同時(shí)抑制其中Slit2參與的兩條途徑，即Robol/Slit2和Robo4/Slit2途徑。
[0035]在本發(fā)明的一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，本發(fā)明的Robol-Fc蛋白用于治療癌癥，具體為胰癌、結(jié)腸癌、具有或不具有淋巴轉(zhuǎn)移的結(jié)腸直腸癌、乳腺癌、肺癌和肺轉(zhuǎn)移、卵巢癌、子宮頸癌、黑素瘤、腎癌、口腔癌、前列腺癌、肝癌等。在一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，所述癌癥是其中Slit2過(guò)量表達(dá)的癌癥。
[0036]在一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，Robo-Fc蛋白用于治療肺癌。
[0037]在另一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，Robo-Fc蛋白用于治療肝癌，如例如肝癌、肝細(xì)胞癌(HCC)、纖維板層癌(肝細(xì)胞癌的病理學(xué)變體)、膽管癌、肝母細(xì)胞瘤或肝的血管肉瘤。
[0038]本發(fā)明的Robol-Fc分子還可以用作抗癌藥物作為目前治療的替代物或補(bǔ)充物。
[0039]具體而言，這些分子可以與抗癌化合物組合(任選同時(shí))施用。
[0040]本發(fā)明的另一主題涉及包含如上文定義的Robol-Fc蛋白和一種或多種藥學(xué)上可接受的賦形劑的組合物。
[0041]本發(fā)明的Robol-Fc蛋白可以配制于藥物組合物中以進(jìn)行局部、口部、腸胃外、鼻內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、眼內(nèi)等施用。優(yōu)選地，藥物組合物包含用于可注射制劑的藥學(xué)上可接受的載體。它們具體可以是等滲的無(wú)菌鹽溶液(磷酸二氫鈉或磷酸氫二鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣或氯化鎂等，或這些鹽的混合物)，或干燥的具體是冷凍干燥的組合物，其適當(dāng)?shù)赝ㄟ^(guò)加入無(wú)菌水或生理鹽水來(lái)允許可注射溶質(zhì)的形成。
[0042]本發(fā)明的另一方面由Robol-Fc分子作為診斷工具檢測(cè)患者中Slit家族分子的過(guò)量表達(dá)的用途組成。這是由于已經(jīng)顯示Slit途徑涉及許多癌。提供用于評(píng)價(jià)Slit信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的紊亂的檢測(cè)對(duì)于選擇患者的目的是非常有幫助的，所述患者能夠響應(yīng)基于施用Robol-Fc分子的治療。
[0043]診斷工具可以是即開(kāi)即用試劑盒形式，包含以適合于將其與來(lái)自患者的生物樣品(血液、尿、腫瘤活組織檢查)接觸的形式的Robol-Fc分子，所述患者易于表現(xiàn)為Slit分子的過(guò)量表達(dá)。可以任選預(yù)先標(biāo)記Robo-Fc分子，并且檢測(cè)Robo-Fc和Slit的結(jié)合，以評(píng)價(jià)與對(duì)照樣品相比生物樣品中Slit蛋白表達(dá)的升高。該試劑盒例如可以為ELISA試劑盒的形式。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0044]圖1: Robo 1-Fe Ll、 Robol-Fc L2 和 Robo 1-Fe L3 蛋白的表達(dá)質(zhì)粒。
[0045]圖2:通過(guò)ELISA的Robol-Fc融合蛋白變體與Slit2蛋白相互作用的評(píng)價(jià)。
[0046]圖3:通過(guò)FACS測(cè)定的Robol-Fc對(duì)不表達(dá)Slit2的HEK293細(xì)胞的親和力。
[0047]圖4:通過(guò)FACS測(cè)定的Robol-Fc對(duì)表達(dá)Slit2的HEK293細(xì)胞的親和力。
[0048]圖5:在小鼠中靜脈注射后Robol-Fc蛋白的藥代動(dòng)力學(xué)概況A。施用Robol-FcLI, B.施用 Robol-Fc L2。
[0049]圖6:用內(nèi)皮細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞的共培養(yǎng)試驗(yàn)中Robol-Fc LI分子的作用。A.Robol-Fc LI抑制培養(yǎng)中小管形成。B.Robol-Fc LI顯著抑制VEGF誘導(dǎo)的假小管形成。
[0050]圖7 =Robol-Fc LI分子在小鼠中的離體主動(dòng)脈環(huán)模型中的作用的評(píng)價(jià)。A:制備主動(dòng)脈環(huán)和測(cè)量小管的方案描述。B: a.對(duì)照;b.Robol-Fc Slit2_minus 500 Pg/mL +VEGF 10 ng/mL; c.Robol-Fc LI 500 Pg/mL + VEGF 10 ng/mL。
[0051]圖8:對(duì)照組中和已接受以25 mg/kg的4次Robol-Fc注射的組中細(xì)胞注射后28天的平均腫瘤重(SCID小鼠的肝的左葉中的IfepG2細(xì)胞)。
[0052]圖9:對(duì)照組中和已接受一周兩次5 mg/kg的Robol-Fc注射的組中細(xì)胞注射后28天的平均腫瘤重(SCID小鼠的肝的一葉的Ifep3B細(xì)胞)。
[0053]圖10:對(duì)照組中和已接受一周兩次5 mg/kg的Robol-Fc的組中血衆(zhòng)AFP濃度。實(shí)施例
[0054]實(shí)施例1 =Robol-Fc蛋白的制備
a.用作生物治療劑的允許Robol-Fc重組蛋白的表達(dá)的構(gòu)建體Robol-Fc重組蛋白由人Robol蛋白同種型b (NP_598334)的前兩個(gè)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域(Igl-1g2)和人免疫球蛋白 G4 的 Fe 結(jié)構(gòu)域(hIgG4-Fc, SwissProt IGHG4_HUMAN)之間的融合組成。
[0055]為了獲得Robol-Fc LI構(gòu)建體，使用人胎心cDNA文庫(kù)(參考號(hào)HL5042T，Clontech)通過(guò)PCR擴(kuò)增cDNA (SEQ ID N0.1)的片段，所述片段對(duì)應(yīng)該蛋白(SEQ ID N0.2)的免疫球蛋白(Ig)結(jié)構(gòu)域Igl和Ig2，其后為GluArgProSerPheVal接頭。將該擴(kuò)增片段隨后克隆至真核表達(dá)載體pXL4904 (描述于圖1中)中，使Robol的兩個(gè)Ig結(jié)構(gòu)域在C末端位置與人IgG4的Fe結(jié)構(gòu)域融合表達(dá)。將三點(diǎn)突變引入IgG4-Fc結(jié)構(gòu)域中以獲得以下特征:S241P (Kabat編號(hào))，以穩(wěn)定Fe鉸鏈區(qū)中的二硫鍵；L248E，以消除IgG4_Fc結(jié)構(gòu)域的殘留效應(yīng)子活性；C末端賴氨酸缺失，以降低蛋白的異質(zhì)性。用于表達(dá)該重組蛋白的cDNA序列對(duì)應(yīng)序列SEQ ID N0.3。將所獲的重組蛋白稱為Robol-Fc LI，并且對(duì)應(yīng)蛋白序列SEQ IDN0.4。[0056]為了獲得Robol-Fc L2構(gòu)建體，將對(duì)應(yīng)于Igl_Ig2結(jié)構(gòu)域但無(wú)提及的接頭的相同cDNA克隆至真核表達(dá)載體pXL4909 (描述于圖1中)中，其允許這些Ig結(jié)構(gòu)域與包含在Robol-Fc LI的構(gòu)建中描述的3個(gè)點(diǎn)突變的IgG4的相同F(xiàn)e結(jié)構(gòu)域融合表達(dá)，但這次在Fe結(jié)構(gòu)域的上游引入了 GlyGlyGlyGlySer接頭。用于表達(dá)該重組蛋白的cDNA序列對(duì)應(yīng)序列SEQ ID N0.5。將所獲的重組蛋白稱為Robol-Fc L2，并且對(duì)應(yīng)蛋白序列SEQ ID N0.6。
[0057]b.用作對(duì)照的Robol-Fc蛋白的構(gòu)建
為了獲得Robol-Fc Slit2-minus構(gòu)建體，通過(guò)PCR修飾之前克隆入pXL4904質(zhì)粒的cDNA,以引入允許位置38的亮氨酸置換為谷氨酰胺和位置89的苯丙氨酸置換為酪氨酸的點(diǎn)突變。用于表達(dá)該重組蛋白的cDNA序列對(duì)應(yīng)序列SEQ ID N0.7。將所獲的重組蛋白稱為Robol-Fc Slit2-minus，并且對(duì)應(yīng)蛋白序列 SEQ ID N0.8。
[0058]為了獲得Robol-Fc肝素-minus構(gòu)建體，通過(guò)PCR修飾克隆入pXL4904質(zhì)粒的cDNA,以引入允許位置97的精氨酸置換為苯胺和位置98的賴氨酸置換為丙氨酸的點(diǎn)突變。用于表達(dá)該重組蛋白的cDNA序列對(duì)應(yīng)序列SEQ ID N0.9。將所獲的重組蛋白稱為Robol-Fc肝素-minus，并且對(duì)應(yīng)蛋白序列SEQ ID N0.10。
[0059]c.多種Robol-Fc蛋白的生產(chǎn)
分別使用PXL4904和pXL4909質(zhì)粒以及如在申請(qǐng)W02008/065543中已描述的允許兩個(gè)N-聚糖糖基化酶即α _2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶和β-1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶表達(dá)的輔助質(zhì)粒 pXL4544 和 pXL4551 通過(guò)在 ΗΕΚ293 系(FreeStyle 293-F 細(xì)胞，參考號(hào) 51-0029，Invitrogen,根據(jù)供應(yīng)商推薦)中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染來(lái)生產(chǎn)兩個(gè)蛋白R(shí)obol-Fc LI和Robol-FcL2。還分別使用pXL4904和pXL4909質(zhì)粒通過(guò)在CHO系(CH0-S細(xì)胞，參考號(hào)11619-012，Invitrogen,根據(jù)供應(yīng)商推薦)中轉(zhuǎn)染來(lái)生產(chǎn)這些蛋白。
[0060]通過(guò)在蛋白A 親和柱(MabSelect 參考號(hào) 17-5199-02，Amersham Biosciences)上層析和在20 mM NaCl / 100 mM乙酸緩沖液中洗脫，并且隨后在PBS緩沖液(參考號(hào)14190-094, Invitrogen)中配制來(lái)純化HEK293細(xì)胞的培養(yǎng)上清液中表達(dá)的Robol-Fc LI和 Robol-Fc L2 蛋白。
[0061]Robol-Fc Slit2_minus和Robol-Fc肝素-minus重組蛋白以相同方式生產(chǎn)并純化。
[0062]d.Robol-Fc重組蛋白的物理化學(xué)特征
SDS-PAGE和凝膠滲透分析可以顯示蛋白是二聚化的并且多于96%純。質(zhì)譜分析可以證明這些蛋白的同一性，去糖基化的蛋白的測(cè)定重量與計(jì)算機(jī)計(jì)算的重量完全一致。如Saddic 等 2002.(Methods Mol.Biol.194: 23-36 和 Anumula 等 1998.Glycobiology8: 685-694)描述的單糖組合物分析和N-聚糖唾液酸的定量可以證明蛋白在非常大程度上被唾液酸化。結(jié)果顯示于表1中。將要注意Robol-Fc LI和Robol-Fc L2分子的N末端分析顯示這些純化的蛋白包含可變比例(O至40% )的具有前2個(gè)殘基(絲氨酸20和Arg20)截短的形式。
[0063]表1:Robol_Fc 蛋白同一件
【權(quán)利要求】
1.重組蛋白，其包含源自RobOl蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域或該結(jié)構(gòu)域的部分，用于治療癌癥。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的重組蛋白，其中所述癌癥是肝癌。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2任一項(xiàng)的重組蛋白，其不抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的重組蛋白，其中所述胞外結(jié)構(gòu)域是源自Robol蛋白的同種型b的胞外結(jié)構(gòu)域。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的重組蛋白，其中所述Robol的胞外結(jié)構(gòu)域或其部分由所述胞外結(jié)構(gòu)域的Igl和Ig2免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域組成。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的重組蛋白，其中所述Robol的胞外結(jié)構(gòu)域具有與序列SEQID N0.2至少80%的同一性。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的重組蛋白，其中所述蛋白進(jìn)一步包含接頭和免疫球蛋白Fe結(jié)構(gòu)域。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的重組蛋白，其中所述Fe結(jié)構(gòu)域來(lái)自人免疫球蛋白G4。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的重組蛋白，其中所述Fe結(jié)構(gòu)域包含S241P和L248E突變，并且其中位于C末端位置的賴氨酸缺失。
10.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的重組蛋白，其序列具有與序列SEQID N0.4、SEQ IDN0.6 或 SEQ ID N0.24 至少 80%的同一性。
11.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的重組蛋白，其序列是序列SEQID N0.4、SEQ ID N0.6或 SEQ ID N0.24。
【文檔編號(hào)】A61K38/18GK103703021SQ201180068378
【公開(kāi)日】2014年4月2日 申請(qǐng)日期:2011年12月22日 優(yōu)先權(quán)日:2010年12月23日
【發(fā)明者】F.多爾-格萊茲, G.蓋蓋恩多布斯 申請(qǐng)人:賽諾菲