使t細胞重定向針對cd70陽性惡性腫瘤的嵌合cd27受體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及與T細胞相關的方法和組合物，其中使所述T細胞針對CD70重定向用于CD70陽性惡性腫瘤的免疫療法。在本發(fā)明的多個方面，使用具有CD70特異性的T細胞。在具體方面，存在表達新分子的T細胞，所述T細胞包含與T-細胞受體復合物的ζ信號傳導結構域融合的全長CD70受體(CD27)。這類T細胞識別CD70陽性腫瘤細胞并且具有針對CD70陽性癌細胞的溶細胞活性。
【專利說明】使T細胞重定向針對CD70陽性惡性腫瘤的嵌合CD27受體
[0001]相關申請的交叉引用
[0002]本申請要求2010年10月27日提交的美國臨時專利申請系列號61/407，189的優(yōu)先權，所述文獻通過引用的方式完整并入本文。
[0003]關于聯(lián)邦贊助研究或開發(fā)的聲明
[0004]本發(fā)明是借助美國政府支持在NIH/NCI資助的P01CA094237下和在NIH/NIDDK資助的T32DK64717下以及在NIH資助的5T32HL092332-07下做出的。美國政府享有本發(fā)明中的某些權利。
【技術領域】
[0005]本發(fā)明的實施方案涉及細胞生物學、分子生物學、免疫學和藥物領域。
【背景技術】
[0006]采用抗原特異性T細胞的免疫療法已經(jīng)在臨床前模型中以及I/II期臨床研究中治療血液學惡性腫瘤方面顯示出前景。(Leen等人，2007 ；Bollard等人，2007 ；6月，2007 ；Rosenberg等人，2008 ；DiStasi等人，2009 ;Vera等人，2006)。一項有吸引力的產(chǎn)生腫瘤特異性T細胞的策略是用嵌合抗原受體(CAR)進行遺傳修飾，所述嵌合抗原受體由胞外抗原識別結構域、跨膜結構域和源自經(jīng)常與共刺激分子胞內(nèi)結構域連接的T-細胞受體CD3- δ鏈的胞內(nèi)信號傳導結構域組成。(Rossig和Brenner, 2004 ；Sadelain等人，2003)。已經(jīng)廣泛地探索了用于治療血液學惡性腫瘤的靶向CD19和CD20抗原的CAR，但是因為可能長久的T細胞壽命，所以這種方案限于B細胞衍生的惡性腫瘤并且可能引起延長的體液免疫受損。(Till等人，2008 ；Cooper等人，`2005)。因此合乎需要的是制備針對替代抗原的CAR，所述CAR可能拓寬潛在可治療腫瘤的范圍和/或減少對正常細胞的損害。
[0007]⑶70是⑶27受體的膜結合配體,其屬于腫瘤壞死因子受體超家族。(Hintzen等人，1994 ；Bowman等人，1994)。⑶70由彌散大B細胞和濾泡淋巴瘤表達并且也由霍奇金淋巴瘤、Waldenstrom巨球蛋白血癥和多發(fā)性骨髓瘤的惡性細胞及HTLV-1相關和EBV相關的惡性腫瘤表達。(Agathanggelou 等人，1995 ；Hunter 等人，2004 ；Lens 等人，1999 ；Baba等人，2008)。另外，⑶70由非血液學惡性腫瘤如腎細胞癌和膠質(zhì)胚細胞瘤表達。(Junker等人，2005 ；ChahIavi等人，2005)。在生理學上，⑶70瞬時表達并且限于高度活化的T細胞、B細胞和樹突細胞的亞群。盡管CD70/CD27共刺激在T-細胞活化方面發(fā)揮作用，但是CD70/CD27信號傳導不是有功能的免疫系統(tǒng)形成和維持必需的，因為CD27敲除小鼠不具有明顯免疫缺陷并且在與野生型小鼠相同的時限內(nèi)從流感病毒感染中恢復。(Hendriks等人，2000 ；Nolte 等人，2009)
[0008]發(fā)明簡述
[0009]本發(fā)明指向涉及治療和/或預防癌癥的免疫療法的方法和/或組合物。在具體方面，本發(fā)明的實施方案涉及T細胞，其中使所述T細胞針對CD70重定向用于免疫治療CD70陽性惡性腫瘤，包括例如惡性腫瘤。本發(fā)明可以用于任何哺乳動物(雄性或雌性)，包括人、犬、貓、馬等。
[0010]⑶70 (腫瘤壞死因子超家族成員)的表達限于活化的T淋巴細胞和B淋巴細胞及成熟的樹突細胞。CD70與其受體CD27的結合在T-細胞的致敏、效應子功能、分化和記憶形成以及血漿B細胞和記憶B細胞產(chǎn)生方面是重要的。具體而言，⑶70在種類廣泛的a)血液學惡性腫瘤，例如多發(fā)性骨髓瘤，非霍奇金淋巴瘤和霍奇金病、b)實體瘤，例如腎細胞癌、胰腺癌、卵巢癌、肺癌和鼻咽癌，和c)腦腫瘤，例如多形膠質(zhì)胚細胞瘤上表達。使用單克隆抗體在動物模型中的臨床前研究已經(jīng)驗證了 CD70作為免疫治療靶。本發(fā)明人現(xiàn)在已經(jīng)采用遺傳方法使T細胞重定向針對CD70陽性惡性腫瘤。出于這個目的，本發(fā)明人已經(jīng)構建一種新分子(CD27()，其由與T-細胞受體復合物的(信號傳導結構域融合的全長CD70受體(⑶27)組成。通過逆轉錄病毒轉導生成表達⑶27 (的T細胞，并且表達⑶27 (的T細胞識別CD70陽性腫瘤細胞，如與未轉導的T細胞相反，它們在隨CD70陽性腫瘤細胞共培養(yǎng)后增殖并產(chǎn)生IFN- y以及IL-2的能力判定。此外，表達⑶27 ;的T細胞具有溶細胞活性并殺傷CD70陽性腫瘤細胞，而CD70陰性腫瘤細胞未遭殺傷。
[0011]在本發(fā)明的一個實施方案中，存在用于減少或預防腫瘤的方法，所述方法包括將編碼本發(fā)明嵌合受體的核酸構建體導入具有或疑似具有腫瘤的個體的分離的T細胞并將這些T細胞遞送(如通過注射)至該個體中，從而嵌合受體在T細胞的表面上表達以便激活該個體中的抗腫瘤免疫力，因而減少或預防腫瘤。
[0012]在本發(fā)明的一個實施方案中，存在識別CD70抗原并且包含胞內(nèi)信號傳導結構域的嵌合抗原受體。在特定的實施方案中，該受體存在于細胞(如T細胞)上。在特定的實施方案中，該受體進一步限定為CD70受體，例如CD27。在某些實施方案中，胞內(nèi)信號傳導結構域是T-細胞受體⑶3-(鏈。
[0013]在本發(fā)明的一些實施方案中，存在靶向具有CD70抗原的細胞的方法，所述方法包括步驟:向所述細胞提供包含本發(fā)明嵌合受體的另一種細胞。在特定的實施方案中，被靶向的細胞可以是任何種類的包含CD70抗原的細胞，包括癌細胞，并且在具體實施方案中，它們例如是血液學惡性細胞。在某些方面，它們例如是淋巴瘤細胞、腎細胞癌細胞或成膠質(zhì)細胞瘤細胞。在一些方面，癌細胞例如是HTLV-1-相關的惡性細胞或EBV-相關的惡性細胞。在特定的實施方案中，癌細胞是CD70陽性的。在特定的實施方案中，正在治療的癌癥是腎細胞癌、胸腺癌瘤、鼻咽癌、腦腫瘤、霍奇金和非霍奇金淋巴瘤、Waldenstoom巨球蛋白血癥、慢性淋巴細胞白血病、T-細胞白血病、多發(fā)性骨髓瘤、EBV相關和HTLV-1相關的惡性腫瘤、腎癌、胰腺癌、喉癌、咽癌、黑色素瘤、卵巢癌、肺癌(包括肺腺癌)、結腸癌、乳腺癌或腦癌。
[0014]在本發(fā)明的特定實施方案中，包含嵌合受體的T細胞靶向包含CD70抗原的任何細胞，無論靶向的細胞是否為癌性的。例如，在一些實施方案中，CD70在與自身免疫病相關的細胞上表達，如在與本發(fā)明相關的某些方面，存在對自身免疫性有貢獻的CD70-CD27共刺激作用的失調(diào)。在特定的實施方案中，CD70細胞存在于中患有自身免疫病如類風濕性關節(jié)炎(RA)、關節(jié)炎(包括銀屑病關節(jié)炎)、炎癥、自身免疫腦炎、炎性腸病、結腸炎和狼瘡的個體。
[0015]在本發(fā)明的一個實施方案中，存在治療個體中CD70陽性惡性細胞的方法，所述方法包括步驟:用包含本發(fā)明嵌合抗原受體的腫瘤特異性T細胞靶向CD70陽性惡性細胞。在特定的實施方案中，個體已經(jīng)接受或正在接受或將要接受額外的抗癌療法，如手術、放療、化療、免疫療法或激素療法。
[0016]前文已經(jīng)相當廣泛地概述了本發(fā)明的特征和技術優(yōu)點，目的在于可以更好理解隨之而來的本發(fā)明的詳細描述。本發(fā)明的額外特征和優(yōu)點將在下文描述，這形成本發(fā)明權利要求的主題。本領域技術人員應當理解，可以容易地使用所公開的構思和具體實施方案作為修改或設計用于實施本發(fā)明相同目的其他結構的基礎。本領域技術人員也應當認識到，這類等同結構不脫離如所附權利要求書中所述的本發(fā)明精神和范圍。聯(lián)系附圖考慮時，將從以下描述中更好地理解就其組織和操作方法而言據(jù)信是本發(fā)明特征的新特性，連同其他目的和優(yōu)點。然而，將明確地理解，每張圖僅出于說明和描述目的而提供并且是不意在作為限制本發(fā)明的定義。
[0017]附圖簡述
[0018]為了更完整地理解本發(fā)明，現(xiàn)在參考結合附圖所取得的以下描述，其中:
[0019]圖1:⑶70-CAR產(chǎn)生、細胞表面表達和人T細胞轉導。(A)通過將全長⑶27與⑶3-ζ鏈的信號傳導結構域(IRES序列)融合來產(chǎn)生⑶70-CAR，并且包含t⑶19以便檢測遺傳修飾的T細胞。(B)用⑶70-CAR構建體轉染的293T細胞表達⑶27和標記基因t⑶19。(C)在轉導的人T細胞上的⑶70-CAR表達是45%(+/-6)，如通過對t⑶19染色所確定。(D)CD4T細胞和CD8T細胞均是遺傳修飾的。
[0020]圖2:⑶70在幾個腫瘤細胞系上但不在正常淋巴細胞上過量表達。少于5%來自健康供體外周血的B和T淋巴細胞表達⑶70。K562和K562.70充當陰性對照和陽性對照。在非霍奇金細胞(Daud1、SNK6、SNT16)、霍奇金細胞(L1236)、ALL (CCL-120)和多發(fā)性骨髓瘤(U266)細胞上觀察到⑶70過量表達。
[0021]圖3:CD70特異性T細胞釋放IFN-Y、IL_2，應答于⑶70陽性靶細胞而增殖。(A)將來自3位供體的T細胞用⑶70- CAR (黑色)轉導或不轉導(灰色)并且在進行IFN-Y ELISA之前與K562.70和K562以及表達⑶70的各種腫瘤細胞系共培養(yǎng)48小時。黑色矩形和灰色矩形分別代表⑶70-CAR轉導或未轉導的T細胞的平均IFN-Y釋放。⑶70-CAR T細胞是對⑶70特異的，因為與K562細胞相比，顯著地(p〈0.03)更多的IFN-Y在K562.70存在的情況下釋放。與表達⑶70的腫瘤細胞系共培養(yǎng)時，⑶70-CAR T細胞也比未轉導的T細胞釋放顯著(P〈0.0001)更多的IFN-Y。(B)相同的共培養(yǎng)實驗，但是分析IL-2的存在。在表達⑶70的腫瘤存在的情況下，⑶70-CAR T細胞比未轉導的T細胞釋放顯著(p〈0.0001)更多的IL-2。(C)將T細胞用CFSE標記并且在外源IL-2不存在的情況下與K562、K562.70、SNT16或Daudi共培養(yǎng)5日并且通過流式細胞術分析CFSE稀釋物。與過量表達⑶70的靶Κ562.70和SNT16共培養(yǎng)時，CD70-CART細胞增殖，但是與CD70-暗(CD70_dim)的Daudi細胞或⑶70陰性K562細胞共培養(yǎng)時，不增殖。
[0022]圖4:⑶70特異性T細胞殺傷⑶70陽性腫瘤細胞系。(A)⑶70-CART細胞(實線)殺傷K562.70細胞但是不殺傷親本K562細胞。未轉導的對照T細胞(虛線)不殺傷任何一種靶。(B)CD70-CART細胞(實線)殺傷CD70陽性Daud1、U266、SNK6，和SNT16腫瘤細胞系；對照T細胞(短劃線)則不殺傷。(C)將CD70特異性T細胞或未轉導的T細胞用CFSE標記并且與SNT16細胞以2:1比率共培養(yǎng)。⑶70特異性T細胞增殖并殺傷SNT16細胞，如通過⑶3+細胞的CFSE稀釋物和與未轉導的T細胞相比，培養(yǎng)物中缺少⑶3/CFSE-陰性細胞所顯示。(D)在全部共培養(yǎng)實驗中，僅⑶70特異性T細胞消除⑶3/CFSE-陰性⑶70+腫瘤細胞 Daud1、U266、SNK6 和 SNT16。
[0023]圖5:⑶27共刺激作用增強T-細胞生存力。(A)在Co-1P實驗中，僅全長⑶27-;與TRAF2締合。(B)在51Cr釋放測定法中，表達CD70-CAR或A CD70-CAR的T細胞顯示同等殺傷CD70+LCL和U266細胞，但是不殺傷CD70-K562細胞。(C)表達CD70-CAR或A CD7O-CAR的T細胞(其用經(jīng)遺傳修飾以表達CD70的自體成纖維細胞活化)的顯微鏡評價(IOX)揭示出表達⑶70-CAR的T細胞的較大‘T-細胞團塊'，然而CFSE稀釋分析顯示各組之間增殖的顯著差異。(D) A⑶70-CART細胞的生存力是表達⑶70-CAR的T細胞的(n=5)生存力的35% (+/-16%)。(E)對采用⑶70轉基因自體成纖維細胞刺激后3日的T細胞進行Bcl_xl胞內(nèi)染色。與ACD70-CART細胞(n=3)相比，Bcl_xl表達在CD70-CART細胞中一致地增加。顯不一個代表性FACS分析。
[0024]圖6:⑶70特異性T細胞識別并殺傷⑶70陽性原發(fā)淋巴瘤。(A)來自3位B-細胞淋巴瘤患者和I位T-細胞急性淋巴性白血病患者的過量表達CD70的腫瘤細胞與來自健康供體的CD70特異性T細胞或未轉導的T細胞在進行IFN- y ELISA之前共培養(yǎng)48小時。在全部情況下，⑶70特異性T細胞在患者腫瘤細胞存在的情況下釋放IFN- y，而未轉導的細胞釋放少量IFN- y至不釋放IFN- y。(B，C)共培養(yǎng)測定法用原發(fā)腫瘤細胞和CFSE標記的T細胞進行以通過FACS分析區(qū)分效應子和靶細胞。僅⑶70特異性T細胞(⑶3/CFSE陽性細胞)是能夠根除患者腫瘤細胞(P=0.036)。
[0025]圖7:⑶70特異性T細胞在`淋巴瘤的鼠異體移植模型中顯示體內(nèi)抗腫瘤活性。(A-B)將表達eGFP-FFLuc基因的Daudi細胞(5x10s)腹內(nèi)注射至SCID小鼠中。將腫瘤生長計量為漸增的光信號(光子/sec/cmVsr)。在第10、11和17日，將小鼠用IxlO7個⑶70特異性或未轉導的T細胞注射。在處理后7日，用⑶70特異性T細胞處理的腫瘤退行，而用未轉導的T細胞處理的腫瘤不退行(P=0.002)。小圖A顯示代表性動物的圖像。小圖B顯示定量性生物發(fā)光成像。在小圖C和D中，將Raji細胞(2xl05)靜脈內(nèi)注射至SCID小鼠中。在第4、5和11日，將小鼠用IxlO7個⑶70特異性或未轉導的T細胞注射。(C)使用生物發(fā)光成像法，計數(shù)全身性腫瘤。在注射腫瘤細胞后3周和4周，與CD70特異性T細胞相比，在接受未轉導的T細胞的小鼠中存在顯著更高的腫瘤負荷(第3周，P=.012 ;第4周[(n=86]，P.010)。(D)用⑶70特異性T細胞處理的小鼠顯示勝過接受未轉導的T細胞的那些小鼠的明顯存活優(yōu)勢(P〈.05)。
[0026]圖8.⑶70特異性T細胞顯示針對自體B和T細胞的最小反應性。(A)將來自3位健康供體的⑶70特異性T細胞(IxlO5)單獨鋪種、在下5xl04個自體T細胞、B細胞或Raji細胞存在的情況鋪種或用PMA/離子霉素刺激。觀察到針對Raji細胞并在PMA/離子霉素處理后的強烈反應性，但是沒有觀察到針對自體T或B細胞的強烈反應性，如通過IFN-y ELISP0T測量。(B)在4小時51鉻釋放測定法中，⑶70特異性T細胞殺傷Raji細胞和B胚細胞，但是不殺傷0KT3胚細胞。未轉導的細胞顯示未殺死任何靶(實線-CD70特異性T細胞，虛線-未轉導的T細胞)。
[0027]圖9.產(chǎn)生表達 CD70-CAR 和 A CD 70-CAR DsRed 的 T 細胞。⑷修飾 CD70-CAR表達盒以包括用于檢測和選擇轉導T細胞的DsRed。通過PCR缺失⑶27胞內(nèi)結構域中的23個氨基酸產(chǎn)生A⑶70-CAR并且將其克隆至DsRed表達盒中。(B)轉導效率在表達CD70-CAR-1-DsRed 或 A CD70_CAR-1DsRed 的 T 細胞之間相當。[0028]本發(fā)明詳述
[0029]如本文所用，在權利要求和/或本說明書中與術語“包含”聯(lián)合使用時，詞語“一 個”或“一種”的使用可以意指“一 (one) ”，但是它還符合以下意思：“一或多”、“至少一”和 “一或多于一”。一些本發(fā)明的實施方案可以由本發(fā)明的一個或多個要素、方法步驟和/或 方法組成或基本上由其組成。構思了本文所述的任何方法或組合物可以相對于本文所述的 任何其他方法或組合物來實施。
[0030]用⑶70特異性單克隆抗體靶向⑶70陽性惡性腫瘤已經(jīng)在臨床前動物模型中顯示 前景(McEarchern 等人，2008 ；Israel 等人,2005 ;McEarchern 等人,2007),本發(fā)明人現(xiàn)在 評價是否可以通過強迫表達適宜的CAR將T細胞重定向針對CD70。由于CAR由源自鼠單克 隆抗體的胞外抗原識別結構域組成，故除非完全人源化，否則它們可能在輸注時誘導人抗 小鼠抗體(HAMA)。(Miotti等人,1999 ；Kershaw等人,2006)。一項克服這種局限的可能 策略是使用內(nèi)源蛋白質(zhì)配體或受體而非單克隆抗體工程化這種抗原識別結構域。（Kahlon 等人，2004 ；Zhang等人，2006)。為了用T細胞靶向⑶70，我們利用生理性CD70/CD27相互 作用的優(yōu)點并且產(chǎn)生⑶70特異性CAR，其由全長⑶27作為與⑶3-(鏈的胞內(nèi)結構域融合 的抗原識別結構域組成。嵌合⑶27-(被表達⑶70配體的腫瘤靶接合導致T-細胞活化和 ⑶27共刺激作用，這依賴于⑶27的胞質(zhì)尾內(nèi)部存在TRAF2結合位點。⑶70特異性T細胞 殺傷CD70陽性腫瘤細胞系以及原發(fā)腫瘤并且在鼠SCID異體移植模型中具有抗腫瘤活性。
[0031]I.本發(fā)明嵌合受體及其用途的實施方案
[0032]在本發(fā)明的實施方案中，存在編碼CD70的受體和胞內(nèi)信號傳導結構域的嵌合受 體。在具體方面，這種CD70受體是識別CD70抗原的多肽。在具體實施方案中，CD70的受 體是CD27。
[0033]雖然在特定實施方案中將任何適合的胞內(nèi)結構域在本發(fā)明的嵌合受體中使用，但 是在具體實施方案施中，它是CD3的（鏈的部分或全部。在具體實施方案中，胞內(nèi)受體信 號傳導結構域是T細胞抗原受體復合體的那些，如CD3的（鏈，也例如是單獨或與CD3 ; 串聯(lián)的Fc y RIII共刺激信號傳導結構域CD28、DAP10、CD2。在具體實施方案中，胞內(nèi)結構 域(其可以稱作胞質(zhì)結構域)包含TCR ;鏈、CD28、0X40/CD134、4-1BB/CD137、Fc e RI y , IC0S/CD278、ILRB/CD122、IL-2RG/CD132和CD40中一者或多者的部分或全部?？梢允褂靡?個或多個胞質(zhì)結構域，如所謂第三代CAR具有融合在一起例如用于加性或協(xié)同效應的至少 2個或3個信號傳導結構域。
[0034]本發(fā)明的免疫受體可以通過本領域已知的任何手段產(chǎn)生，不過優(yōu)選地使用重組 DNA技術產(chǎn)生。可以通過標準分子克隆技術（基因組文庫篩選、PCR、引物輔助連接、位點定 向誘變等）制備編碼嵌合受體的幾個區(qū)域的核酸序列并且將其裝配成完整的編碼序列。為 了表達免疫受體，將所得到的編碼區(qū)優(yōu)選地插入表達載體中并用來轉化合適的表達宿主細 胞系，優(yōu)選地是T淋巴細胞細胞系，并且最優(yōu)選地是自體T淋巴細胞細胞系，第三方衍生的 T細胞系/克隆、轉化的體液或異種免疫效應細胞系。也可以使用NK細胞、巨噬細胞、嗜中 性粒細胞、LAK細胞、LIK細胞和分化成這些細胞的干細胞。在一個優(yōu)選實施方案中，通過 白細胞生成（leukopharesis)從患者獲得淋巴細胞，并且將自體T細胞轉導以表達;鏈 (zetakine)并通過任何臨床上可接受的手段施用返回至該個體，以實現(xiàn)抗癌療法。
[0035]治療作用的合適劑量將在每劑量約106個至約109個細胞之間，優(yōu)選地以一系列給藥循環(huán)進行。優(yōu)選的給藥方案由4個遞增劑量的I周給藥循環(huán)組成，在第O日以約IO7個細胞開始，遞增式增加最高至截止第5日約IO8個細胞的目標劑量。合適的施用模式包括靜脈內(nèi)、皮下、腔內(nèi)(例如通過儲器接入裝置)、腹內(nèi)和直接注射至腫瘤塊中。
[0036]如本文所用，核酸構建體或核酸序列意在指可以被轉化或導入T細胞中并經(jīng)轉錄和翻譯以產(chǎn)生產(chǎn)物(例如，嵌合受體)的DNA分子。僅通過舉例，GenBankA _錄號NM_001242提供CD27的核苷酸序列，并且將此通過引用的方式并入本文。除CD27之外，⑶27-4分子含有⑶3-4鏈的信號傳導結構域(GenBank ?.登錄號NP_000725.1和NP_932170.1)。
[0037]在本發(fā)明中所用的核酸構建體中，啟動子與編碼本發(fā)明嵌合受體的核酸序列有效連接，即，將它們?nèi)绱税仓茫瑥亩龠M信使RNA從編碼嵌合受體的DNA轉錄。啟動子可以是基因組源的或是合成產(chǎn)生的。用于T細胞中的多種啟動子是本領域熟知的(例如，Marodon等人，(2003)Bloodl01 (9):3416-23)公開的CD4啟動子)。啟動子可以是組成型或誘導型的，其中誘導例如與特定細胞類型或特定成熟水平相關。可選地，眾多熟知的病毒啟動子也是合適的。目的啟動子包括(6-肌動蛋白啟動子、SV40早期和晚期啟動子、免疫球蛋白啟動子、人細胞巨化病毒啟動子、逆轉錄病毒啟動子、和弗氏脾病灶形成病毒啟動子。啟動子可以與增強子結合或可以不與之結合，其中所述增強子可以與特定啟動子天然結合或與不同的啟動子結合。
[0038]編碼嵌合受體的可讀框的序列可以從基因組DNA來源、cDNA來源獲得或可以經(jīng)合成(例如，通過PCR)，或是前者的組合。取決于基因組DNA的尺寸和內(nèi)含子的數(shù)目，可以需要使用cDNA或其組合，因為發(fā)現(xiàn)內(nèi)含子使mRNA穩(wěn)定或提供T細胞特異性表達(Barthel和Goldfeld(2003) J.1mmunol.171(7):3612-9)。另外，可能進一步有利的是使用內(nèi)源或外源非編碼區(qū)來穩(wěn)定mRNA。
[0039]為表達本發(fā)明的嵌合受體，編碼嵌合受體N端組分的核酸序列的天然存的或內(nèi)源的轉錄起始區(qū)可以用來在靶宿主 中產(chǎn)生嵌合受體?？蛇x地，可以使用允許組成型或誘導型表達的外源轉錄起始區(qū)，其中可以根據(jù)靶宿主、所需的表達水平、靶宿主性質(zhì)等控制表達。
[0040]同樣地，指引嵌合受體至表面胞膜的信號序列可以是嵌合受體的N端組分的內(nèi)源信號序列。任選地，在一些情況下，可以需要的將這種序列交換成不同的信號序列。然而，選擇的信號序列應當與T細胞的分泌途徑相容，從而將嵌合受體呈遞在T細胞的表面上。
[0041]類似地，可以由編碼嵌合受體C端組分的核酸序列的天然存在的或內(nèi)源的轉錄終止區(qū)提供終止區(qū)。可選地，終止區(qū)可以源自不同的來源。就絕大部分而言，通常不認為終止區(qū)的來源對重組蛋白表達至關重要并且可以使用多種終止區(qū)而沒有不利地影響表達。
[0042]如本領域技術人員將領會，在一些情況下，可以缺失在CD27末端的幾個氨基酸，通常例如不多于10個，更通常不多于5個殘基。另外，可以合乎需要的是，在邊界處引入少數(shù)氨基酸，通常不多于10個、更通常不多于5個殘基。氨基酸的缺失或插入可以是結構需要、提供便利限制性位點、易于操作、表達水平改善等的結果。此外，將一個或多個氨基酸用不同氨基酸置換可以因相同原因而進行，通常在任一個結構域中不置換多于約5個氨基酸。
[0043]可以按常規(guī)方式制備編碼本發(fā)明嵌合受體的嵌合構建體。因為，就絕大部分而言，可以使用天然序列，如果適宜，可以分離并操作天然基因，從而允許恰當?shù)慕雍细鞣N組分。因此，可以利用導致基因的不想要部分缺失的適宜引物，通過使用聚合酶鏈反應(PCR)分離編碼該嵌合受體N端和C端蛋白質(zhì)的核酸序列。可選地，克隆的基因的限制性消化物可以用來產(chǎn)生嵌合構建體。在任何一種情況下，可以選擇序列以提供平末端化或具有互補性重疊的限制性位點。
[0044]可以體外實施用于制備嵌合構建體的各種操作并且在特定實施方案中，使用標準轉化或轉染方法，將嵌合構建體導入載體中用于在適宜的宿主中克隆和表達。因此，在每種操作后，將來自DNA序列接合的所得構建體克隆，分離載體，并且篩選序列以確保所述序列編碼所需的嵌合受體?？梢酝ㄟ^限制性分析、測序等篩選序列。
[0045]通過在患有或疑似患有癌癥的受試者中縮減腫瘤尺寸或防止腫瘤生長或再生長，將本發(fā)明的嵌合構建體應用于這些受試者中。因而，本發(fā)明還涉及一種通過以下方式在受試者中減少腫瘤生長或防止腫瘤形成的方法:將本發(fā)明的嵌合構建體導入該受試者的分離的T細胞中并且向受試者再導入轉化的T細胞，因而實現(xiàn)抗腫瘤反應以減少或消除受試者中的腫瘤。可以使用的合適T細胞包括細胞毒淋巴細胞(CTL)、腫瘤侵潤性淋巴細胞(TIL)或活化時能夠殺傷靶細胞的其他細胞。如本領域技術人員熟知，各種方法容易地可用于從受試者中分離這些細胞。例如，使用細胞表面標記表達或使用市售試劑盒(例如來自Pierce, Rockford, 111.的 ISOCELL )。
[0046]構思了可以將嵌合構建體作為裸DNA或在合適的載體內(nèi)導入受試者自身T細胞中。使用裸DNA通過電穿孔法穩(wěn)定轉染T細胞的方法是本領域已知的。見，例如美國專利號6，410，319。裸DNA通常指以用于表達的恰當方向包含于質(zhì)粒表達載體中的編碼本發(fā)明嵌合受體的DNA。有利地，裸DNA的使用縮減為產(chǎn)生表達本發(fā)明嵌合受體的T細胞所要求的時間。
[0047]可選地，病毒載體(例如，逆轉錄病毒載體、腺病毒載體、腺相關病毒病毒載體或慢病毒載體)可以用來將嵌合構建體`導入T細胞中。根據(jù)本發(fā)明方法使用的合適載體是在受試者的T細胞中非復制的?；诓《镜拇罅枯d體是已知的，其中細胞中維持的病毒的拷貝數(shù)低到足以維持細胞的生存力。示意性的載體包括本文中公開的pFB-neo載體(STRATAGENE ⑧:)以及基于 HIV、SV40、EBV、HSV 或 BPV 的載體。
[0048]一旦確立轉染的或轉導的T細胞能夠將嵌合受體用所需的調(diào)節(jié)并且以所需的水平表達為表面膜蛋白，則可以確定該嵌合受體是否在宿主細胞中有功能，以便提供所需的信號誘導作用。隨后，將轉導的T細胞是再導入或施用至受試者，以便在受試者中激活抗腫瘤反應。為促進施用，可以將本發(fā)明的轉導的T細胞用適宜的載體或稀釋劑制成藥物組合物或制成適于體內(nèi)施用的植入物，所述載體或稀釋劑也可以是可藥用的。制造這種組合物或植入物的手段已經(jīng)在本領域中描述(見，例如，Remington' s PharmaceuticalSciences,第16版，Mack編著(1980))。在適宜的情況下，可以將轉導的T細胞以用于其相應施用途徑的尋常方式配制成半固態(tài)或液體形式的制劑，如膠囊劑、溶液劑、注射劑、吸入劑或氣溶膠劑。本領域已知的手段可以用來防止或最小化組合物的釋放和吸收直至它抵達靶組織或器官，或用來確保組合物的定時釋放。然而，希望地，使用確實現(xiàn)細胞表達嵌合受體的可藥用形式。因此，可以將轉導的T細胞合乎需要地制成含有平衡鹽溶液(優(yōu)選Hanks平衡鹽溶液)或生理鹽水的藥物組合物。
[0049]本發(fā)明的藥物組合物可以單獨使用或與其他充分-建立的可用于治療癌癥的藥物組合使用。無論是否單獨或與其他藥物組合時遞送，可以將本發(fā)明的藥物組合物經(jīng)各種途徑遞送并遞送至哺乳動物(尤其人)身體中的各個部位以實現(xiàn)特定作用。本領域技術人員會認識到，雖然多于一種途徑可以用于施用，但是一種特定途徑可以比另一種途徑提供更即時和更有效的反應。例如，對于治療黑色素瘤，可以有利地使用皮內(nèi)遞送勝過吸入法?？梢酝ㄟ^施用完成局部或全身遞送，所述施用包括施加或滴注制劑至體腔中、吸入或吹入氣溶膠，或通過腸胃外導入，包括肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、門脈內(nèi)、肝內(nèi)、腹膜、皮下或皮內(nèi)施用。
[0050]本發(fā)明的組合物可以按單位劑量形式提供，其中每個劑量單位(例如，注射液)含有單獨或與其他有效藥物適宜組合的預定量的組合物。如本文所用的術語“單位劑量形式”指適合作為單一劑量用于人和動物受試者的物理分立單元；每個單位含有預定量的單獨或與其他有效藥物組合的本發(fā)明組合物，所述的預定量經(jīng)計算處于(根據(jù)需要)與可藥用稀釋劑、載體或溶媒結合的情況下足以產(chǎn)生所需作用的量。對本發(fā)明的新單位劑量形式的規(guī)定取決于具體受試者中與藥物組合物有關的具體藥效學。
[0051]合乎需要地，有效量或足夠數(shù)目的分離的轉導T細胞存在于組合物中并且被導入受試者中，從而建議長期、特異性抗腫瘤反應以縮減腫瘤的尺寸或消除在這類治療不存在下本來將出現(xiàn)的腫瘤生長或再生長。合乎需要地，與不存在轉導T細胞下否則相同的條件相比時，再導入受試者中的轉導T細胞的量引起腫瘤尺寸縮減10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98% 或 100%。
[0052]因而，施用的轉導T細胞的量應當考慮施用途徑并且應當是這樣的，從而將會導入足夠數(shù)目的轉導T細胞從而實現(xiàn)所需的治療反應。另外,在本文所述的組合物中包含的每種有效藥物的量(例如，待接觸的每個細胞的量或每個某種體重的量)可能在不同的應用中變動。通常，轉導T細胞的濃度合乎需要地應當足以在正在治療的受試者中提供至少約I X IO6至約IXlO9個轉導的T細胞，甚至更合乎需要地約I X IO7至約5 X IO8個轉導的T細胞，不過可以使用高于以上量(例如，大于5X108個細胞)或低于以上量(例如，小于IXlO7個細胞)的任何適合量。 給藥方案可以基于充分建立的基于細胞的療法(見，例如，Topalian 和 Rosenberg (1987) Acta Haematol.78Suppll: 75-6 ;美國專利號 4, 690, 915)或可以使用交替連續(xù)輸注策略。
[0053]這些值提供了優(yōu)化本發(fā)明方法以便實施本發(fā)明時由執(zhí)業(yè)者使用的轉導T細胞的范圍的一般指導。本文中提到這類范圍無論如何不排除使用量更高或更低的組分，如可能在特定應用中是必要的。例如，實際劑量和方案可以根據(jù)組合物是否與其他藥物組合物組合施用或根據(jù)藥物代謝動力學、藥物配置和代謝的個體間差異而變動。本領域技術人員可以根據(jù)特定情況的急迫需要容易地做出任何必要調(diào)整。
[0054]本發(fā)明試劑盒的實施方案
[0055]可以在試劑盒中包含本文所述的任何組合物。在非限制性實施例中，嵌合受體表達構建體、產(chǎn)生嵌合受體表達構建體的一種或多種試劑、用于表達構建體轉染的細胞和/或獲得自體細胞以便表達構建體轉染的一種或多種儀器(這種儀器可以是注射器、吸管、鑷子和/或任何這類醫(yī)學上許可的設備)。
[0056]試劑盒可以包含一種或多種適當?shù)氐确值谋景l(fā)明組合物或產(chǎn)生本發(fā)明組合物的試劑。試劑盒的組分可以包裝在含水介質(zhì)中或以凍干的形式包裝。試劑盒的容器裝置可以包括至少一個小瓶、試管、燒瓶、瓶、注射器或其他容器裝置，其中可以安置并且優(yōu)選地適當?shù)确纸M分。在試劑盒中存在多于一種組分的情況下，試劑盒通常也將含有其中可以分別放置額外組分的第二、第三或其他額外容器。然而，可以在小瓶中包含組分的各種組合。本發(fā)明的試劑盒通常地也將包括用于含有嵌合受體構建體或密封用于商業(yè)銷售的任何其他試劑容器的裝置。這類容器可以包括例如留置所需小藥瓶的注塑或吹塑成型塑料容器。
實施例
[0057]包括以下實施例以展示本發(fā)明的一些實施方案。本領域技術人員應當理解，以下的實施例中公開的技術代表由發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的在實施本發(fā)明時發(fā)揮良好作用的技術，并且因此可以視為構成其實施的一些模式。然而，根據(jù)本公開，本領域技術人員應當理解可以在公開的具體實施方案中產(chǎn)生許多變化并且仍獲得類似或相似的結果而不脫離本發(fā)明的精神和范圍。
[0058]采用靶向⑶19或⑶20的遺傳修飾的T細胞的T細胞療法為免疫治療血液學惡性腫瘤帶來希望。然而，這些靶僅存在于B細胞衍生的惡性腫瘤上并且因為它們在造血系統(tǒng)中廣泛表達，故以它們?yōu)榘锌赡墚a(chǎn)生不想要的結果。為了將T-細胞療法擴展至并非B細胞衍生的血液學惡性病，發(fā)明人確定是否可以將T細胞重定向針對⑶70 ( —種由正常淋巴細胞和樹突細胞的有限亞群表達，但是由類型廣泛的血液學惡性腫瘤和一些實體瘤異常表達的抗原)。為產(chǎn)生⑶70特異性T細胞，本發(fā)明人構建了包含與⑶3-ζ鏈融合的⑶70受體(⑶27)的嵌合抗原受體(CAR)。刺激表達⑶70特異性CAR的T細胞導致⑶27共刺激和識別⑶70陽性腫瘤細胞系和原發(fā)腫瘤細胞，如通過IFN- Y和IL-2分泌和通過腫瘤細胞殺傷顯示。過繼轉移的⑶70特異性T細胞引起建立的鼠異體移植物持續(xù)消退。因此，⑶70特異性T細胞是CD70陽性惡性腫瘤的有用免疫治療方案。
[0059]實施例1
[0060]示例性材料與方法
`[0061]細胞系和腫瘤細胞
[0062]獲得血液樣品或原發(fā)腫瘤細胞的操作方案由貝勒大學藥物機構審查委員會(IRB)批準。細胞系Daud1、CCL-120、U266和K562從美國典型培養(yǎng)物保藏中心獲得(ATCC, Rockville，MD，美國)。通過用編碼人CD70和GFP的自我失活性慢病毒載體轉導K562 細胞產(chǎn)生表達 CD70 的 K562 細胞(K562.70)。L1236 從 DSMZ ?raunschweig，德國)獲得。SNK6 和 SNT16 由 Norio Shimizu (Tokyo Medical and Dental University,日本)博士友好提供。(Nagata等人，2001)。已經(jīng)在沒有體外培養(yǎng)情況下冷凍保存的原發(fā)性B細胞非霍奇金淋巴瘤由 Stephen Ansell 博士提供(Mayo Clinic, Rochester, MN, USA) ?
[0063]⑶70特異性CAR構建體的產(chǎn)生
[0064]使用重疊聚合酶鏈反應(PCR)，使全長人⑶27 (⑶70受體)與T-細胞受體ζ-鏈(TCR-ζ)的信號傳導結構域(氨基酸52-164)符合可讀框地融合；pORF.CD27(Invitrogen, Carlsbad, CA)和 pSFG.FRP5.ζ (Ahmed 等人，2007)充當 PCR 模板。修改引物以產(chǎn)生Y -NcoI和:V -SphI限制性位點并且將CD27TCR- ζ融合基因(CD70-CAR)亞克隆至SFG逆轉錄病毒載體中。為促進明確檢測轉導的T細胞，通過重疊PCR產(chǎn)生內(nèi)部核糖體進入序列(IRES)截短的CD19(tCD19) (Tey等人，2007)表達盒(IRES_tCD19)并且將CD27TCR-4融合基因的:V亞克隆至SFG逆轉錄病毒載體的Y -SphI和:V -AccIII限制性位點中(pSFG.CD70-CAR-1RES-tCD19 ;圖 1A)。此外，產(chǎn)生了含有CD70-CAR-1RES_DsRed表達盒或ACD70-CAR-1RES-DsRed表達盒的逆轉錄病毒載體，其中A CD70-CAR-1RES_DsRed表達盒缺失⑶27的23個氨基酸的TRAF2結合位點(殘基238-260 (Yamamoto等人，1998)；圖8)。
[0065]T-淋巴細胞的逆轉錄病毒產(chǎn)生和轉導
[0066]通過使用GeneJuice轉染試劑(Novagen, SanDiego, CA)用 0)70-CAR SFG逆轉錄病毒載體、含有MoMLV gag-pol序列的Peg-Pam_e質(zhì)粒和含有RD114包膜的RDF質(zhì)粒(Kelly等人，2000)瞬時轉染293T細胞，產(chǎn)生RD114假型逆轉錄病毒粒子。(Vera等人，2006)。48-72小時后，收集含有逆轉錄病毒的上清液。對于逆轉錄病毒轉導，未經(jīng)組織培養(yǎng)處理的24 孔平板用 0KT3 抗體(OrthoBiotech, Bridgewater, NJ)和 CD28 抗體(BectonDickinson,MountainView, CA)處理過夜。次日，將0.5xl06外周血單核細胞(PBMC)添加至每個孔并且在含有10%熱滅活胎牛血清(FCS)和l%GlutaMax (Gibco-BRL)的RPMI1640完全培養(yǎng)基(Gibco-BRL, Gaithersburg, MD)中培養(yǎng)。在第3日，將重組人白介素-2 (rhIL-2 ;200U/mL ;阿地白介素；Chiron, Emeryville, CA)添加至培養(yǎng)物。將病毒上清液添加至用RetroNectin ? (TakaraShuzo，Otsu，日本)預處理的24孔平板并且將培養(yǎng)的0KT3/CD28刺激的細胞添加至每個孔(5xl05個細胞/孔)。將細胞離心并且在37°C于5%C02下溫育。72小時后測量T細胞上的CAR表達并且將細胞在完全培養(yǎng)基中維持培養(yǎng)，每3日添加rhIL-2 (50-100U/mL)。在使用之前，作為對照使用的未轉導的T細胞以0KT3/CD28活化并且在每毫升50-100單位IL-2存在的情況下擴充10-15日。
[0067]流式細胞術
[0068]FACS Calibur儀(BD Biosciences)用來獲得免疫熒光數(shù)據(jù)，所述數(shù)據(jù)用FCSExpress軟件3版(De Novo Software, Los Angeles, CA)分析。用于表面染色的全部抗體均從BD Biosciences購買。同種型對照是免疫球蛋白Gl-異硫氰酸熒光素(IgGl-FITC)、IgGl-藻紅蛋白(IgGl-PE)、IgGl`-多甲藻素葉綠素蛋白(IgGl-PerCP)和IgGl-別藻藍蛋白(IgGl-APC)。正向散射和側向散射設門用來區(qū)分活細胞與死細胞。使用⑶27-FITC、⑶19-PE對 293T 細胞分析 CD70-CAR 表達，并且使用 CD19-PE、CD3-FITC、CD4_PerCP 和 CD8-APC 對人⑶3/⑶28刺激的T細胞分析⑶70-CAR表達。使用⑶70-PE確定腫瘤細胞上的⑶70表達。對于胞內(nèi)染色，將細胞用4%多聚甲醛(BD)固定和用1%皂素(Sigma)透化。針對Bcl_xl的小鼠單克隆抗體(Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA)用于初級染色,并且山羊抗小鼠APC (GAM-APC ；BD)用于次級染色。同種型對照是與GAMAPC單獨溫育的細胞。
[0069]細胞因子產(chǎn)生的分析
[0070]在48孔平板中，來自健康供體的CD70特異性T細胞或未轉導的T細胞與CD70陽性細胞系或原發(fā)性CD70陽性淋巴瘤以2:1效應子對靶的比率共培養(yǎng)。在24小時溫育后，收獲培養(yǎng)上清液并且發(fā)明人通過ELISA按照制造商的說明書測量IFN-Y和IL-2(R&DSystems, Minneapolis, MN)。
[0071]IFN-Y ELISP0T 測定法
[0072]如先前所描述(Gottschalk等人，2003)，發(fā)明人使用ELISP0T測定法來確定分泌IFN- Y的T細胞的頻率。將⑶70-CAR或未轉導的T細胞以IxlO5鋪種并且溫育18小時，伴以適宜刺激。隨后使平板顯色、干燥過夜并送至ZellNet Consulting (New York, NY)用于定量。
[0073]免疫共沉淀法
[0074]通過逆轉錄病毒轉導產(chǎn)生了穩(wěn)定表達CD70-CAR或ΛCD70-CAR的293T細胞。使用 GeneJuice 轉染試劑(Novagen, SanDiego, CA),將表達 CAR 的細胞用 Jinhua Yang 博士(貝勒醫(yī)學院)友好提供的2μ g加FLAG-標簽的TRAF2轉染。轉染后24小時，將細胞與K562.70細胞以1:1的比率共培養(yǎng)以交聯(lián)受體。在12小時后，細胞用冰冷的PBS (Sigma, St.Louis, MO)洗滌并且從培養(yǎng)物中吸出非貼壁的K562.70細胞。將剩余的293T細胞裂解并且使用μ MACS蛋白G微珠和μ柱(Miltenyi Biotec Inc.，Auburn, CA),將蛋白質(zhì)用抗FLAC ?M2抗體(Sigma)沉淀。免疫沉淀物通過SDS-PAGE分離并用CD3-ζ抗體(SantaCruz Biotechnology)印跡。
[0075]鉻釋放測定法
[0076]如先前所描述，一式三份進行標準鉻釋放測定法。(Gottschalk等人，2003)簡而言之，將IxlO6個靶細胞用0.1mCi (3.7MBq) 51Cr標記并且與漸減數(shù)目的效應細胞混合以產(chǎn)生40:1、20:1、10:1和5:1效應子對靶比率。在單獨的完全培養(yǎng)基中或在l%TritonX_100中溫育的靶細胞分別用來測定自發(fā)釋放和最大51Cr釋放。在4小時后收集上清液并且在Y計數(shù)器中測量放射性活度(CobraQuantum ;PerkinElmer ;Wellesley ;MA)。根據(jù)下式計算三重復孔的特異性裂解的平均百分比:[測試釋放-自發(fā)釋放]/[最大釋放-自發(fā)釋放]
xlOO。
[0077]CFSE增殖和長期殺傷測定法
[0078]為測量T-細胞增殖和長期殺傷，發(fā)明人將1xlO7個T細胞在室溫與1.5μΜ 二乙酸羧基熒光素琥珀酰亞胺酯(CFSE ；Molecular Probes, Inc.，Eugene, OR)溫育10分鐘。發(fā)明人將CFSE標記的T細胞在外源IL-2不存在的情況下與適宜的⑶70陽性或⑶70陰性腫瘤細胞以2:1效應子:靶比率培養(yǎng)。在5-7日共培養(yǎng)后，將細胞收集，用⑶3染色，并且通過FACS分析法分析CFSE稀釋物。用于增殖實驗的陽性對照和陰性對照分別地是在IOOU/mL rhIL-2存在的情況下培養(yǎng)的T細胞和沒有細胞因子情況下單獨培養(yǎng)的T細胞。對于長期殺傷實驗，使用正向散射和側向散射設門進行FACS分析以確定活細胞，同時使用CFSE染色和CD3陽性來區(qū)分CD70特異性或未轉導的T細胞與CD3-陰性、未標記的腫瘤細胞。
[0079]異體移植模型和生物發(fā)光成像
[0080]全部動物實驗均按照貝勒醫(yī)學院研究機構動物護理和使用委員會批準的方案實施。為了在體內(nèi)評估CD70特異性T細胞的抗腫瘤作用，發(fā)明人使用2種SCID小鼠模型和IVIS(Caliper Life Sciences)體內(nèi)成像系統(tǒng)(Ahmed等人，2007)。將8周齡至 10周齡SCID小鼠ICrTac:1CR-Prkdcseid Jaconic)以亞致死方式照射(2.5Gy)，并且2日后，腹內(nèi)注射懸浮于基質(zhì)膠(BD Biosciences)中的表達增強型GFP (eGFP)-螢火蟲螢光素酶(eGFP-FFLuc)融合基因的5xl05個Daudi細胞。為監(jiān)測腫瘤生長，用D-螢光素(150mg/k)對異氟烷麻醉的動物進行腹內(nèi)注射，并且在10分鐘后使用Living Image軟件4.0版(Caliper LifeSciences)獲得和分析生物發(fā)光圖像。在腫瘤區(qū)域上方繪制目的恒定區(qū)并且獲得作為每秒每平方厘米每球面度總光子計量的信號強度(p/s/cmVsr)。10日后，當腫瘤信號平穩(wěn)地增加時，將小鼠用CD70特異性細胞或未轉導的T細胞處理。在第10、11和17日給予3次腹內(nèi)注射IxlO7個T細胞，隨后還腹內(nèi)給予1500U rhIL-2 (R&D Systems)。小鼠在每次T-細胞注射之前成像并且此后每周成像3次。發(fā)明人使用RajiSCID異體移植物以在全身性非霍奇金淋巴瘤模型中評價⑶70特異性T細胞的抗腫瘤活性(Brentjens等人，2003 ；Cheadle等人，2008 ；Tammana等人，2010)。簡而言之，將2xl05個Raj1.FFluc細胞靜脈內(nèi)注射至以亞致死方式照射的(2.5Gy) SCID小鼠中，其中4日后通過靜脈內(nèi)施用IxlO7個⑶70特異性T細胞或未轉導的T細胞處理所述小鼠。發(fā)明人給予3次T細胞連同500U rhIL-2給藥(在第4、5和11日)。使用生物發(fā)光成像，發(fā)明人將轉移性腫瘤定量。為進行存活分析，將小鼠在后肢癱瘓的第一體征(將其鑒定為行走時一條或兩條肢體拖曳)出現(xiàn)時安樂死。
[0081]統(tǒng)計分析
[0082]使用Wilcoxon符號秩檢驗，進行⑶70特異性T細胞和未轉導的T細胞之間IFN-Y和IL-2分泌的比較。將腫瘤體積數(shù)據(jù)進行對數(shù)轉化并且計算從初始T-細胞注射至處理后測量的變化。使用配對比較來鑒定兩個T-細胞組之間光強度的任何統(tǒng)計顯著差異。小于
0.05的P-值視為統(tǒng)計顯著。使用Kaplan-Meier方法構建存活曲線并且比較使用加權長程檢驗(weighted long-range test)。
[0083]實施例2
[0084]⑶70特異性T細胞的產(chǎn)生
[0085]發(fā)明人構建了編碼與T-細胞受體;鏈的信號傳導結構域融合的CD70受體(⑶27)(⑶70-CAR)的SFG逆轉錄病毒載體。因為大多數(shù)原生T細胞和記憶T細胞內(nèi)源型表達低水平⑶27，所以在逆轉錄病毒載體中也包括IRES-t⑶19表達盒以允許明確檢測轉導的細胞(圖1A)。⑶27和t⑶19顯`示線性共表達樣式，這表明⑶19是用于⑶70-CAR表達的合適標記(圖1B)。⑶3/⑶28活化的T細胞用編碼⑶70-CAR-1RES-t⑶19的RDl 14假型的逆轉錄病毒粒子轉導，并且轉導后10至14日，通過FACS分析確定⑶19的表達。平均45%(+/-6 ；n=5)的T細胞表達tCD19,并且CD4-和CD8陽性細胞均被轉導(圖1C-D)。
[0086]實施例3
[0087]⑶70特異性T細胞在暴露于⑶70陽性腫瘤細胞后分泌免疫刺激性細胞因子并且
增殖
[0088]為檢測轉基因T細胞對⑶70的識別，發(fā)明人起初使用⑶70陰性K562細胞和⑶70轉基因K562細胞(圖2)。3位供體的⑶70特異性T細胞和未轉導的T細胞用K562或K562.CD70刺激，并且在48小時后，我們測量IFN- y和IL-2釋放(圖3A，B)。在暴露于K562.⑶70后，與未轉導的T細胞相比，⑶70特異性T細胞產(chǎn)生顯著量的IFN_y (p=0.03)和IL-2(p=0.02)。此外，⑶70陰性K562細胞沒有活化⑶70特異性T細胞，這表明細胞因子產(chǎn)生既需要⑶70在靶細胞上的表達，又需要⑶70-CAR在T細胞上存在。當發(fā)明人比較在這些培養(yǎng)組合的每一種組合中的T-細胞增殖時，存在相似的結果(圖3C)。
[0089]通過使用其中⑶70表達天然存在但是處于可變水平的腫瘤細胞，發(fā)明人證實了以上研究結果。他們使用一系列代表非霍奇金淋巴瘤(Daud1、SNK6、SNT16)、霍奇金淋巴瘤(L1236)、白血病(CCL-120)和多發(fā)性骨髓瘤(U266 ;圖2)的CD70陽性腫瘤細胞系。CD70特異性T細胞比未轉導的T細胞分泌顯著更多的IFN-Y (p〈0.0001)和IL-2(p〈0.0001)(圖3A、B)。T-細胞增殖依賴于CD70在靶細胞上的表達，并且CD70?(CD70dim)腫瘤細胞(Daudi)比⑶70*(⑶70Mght)腫瘤細胞更少地誘導T-細胞增殖。此外，用SNT16細胞刺激后，發(fā)明人觀察到未轉導的T細胞的增殖，發(fā)明人將這歸因于SNT16細胞分泌低水平IL-2 (10-50pg/mL)并歸因于它們穩(wěn)健的共刺激能力，如通過它們誘導CD70特異性T細胞產(chǎn)生IL-2的能力所判定(圖1B)。⑶70的表達在來自健康供體的外周血B和T細胞上是低至不存在的(圖2)。因而，發(fā)明人不能檢測到CD70特異性T細胞與原代B或T細胞共培養(yǎng)后產(chǎn)生IFN- Y或IL-2。為證實⑶70特異性T細胞不受B或T細胞刺激，發(fā)明人使用IFN-Y ELISPOT測定法，所述測定法顯示與原代B或T細胞共培養(yǎng)后CD70特異性T細胞不活化(圖8A)。
[0090]實施例4[0091]⑶70特異性T細胞殺傷⑶70陽性腫瘤細胞但是不殺傷⑶70陰性細胞
[0092]發(fā)明人接下來在標準4小時51Cr-釋放測定法和5至7日共培養(yǎng)測定法中測量⑶70特異性T細胞對⑶70陽性靶的殺傷。在4小時51Cr-釋放測定法中，⑶70特異性T細胞殺傷CD70陽性靶細胞(K562.70、Daud1、U266、SNK6、SNK16)但是不殺傷CD70陰性細胞(K562)。未轉導的T細胞顯示無殺傷作用，從而證實CD70-特異性(圖4A、B)。對于共培養(yǎng)測定法，將⑶70特異性T細胞或未轉導的T細胞用CFSE標記并且以2:1比率添加至未標記的腫瘤細胞。在5至7日后，通過⑶3-/CFSE-陰性部分的FACS分析計數(shù)腫瘤細胞(圖4C)。CD70特異性T細胞消除所測試的全部4個CD70陽性系(Daud1、U266、SNK6、SNK16)，而對照T細胞不能消除(圖4D)。在受CD3/CD28刺激的T細胞未遭CD70特異性T細胞殺傷的情況下，用MRC5細胞上的CD40配體“以超級生理”方式活化的B胚細胞易感于CD70特異性T-細胞殺傷作用(圖8B)。
[0093]實施例5
[0094]⑶27共刺激作用對⑶70特異性刺激后的T-細胞存活重要
[0095]為確定位于⑶70-CAR胞內(nèi)結構域內(nèi)部的⑶27的23個氨基酸共刺激結構域的作用(圖1A)，發(fā)明人產(chǎn)生了⑶27共刺激結構域缺失的⑶70-CAR( Λ⑶70-CAR)。共刺激結構域的功能性缺失由Λ CD70-CAR不能與TRAF2 (介導CD27信號傳導的關鍵銜接子蛋白)的結合證實(圖5Α)。將T細胞用編碼CD70-CAR-1-dsRed或Λ CD70-CAR-1_dsRed的逆轉錄病毒載體轉導(圖9A)。兩種構建體的轉導效率是相似的，如由dsRed表達所判定(65%至90% ;圖9B)，并且在細胞毒性測定法中，表達⑶70-CAR的T細胞和表達Λ⑶70-CAR的T細胞以相同的效率殺傷CD70陽性靶(圖5B)。為評估CD27共刺激對活化T-細胞的貢獻，發(fā)明人利用缺少共刺激分子并經(jīng)遺傳修飾以表達⑶70的自體成纖維細胞(Fib.⑶70)。用Fib.⑶70刺激T-細胞后3日開始，與Λ⑶70-CART細胞相比，存在活化的⑶70-CART細胞的顯著較大的“團塊”(圖5C)。盡管在T-細胞增殖(圖5D)和IFN- Y或IL-2產(chǎn)生方面不存在差異，但是與⑶70-CART細胞相比，Λ⑶70-CART-細胞生存力顯著地降低(圖? ；Ρ<0.05)。如其他人報道，Bcl-xl (—種重要抗凋亡蛋白)由⑶27信號傳導誘導(vanOosterwi jk等人，2007)。與這項研究結果一致，與Λ⑶70-CART細胞相比，⑶70-CART細胞穩(wěn)定地表達較高水平的Bcl-xl (圖5Ε)。這些結果表明位于⑶70-CAR內(nèi)部的⑶27共刺激結構域提供共刺激信號，導致增強的T-細胞存活。對于全部后續(xù)實驗，我們因此使用CD70-CART細胞(CD70特異性T細胞)。
[0096]實施例6
[0097]⑶70特異性T細胞識別并且殺傷原發(fā)性B-和T-細胞淋巴瘤
[0098]已經(jīng)顯示⑶70特異性T細胞識別并且殺傷⑶70陽性淋巴瘤細胞系，發(fā)明人接下來驗證⑶70抗原作為原發(fā)性B-和T-細胞淋巴瘤上的靶。發(fā)明人將原發(fā)性⑶70陽性B-細胞非霍奇金淋巴瘤細胞(MF1792、MF1731、MF888)和T-細胞急性淋巴性白血病細胞(T007)與來自健康供體的⑶70特異性T細胞共培養(yǎng)24小時，并且測量上清液中的IFN- y。一旦暴露于⑶70+惡性腫瘤，則⑶70特異性T細胞但不是對照T細胞產(chǎn)生IFN- y分泌。(圖6A)。在5日共培養(yǎng)測定法中，⑶70特異性T細胞但不是對照T細胞消除原代⑶70陽性細胞(圖6B、C)。因此，⑶70特異性T細胞以⑶70特異性方式識別并殺傷原代⑶70陽性惡性細胞。
[0099]實施例1
[0100]在施用⑶70特異性T細胞后建立的淋巴瘤在體內(nèi)消退
[0101]發(fā)明人測量了 CD70特異性T細胞在異種SCID小鼠模型中的抗腫瘤活性。發(fā)明人將5x10s個Daud1.FFluc細胞腹內(nèi)注射至亞致死照射的SCID小鼠并且通過小鼠的連續(xù)生物發(fā)光成像追蹤腫瘤生長。10日后，小鼠接受3次IxlO7個⑶70特異性T細胞注射，所述注射在第I日給予并且隨后間隔I周給予(注射日0、1和7;n=10)。第二組帶瘤小鼠用未轉導的T細胞注射。在用未轉導的T細胞處理的小鼠中，腫瘤以指數(shù)方式生長，如通過生物發(fā)光成像法判定(圖7A)。相反，在T-細胞注射后7日，在⑶70特異性T細胞組和未轉導的T細胞組之間的腫瘤負荷方面存在顯著差異(p=0.002)(圖7B)。在9只腫瘤正在生長的小鼠中的8只小鼠中，光子發(fā)射在CD70特異性T-細胞注射后返回基線，表明腫瘤消退，所述腫瘤消退在T-細胞轉移后在7只小鼠中持續(xù)超過2周。
[0102]在第二項體內(nèi)研究中，使用全身性淋巴瘤模型，發(fā)明人測量了 CD70特異性T細胞的抗腫瘤活性。發(fā)明人將2xl05個Raj1.FFluc細胞靜脈內(nèi)注射至亞致死照射的SCID小鼠中。在4日后，使用前述段落中描述的相同治療方案，發(fā)明人對小鼠給予3次靜脈內(nèi)注射IxlO7個⑶70特異性T細胞或未轉導的T細胞。使用生物發(fā)光成像法，計數(shù)全身性腫瘤。在注射腫瘤細胞后3周和4周， 與CD70特異性T細胞相比，在接受未轉導的T細胞的小鼠中存在顯著更高的的腫瘤負荷(分別地是P=.012和P=.10)。在用⑶70特異性T細胞處理的小鼠中，這轉換成總生存期的顯著增加(P〈.05)(圖7D)。
[0103]實施例8
[0104]與嚴重慢性活動性EBV感染相關的原代⑶70陽性T-細胞淋巴瘤細胞被⑶70特異性T細胞殺傷
[0105]嚴重慢性活動性Epstein-Barr病毒感染(CAEBV)是潛伏EBV感染的罕有并發(fā)癥。它在日本優(yōu)勢地出現(xiàn)，但是幾個病例已經(jīng)在西半球報道(Kimura等人，2003 ；Cohen等人，2008)。在CAEBV中，天然殺傷細胞(NK)、T細胞或罕見地B細胞遭感染，使患者易患致命并發(fā)癥，如噬血細胞綜合征和NK-細胞或T-細胞淋巴增生性疾病(LPD) (Kimura等人，2001 ； Ishihara等人，1997)。用于CAEBV相關性LPD的唯一治愈性選項目前是干細胞移植。在這個實施例中，發(fā)明人報道了一位在CAEBV背景下形成侵潤性T-細胞淋巴瘤的患者。
[0106]發(fā)明人現(xiàn)在證實，⑶70在原代CAEBV相關性T-細胞淋巴瘤細胞中表達并且這些細胞對CD70特異性T細胞殺傷作用敏感，從而確定CD70作為CAEBV-相關性T-細胞淋巴瘤的潛在免疫治療靶。
[0107]實施例9
[0108]本發(fā)明的某些實施方案的意義[0109]發(fā)明人顯示，幾種血液學惡性病和癌瘤上異常表達的⑶70可以由經(jīng)工程化以表達⑶27作為CAR的部分的T細胞靶向。表達⑶70特異性CAR的T細胞在體外識別并且殺傷CD70-陽性腫瘤細胞系和原發(fā)性腫瘤樣品并且消除小鼠異體移植物中的人CD70腫瘤。
[0110]雖然在許多白血病和淋巴瘤上存在，但是⑶70不是譜系特異性標記，并且在生理上，它僅在高度活化的T細胞、B細胞和樹突細胞的亞群中瞬時表達。CD70啟動子含有AP-1、AP-2，Spl和NF- K B的轉錄因子結合位點，并且對甲基化敏感；然而，調(diào)節(jié)⑶70表達的精確信號傳導途徑知之甚少。(Lu等人，2005)。⑶70在人T淋巴細胞病毒類型I相關性惡性腫瘤和EBV相關性惡性腫瘤和霍奇金淋巴瘤中上調(diào)，這可能與組成型NF- K B活化(一個可能對調(diào)節(jié)⑶70表達有貢獻的途徑)有關。(Nolte等人，2009 Jost等人，2007)。相比于其生理貢獻，對異常CD70表達對惡性細胞的作用認識得更不充分，但是它可能有助于非霍奇金淋巴瘤免疫入侵(Yang等人，2007)。其他人已經(jīng)證實，⑶70/⑶27共刺激途徑對誘導白血病特異性T-細胞反應至關重要(Glouchkova等人，2009)。
[0111]大多數(shù)CAR的胞外結構域由修飾的單克隆抗體結合位點組成，所述結合位點可以用來制備以MHC非限制性方式識別并殺傷腫瘤細胞的抗原特異性T細胞。除非這些單克隆抗體片段是人源化，否則它們可以誘導人抗小鼠抗體和/或縮短所輸注細胞的效應子功能的內(nèi)源性T-細胞反應。(Miotti等人，1999 ;Kahlon等人，2004 Jensen等人，2010)。因此，利用生理存在的受體-配體相互作用(Kahlon等人，2004 ；Zhang等人，2006)繞過這種障礙并且應當確保在人類受試者中的體內(nèi)效應子功能不被針對轉基因的不利免疫反應阻斷。發(fā)明人因此通過使⑶3-鏈與天然存在的⑶70受體⑶27融合而構建⑶70特異性CAR。
[0112]用⑶70陽性腫瘤細胞刺激⑶70特異性T細胞導致IFN- Y和IL_2的分泌。在觸發(fā)僅含有信號傳導結構域的CAR導致IFN-Y產(chǎn)生的情況下，IL-2通常僅以抗原依賴性方式分泌(Ahmed等人，2007)。⑶70特異性T細胞與⑶70陽性腫瘤細胞的共培養(yǎng)導致由CD70特異性T細胞產(chǎn)生4000-140`00pg/mL的IFN- y，(Ahmed等人，2009)，所述產(chǎn)量處于對表達CAR的其他T細胞所報道的范圍內(nèi)。因為CAR T-細胞活化依賴于靶細胞上的抗原密度(Weijtens等人，2000)以及依賴于共刺激分子的存在(Zhao等人，2009)，所以IFN-Y產(chǎn)量在各個CD70陽性腫瘤細胞系之間變動不令人驚訝。誘導最低水平IFN-Y分泌的Daudi細胞具有最低⑶70表達，如通過FACS分析法判定。除產(chǎn)生IFN- Y之外，發(fā)明人還觀察到在暴露于腫瘤細胞后顯著的-盡管可變-的IL-2分泌。這些差異與腫瘤CD70表達水平無關并且似乎不依賴于常規(guī)共刺激分子的表達，因為用不表達經(jīng)典共刺激分子(如CD80和⑶86)的K562.70細胞刺激T-細胞后，發(fā)明人觀察到IL-2分泌。然而，這些細胞的確表達NKG2D配體，所述NKG2D配體可以通過與人⑶8陽性T細胞上表達的NKG2D相互作用提供共刺激信號。(Maasho等人，2005)。另外，SNT16和SNK6非霍奇金淋巴瘤細胞誘導來自⑶70特異性T細胞的高水平IL-2產(chǎn)生(與EBV陽性、NK/T-細胞非霍奇金淋巴瘤細胞上已知的黏附分子高表達一致的作用)。(Kanno等人，2008)
[0113]⑶27共刺激作用防止T細胞中激活誘導的細胞死亡，部分因為抗凋亡蛋白Be 1-XI上調(diào)所致(Oosterwi jk等人，2007)。與這項研究結果一致,發(fā)明人觀察到，與表達具有全長⑶27的⑶70-CAR的T細胞相比，表達⑶27共刺激結構域缺失的Λ⑶70-CAR的T細胞具有減少的生存力和較低的Bcl-xl表達水平。這些數(shù)據(jù)表明⑶70-CART細胞也可以在體內(nèi)顯示延長持久性。有趣地,離體擴充的腫瘤淋巴細胞的體內(nèi)功效數(shù)據(jù)顯示，CD27的表達與抗腫瘤活性相關(Huang等人，2006)?？赡艽_定CD27共刺激作用是否增強表達CAR的T細胞的持久性。[0114]發(fā)明人在5日至7日共培養(yǎng)測定法中觀察⑶70陽性腫瘤細胞的完全殺傷(圖4C-D)，而發(fā)明人在標準4小時51Cr釋放測定法中觀察更可變的腫瘤細胞殺傷水平(圖4B)。這些差異是最可能與T-細胞無關的，因為腫瘤細胞解整合(鉻釋放)的動力學取決于它們對T細胞衍生性細胞毒分子如穿孔素或粒酶B固有靈敏度而非T細胞本身的效應子功能的差異。(Perelson 等人，1984)
[0115]在本發(fā)明的實施方案中，表達⑶27-(CAR的⑶70特異性T細胞在IP Daudi和IVRaj i淋巴瘤模型中顯示明顯的體內(nèi)抗腫瘤活性。⑶70特異性T細胞在IP Daudi模型中的所觀察到的抗腫瘤活性與表達⑶19-CAR的T細胞相似，如先前報道。(Tammana等人，2010 ；Kowolik等人，2006 ；Hoyos等人，2010)。有趣地，持續(xù)的抗腫瘤應答，如隨CD70特異性T細胞的所觀察那樣，僅隨CD19特異性T細胞觀察到，其中所述CD19特異性T細胞表達含有共刺激結構域的CAR。在具體實施方案中，這表示CD27-( CAR在體內(nèi)提供共刺激信號，如發(fā)明人已經(jīng)在體外實驗中顯示(圖5)。對于IV Raji模型中殺傷腫瘤細胞的⑶19-CAR的共刺激結構域的要求是存在爭議和矛盾的。(Brentjens等人，2003 ；Cheadle等人，2008 ；Ta_ana等人，2010)。這些矛盾的結果可能在某些方面由遺傳修飾的T細胞的離體制備物、免疫缺陷性小鼠品系和/或用于體內(nèi)實驗的特定Raji細胞系衍生物的差異解釋。
[0116]因為⑶70在活化期間由免疫細胞亞群生理表達，以CAR T細胞靶向這種受體可能潛在地損害細胞免疫反應。然而，發(fā)明人認為這不可能，因為CD70僅在小比例活化的淋巴細胞和樹突細胞上瞬時表達。此外，⑶27-敲除小鼠(缺少任何⑶27/⑶70共刺激作用)僅具有難以察覺的免疫系統(tǒng)變化，與病原體暴露后的正常小鼠相比，存在保護性抗原特異性T-細胞初級反應但是更小的記憶T-細胞區(qū)室。(Hendriks等人，2000 ；Nolte等人，2009)。這些難以察覺的變化在成年人受試者中不可能重要意義，在所述成年人受試者中事先存在的記憶群體的再活化是針對感染的優(yōu)勢反應。在研究中,CD70特異性T細胞不顯示針對外周血B和T細胞的反應性。發(fā)明人也顯示，在細胞毒性測定法中CD70特異性T細胞不殺傷活化的T細胞(圖8B)。相反，B胚細胞易遭受CD70特異性T-細胞殺傷，但是僅在用CD40配體活化后并且在同種異型飼養(yǎng)細胞已經(jīng)誘導⑶70表達后才是如此(圖SB)。盡管這些結果表明CD70特異性T細胞具有殺傷活化的B細胞的潛力，這項研究結果的生理意義仍不確定，因為導致⑶70表達延長的這種類型的“超級生理” B-細胞活化作用在體內(nèi)不發(fā)生。實際上，已經(jīng)展示CD70在用CD40單克隆抗體和脂多糖體外刺激的鼠B細胞的表面上容易地表達；然而，用流感病毒攻擊的小鼠顯示CD70在浸潤肺和流出淋巴結的B細胞在視覺上無表面表達(Tesselaar等人，2003)。同樣地，在人類中幾乎觀察不到表達⑶70的B細胞，在小于10%所檢驗的扁桃體中有限數(shù)目的生發(fā)中心B細胞上和在次級淋巴樣器官和外周血中的散在淋巴細胞上存在所述B細胞(Hintzen等人，1994)。迄今在評價⑶70單克隆抗體安全性和可耐受性的2個I期臨床研究中未曾報道副作用(MDX-1203，NCT00944905 ;SGN_75，NCT01015911)。
[0117]總之，可以通過用編碼⑶27-(的CAR的基因轉移容易地產(chǎn)生⑶70特異性T細胞，并且這些細胞可以在體外和在體內(nèi)殺傷人腫瘤。CD70重定向的T細胞的過繼轉移可以是B細胞或T細胞衍生性血液學惡性病和其他CD70陽性實體瘤的有吸引力的免疫治療方案。
[0118]參考文獻
[0119]本說明書中提到的全部專利及出版物說明本發(fā)明所屬領域的技術人員的水平。將全部專利及出版物通過引用方式以相同的程度并入本文，如同專門且個別地指出通過引用的方式并入每份單獨的出版物。
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【權利要求】
1.一種嵌合抗原受體，其識別CD70抗原并且包含胞內(nèi)信號傳導結構域。
2.根據(jù)權利要求1所述的受體，其中所述受體存在于T細胞上。
3.根據(jù)權利要求1所述的受體，還定義為包括⑶70受體。
4.根據(jù)權利要求1所述的受體，其中所述CD70受體是CD27。
5.根據(jù)權利要求1所述的受體，其中所述胞內(nèi)信號傳導結構域是T-細胞受體CD3-4鏈。
6.靶向具有CD70抗原的細胞的方法，所述方法包括步驟:向具有CD70抗原的細胞提供包含根據(jù)權利要求1所述的受體的細胞。
7.根據(jù)權利要求6所述的方法，其中所述具有CD70抗原的細胞是癌細胞或與自身免疫性疾病相關的細胞。
8.根據(jù)權利要求7所述的方法，其中所述癌細胞是血液學惡性細胞。
9.根據(jù)權利要求7所述的方法，其中所述癌細胞是淋巴瘤細胞、白血病細胞、腎細胞癌細胞、骨髓瘤細胞或成膠質(zhì)細胞瘤細胞。
10.根據(jù)權利要求7所述的方法，其中所述癌細胞是HTLV-1-相關的惡性細胞或EBV-相關的惡性細胞。
11.根據(jù)權利要求7所述的方法，其中所述癌細胞是實體瘤細胞。
12.根據(jù)權利要求11所述的方法，其中所述實體瘤細胞是腎癌細胞、胰腺癌細胞、卵巢癌細胞、肺癌細胞、鼻咽癌細胞、胸腺癌細胞、腎癌細胞、胰腺癌細胞、喉癌細胞、咽癌細胞、皮膚癌細胞、卵巢癌細胞、肺癌細胞、結腸癌細胞、乳腺癌細胞或腦癌細胞。
13.根據(jù)權利要求7所述的方法，其中所述自身免疫性疾病是類風濕性關節(jié)炎、關節(jié)炎、炎癥、自身免疫腦炎、炎性腸病、結腸炎或狼瘡。
14.根據(jù)權利要求6所述的方法，其中包含根據(jù)權利要求1所述受體的細胞是T細胞。
15.根據(jù)權利要求14所述的方法，其中所述T細胞來自個體并且經(jīng)遺傳修飾以包含所述嵌合抗原受體。
16.根據(jù)權利要求14所述的方法，其中所述T細胞不來自個體并且經(jīng)遺傳修飾以包含所述嵌合抗原受體。
17.處理個體中⑶70陽性惡性細胞的方法，其包括步驟:用包含根據(jù)權利要求1所述的嵌合抗原受體的腫瘤特異性T細胞靶向CD70陽性惡性細胞。
18.根據(jù)權利要求17所述的方法，其還包括步驟:修飾T細胞以攜帶根據(jù)權利要求1所述的嵌合抗原受體。
19.根據(jù)權利要求17所述的方法，其中所述個體已經(jīng)接受或正在接受或將要接受額外的抗癌療法。
20.根據(jù)權利要求19所述的方法，其中所述額外的抗癌療法包括手術、放療、化療、免疫療法或激素療法。
21.用于治療個體的癌癥的試劑盒，其包含多核苷酸，所述多核苷酸包含編碼根據(jù)權利要求1所述的嵌合受體的表達構建體，所述多核苷酸容納于合適的容器中。
22.根據(jù)權利要求19所述的試劑盒，其還包含T細胞。
【文檔編號】A61K39/395GK103501816SQ201180060893
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2011年10月27日 優(yōu)先權日:2010年10月27日
【發(fā)明者】S·M·G·戈特沙爾克, D·R·沙弗爾, D·M·斯潘塞 申請人:貝勒醫(yī)學院