專利名稱：病毒體顆粒的生產(chǎn)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用植物中表達(dá)的病毒抗原尤其是流感抗原生產(chǎn)一種新型病毒體顆粒以及包含這些病毒體顆粒的疫苗尤其是流感疫苗。
背景技術(shù)：
流感，通常稱為flu，是一種最古老和最常見的疾病。它是由不同癥狀像發(fā)燒、冷戰(zhàn)、咳嗽、咽喉痛和頭疼表征的一種急性呼吸道疾病。它是由呼吸道分泌物通過噴嚏或咳嗽傳遞的真正的接觸性傳染病。盡管在大部分時(shí)間里流感是一種溫和的病毒感染，但其也是造成嬰兒、老年人以及免疫系統(tǒng)受損的成人中高發(fā)病率和死亡率的原因(Cox N.J.,AnnuRev Med,2000, 51:4-7-421)。抗流感的疫苗基于流感病毒表面蛋白(血凝素，HA)，其是保護(hù)性抗原?，F(xiàn)有的流感疫苗包含來自三個(gè)不同流感毒株的HA抗原，流感A Hl NI和H3N2以及流感B病毒。由于抗原性漂移的結(jié)果的季節(jié)性流感病毒的新毒株的出現(xiàn)需要每年修正流感疫苗組合物?？乖云浦芷谛缘?平均每20年)導(dǎo)致大流行病并且目前2009年流感大流行病的高致病性HlNl毒株是值得注意的公共衛(wèi)生問題。疫苗接種仍然是最有效和最經(jīng)濟(jì)的預(yù)防流感病毒感染的方式，尤其是在面對(duì)危險(xiǎn)的流感大流行病時(shí)。而且，全世界季節(jié)性流感疫苗產(chǎn)品的生產(chǎn)能力限于4億個(gè)劑量，其遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足在世界范圍內(nèi)對(duì)高危成人接種疫苗所必須的十億個(gè)劑量(Emmanuel E.J.和Wertheimer A., Science 2006,312:854-855)。流感病毒血凝素(HA)的抗體在流感疫苗的保護(hù)性能力中起到重要作用。該分子包含靶細(xì)胞受體的結(jié)合位點(diǎn)并且其可變球狀結(jié)構(gòu)域表現(xiàn)大部分的中和表位(Wiley D.C.，Wilson LA.和 Skehel J.J., Natu`re 1981,289:373-378)。商業(yè)化的季節(jié)性流感疫苗基于失活或者活力減弱的流感病毒(Nichol K.L.和 Treanor J.J.，JID，2006，194 (Suppl.2)，S111-S118)。基于亞單位疫苗方法(尤其是使用桿狀病毒表達(dá)的重組HA的)已經(jīng)在臨床研究中被檢測(Goj1.A，等人，JID, 2008，1998 =635-638)。通常，花費(fèi)大約6個(gè)月制造大批量的基于新出現(xiàn)的病毒的新疫苗，其代表開發(fā)普遍性疫苗的重要阻礙。在2009年流感大流行病的高致病性HlNl毒株的實(shí)例中，第一例于2009年3月于墨西哥被報(bào)道(參見WHO網(wǎng)站)而最初的相應(yīng)疫苗Focetria (Novartis)和Pandemrix (Glaxo-SmithKline)于2009年9月24日在歐洲獲得EMEA的批準(zhǔn)(參見EMEA網(wǎng)站)。這兩者都是在雞蛋中生產(chǎn)的并且由于基于雞蛋的疫苗生產(chǎn)顯然導(dǎo)致疫苗的相當(dāng)?shù)偷牡味纫约跋鄳?yīng)相當(dāng)?shù)偷拿庖咴?，因此兩個(gè)實(shí)例中必須加入佐劑。因此，至今主要生產(chǎn)工藝仍舊包括基于雞蛋的技術(shù)，而其不能生產(chǎn)將世界上所有高危成人免疫所必需數(shù)目的疫苗劑量。通常，生產(chǎn)一個(gè)劑量的疫苗需要一個(gè)雞蛋。所述工藝面臨幾個(gè)限制:-困難并且耗時(shí)的后勤，歸因于所需要的大量的雞蛋；-生產(chǎn)規(guī)模和能力的限制；-在大流行的禽流感和大流行的2009年流感的實(shí)例中生產(chǎn)來源的問題；
-生產(chǎn)工藝對(duì)污染的敏感性；-生產(chǎn)工藝的復(fù)雜性和持續(xù)時(shí)間(6個(gè)月)；-盡管有若干純化步驟，但是疫苗可能含有痕量的鳥類蛋白，其可能導(dǎo)致疫苗中所不期望的變態(tài)反應(yīng)。在2009年流感的高致病性的HlNl毒株的實(shí)例中，基于雞蛋的疫苗生產(chǎn)部分導(dǎo)致了疫苗的相當(dāng)?shù)偷牡味群拖鄳?yīng)相當(dāng)?shù)偷拿庖咴?，使得必需加入佐劑。?dāng)今基于細(xì)胞的技術(shù)開始與基于雞蛋的工藝競爭。最先進(jìn)的技術(shù)基于稱為MDCK(馬-達(dá)二氏犬腎)的犬腎細(xì)胞系。其具有一些優(yōu)點(diǎn)，如由于細(xì)胞可被冷凍并且儲(chǔ)存直至生產(chǎn)工藝開始因而后勤工藝比較簡單。該系統(tǒng)同樣對(duì)產(chǎn)品的污染較不敏感并且疫苗本身不含有可能導(dǎo)致變態(tài)反應(yīng)的殘留的痕量雞蛋蛋白。使用Vero和PER.C6細(xì)胞培養(yǎng)物的其他基于細(xì)胞的技術(shù)正處于開發(fā)中?？?009年流感的高致病性的Hl I毒株的疫苗，Cel-vapan (Baxter ;在非洲綠猴腎異倍體細(xì)胞中生產(chǎn)，未加佐劑)，于2009年10月I日在歐洲獲得EMEA的批準(zhǔn)(參見EMEA網(wǎng)站)。然而，不管所用的細(xì)胞系，就大量生產(chǎn)而言，這些生產(chǎn)工藝僅具有有限的生產(chǎn)能力。然而大量生產(chǎn)適當(dāng)流感抗原的快速可用性是面對(duì)流感流行或大流行的威脅時(shí)所必需的。綠色生物技術(shù)為克服與現(xiàn)有的流感疫苗生產(chǎn)體系(雞蛋和哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物)有關(guān)的數(shù)量問題提供了一個(gè)機(jī)會(huì)。植物的另一個(gè)優(yōu)勢在于它們不具有動(dòng)物病原體，這使得它們成為用于生物制藥的更安全的生產(chǎn)有機(jī)體。然而，在植物中生產(chǎn)流感抗原也不是沒有缺點(diǎn)。使用植物材料的污染可能導(dǎo)致有害的變態(tài)反應(yīng)并且妨礙藥物批準(zhǔn)。因此，在分離和純化來自植物提取的流感抗原時(shí)必須非
常注意。 在增強(qiáng)疫苗效力并由此克服可用性問題的另一個(gè)方法中，開發(fā)了免疫增強(qiáng)性重建流感病毒體(IRIV)。IRIV包含一種抗原或者摻入還含有磷脂混合物，一種必需的重建的功能病毒被膜，以及流感血凝素蛋白(HA)的病毒體的多種抗原的組合(參見例如W01992/19267)。采用例如來源于失活的甲型肝炎病毒的抗原，這些IRIV顯示非常好的結(jié)果。然而在這些IRIV疫苗中，沒有檢測到抗HA的抗體，表明沒有對(duì)HA抗原的免疫響應(yīng)，因此使用“空”的IRIV，即僅使用流感血凝素蛋白，作為“獨(dú)立”疫苗似乎是不可行的。因此，現(xiàn)有領(lǐng)域“空” IRIV被認(rèn)為是佐劑而不是疫苗。近來，綠色生物技術(shù)和IRIV方法的組合被公開(W0 2009/009876 ；W02009/076778)。在這些實(shí)驗(yàn)中，在植物中生產(chǎn)病毒樣顆粒(VLP)并且從植物材料分離。這一新方法允許大量生產(chǎn)VLP顆粒。然而不幸的是，VLP顯示相當(dāng)?shù)偷拿庖咴?，使得必須另外使用有效力的佐劑。盡管已經(jīng)測試若干方法以增強(qiáng)植物來源流感抗原的效力，但是還沒有植物來源的流感疫苗獲得批準(zhǔn)。因此，本發(fā)明所基于的技術(shù)問題是提供新的疫苗，尤其是抗流感的疫苗，其克服了與本領(lǐng)域中所用的方法有關(guān)的生產(chǎn)限制(例如就疫苗的數(shù)量、重復(fù)性和純度而言)而同時(shí)保持疫苗的免疫原性?，F(xiàn)有領(lǐng)域沒有提供也沒有建議之前提及的技術(shù)問題即可以大量生產(chǎn)并具有高重復(fù)性和純度以及同時(shí)高免疫原性的疫苗尤其是流感疫苗的解決方案。
本發(fā)明通過提供權(quán)利要求中表征的實(shí)施方案解決的上文的技術(shù)問題。通過使用這些實(shí)施方案，提高疫苗尤其是流感疫苗的生產(chǎn)能力和品質(zhì)變得可能。本發(fā)明可在疫苗和疫苗生產(chǎn)的所有領(lǐng)域尤其是流感疫苗中獲得應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種病毒體顆粒，其包含(i)在植物中重組生產(chǎn)的病毒抗原和(ii)脂雙層，其中所述脂雙層由下列特征中的至少一個(gè)表征:a)在所述脂雙層中錨定的至少一種二酰氧基丙基半胱氨酸(bisacy 1xypropy I cysteine)輒合物；b)在所述脂雙層中沒有錨定的植物甾醇；c)在所述脂雙層中錨定的至少一種動(dòng)物甾醇；d)與在所述病毒的宿主細(xì)胞的質(zhì)膜中發(fā)現(xiàn)的相同的脂雙層的質(zhì)膜組成；e)在所述脂雙層中沒有錨定的植物來源的鞘脂。在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及合成生產(chǎn)的病毒體顆粒，其包含(i)煙草屬植物中重組生產(chǎn)的流感血凝素(HA)抗原和(ii) 脂雙層，其中所述脂雙層包含在所述脂雙層中錨定的至少一種二酰氧基丙基半胱氨酸軛合物。本發(fā)明還提供了含有根據(jù)本發(fā)明的病毒體顆粒的疫苗，任選地與適合的藥學(xué)上可接受的物質(zhì)稀釋劑組合。本發(fā)明還提供生產(chǎn)病毒體顆粒的方法，其包括下列步驟:a)在植物中重組生產(chǎn)病毒抗原；b)生產(chǎn)磷脂混合物，其由下列特征中的至少一個(gè)表征:至少一種二酰氧基丙基半胱氨酸軛合物；無植物甾醇；至少一種動(dòng)物甾醇；如同在所述病毒的宿主細(xì)胞的質(zhì)膜中發(fā)現(xiàn)的質(zhì)膜組成；和/或無鞘脂；c)將流感病毒抗原與所述磷脂的混合物重建以形成所述病毒體顆粒。本發(fā)明還提供根據(jù)本發(fā)明的病毒顆粒、根據(jù)本發(fā)明的疫苗或由根據(jù)本發(fā)明的方法生產(chǎn)的病毒顆粒用于預(yù)防感染性傳染病的用途。


附圖顯示:圖1:制備病毒體的流程的原理:(a)植物中表達(dá)的HA流感抗原(b)磷脂的混合物(c)將含有HA的流感spike亞單元抗原與磷脂一起溶解于去污劑(d)除去去污劑之后含有表面上攜帶流感spike蛋白包括HA的重建的膜的病毒體顆粒。圖2:梯度銀染
圖3:光子相關(guān)光譜(PCS)圖4:小鼠中病毒體顆粒的免疫原性
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的一個(gè)方面涉及提供一種病毒體顆粒，其包含(i)在植物中重組生產(chǎn)的病毒抗原和(ii)脂雙層，其中所述脂雙層由下列特征中的至少一個(gè)表征:a)在所述脂雙層中錨定的至少一種二酰氧基丙基半胱氨酸軛合物；b)在所述脂雙層中沒有錨定的植物甾醇；c)在所述脂雙層中錨定的至少一種動(dòng)物甾醇；d)與在所述病毒的宿主細(xì)胞的質(zhì)膜中發(fā)現(xiàn)的相同的脂雙層的質(zhì)膜組成；e)在所述脂雙層中沒有錨定的植物來源的鞘脂。如本文所用的，術(shù)語“病毒體顆?！笔侵妇哂兄p層的顆粒，所述脂雙層含有磷脂的混合物，因此類似基本上重建的功能病毒被膜。在特定的實(shí)施方案中，所述脂雙層是單膜雙層(unilamellar bilayer)的形式。如本文所用的，術(shù)語“病毒抗原”是指促進(jìn)抗體生成并可導(dǎo)致免疫響應(yīng)的任何病毒抗原。在一個(gè)實(shí)施方案中，這樣的病毒抗原是來源于正粘病毒科家族的抗原。在特定的這些實(shí)施方案中，抗原是流感來源的抗原，在一些實(shí)施方案中，流感A、B或C來源的抗原。在某些實(shí)施方案中，抗原選自流感糖蛋白。在某些實(shí)施方案中，流感抗原選自由血凝素(HA)、神經(jīng)氨酸酶(NA)、核蛋白(NP)、M1-蛋白、M2-蛋白、NSl-蛋白、NS2 (NEP)-蛋白、P A-蛋白、PBl-蛋白、PB l-f2-蛋白和PB2-蛋白組成的組一種或多種。在特定的實(shí)施方案中，病毒抗原是血凝素(HA)。在另外的實(shí)施方案中，流感血凝素選自由H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15 和 H16 組成的組，特別地是 Hl。在另外的實(shí)施方案中，涵蓋這些病毒抗原的缺失、插入或加入突變體(即具有缺失的、插入的或增加的氨基酸或氨基酸序列的蛋白)。同樣，涵蓋嵌合體(即融合蛋白或不同來源的蛋白-絡(luò)合物)、化學(xué)修飾蛋白(例如聚乙二醇化的蛋白)和修飾的蛋白(例如用另外的非天然的氨基酸)。在一個(gè)實(shí)施方案中，植物來源的抗原來自于流感血凝素。在另外的實(shí)施方案中，病毒抗原來自于選自由H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15和H16組成的組的流感血凝素，特別地是Hl。在特定的實(shí)施方案中，病毒抗原，例如血凝素HA包含跨膜區(qū)或其衍生物。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，病毒抗原位于病毒體顆粒的脂雙層中。在某些實(shí)施方案中，血凝素(HA)是生物學(xué)上有活性的。如本文所用的，術(shù)語“生物學(xué)上有活性的”是指基本上顯示天然HA的全部生物學(xué)活性并且由此能夠介導(dǎo)本發(fā)明的病毒體顆粒與它們的靶細(xì)胞經(jīng)由包含唾液酸的受體吸附的HA或其衍生物。而且，這些HA組分可通過將抗流感抗體循環(huán)來識(shí)別。生物學(xué)活性是本發(fā)明的病毒體顆粒的必要特征。
不限于任何理論，本發(fā)明的病毒體顆粒的HA組分的功能可如下解釋:I)其與靶細(xì)胞上含有唾液酸(N-乙酰神經(jīng)氨酸)的受體結(jié)合以起始病毒體顆粒-細(xì)胞相互作用；
2)其介導(dǎo)病毒體顆粒通過膜融合事件進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)并由此最終導(dǎo)致其釋放；和3)其起到“識(shí)別抗原”的作用，因?yàn)榇蠖鄶?shù)人類可被認(rèn)為是對(duì)HA “預(yù)處理的”，原因在于事先通過疾病或接種疫苗暴露。因此，這些病毒體顆粒的必要特征在于它們?cè)谒鼈兊谋砻鏀y帶生物學(xué)上有活性的病毒糖蛋白(HA)或其衍生物，避免不期望的HA抗原在其可能被非特異性降解的細(xì)胞內(nèi)胞質(zhì)體(endocytosome)中的長期停留。最重要的是抗原應(yīng)當(dāng)適合巨噬細(xì)胞和其他輔佐細(xì)胞的事實(shí)。為了這一目的，病毒體顆粒的顆粒性質(zhì)是優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)槠淠M了微生物的顆粒實(shí)體。

而且，因?yàn)樗腥祟惗季哂锌沽鞲锌乖璈A的抗體(來自之前的流感感染或來自于疫苗接種)，因此快速形成抗體-抗原絡(luò)合物(免疫絡(luò)合物)。然而這些免疫絡(luò)合物不僅加速識(shí)別抗原的進(jìn)入巨噬細(xì)胞還加速識(shí)別抗原進(jìn)入淋巴小結(jié)，其中抗原被長期保留在濾泡樹突狀細(xì)胞表面的細(xì)胞外位點(diǎn)中。這些長期的細(xì)胞外顯露當(dāng)然是疫苗的優(yōu)選特征，因?yàn)槠涠喙δ艿拿庖?激發(fā)作用(免疫原性)。進(jìn)入巨噬細(xì)胞和淋巴小結(jié)的這一過程稱為調(diào)理作用。而且，通過抗體的結(jié)合具有抗原免疫原性的另一個(gè)結(jié)果。然而，溶液中一種給定的抗原，A，將僅與在其表面呈現(xiàn)具有抗A特異性的抗體分子的B細(xì)胞結(jié)合，而免疫絡(luò)合物可經(jīng)由Fe受體粘附于任何B細(xì)胞。因?yàn)檩斎肓馨凸苤械腂細(xì)胞進(jìn)入淋巴結(jié)的B細(xì)胞區(qū)域的能力，經(jīng)由Fe受體的這一非特異性結(jié)合是天然感染中可能的一種途經(jīng)，通過所述途經(jīng)所述抗原被運(yùn)輸至淋巴組織中的淋巴小結(jié)和其他地方(Nossal, G.J.V., New GenerationVaccines (ed.Woodrow, G.C.和 Levine, Μ.Μ.), Marcel Dekker, Inc.，(1990)85)。該機(jī)制可能輔助經(jīng)由單核細(xì)胞的運(yùn)輸。因此，病毒體顆粒表面上流感抗原的存在有利于調(diào)理作用的免疫機(jī)制。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的病毒顆粒含有完整的HA，其作為550個(gè)氨基酸的單個(gè)多肽鏈而在植物中合成，隨后通過除去精氨酸329 (相應(yīng)于HA[Influenza A virus (A/Tff/36/04 (H3N2))]的精氨酸345)而剪切為兩個(gè)鏈HAl (36，334道爾頓)和HA2 (25，750道爾頓)。這些鏈可任選地通過包括HAl位點(diǎn)14的半胱氨酸和HA2位點(diǎn)137的半胱氨酸的二硫鍵共價(jià)連接并且所述雙鏈單體可非共價(jià)結(jié)合以在IRIV的表面上形成三體。這些HAl或HA2肽可獲得自天然或合成來源或者通過基因工程獲得。而且，大劑量純蛋白抗原的突然使用包括激活免疫響應(yīng)中的抑制通路的風(fēng)險(xiǎn)，尤其是如果使用靜脈內(nèi)途經(jīng)時(shí)；參見 Nossal, G.J.V.，New Generation Vaccines, MarcelDekker, Inc.New York, Basle (eds.Woodrow, Levine), (1990)85。另一方面，緩慢釋放允許抗原對(duì)廣泛分布的樹突細(xì)胞和巨噬細(xì)胞大大過量，并且其同樣確保抗原在克隆增殖的最初爆發(fā)后仍然可獲得，由此允許某些方面的二次響應(yīng)。因此，如病毒體顆粒所表現(xiàn)的抗原的緩慢釋放對(duì)于疫苗來說是另一個(gè)有利特征。如本文所用的，術(shù)語“在植物中重組生產(chǎn)的”是指蛋白包括糖基化蛋白通過植物宿主中的表達(dá)而重組生產(chǎn)。在本發(fā)明的背景下，術(shù)語“植物宿主”是指任何適于異種蛋白的重組表達(dá)的任何植物。在特定的實(shí)施方案中，植物表達(dá)宿主是煙草屬植物、尤其是本塞姆氏煙草(Nicotiana benthamiana)。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，植物中重組生產(chǎn)的病毒抗原具有植物表達(dá)宿主的碳水化合物分布特征。與在植物中產(chǎn)生完整的病毒樣顆粒(VLP)的本領(lǐng)域技術(shù)相反，僅在植物中生產(chǎn)并純化病毒抗原(例如HA蛋白)。之后將抗原與并非在植物中生產(chǎn)的磷脂的混合物一起重建。如之前提及的，現(xiàn)有領(lǐng)域的方法通常在植物中生產(chǎn)整個(gè)VLP，即抗原以及磷脂混合物并且另外的蛋白具有植物來源。之后將VLP從植物產(chǎn)品中純化并且通過自發(fā)的凝集而形成。盡管這樣的“一步法”程序具有簡單的優(yōu)點(diǎn)，但是其也具有一些缺陷。首先，其使得生產(chǎn)不含雜質(zhì)的VLP實(shí)際上是不可能的。然而，與植物材料一起的雜質(zhì)對(duì)于變態(tài)或其他有害身體反應(yīng)的危險(xiǎn)來源。因此，對(duì)于這些VLP組成的疫苗來說制藥批準(zhǔn)是很難的。第二，自發(fā)凝集和顆粒形成使得任何進(jìn)一步的工藝控制都是不可能的。這導(dǎo)致尺寸和組成上不均勻的顆粒。第三，其不能夠同時(shí)配制佐劑達(dá)到它們成為VLP的一部分的效果。相反，佐劑僅可以在顆粒形成已經(jīng)發(fā)生之后被加入。本發(fā)明克服了所有這些缺陷。首先，其具有其產(chǎn)生非常純的病毒體顆粒的優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)樵谥参镏袃H產(chǎn)生病毒抗原(例如HA蛋白)，而磷脂和顆粒的其他組分通過化學(xué)或生物化學(xué)手段從非植物來源生產(chǎn)。令人驚訝地，本發(fā)明的純的病毒體顆粒顯示出與現(xiàn)有領(lǐng)域VLP相比增強(qiáng)的免疫原性。不限制于任何理論，假定因?yàn)榧兊牟《倔w顆粒不含有植物糖脂并且更類似于“天然”病毒體的結(jié)構(gòu)，抗原(例如HA蛋白)的重要表位沒有被遮蔽并且因此本發(fā)明的病毒體顆粒導(dǎo)致更強(qiáng)的免疫響應(yīng)。其次，向病毒抗原(例如HA蛋白)有控制地加入磷脂(和其他成分)允許受控的顆粒組成。這意味著顆粒的尺寸以及它們的組成可以根據(jù)個(gè)體需要被精確地控制并且調(diào)節(jié)。而且，免疫原性可以通過精細(xì)調(diào)節(jié)顆粒的組成來改進(jìn)。如本文所用的，“磷脂的混合物”包含天然或合成的磷脂或其混合物。至少其含有選自甘油磷脂(例如磷酸卵磷脂或磷脂酰乙醇胺)和膽固醇的組的一種或多種化合物，尤其是磷酸卵磷脂和/或磷脂酰乙醇胺。顆粒的受控凝集允許將佐劑摻入(即包埋或錨定于)顆粒自身的脂雙層中。為了增強(qiáng)免疫原性，在一些實(shí)施方案中，所述脂雙層包含至少一種二酰氧基丙基半胱氨酸軛合物，其被錨定在脂雙層中產(chǎn)生為疫苗接種所準(zhǔn)備的穩(wěn)定的顆粒。將二酰氧基丙基半胱氨酸軛合物摻入病毒體顆粒的脂雙層中的優(yōu)點(diǎn)在于病毒體顆粒表面、抗原分布和佐劑分布之間的理想比例可以保持穩(wěn)定。

在本發(fā)明的背景下，術(shù)語“二酰氧基丙基半胱氨酸”是指通式I的分子
權(quán)利要求
1.一種合成生產(chǎn)的病毒體顆粒，其包含Q)煙草屬植物中重組生產(chǎn)的流感血凝素(HA)抗原和(ii)脂雙層，其中所述脂雙層包含在所述脂雙層中錨定的至少一種二酰氧基丙基半胱氨酸軛合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的病毒體顆粒，其中所述流感血凝素(HA)抗原位于所述病毒體顆粒的脂雙層中。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的病毒體顆粒，其中所述二酰氧基丙基半胱氨酸軛合物選自由MALP-2、聚乙二醇化的二酰氧基丙基半胱氨酸和4-ARM- 二酰氧基丙基半胱氨酸所組成的組，特別地為 BPP-Glyc-Cys-4-arm-PEG。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的病毒體顆粒，其中所述二酰氧基丙基半胱氨酸軛合物選自由MALP-2和S-[2, 3_ 二(酸氧基)-(2R)-丙基]-L-半胱;酸基_竣基聚乙二醇所組成的組。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的病毒體顆粒，其中所述所述二酰氧基丙基半胱氨酸軛合物是S-[2, 3- 二(掠櫚酸基氧基)-(2R)_丙基]-L-半胱酸基_羧基聚乙二醇。
6.一種疫苗，其包含根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的病毒體顆粒，所述病毒體顆粒任選地與適合的藥學(xué)上可接受的物質(zhì)稀釋劑組合。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的疫苗，其與適合的藥學(xué)上可接受的物質(zhì)佐劑組合。
8.根據(jù)權(quán)利要求6至7中任一項(xiàng)所述的疫苗，其用于鼻施用。
9.一種生產(chǎn)病毒體顆粒的方法，其包括下列步驟: a)在植物中重組生產(chǎn)流感血凝素(HA)抗原； b)生產(chǎn)磷脂混合物，其包含至少一種二酰氧基丙基半胱氨酸軛合物；和 c)將所述病毒抗原與所述磷脂的混合物重組以形成所述病毒體顆粒。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的病毒體顆粒、根據(jù)權(quán)利要求6至8中任一項(xiàng)所述的疫苗或通過權(quán)利要求9的方法生產(chǎn)的病毒體顆粒用于預(yù)防流感的用途。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的用途，其包括向有需要的患者施用適當(dāng)劑量的根據(jù)權(quán)利要求I至5中任一項(xiàng)所述的病毒體顆粒、根據(jù)權(quán)利要求6至8中任一項(xiàng)所述的疫苗或通過權(quán)利要求9的方法生產(chǎn)的病毒體顆粒。
全文摘要
本發(fā)明涉及使用植物中表達(dá)的病毒抗原尤其是流感抗原生產(chǎn)一種新型病毒體顆粒以及包含這些病毒體顆粒的疫苗尤其是流感疫苗。
文檔編號(hào)A61K39/145GK103154251SQ201180047873
公開日2013年6月12日 申請(qǐng)日期2011年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月30日
發(fā)明者馬里亞·迪納羅 申請(qǐng)人:佛蘭瓦克斯有限責(zé)任公司