專利名稱：使用來自細(xì)胞的微泡治療和診斷癌癥的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種使用來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡，治療癌癥和/或診斷癌癥的方法。特別地，本發(fā)明涉及一種使用來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡的組分治療癌癥的方法。
背景技術(shù)：
在1813年，Vautier報道了在同時患有厭氧細(xì)菌產(chǎn)氣莢膜梭菌感染引起的氣性壞疽的患者中癌癥的明顯治愈。自那時起，對于有意注射各種細(xì)菌進(jìn)行了廣泛研究，所述細(xì)菌除了梭菌之外，還包括鼠傷寒沙門氏菌，即細(xì)菌介導(dǎo)的癌癥治療的概念。當(dāng)癌細(xì)胞生長超過一定大小(大約Imm3)時，其經(jīng)受周圍血管的氧氣供應(yīng)不足，形成癌組織內(nèi)缺氧。缺氧狀態(tài)下的癌組織提供了厭氧細(xì)菌容易增殖的環(huán)境，同時其可能使用各種毒素和/或通過未知機(jī)制攻擊周圍癌細(xì)胞至壞死。已進(jìn)行了各種嘗試以增強(qiáng)細(xì)菌介導(dǎo)的癌癥治療。例如，細(xì)菌被轉(zhuǎn)化以表達(dá)抗癌蛋白質(zhì)，或用于遞送攜帶抗癌蛋白質(zhì)基因的質(zhì)粒至癌組織。為了減輕由細(xì)菌增殖和毒素產(chǎn)生的副作用，也嘗試將營養(yǎng)缺陷型突變體、孢子和減毒細(xì)菌用于癌癥治療。盡管這些努力，但在癌癥治療中使用細(xì)菌一直存在癌癥周圍的正常組織或器官中細(xì)菌增殖的風(fēng)險。廣義上細(xì)菌中具有兩種不同類型的細(xì)胞壁，稱為革蘭氏陽性和革蘭氏陰性。已知革蘭氏陰性菌，諸如大腸桿菌、腦膜炎奈瑟氏菌、綠膿假單胞菌和福氏志賀氏菌自發(fā)地從外膜脫落微泡。來自革蘭氏陰性菌細(xì)胞脫落的微泡被稱為外膜囊泡，通常由脂質(zhì)雙分子層組成。通常其為大小為20 200nm的球狀，并具有各種生物活性物質(zhì)，諸如脂多糖(LPS)和外膜蛋白、脂質(zhì)和遺傳物質(zhì)(DNA，RNA)，其影響宿主細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。來自細(xì)菌細(xì)胞脫落的微泡用作信息載體，其在同源細(xì)胞之間的蛋白質(zhì)或遺傳物質(zhì)輸送中及細(xì)胞至細(xì)胞的信號傳導(dǎo)中起重要作用，并有助于競爭生物體的去除或細(xì)菌的存活。此外，脫落的微泡將毒素傳遞至宿主，因此部分地解釋了細(xì)菌性疾病的病原學(xué)。在死于嚴(yán)重敗血癥的患者血液中發(fā)現(xiàn)脫落的微泡的報道表示脫落的微泡在敗血癥的病理學(xué)中起重要作用，敗血癥的特征是全身性炎癥反應(yīng)。發(fā)現(xiàn)來自細(xì)菌細(xì)胞脫落的微泡刺激宿主細(xì)胞分泌炎癥性細(xì)胞因子和凝結(jié)劑的研究也支持上述觀點(diǎn)。 本發(fā)明人首次發(fā)現(xiàn)，革蘭氏陽性菌，包括枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌產(chǎn)生脫落的微泡。然而，還需要更多關(guān)于來自革蘭氏陽性菌細(xì)胞脫落的微泡的組分或功能的信息。已分離并觀察到從各種細(xì)菌種類自發(fā)脫落的微泡。通常，通過過濾或超速離心從細(xì)胞培養(yǎng)物中分離脫落的微泡。此外，已知可用抗生素(諸如慶大霉素)控制脫落的微泡的產(chǎn)生。特別地，建議通過清潔劑處理制備脫落的微泡可能應(yīng)用為抗腦膜炎奈瑟氏菌(一種細(xì)菌性病原體)感染的疫苗。然而，這些生產(chǎn)方法的容量受到嚴(yán)格限制。盡管癌癥和細(xì)菌之間的關(guān)系，但迄今為止未報道來自細(xì)菌細(xì)胞脫落的微泡在癌癥發(fā)病及發(fā)展中的作用，特別地，未報道應(yīng)用來自細(xì)菌細(xì)胞脫落的微泡治療癌癥和/或診斷癌癥。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明人徹底深入的研究發(fā)現(xiàn)包含來自細(xì)菌或轉(zhuǎn)化細(xì)菌的微泡的組合物能有效地抑制癌細(xì)胞的生長。因此，本發(fā)明提供了一種使用來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡治療癌癥和/或診斷癌癥的方法，其在癌癥治療中卓有成效并顯著減少副作用，及一種使用負(fù)載藥物的來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡，遞送治療或診斷疾病藥物的方法，從而有效并特異性地治療和診斷疾病。然而，本發(fā)明所要達(dá)到的目的不限于上述，因此本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，可從以下描述中清楚地理解其他目的。技術(shù)方案根據(jù)一方面，本發(fā)明涉及用于治療癌癥和/或診斷癌癥的藥物組合物，其包含來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡。本發(fā)明中使用的細(xì)菌可來自革蘭氏陽性或革蘭氏陰性菌，且其可以是天然的或基因轉(zhuǎn)化的。該組合物還進(jìn)一步包含中和微泡毒性的藥物、提高抗癌活性的藥物、負(fù)載這種藥物的納米顆粒治療劑和/或細(xì)胞治療劑。所述納米顆粒治療劑是大小為IOnm至10 μ m的顆粒，且其實例包括，但不限于，脂質(zhì)體、樹枝狀大分子、聚合物和微泡。根據(jù)另一方面，本發(fā)明涉及一種治療癌癥和/或診斷癌癥的方法，其包括向需要的受試者施用來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡。所述微泡可與中和微泡毒性的藥物、提高抗癌活性的藥物、負(fù)載這種藥物的納米顆粒治療劑和/或細(xì)胞治療劑一起同時/順序地施用。根據(jù)還一方面，本發(fā)明涉及一種用于治療癌癥和/或診斷癌癥的來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡的制備方法。在本發(fā)明 的制備方法中，所述來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡可以是從細(xì)菌自發(fā)脫落的微泡或人工微泡。在本發(fā)明的一個實施方式中，用于治療癌癥或診斷癌癥的脫落的微泡的制備方法包括以下步驟:添加藥物至細(xì)菌或轉(zhuǎn)化細(xì)菌的懸浮液中以得到含有藥物的細(xì)菌懸浮液；并將負(fù)載藥物的脫落的微泡從細(xì)菌懸浮液中分離。在本發(fā)明的另一實施方式中，用于治療癌癥或診斷癌癥的脫落的微泡的制備方法包括以下步驟:將脫落的微泡從細(xì)菌或轉(zhuǎn)化細(xì)菌的培養(yǎng)物中分離；并培養(yǎng)帶有藥物的已分離的微泡的懸浮液。該方法還進(jìn)一步包括分離負(fù)載用于治療癌癥或診斷癌癥的藥物的脫落的微泡。在本發(fā)明的還一實施方式中，用于治療癌癥或診斷癌癥的人工微泡的制備方法包括以下步驟:將細(xì)菌或轉(zhuǎn)化細(xì)菌的懸浮液與藥物混合以得到含有藥物的細(xì)菌懸浮液；使用選自下組的方法對細(xì)菌懸浮液進(jìn)行處理以構(gòu)建人工微泡，該組由擠壓、超聲波處理、分裂、均質(zhì)化、凍融、電穿孔、機(jī)械降解和化學(xué)處理組成；并分離人工微泡。在本發(fā)明的又一實施方式中，用于治療癌癥或診斷癌癥的人工微泡的制備方法包括以下步驟:使用選自下組的方法對細(xì)菌或轉(zhuǎn)化細(xì)菌懸浮液進(jìn)行處理以構(gòu)建人工微泡，該組由擠壓、超聲波處理、分裂、均質(zhì)化、凍融、電穿孔、機(jī)械降解和化學(xué)處理組成；分離人工微泡；并培養(yǎng)帶有藥物的已分離的微泡的懸浮液。該方法還進(jìn)一步包括從細(xì)菌懸浮液中分離負(fù)載用于治療癌癥或診斷癌癥的藥物的人工微泡。根據(jù)本發(fā)明的制備方法還進(jìn)一步可包括使用選自由抗生素治療、紫外線照射、Y射線照射和過濾組成的組中的方法滅菌用于治療癌癥或診斷癌癥的脫落的微泡或人工微泡。根據(jù)還一方面，本發(fā)明提供了一種包含負(fù)載治療癌癥或診斷癌癥的藥物的來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡的藥物組合物。根據(jù)還一方面，本發(fā)明提供了一種包含負(fù)載治療癌癥或診斷癌癥的藥物的來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡的藥物組合物，所述細(xì)菌細(xì)胞被轉(zhuǎn)化以靶向癌細(xì)胞或癌組織。此外，本發(fā)明的又一方面設(shè)想一種遞送治療癌癥和/或診斷癌癥的藥物至癌細(xì)胞或癌組織的方法，其包括使用負(fù)載藥物的來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡，所述細(xì)菌細(xì)胞被轉(zhuǎn)化以靶向癌細(xì)胞或癌組織。此外，本發(fā)明的又一方面設(shè)想一種治療癌癥和/或診斷癌癥的方法，其包括使用負(fù)載藥物的來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡，所述細(xì)菌細(xì)胞被轉(zhuǎn)化以靶向癌細(xì)胞或癌組織。根據(jù)還一方面，本發(fā)明提供了一種用于遞送治療疾病和/或診斷疾病的物質(zhì)的組合物，其包含負(fù)載治療物質(zhì)和/或診斷物質(zhì)的來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡。根據(jù)還一方面，本發(fā)明涉及一種遞送治療疾病和/或診斷疾病的藥物的方法，其包括使用負(fù)載治療藥物和/或診斷藥物的來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡。根據(jù)另一方面，本發(fā)明涉及一種遞送治療疾病和/或診斷疾病的藥物至目的細(xì)胞或目的組織的方法，其包括使用負(fù)載治療藥物和/或診斷藥物的來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡，所述細(xì)菌細(xì)胞被轉(zhuǎn)化以靶向目的細(xì)胞或目的組織。根據(jù)還一方面 ，本發(fā)明涉及一種治療疾病和/或診斷疾病的方法，其包括遞送負(fù)載治療疾病和/或診斷疾病的藥物的微泡。根據(jù)另一方面，本發(fā)明涉及一種用于診斷疾病和/或治療疾病的藥物遞送系統(tǒng)，其包含負(fù)載治療疾病和/或診斷疾病的藥物的微泡。根據(jù)還一方面，本發(fā)明涉及一種診斷疾病的試劑盒，其包含負(fù)載診斷疾病的物質(zhì)的來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡。根據(jù)還一方面，本發(fā)明涉及一種治療癌癥的方法，其包括施用負(fù)載蛋白質(zhì)作為活性成分的來自細(xì)菌細(xì)胞的囊泡。在本發(fā)明的這種方法中，所述蛋白質(zhì)可以來自革蘭氏陰性或革蘭氏陽性菌。在該方法的一個實施方式中，所述微泡可負(fù)載中和微泡組分副作用的藥物、提高抗癌活性的藥物、負(fù)載這種藥物的納米顆粒治療劑和/或細(xì)胞治療劑。根據(jù)又一方面，本發(fā)明涉及一種治療癌癥的方法，其包括施用負(fù)載核酸作為活性成分的來自細(xì)菌細(xì)胞的囊泡。在本發(fā)明的這種方法中，所述核酸可以來自革蘭氏陰性或革蘭氏陽性菌。在該方法的一個實施方式中，所述微泡可負(fù)載中和微泡核酸的副作用的藥物、提高抗癌活性的藥物、負(fù)載這種藥物的納米顆粒治療劑和/或細(xì)胞治療劑。根據(jù)又一方面，本發(fā)明涉及一種治療癌癥的方法，其包括施用負(fù)載脂質(zhì)作為活性成分的來自細(xì)菌細(xì)胞的囊泡。在本發(fā)明的這種方法中，所述脂質(zhì)可以來自革蘭氏陰性或革蘭氏陽性菌。在該方法的一個實施方式中，所述微泡可負(fù)載中和微泡脂質(zhì)的副作用的藥物、提高抗癌活性的藥物、負(fù)載這種藥物的納米顆粒治療劑和/或細(xì)胞治療劑。根據(jù)還一方面，本發(fā)明涉及一種治療癌癥的方法，其包括施用負(fù)載兩種或多種選自蛋白質(zhì)、核酸及脂質(zhì)的組分作為活性成分的來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡。在該方法的一個實施方式中，所述微泡可負(fù)載中和微泡組分的副作用的藥物、提高抗癌活性的藥物、負(fù)載這種藥物的納米顆粒治療劑和/或細(xì)胞治療劑。根據(jù)還一方面，本發(fā)明涉及在癌癥治療中與蛋白質(zhì)重組的納米顆粒治療劑的用途，所述蛋白質(zhì)是來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡的組分。根據(jù)另一方面，本發(fā)明本發(fā)明涉及在癌癥治療中負(fù)載核酸的納米顆粒治療劑的用途，所述核酸是來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡的組分。根據(jù)還一方面，本發(fā)明涉及在癌癥治療中與脂質(zhì)重組的納米顆粒治療劑的用途，所述脂質(zhì)是來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡的組分。根據(jù)又一方面，本發(fā)明涉及在癌癥治療中與兩種或多種來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡的組分負(fù)載或重組的納米顆粒治療劑的用途。根據(jù)還一方面，本發(fā)明涉及一種治療癌癥的方法，包括施用來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡的組分。在本發(fā)明的一個實施方式中，來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡的組分可與中和組分毒性的藥物、提高抗癌活性的藥物或負(fù)載這種藥物的納米顆粒治療劑或細(xì)胞治療劑一起同時或順序地施用。所述納米顆粒治療劑是大小IOnm至10 μ m的顆粒，且其實例包括，但不限于，脂質(zhì)體、樹枝狀大分子、聚合物和微泡。在本發(fā)明的一個實施方式中，蛋白質(zhì)作為一種來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡的組分存在，包括水溶性蛋白、脂溶性蛋白或膜蛋白，但不限于此。在本發(fā)明另一實施方案中，核酸可包括DNA和RNA，但不限于此。有益效果 根據(jù)本發(fā)明的來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡可用于治療癌癥或診斷癌癥，減少傳統(tǒng)藥物的副作用，由此可以減少患者在治療過程中的痛苦和不便。傳統(tǒng)的抗癌藥物非特異性地作用于增殖細(xì)胞，在正常細(xì)胞上產(chǎn)生細(xì)胞毒性導(dǎo)致副作用。此外，傳統(tǒng)施用方法使抗癌藥物不僅被遞送至癌細(xì)胞或癌組織，還遞送至非癌器官，從而導(dǎo)致嚴(yán)重的副作用。隨著衰老人口的增加，老年人患癌癥已上升為社會問題。免疫功能異常，即失去控制癌細(xì)胞生長的能力，大體上解釋了癌癥的發(fā)生和發(fā)展，但只有極少數(shù)情況下，通過增強(qiáng)防御機(jī)制有效抑制癌細(xì)胞生長而治療癌癥。本發(fā)明的來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡可用于有效抑制癌細(xì)胞的生長。一旦它們負(fù)載靶分子，來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡，無論細(xì)菌細(xì)胞是否被轉(zhuǎn)化，可靶向癌癥血管、癌細(xì)胞或癌組織，從而最小化由微泡的錯誤靶向引起的副作用。此外，當(dāng)諸如抗癌劑、抗炎劑等藥物負(fù)載于微泡或封裝于其中時，微泡可準(zhǔn)確地遞送藥物并最大限度地提高藥物的治療效果，同時不靶向非靶細(xì)胞，也不會引起副作用。此外，可使用根據(jù)本發(fā)明的遺傳、化學(xué)或機(jī)械方法制備降低毒性并提高治療能力的微泡。此外，本發(fā)明的來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡具有同時被用于治療癌癥和診斷癌癥的優(yōu)勢。特別地，來自轉(zhuǎn)化至靶向癌細(xì)胞或目的組織的細(xì)菌的微泡，或顯示分子靶向癌細(xì)胞或目的組織的或負(fù)載諸如熒光劑的外部可檢測物質(zhì)的來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡，可同時應(yīng)用于癌癥治療和癌癥診斷。另外，當(dāng)本發(fā)明的來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡負(fù)載與治療和診斷疾病相關(guān)的物質(zhì)時，其可用于治療和診斷除癌癥外的疾病。微泡可特異性地遞送物質(zhì)至靶細(xì)胞或靶組織，從而改善了疾病的治療和診斷。
本發(fā)明的來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡的另一個優(yōu)勢是其大量生產(chǎn)及適用性廣泛。此外，只要由細(xì)菌細(xì)胞表達(dá)，任何靶分子、治療物質(zhì)或診斷物質(zhì)可不經(jīng)純化負(fù)載于來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡上或負(fù)載于該微泡中。負(fù)載物質(zhì)可有效地發(fā)揮其固有功能。此外，根據(jù)本發(fā)明的負(fù)載治療物質(zhì)和/或診斷物質(zhì)的來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡及其制備方法可用于體外和/或體內(nèi)治療、診斷或?qū)嶒灐?br>

圖1示出了通過擠壓由革蘭氏陰性菌大腸桿菌構(gòu)建的微泡的TEM圖像。圖2示出了在結(jié)腸癌的動物模型中來自革蘭氏陰性菌大腸桿菌的脫落的微泡(大腸桿菌MV)抑制癌組織生長(腫瘤體積)的圖表。圖3示出了在結(jié)腸癌的動物模型中來自革蘭氏陰性菌綠膿假單胞菌的脫落的微泡(綠膿假單胞菌MV)抑制癌組織生 長(腫瘤體積)的圖表。圖4示出了在結(jié)腸癌的動物模型中來自革蘭氏陰性菌腸炎沙門氏菌的脫落的微泡(腸炎沙門氏菌MV)抑制癌組織生長(腫瘤體積)的圖表。圖5示出了在結(jié)腸癌的動物模型中來自革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌的脫落的微泡(金黃色葡萄球菌MV)抑制癌組織生長(腫瘤體積)的圖表。圖6示出了在結(jié)腸癌的動物模型中來自革蘭氏陽性菌嗜酸乳桿菌的脫落的微泡(嗜酸乳桿菌MV)抑制癌組織生長(腫瘤體積)的圖表。圖7示出了在結(jié)腸癌的動物模型中來自野生型大腸桿菌和被轉(zhuǎn)化為具有減弱脂多糖毒性的突變型大腸桿菌的脫落的微泡(大腸桿菌MV)對癌組織生長(腫瘤體積)的抗癌效應(yīng)的圖表。圖8示出了在結(jié)腸癌的動物模型中來自野生型金黃色葡萄球菌和被轉(zhuǎn)化為具有減弱脂磷壁酸毒性的突變型金黃色葡萄球菌的脫落的微泡(金黃色葡萄球菌MV)對癌組織生長(腫瘤體積)的抗癌效應(yīng)的圖表。圖9示出了在轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的動物模型中來自被轉(zhuǎn)化為具有減弱脂多糖毒性的突變型大腸桿菌的脫落的微泡(大腸桿菌MV)對癌組織生長(菌落數(shù))的抗癌效應(yīng)的圖表。圖10示出了對結(jié)腸癌的動物模型共同施用來自被轉(zhuǎn)化為具有減弱脂多糖毒性的突變型大腸桿菌的脫落的微泡(MV)和阿司匹林(ASA)的抗癌活性的圖表。圖11示出了負(fù)載阿霉素的綠色熒光(DiO)標(biāo)記的來自被轉(zhuǎn)化為具有減弱脂多糖毒性的突變型大腸桿菌的脫落的微泡(突變型大腸桿菌MV)的圖像。圖12示出了負(fù)載阿霉素(D0x0)的來自被轉(zhuǎn)化為具有減弱脂多糖毒性的突變型大腸桿菌的脫落的微泡(MV+Doxo)對小鼠結(jié)腸26細(xì)胞系的抗癌活性的圖表。圖13示出多粘菌素B (PMB)對來自大腸桿菌脫落的微泡(大腸桿菌MV)的副作用(全身性炎癥引起的死亡)的效應(yīng)圖。圖14示出了來自野生型大腸桿菌的微泡(野生型MV)和來自被轉(zhuǎn)化為具有減弱脂多糖毒性的突變型大腸桿菌的微泡(突變型MV)對來自大腸桿菌脫落的微泡的副作用(全身性炎癥引起的死亡)的效應(yīng)圖。圖15示出了靜脈注射來自被轉(zhuǎn)化為具有減弱脂多糖毒性的突變型大腸桿菌的微泡(突變型大腸桿菌MV)后血小板數(shù)量的變化圖。
圖16示出了靜脈注射來自被轉(zhuǎn)化為具有減弱脂多糖毒性的突變型大腸桿菌的微泡(突變型大腸桿菌MV)后D- 二聚體水平的變化圖。圖17示出了在平板上培養(yǎng)來自被轉(zhuǎn)化為具有減弱脂多糖毒性的突變型大腸桿菌的微泡(突變型大腸桿菌MV)后，在血液瓊脂平板上觀察到溶血的圖示。圖18示出了來自野生型金黃色葡萄球菌和被轉(zhuǎn)化為具有減弱脂磷壁酸毒性的突變型金黃色葡萄球菌的脫落的微泡(金黃色葡萄球菌MV)的副作用(由炎癥細(xì)胞釋放IL-6)的圖表。圖19示出了在結(jié)腸癌的動物模型中共同施用阿司匹林(ASA)對來自被轉(zhuǎn)化為具有減弱脂多糖毒性的突變型大腸桿菌的微泡(MV)的副作用(白細(xì)胞計數(shù)，全身性炎癥反應(yīng)的指標(biāo))的效應(yīng)圖。圖20示出了在結(jié)腸癌的動物模型中，來自被轉(zhuǎn)化為具有減弱脂多糖毒性的突變型大腸桿菌的微泡(突變型大腸桿菌MV)將IOOnm大小的熒光微球遞送至癌細(xì)胞的圖像。圖21示出了在結(jié)腸癌的動物模型中來自細(xì)菌細(xì)胞脫落的微泡的主要外膜蛋白OmpA抑制癌組織生長(腫瘤體積)的圖表。圖22示出了在結(jié)腸癌的動物模型中來自O(shè)mpF-敲除(OmpF-/-)突變型大腸桿菌和野生型大腸桿菌(WT)的脫落的微泡(大腸桿菌MV)抑制癌組織生長(腫瘤體積)的圖表。圖23示出了來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡的組分OmpA作為納米顆粒載體與脂質(zhì)體重組后脂質(zhì)體中存在OmpA的圖示。
具體實施例方式根據(jù)一方面，本發(fā)明提供了一種用于治療癌癥和/或診斷癌癥的藥物組合物，其包含來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡。本發(fā)明中使用的細(xì)菌可以是革蘭氏陰性或革蘭氏陽性菌。革蘭氏陰性菌的例子有大腸桿菌、綠膿假單胞菌和沙門氏菌。革蘭氏陽性菌的例子包括金黃色葡萄球菌和嗜酸乳桿菌，但不限于此。如本文所使用的術(shù)語“細(xì)菌”是指天然存在的細(xì)菌或轉(zhuǎn)化細(xì)菌。更具體地，如本文所使用的術(shù)語“轉(zhuǎn)化細(xì)菌”是指包括，但不限于，被轉(zhuǎn)化為具有減弱毒性的細(xì)菌，例如，具有改性的內(nèi)毒素基因；被轉(zhuǎn)化的以表達(dá)靶向目的細(xì)胞或組織所必需的物質(zhì)的細(xì)菌，例如癌癥血管、癌組織或癌細(xì)胞；及被轉(zhuǎn)化的以表達(dá)細(xì)胞膜與靶細(xì)胞融合，治療和/或診斷目的疾病所必需的物質(zhì)的細(xì)菌；及被轉(zhuǎn)化的以同時上調(diào)目的物質(zhì)和下調(diào)目的物質(zhì)的細(xì)菌。此外，通過用物質(zhì)處理細(xì)胞或?qū)⑼庠椿驅(qū)爰?xì)胞中轉(zhuǎn)化細(xì)菌兩次或多次。在本發(fā)明的一個實施方式中，細(xì)菌可被轉(zhuǎn)化以下調(diào)至少一種目的蛋白。在本發(fā)明的一個實施方式中，轉(zhuǎn)化細(xì)菌可用于表達(dá)一種或多種物質(zhì)，所述物質(zhì)選自由細(xì)胞粘附分子、抗體、靶向蛋白、細(xì)胞膜融合蛋白及其融合蛋白所組成的組，但不限于此。如本文所使用的術(shù)語“來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡”是指包含由細(xì)菌自發(fā)分泌的“脫落的微泡”，及使用遺傳、化學(xué)或機(jī)械方法人工合成的“人工微泡”。如本文所使用的術(shù) 語“來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡”指的是亞細(xì)胞大小的囊泡，其內(nèi)部和外部環(huán)境僅通過脂雙層膜分開，且其具有質(zhì)膜脂質(zhì)、質(zhì)膜蛋白、核酸和細(xì)菌組分。
可使用以下說明的非限制性的方法之一構(gòu)建本發(fā)明的脫落的微泡。(I)培養(yǎng)細(xì)菌或轉(zhuǎn)化細(xì)菌，并過濾及超速離心培養(yǎng)物以得到脫落的微泡。(2)用清潔劑處理細(xì)菌或轉(zhuǎn)化的細(xì)菌，并過濾及超速離心培養(yǎng)物以得到脫落的微泡。對清潔劑不賦予任何限制。(3)用抗生素處理細(xì)菌或轉(zhuǎn)化的細(xì)菌，并過濾及超速離心培養(yǎng)物以得到脫落的微泡。抗生素不賦予特別限制，且其包括慶大霉素、氨芐青霉素和卡那霉素?？墒褂眠x自下組方法處理含有細(xì)菌的懸浮液以構(gòu)建本發(fā)明的人工微泡，該組由擠壓、超聲波處理、分裂、均質(zhì)化、凍融、電穿孔、機(jī)械降解及化學(xué)處理組成，構(gòu)建方法不限于此。在本發(fā)明的一個實施方式中，來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡還進(jìn)一步包含來自細(xì)菌細(xì)胞膜的組分以外的膜內(nèi)組分。來自細(xì)菌細(xì)胞膜以外的組分還包含靶向分子、膜融合靶細(xì)胞所必需的融合劑、環(huán)糊精及聚乙二醇。此外，可使用各種方法，包括細(xì)胞膜的化學(xué)改性，添加來自細(xì)胞膜以外的組分。

例如，來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡的膜組分可用巰基(-SH)或胺基(-NH2)化學(xué)改性或通過化學(xué)方法將聚乙二醇結(jié)合至膜。根據(jù)本發(fā)明的來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡的制備方法還進(jìn)一步包括膜組分的化學(xué)改性。根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式，藥物組合物還進(jìn)一步包含中和微泡自身毒性的藥物。在這方面，所述藥物可負(fù)載于微泡。所述藥物功能為抑制內(nèi)毒素的毒性，且其可為多粘菌素B。根據(jù)本發(fā)明的另一實施方式，藥物組合物還進(jìn)一步包含提高抗癌活性的藥物。在這方面，所述藥物可負(fù)載于微泡。本發(fā)明中使用的藥物包含抑制Thl7(輔助性T細(xì)胞17)免疫應(yīng)答的藥物、抑制白介素6(IL-6)的產(chǎn)生或活性的藥物、抑制血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的產(chǎn)生或活性的藥物、抑制STAT3(信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3)信號傳導(dǎo)的藥物、抗癌劑、負(fù)載這種藥物的納米顆粒治療劑及用于癌癥的細(xì)胞治療劑。抑制Thl7免疫應(yīng)答的藥物可以是阿司匹林，且抑制VEGF形成或活性的藥物可起到中斷VEGF受體介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)的作用。負(fù)載抗癌劑的納米顆?？梢允侵|(zhì)體，諸如D0XIL。納米顆粒治療劑是大小為IOnm至10 μ m的顆粒，且其例子包括，但不限于，脂質(zhì)體、樹枝狀大分子、聚合物和微泡。除了活性成分之外，本發(fā)明的藥物組合物可包含藥學(xué)上可接受的載體，例如，生理鹽水、無菌水、林格氏溶液、緩沖鹽水、環(huán)糊精、葡萄糖溶液、麥芽糖糊精溶液、甘油、乙醇、月旨質(zhì)體或其組合。如果需要，所述藥物組合物還進(jìn)一步包含典型的添加劑，諸如抗氧化劑、緩沖液等。此外，借助稀釋劑、分散劑、表面活性劑、結(jié)合劑和/或潤滑劑，所述藥物組合物可配制成注射劑，諸如水溶液、懸浮液、乳劑等、丸劑、膠囊劑、顆粒劑或片劑。此外，可根據(jù)本領(lǐng)域眾所周知的方法或 Remington' sPharmaceutical Science (Mack PublishingCompany, Easton PA)中公開的方法,所述藥物組合物可配制成合適的劑型。不賦予藥物組合物的制劑特殊限制。優(yōu)選地，所述藥物組合物可配制成注射劑或可吸入形式。不賦予本發(fā)明藥物組合物的施用特殊限制。所述藥物組合物可口服或腸胃外施用，諸如靜脈內(nèi)、皮下、腹腔內(nèi)，經(jīng)由吸入或局部地施用。在本發(fā)明藥物組合物中活性成分的量可依據(jù)各種因素變化，所述因素包括患者體重、年齡、性別和健康情況、飲食、給藥時間、給藥途徑、排泄速率、疾病嚴(yán)重程度等。術(shù)語“日劑量”是指本發(fā)明的治療上有效成分的量，當(dāng)施用于需要的受試者時其足夠緩解病情。本發(fā)明藥物組合物中活性成分的合適劑量取決于負(fù)載化合物的種類、疾病嚴(yán)重程度及需要治療的受試者的情況，并可由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定。例如，本發(fā)明組合物的合適劑量可依據(jù)患者體重、年齡、性別和健康情況、給藥途徑和疾病嚴(yán)重程度變化，對于體重70kg的成年患者通常的劑量變化范圍為0.1至IOOOmg/天，且優(yōu)選地I至500mg/天。本發(fā)明藥物組合物的總有效量可以單劑量施用于患者，或通過分級的治療方案施用，其中在更長時間內(nèi)施用多劑量。根據(jù)另一方面，本發(fā)明涉及一種治療癌癥和/或診斷癌癥的方法，其包括向需要的受試者施用來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡。如本文所使用的術(shù)語“受試者”指的是需要治療目的疾病(例如癌癥、血管疾病或炎癥性疾病)的動物，包括人類、或非人類哺乳動物諸如靈長類動物、小鼠、大鼠、狗、貓、馬、牛等。如本文所使用的術(shù)語“癌癥”指的是一組不同疾病，其特征在于由于程序性細(xì)胞死亡的破壞引起的未經(jīng)調(diào)節(jié)的細(xì)胞生長并浸潤到鄰近組織。根據(jù)本發(fā)明待處理的靶標(biāo)可選自下組癌癥中，但不限于此，該組由以下癌癥組成:源于上皮細(xì)胞的癌癥，諸如肺癌、咽喉癌、胃癌、大腸癌/直腸癌、肝癌、膽囊癌、胰腺癌、乳腺癌、宮頸癌、前列腺癌、腎癌、皮膚癌等，源于結(jié)締組織細(xì)胞的肉瘤，諸如骨癌、肌肉癌、脂肪癌、纖維細(xì)胞癌等，源于造血細(xì)胞的血癌,諸如白血病、淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤等,及神經(jīng)組織腫瘤的神經(jīng)瘤。如本文所使用的術(shù)語“血管疾病”指的是一組不同疾病，其中由于代謝性、傳染性、毒性或免疫原因引起血管內(nèi)或血管壁內(nèi)出現(xiàn)功能失調(diào)。根據(jù)本發(fā)明待處理的靶標(biāo)可選自下組血管疾病中，但不限于此，該組由以下血管疾病組成:動脈硬化(或動脈粥樣硬化)、心絞痛、急性心肌梗塞、中風(fēng)、血管性癡呆、代謝性血管疾病，諸如缺血性血管疾病，及傳染性、毒性或免疫血管疾病 ，諸如敗血癥、彌漫性血管內(nèi)凝血、血栓栓塞、血管炎、腎炎、急性呼吸窘迫綜合征、肺氣腫等。如本文所使用的術(shù)語“炎癥”包括由體液在組織中異常積累造成的水腫、由于血管擴(kuò)張引起的充血、由熱原及血管舒張增加的熱量，及花生四烯酸代謝物導(dǎo)致的疼痛的綜合癥或癥狀。根據(jù)時間，炎癥可分類為急性炎癥、亞急性炎癥和慢性炎癥，根據(jù)病理生理條件，炎癥可分類為傳染性炎癥性疾病、過敏性炎癥性疾病、自身免疫性炎癥性疾病、毒性炎癥性疾病、代謝性炎癥性疾病和創(chuàng)傷性炎癥性疾病。根據(jù)本發(fā)明待處理的靶標(biāo)可選自下組中，但不限于此，該組由以下疾病組成:呼吸道炎癥性疾病，諸如鼻炎、鼻竇炎、中耳炎、鼻咽炎、喉炎、支氣管炎、哮喘、慢性阻塞性肺疾病、支氣管擴(kuò)張、細(xì)支氣管炎、肺炎、肺纖維化等，消化系統(tǒng)的炎癥性疾病，諸如口腔炎、食管炎、胃炎、消化性潰瘍、腸易激綜合征、潰瘍性結(jié)腸炎、膽囊炎、膽管炎、胰腺炎、肝炎等，皮膚炎癥，諸如過敏性皮炎、牛皮癬等，心血管炎癥性疾病，諸如心內(nèi)膜炎、心肌炎、心包炎、脈管炎、動脈硬化、敗血癥等，內(nèi)分泌系統(tǒng)的炎癥性疾病，諸如甲狀腺炎、甲狀旁腺炎、糖尿病等，泌尿生殖系統(tǒng)的炎癥性疾病，諸如腎炎、腎病、間質(zhì)性腎炎、睪丸炎、卵巢炎、子宮內(nèi)膜炎、陰道炎等，肌肉骨骼系統(tǒng)的炎癥性疾病，諸如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、脊椎關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、系統(tǒng)性硬化癥、肌病、干燥綜合征和白塞氏病及抗磷脂綜合征，及神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥性疾病，諸如血管性癡呆、阿爾茨海默氏病、神經(jīng)退行性疾病、抑郁癥、精神分裂癥等。本發(fā)明方法中使用的細(xì)菌和來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡如上所述。在本發(fā)明的一個實施方式中，所述方法可采用負(fù)載中和微泡自身副作用的藥物的來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡。來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡自身殘留的副作用可通過如下各種方式減少。(I)可由來自被遺傳轉(zhuǎn)化為具有減弱毒性的細(xì)菌制備微泡。例如，被轉(zhuǎn)化為減弱介導(dǎo)宿主細(xì)胞的免疫應(yīng)答的脂多糖毒性的細(xì)菌(msbB突變型)或被轉(zhuǎn)化為減弱脂磷壁酸(LTA)毒性的細(xì)菌(LTA突變型)可用作微泡的來源。(2)可采用抑制內(nèi)毒素毒性的藥物。這種藥物可舉例為多粘菌素B。這種藥物可與來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡一起施用，或負(fù)載于來自含有所述藥物的細(xì)菌培養(yǎng)物構(gòu)建的微泡。(3)將藥物用作抗炎劑和/或抗凝血劑可減少副作用。所述藥物可包括阿司匹林。當(dāng)與來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡一起施用時，阿司匹林防止微泡引起的副作用，諸如炎癥反應(yīng)、血液凝固等?？商鎿Q地，可由存在藥物條件下培養(yǎng)的細(xì)菌構(gòu)建微泡。(4)可通過化學(xué)改性來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡的膜組分減少副作用。例如，膜組分可用巰基或胺基化學(xué)改性或通過膜結(jié)合聚乙二醇改性。(5)可通過殺菌預(yù)防可能在施用來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡時發(fā)生的細(xì)菌感染。例如，使用紫外線或Y射線或通過過濾對來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡進(jìn)行滅菌以殺死或去除細(xì)菌。這些實例不限制減少來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡的副作用的方法，且其可單獨(dú)使用或組合使用。在本發(fā)明另一實施方式中，可使用負(fù)載增強(qiáng)抗癌活性的藥物的微泡。這種藥物如上所述。在本發(fā)明另一實施方式中，微泡可與抑制微泡副作用的藥物和/或增強(qiáng)抗癌活性的藥物，負(fù)載這種藥物的納米顆粒治療劑以及細(xì)胞治療劑組合施用于受試者。所述納米顆粒治療劑是大小為IOnm至10 μ m的顆粒，且其實例包括，但不限于，脂質(zhì)體、樹枝狀大分子、聚合物和微泡。如本文所使用的術(shù)語“負(fù)載”指的是，但不限于，在來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡的表面顯示目的物質(zhì)或?qū)⑽镔|(zhì)封裝進(jìn)微泡內(nèi)的過程。此外，根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供了一種用于癌癥治療和/或癌癥診斷的來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡的制備方法。在本發(fā)明的制備方法中，來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡包括由細(xì)菌自發(fā)釋放的脫落的微泡，或人工微泡。根據(jù)一個實施方式，所述用于癌癥治療或癌癥診斷的脫落的微泡的制備方法包括以下步驟:添加藥物至細(xì)菌或轉(zhuǎn)化細(xì)菌的懸浮液中以得到含有藥物的細(xì)菌懸浮液；并將負(fù)載藥物的脫落的微泡從細(xì)菌懸浮液中分離。根據(jù)另一實施方式，所述用于癌癥治療或癌癥診斷的脫落的微泡的制備方法包括以下步驟:將脫落的微泡從細(xì)菌或轉(zhuǎn)化細(xì)菌的培養(yǎng)物中分離；并培養(yǎng)帶有藥物的已分離的微泡的懸浮液。該方法還進(jìn)一步包括分離負(fù)載用于癌癥治療或癌癥診斷的藥物的脫落的微泡。

在本發(fā)明的一個實施方式中，所述用于癌癥治療或癌癥診斷的人工微泡的制備方法包括以下步驟:將細(xì)菌或轉(zhuǎn)化細(xì)菌的懸浮液與藥物混合以得到含有藥物的細(xì)菌懸浮液；使用選自下組的方法對細(xì)菌懸浮液進(jìn)行處理以構(gòu)建人工微泡，該組由擠壓、超聲波處理、分裂、均質(zhì)化、凍融、電穿孔、機(jī)械降解和化學(xué)處理組成；并從細(xì)菌懸浮液中分離負(fù)載用于癌癥治療或癌癥診斷的藥物的人工微泡。在本發(fā)明的另一實施方式中，所述用于癌癥治療或癌癥診斷的人工微泡的制備方法包括以下步驟:使用選自下組的方法對細(xì)菌或轉(zhuǎn)化細(xì)菌懸浮液進(jìn)行處理以構(gòu)建人工微泡，該組由擠壓、超聲波處理、分裂、均質(zhì)化、凍融、電穿孔、機(jī)械降解和化學(xué)處理組成；分離人工微泡；并在存在藥物條件下培養(yǎng)已分離的人工微泡的懸浮液。該方法還進(jìn)一步包括從人工微泡的懸浮液中分離負(fù)載用于癌癥治療或癌癥診斷的藥物的人工微泡。根據(jù)本發(fā)明的用于癌癥治療或癌癥診斷的脫落的微泡或人工微泡的制備方法可進(jìn)一步包括使用選自由抗生素處理，紫外線照射，Y射線照射和過濾組成的組中的的方法滅菌脫落的微泡或人工微泡。本發(fā)明的制備方法還進(jìn)一步包括分離亞細(xì)胞大小的負(fù)載藥物的微泡?？墒褂眠x自下組的方法進(jìn)行分離步驟，該組由密度梯度、超速離心、過濾、透析和自由流電泳的方法組成。根據(jù)本發(fā)明的另一個實施方式，所述制備方法可進(jìn)一步包括去除膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)與來源的細(xì)菌細(xì)胞不同的微泡。在構(gòu)建微泡后，根據(jù)用途只選擇那些與源細(xì)胞具有相同膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的微泡。使用識別膜蛋白胞質(zhì)區(qū)的抗體，可去除胞質(zhì)區(qū)暴露于外部的微泡。就是說，質(zhì)膜內(nèi)朝外的微泡被去除，只保留膜蛋白的胞外區(qū)被定位以朝向外部的微泡。根據(jù)還一方面 ，本發(fā)明涉及一種包含負(fù)載癌癥治療和/或斷癌診癥藥物的來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡的藥物組合物。根據(jù)還一方面，本發(fā)明涉及一種包含負(fù)載癌癥治療和/或癌癥診斷藥物的來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡的藥物組合物，所述細(xì)菌細(xì)胞被轉(zhuǎn)化以靶向癌細(xì)胞或癌組織。此外，本發(fā)明的又一方面涉及一種遞送癌癥治療和/或癌癥診斷藥物至癌細(xì)胞或癌組織的方法，其包括使用負(fù)載藥物的來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡，所述細(xì)菌細(xì)胞被轉(zhuǎn)化以靶向癌細(xì)胞或癌組織。根據(jù)又一方面，本發(fā)明涉及一種治療癌癥和/或診斷癌癥的方法，其包括使用負(fù)載藥物的來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡，所述細(xì)菌細(xì)胞被轉(zhuǎn)化以靶向癌細(xì)胞或癌組織。此外，根據(jù)還一方面，本發(fā)明涉及一種用于遞送治療疾病和/或診斷疾病的物質(zhì)的組合物，其包含負(fù)載治療物質(zhì)和/或診斷物質(zhì)的來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡。不賦予負(fù)載于來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡的物質(zhì)以特定限制。例如，所述物質(zhì)可以是治療和/或診斷中使用的一種物質(zhì)，或由細(xì)菌或轉(zhuǎn)化細(xì)菌自身表達(dá)的蛋白質(zhì)。如果需要，所述負(fù)載物質(zhì)可以不來自細(xì)胞，而是外源物質(zhì)。也就是說，治療物質(zhì)和/或診斷物質(zhì)可以是至少一種來自細(xì)菌的物質(zhì)或從細(xì)菌細(xì)胞外導(dǎo)入的物質(zhì)。此外，可使用，但不限于，物理、化學(xué)和/或生物方法將物質(zhì)負(fù)載于微泡表面。本發(fā)明的來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡可以如下的各種方式負(fù)載各種治療物質(zhì)或診斷物質(zhì)。首先，可由已負(fù)載目的治療物質(zhì)或診斷物質(zhì)的細(xì)胞制備微泡。例如，當(dāng)在含有目的治療物質(zhì)或診斷物質(zhì)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞時，細(xì)胞中可含有所述物質(zhì)。可替換地，可通過電穿孔將物質(zhì)導(dǎo)入細(xì)胞。
此外，通過超聲波處理、擠壓或機(jī)械降解由含有物質(zhì)的細(xì)胞脫落的微泡或構(gòu)建的微泡負(fù)載所述物質(zhì)。接著，所述物質(zhì)可在構(gòu)建微泡過程中負(fù)載于微泡。例如，通過亞細(xì)胞大小的過濾器擠壓含有目的物質(zhì)的細(xì)菌細(xì)胞懸浮液時，由此形成的微泡負(fù)載所述物質(zhì)。在另一可選擇的實施方式中，脫落的微泡或人工微泡可在其構(gòu)建或形成后負(fù)載目的物質(zhì)。例如，可通過電穿孔使物質(zhì)進(jìn)入已制備的脫落的微泡或人工微泡中以完成負(fù)載。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是將目的物質(zhì)負(fù)載于微泡的方法不限制于上述方法。本發(fā)明中使用的治療物質(zhì)和/或診斷物質(zhì)是抗癌劑、抗炎劑、血管生成抑制劑、肽類、蛋白質(zhì)、毒素、核酸、小珠、微?；蚣{米顆粒，但本發(fā)明不限于此。核酸的實例包括DNA、RNA、適體、LNA (鎖核酸)、PNA (肽核酸)及嗎啉寡聚核苷酸，但不限于此。納米顆粒說明性、非限制性的實例包括氧化鐵、金、碳納米管和磁珠，但不限于此。在本發(fā)明的一個實施方式中，治療物質(zhì)和/或診斷物質(zhì)可以是熒光團(tuán)，但不限于此。例如，熒光團(tuán)可以是熒光蛋白或量子點(diǎn)(Qdot)。在本發(fā)明的另一實施方式中，治療物質(zhì)和/或診斷物質(zhì)可以是一種或多種抗癌劑。本發(fā)明的微泡可被引導(dǎo)至特定細(xì)胞或組織。特定組織可包括，但不限于，血管、癌癥組織和炎癥組織。 根據(jù)還一方面，本發(fā)明涉及一種遞送治療疾病和/或診斷疾病的藥物、負(fù)載所述藥物的納米顆粒治療劑及細(xì)胞治療劑的方法，其包括使用負(fù)載治療藥物和/或診斷藥物的來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡。根據(jù)另一方面，本發(fā)明涉及一種遞送治療疾病和/或診斷疾病的物質(zhì)、負(fù)載治療疾病和/或診斷疾病的物質(zhì)的納米顆粒治療劑及細(xì)胞治療劑的方法，其包括使用負(fù)載治療物質(zhì)和/或診斷物質(zhì)的來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡，所述微泡來自被轉(zhuǎn)化以靶向目的細(xì)胞或目的組織的細(xì)菌細(xì)胞。所述納米顆粒治療劑是大小為IOnm至10 μ m的顆粒，且其實例包括，但不限于，脂質(zhì)體、樹枝狀大分子、聚合物和微泡。借助本發(fā)明的微泡，可遞送治療疾病和/或診斷疾病的物質(zhì)、負(fù)載治療疾病和/或診斷疾病的物質(zhì)的納米顆粒治療劑及細(xì)胞治療劑。在本發(fā)明的一個實施方案中，兩種或多種不同治療物質(zhì)或診斷物質(zhì)可被遞送至特定細(xì)胞或組織。例如，負(fù)載兩種或多種不同治療物質(zhì)或診斷物質(zhì)的微泡可用于遞送所述物質(zhì)至特定細(xì)胞或組織。在本發(fā)明另一實施方式中，兩種或多種不同微泡可用于遞送遞治療物質(zhì)或診斷物質(zhì)，所述微泡選自下組，該組由負(fù)載一種治療物質(zhì)或診斷物質(zhì)的微泡、負(fù)載兩種或多種不同治療物質(zhì)或診斷物質(zhì)的微泡及其組合組成。例如，兩種或多種不同微泡可同時施用。在本發(fā)明另一實施方式中，可通過順序地施用兩種或多種不同微泡，將兩種或多種不同治療物質(zhì)或診斷物質(zhì)遞送至特定細(xì)胞或組織，所述微泡選自下組，該組由負(fù)載一種治療物質(zhì)或診斷物質(zhì)的微泡、負(fù)載兩種或多種不同治療物質(zhì)或診斷物質(zhì)的微泡及其組合組成。根據(jù)本發(fā)明另一實施方式，可順序地施用負(fù)載一種或多種治療物質(zhì)或診斷物質(zhì)的微泡，負(fù)載一種或多種治療物質(zhì)或診斷物質(zhì)的納米顆粒治療劑或細(xì)胞治療劑。此外，根據(jù)另一方面，本發(fā)明涉及一種治療疾病和/或診斷疾病的方法，其包括將負(fù)載治療疾病或診斷疾病的藥物的來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡遞送至靶細(xì)胞或靶組織。根據(jù)另一方面，本發(fā)明涉及一種治療藥物或診斷藥物的遞送系統(tǒng)，其包含負(fù)載治療藥物或診斷藥物的來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡。根據(jù)另一方面，本發(fā)明涉及一種用于診斷疾病的試劑盒，其包含負(fù)載診斷物質(zhì)的來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡。所述診斷物質(zhì)可選自由引物、探針、反義核酸和抗體所組成的組。[使用來自細(xì)菌細(xì)胞的 微泡遞送物質(zhì)]在本發(fā)明中，可采用來自靶向特定組織的細(xì)胞的微泡或來自表達(dá)靶向蛋白的轉(zhuǎn)化細(xì)胞的微泡。此外，微泡可來自表達(dá)融合劑的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。已知血細(xì)胞，就是說單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞和血小板、髓源性抑制細(xì)胞及在骨髓、血液和脂肪組織中發(fā)現(xiàn)的干細(xì)胞，被引導(dǎo)至癌癥組織和炎癥組織。所以，來自免疫細(xì)胞/炎癥細(xì)胞或干細(xì)胞膜的微泡被引入癌癥組織或炎癥組織。此外，來自被轉(zhuǎn)化的以表達(dá)與特定細(xì)胞或組織表達(dá)的底物選擇性結(jié)合的蛋白質(zhì)的細(xì)菌的微泡可被引導(dǎo)至特定細(xì)胞或組織。在本發(fā)明中，負(fù)載治療物質(zhì)或診斷物質(zhì)后，由這種細(xì)菌細(xì)胞構(gòu)建的微泡可用于遞送所述物質(zhì)至靶細(xì)胞、組織或血液。存在參與引導(dǎo)免疫細(xì)胞/炎癥細(xì)胞和干細(xì)胞至特定組織中的各種質(zhì)膜蛋白。例如，包括整合素，諸如LFA-1 (白細(xì)胞功能相關(guān)抗原-1)和Mac-1 (巨噬細(xì)胞_1抗原)的細(xì)胞粘附分子存在于單核細(xì)胞表面。這些細(xì)胞粘附分子可與其他細(xì)胞粘附分子結(jié)合，諸如血管細(xì)胞上的ICAM-1 (細(xì)胞間粘附分子-1)和VCAM-1 (血管細(xì)胞粘附分子_1)。LFA-1和ICAM-1之間的相互作用允許單核細(xì)胞通過血管內(nèi)皮細(xì)胞以使單核細(xì)胞被引導(dǎo)至炎癥組織或癌癥組織。當(dāng)被轉(zhuǎn)化以表達(dá)來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡的表面上特異于癌癥或目的組織的質(zhì)膜蛋白時，所述微泡可被引導(dǎo)至特定組織，諸如血管組織、癌癥組織或腫瘤組織等。例如ERBB2在乳腺癌細(xì)胞表面上過表達(dá)。來自被轉(zhuǎn)化以表達(dá)由細(xì)菌跨膜蛋白和特異于膜蛋白ERBB2的抗體組成的融合蛋白的細(xì)菌的微泡可被允許靶向乳腺癌組織。此外，如果細(xì)菌被轉(zhuǎn)化以表達(dá)一種融合蛋白，在所述融合蛋白中識別癌組織中大量發(fā)現(xiàn)的癌胚抗原(CEA)的抗體與細(xì)菌跨膜蛋白相融合，來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡可被引導(dǎo)至大腸癌、胰腺癌和肺癌組織。來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡保留著與來源細(xì)菌細(xì)胞幾乎相同的膜組分，以使其朝向細(xì)菌靶向的特定組織或細(xì)胞。如果需要，在構(gòu)建微泡過程中可使用核酸酶以從微泡中去除對于遞送治療物質(zhì)或診斷物質(zhì)不必要的核酸。[來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡及其制備]來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡可容易地負(fù)載各種需遞送的治療物質(zhì)或診斷物質(zhì)。所以，微泡可以單獨(dú)或組合用于治療或診斷或同時治療和診斷(治療診斷，藥物診斷)。在這方面，當(dāng)需要遞送的物質(zhì)被封裝時其存在于微泡內(nèi)，當(dāng)所述物質(zhì)至少部分包埋或嵌入其中(如同跨膜蛋白)或存在于微泡表面時，其存在于脂質(zhì)雙分子層內(nèi)。
來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡可人工地構(gòu)建成各種尺寸，如脂質(zhì)體。由于EPR(高通透性和滯留)效應(yīng)，通常尺寸為IOOnm或更大的分子在癌組織中比其在正常組織中積累時間更長。因此，負(fù)載于尺寸為IOOnm或更大的微泡的藥物有利于診斷和治療，因為這種藥物能夠在癌組織中停留更長時間，從而提高治療或診斷效果。在另一方面，當(dāng)吸入時，由于肺組織的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，只有尺寸Iym或更小的顆粒允許到達(dá)肺泡。一種物質(zhì)，例如，用于治療哮喘的炎癥抑制劑，如果其負(fù)載于尺寸小于I μ m的微泡時可將所述炎癥抑制劑遞送至肺組織。如所描述的，可依據(jù)負(fù)載的物質(zhì)應(yīng)用的組織構(gòu)建各種尺寸的微泡。優(yōu)選地，本發(fā)明微泡的尺寸范圍為IOnm至10 μ m。當(dāng)負(fù)載于本發(fā)明微泡的治療物質(zhì)和/或診斷物質(zhì)施用于“受試者”時，可一起使用免疫抑制劑。在本發(fā)明中，可由所有種類的細(xì)菌細(xì)胞構(gòu)建微泡，例如，可以通過轉(zhuǎn)化以定向到靶標(biāo)(諸如特定細(xì)胞或組織)的細(xì)菌。用于遞送物質(zhì)至特定組織，微泡可以由定向特定組織的細(xì)菌細(xì)胞構(gòu)建。此外，當(dāng)由其中定向特定組織的蛋白質(zhì)被上調(diào)和/或參與非特異性導(dǎo)向的蛋白質(zhì)被下調(diào)的細(xì)胞構(gòu)建微泡時，微泡可有效地用于遞送治療物質(zhì)或診斷物質(zhì)至，例如，血管、癌組織或炎癥組織。可使用本領(lǐng)域已知的典型方法完成細(xì)菌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，例如，通過刺激細(xì)胞或?qū)⑼庠椿驅(qū)爰?xì)菌細(xì)胞以改性，例如，上調(diào)或下調(diào)目的蛋白的表達(dá)。特定刺激可能誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)的變化。導(dǎo)入外源基因可能誘導(dǎo)或抑制目的蛋白的表達(dá)。在這方面，使用電穿孔、顯微注射、超聲介導(dǎo)或本領(lǐng)域已知的其他方法將質(zhì)粒DNA、RNA或噬菌體導(dǎo)入細(xì)胞。細(xì)菌被轉(zhuǎn)化以表達(dá)能夠在其表面單獨(dú)或作為融合蛋白結(jié)合癌細(xì)胞、癌組織或癌血管或炎癥組織的蛋白或抗體后，可由細(xì)菌細(xì)胞構(gòu)建微泡。此外，可由表達(dá)治療物質(zhì)和/或診斷物質(zhì)的細(xì)菌細(xì)胞或被轉(zhuǎn)化以表達(dá)治療物質(zhì)和/或診斷物質(zhì)的細(xì)菌細(xì)胞制備微泡。此外，可由表達(dá)上述物質(zhì)的組合的細(xì)菌細(xì)胞或被轉(zhuǎn)化以表達(dá)上述物質(zhì)的組合的細(xì)菌細(xì)胞制備微泡。為了抑制特定蛋白的表達(dá)，可使用反義RNA、LNA、PNA等。當(dāng)由定向兩種靶標(biāo)的細(xì)菌細(xì)胞構(gòu)建微泡時，細(xì)菌細(xì)胞可 以這種方式轉(zhuǎn)化，其中抑制一種或多種特定蛋白的表達(dá)以降低細(xì)胞至兩種靶標(biāo)之一的引導(dǎo)。所以，增強(qiáng)了遞送用于來自轉(zhuǎn)化細(xì)胞的微泡的物質(zhì)的特異性?？商鎿Q地，可使用進(jìn)行兩輪或多輪轉(zhuǎn)化的細(xì)菌細(xì)胞。例如，初級轉(zhuǎn)化株在用作構(gòu)建微泡的來源前可經(jīng)過二次轉(zhuǎn)化。然而，本發(fā)明的制備方法不限于上述的那些方法?？墒褂酶鞣N機(jī)械方法、電學(xué)或化學(xué)方法構(gòu)建根據(jù)本發(fā)明的微泡。這些方法包括使用利用滲透作用的細(xì)胞溶解、電穿孔、超聲波處理、均質(zhì)化、清潔劑處理、凍融、擠壓、機(jī)械降解和化學(xué)處理，但不限于此。在機(jī)械降解方法中，細(xì)胞溶液與金屬、陶瓷或足夠堅硬的塑料球一起振搖。在擠壓的情況下，強(qiáng)制細(xì)胞按順序地通過較大孔徑的過濾器，直到較小孔徑的過濾器。例如，細(xì)胞按順序地通過三個過濾器，其孔徑分別為ΙΟμπι—5μπι— Ιμπι以形成微泡。[治療物質(zhì)或診斷物質(zhì)]本發(fā)明中使用的物質(zhì)可包括，但不限于，細(xì)菌或轉(zhuǎn)化細(xì)菌表達(dá)的物質(zhì)或細(xì)菌不表達(dá)的外源物質(zhì)。本發(fā)明中使用的治療物質(zhì)或診斷物質(zhì)可負(fù)載于微泡或根據(jù)需求和目的與微泡組合施用。
在本發(fā)明的一個實施方式中，治療物質(zhì)或診斷物質(zhì)其本身或作為與納米顆粒治療劑或細(xì)胞治療劑的復(fù)合物或與微泡組合施用。所述納米顆粒治療劑是大小為IOnm至10 μ m的顆粒，且其實例包括，但不限于，脂質(zhì)體、樹枝狀大分子、聚合物和微泡。作為負(fù)載于本發(fā)明的微泡或納米顆?；蚣?xì)胞治療劑的治療物質(zhì)或診斷物質(zhì)，可無限制地使用各種來自有細(xì)胞核的哺乳動物細(xì)胞的物質(zhì)，其包括蛋白質(zhì)或肽類、核酸、脂質(zhì)和代謝產(chǎn)物。本發(fā)明中使用的可負(fù)載的蛋白質(zhì)或肽類的實例包括，但不限于，生長因子，諸如VEGF, EGF (表皮生長因子)等，細(xì)胞因子，諸如IL-1、IFN-Y (干擾素Y )、IL-10等，抗體，受體和熒光蛋白。所述蛋白質(zhì)或肽類可在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)或顯露在質(zhì)膜上。此外，其全部或活性位點(diǎn)可單獨(dú)表達(dá)或作為融合蛋白表達(dá)。已知由于具有較高的局部濃度，蛋白質(zhì)或肽類顯露在微泡上時蛋白質(zhì)或肽類的活性高于其在細(xì)胞內(nèi)單獨(dú)存在時的活性。負(fù)載于微泡的蛋白質(zhì)或肽類可用作配體以觸發(fā)信號傳導(dǎo)或用作拮抗劑抑制各種配體的功能。根據(jù)本發(fā)明的可負(fù)載于微泡或納米顆?；蚣?xì)胞治療劑的核酸實例包括DNA、miRNA(小分子RNA)、siRNA (小干擾RNA)、反義RNA和正義RNA，但不限于此。這些核酸可用于引發(fā)正義效應(yīng)、反義效應(yīng)、RNA干擾或抑制蛋白質(zhì)功能。作為可負(fù)載于微泡或納米顆?；蚣?xì)胞治療劑的外源治療物質(zhì)或診斷物質(zhì)，可無限制地使用抗癌劑、抗炎劑、血管生成抑制劑、肽類、蛋白質(zhì)、毒素、核酸、小珠、微粒和納米顆粒。抗癌劑是抑制癌細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移而使用的藥物的通用術(shù)語。多數(shù)抗癌劑用作阻止癌細(xì)胞的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。不賦予本發(fā)明中使用的抗癌劑種類特殊限制。根據(jù)一般原則選則抗癌劑，其中考慮癌細(xì)胞種類、抗癌劑的吸收率(治療的持續(xù)時間、給藥途徑等)、腫瘤位置、腫瘤大小等。本發(fā)明中使用的抗癌劑的例子包括DNA烷化劑，諸如二氯甲基二乙胺、苯丁酸氮芥、苯丙氨酸、芥末、環(huán)磷酰胺、異環(huán)磷酰胺、亞硝脲氮芥(BCNU)、環(huán)己亞硝脲(CCNU)、鏈脲菌素、二甲磺酸丁酯、三胺硫磷、順鉬及卡鉬，抗癌抗生素，諸如更生霉素(放線菌素D)、多柔比星(阿霉素)、表柔比星、伊達(dá)比星、米托蒽醌、普卡霉素、絲裂霉素及C博來霉素及植物生物堿，諸如長春新堿、長春花堿、紫杉醇、多西紫杉醇、柔紅霉素、紫杉酚、長春堿、強(qiáng)的松、順鉬、赫塞汀、利妥昔單抗、依托泊苷、替尼泊苷、拓?fù)涮婵导耙亮⑻婵?。同樣，可使用本領(lǐng)域已知的放射性物質(zhì)。然而，本發(fā)明中使用的抗癌劑不限于上述例子。此外，本發(fā)明的可負(fù)載于微泡或納米顆?；蚣?xì)胞治療劑的抗炎劑選自下組，該組由地塞米松、吲哚美辛、布洛芬、氯倍他索丙酸酯、醋酸雙氟拉松、鹵倍他索丙酸酯、安西奈德、醋酸氟輕松、糠酸莫米松、去羥米松、雙氯芬酸及吡羅昔康組成，但不限于此。如本文所使用的術(shù)語“血管生成抑制劑”指的是功能為抑制新血管從已存在的血管生長的藥物。多數(shù)血管生成抑制劑具有抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移及炎癥反應(yīng)的功能。不賦予作為本發(fā)明的治療物質(zhì)的血管生成抑制劑的種類特殊限制。根據(jù)本發(fā)明負(fù)載于微泡或納米顆?；蚣?xì)胞治療劑的治療物質(zhì)或診斷物質(zhì)可包括蛋白質(zhì)或肽類。例如，可使用核糖核酸酶A，生長因子，諸如VEGF和EGF，細(xì)胞因子，諸如IL-U IFN-Y和IL-10、抗體療法、脫氧核糖核酸酶，及各種抑制癌細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移及炎癥反應(yīng)的蛋白質(zhì)或肽類，但不限 于此。
此外，根據(jù)本發(fā)明負(fù)載于微泡或納米顆?；蚣?xì)胞治療劑的治療物質(zhì)或診斷物質(zhì)可包括毒素。術(shù)語“毒素”指的是在活細(xì)胞或生物體內(nèi)產(chǎn)生的毒性物質(zhì)，與機(jī)體組織接觸或被機(jī)體組織吸附時其能夠?qū)е录膊?。使用毒素可誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。不賦予用作本發(fā)明治療物質(zhì)的毒素的種類特殊限制。根據(jù)本發(fā)明可負(fù)載于微泡或納米顆?；蚣?xì)胞治療劑的核酸中典型的為DNA、mi RNA, siRNA、反義RNA、正義RNA和適配體。此外，核酸類似物，諸如LNA、PNA和嗎啉寡聚核苷酸可負(fù)載于微泡或納米顆粒或細(xì)胞治療劑，但不限于此。這些核酸可用于引發(fā)正義效應(yīng)、反義效應(yīng)、RNA干擾或抑制蛋白質(zhì)功能。在本發(fā)明中，可將負(fù)載編碼熒光蛋白的核酸或負(fù)載各種熒光的微泡用于診斷。當(dāng)設(shè)計為靶向特定細(xì)胞或組織的微泡負(fù)載攜帶編碼熒光蛋白的基因的質(zhì)粒DNA并導(dǎo)入體內(nèi)時，從熒光蛋白發(fā)射的熒光信號使得能識別靶細(xì)胞或靶組織的存在。此外，熒光量子點(diǎn)或其他各種熒光劑可負(fù)載于微泡并用于檢測體內(nèi)特定的靶細(xì)胞和靶組織的位置。就是說，靶細(xì)胞或靶組織產(chǎn)生的熒光可用于診斷。另外，因為其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，所以熒光發(fā)射的量子點(diǎn)可用于治療疾病。除了熒光劑，可負(fù)載于微泡的治療物質(zhì)或診斷物質(zhì)還可舉例為微?；蚣{米粒子。實例包括氧化鐵顆粒、金顆粒和碳納米管，但不限于此。磁珠可用作治療物質(zhì)或診斷物質(zhì)并負(fù)載于微泡。磁性粒子諸如氧化鐵可用作MRI (磁共振成像)的圖像對比劑。此外，也可以使用與納米顆粒結(jié)合的核酸或蛋白質(zhì)。還可以使用診斷性的放射性物質(zhì)。

通過本發(fā)明的微泡可遞送兩種或多種不同物質(zhì)。例如，同時負(fù)載兩種或多種不同物質(zhì)的微泡可用于遞送所述物質(zhì)?？商鎿Q地，將組合使用單獨(dú)或組合地負(fù)載不同物質(zhì)的微泡，以遞送兩種或多種不同物質(zhì)。為了遞送三種不同物質(zhì)，例如，第一、第二和第三微泡可分別負(fù)載三種不同物質(zhì)。另一方面，同時負(fù)載兩種不同物質(zhì)的第四微泡及負(fù)載另一種不同物質(zhì)的第五微泡可用于遞送三種不同物質(zhì)。第一、第二和第三微泡可同時或順序地使用。同樣地，第四和第五微泡可同時或順序地使用。存在多種從其他分子或其他細(xì)胞組分中分離微泡的方法，所述方法的例子包括密度梯度、超速離心、過濾、透析和自由流電泳，但不限于此。用于區(qū)分具有不同密度的材料的最流行的方法之一為密度梯度方法，可應(yīng)用于分離本發(fā)明的微泡，因為其密度與游離分子的密度不同。在密度梯度方法中，使用的介質(zhì)可選自，但不限于聚蔗糖、甘油、蔗糖及OptiPrep 。負(fù)載或未負(fù)載治療物質(zhì)或診斷物質(zhì)的微泡可利用其密度差異相互分離。密度梯度方法可與離心或電泳組合使用。微泡還可通過凝膠過濾或超濾作用分離。可采用透析替代過濾去除小分子。另外，自由流電泳可用于分離本發(fā)明的微泡。根據(jù)用途，可在使用前選擇在一定尺寸范圍之內(nèi)的微泡。可在負(fù)載治療物質(zhì)或診斷物質(zhì)之前、之間或之后進(jìn)行選擇在一定尺寸范圍之內(nèi)的微泡。在本發(fā)明中，可構(gòu)建其中部分膜組分改性的微泡。例如，當(dāng)由融合蛋白和細(xì)胞的混合物構(gòu)建微泡時，所述融合蛋白可至少部分地暴露于微泡上。用聚乙二醇涂層微泡可將微泡轉(zhuǎn)化為隱形微泡。加入環(huán)糊精至微泡可降低微泡的非特異性靶向。當(dāng)將同時顯示親水性和疏水性的環(huán)糊精附著于微泡表面時，可用作阻斷脂質(zhì)之間的非特異性結(jié)合。微泡或脫落的微泡可被化學(xué)改性。例如，從膜蛋白或跨膜蛋白至少部分地暴露于外面的細(xì)胞構(gòu)建微泡后，各種分子可在蛋白質(zhì)的暴露區(qū)域與半胱氨酸殘基的巰基化學(xué)結(jié)合。此外，還可通過各種分子與膜蛋白內(nèi)的胺基結(jié)合使微泡的膜組分改性。根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供了一種治療癌癥的方法，其包括向需要的受試者施用來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡的組分。本發(fā)明中使用的細(xì)菌可以是革蘭氏陰性或革蘭氏陽性菌。革蘭氏陰性菌的實例為大腸桿菌、綠膿假單胞菌和沙門氏菌。革蘭氏陽性菌的實例包括金黃色葡萄球菌和嗜酸乳桿菌，但不限于此。微泡的組分的實例包括蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)，但不限于此。在本發(fā)明的一個實施方式中，作為來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡的組分之一存在的蛋白質(zhì)，包括水溶性蛋白、脂溶性蛋白或膜蛋白，但不限于此。在本發(fā)明另一實施方式中，膜蛋白可包括OmpA、OmpF> OmpC和鞭毛蛋白，但不限于此。在本發(fā)明另一實施方式中，核酸可包括DNA和RNA,但不限于此。在本發(fā)明另一實施方式中，蛋白質(zhì)可與至少一種物質(zhì)結(jié)合，所述物質(zhì)選自下組，但不限于，該組由細(xì)胞粘附分子、抗體、靶向蛋白、細(xì)胞膜融合蛋白及其融合蛋白所組成。根據(jù)另一方面，本發(fā)明涉及在治療癌癥中與蛋白質(zhì)重組的納米顆粒治療劑的用途，所述蛋白質(zhì)是來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡的組分。

根據(jù)還一方面，本發(fā)明涉及在治療癌癥中負(fù)載核酸的納米顆粒治療劑的用途，所述核酸是來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡的組分。根據(jù)還一方面，本發(fā)明涉及在治療癌癥中與脂質(zhì)重組的納米顆粒治療劑的用途，所述脂質(zhì)是來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡的組分。根據(jù)又一方面，本發(fā)明涉及在治療癌癥中負(fù)載或重組兩種或多種來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡的組分的納米顆粒治療劑的用途。所述納米顆粒治療劑是大小為IOnm至10 μ m的顆粒，且其實例包括，但不限于，脂質(zhì)體、樹枝狀大分子、聚合物和微泡。在本發(fā)明的一個實施方式中，一種新物質(zhì)可進(jìn)一步用作來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡的組分。這種新物質(zhì)可包括環(huán)糊精和聚乙二醇。此外，可使用各種方法(包括化學(xué)改性)將這種新物質(zhì)作為組分。在本發(fā)明另一實施方式中，納米顆粒治療劑還進(jìn)一步包含減少組分副作用的藥物，或增強(qiáng)抗癌活性的藥物。減少組分副作用的藥物可以是阿司匹林。增強(qiáng)抗癌活性的藥物包括抑制Thl7 (輔助性T細(xì)胞17)免疫應(yīng)答的藥物、抑制白介素6(IL-6)的產(chǎn)生或活性的藥物、抑制VEGF (血管內(nèi)皮生長因子)的產(chǎn)生或活性的藥物、抑制STAT3 (信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3)信號傳導(dǎo)的藥物，及抗癌劑。抑制Thl7免疫應(yīng)答的藥物可以是阿司匹林，及抑制VEGF的產(chǎn)生或活性的藥物功能可為干擾VEGF受體介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)。在本發(fā)明的一個實施方式中，微泡的組分可與中和組分毒性的藥物、增強(qiáng)抗癌活性的藥物、或負(fù)載這種藥物的納米顆粒治療劑或細(xì)胞治療劑一起同時/順序地施用。所述納米顆粒治療劑是大小為IOnm至10 μ m的顆粒，且其實例包括，但不限于，脂質(zhì)體、樹枝狀大分子、聚合物和微泡。
根據(jù)本發(fā)明的另一實施方式，將兩種或多種不同組分同時施用，所述組分選自由微泡的一種組分、微泡的兩種或多種不同組分及其組合所組成的組。根據(jù)本發(fā)明的另一實施方式，將兩種或多種不同組分順序地施用，所述組分選自由微泡的一種組分、微泡的兩種或多種不同組分及其組合所組成的組。根據(jù)本發(fā)明的另一實施方式，兩種或多種不同組分與減少組分副作用的藥物、增強(qiáng)抗癌活性的藥物、負(fù)載藥物的納米顆粒治療劑或細(xì)胞治療劑結(jié)合并順序地施用，所述組分選自由微泡的一種組分、微泡的兩種或多種不同組分及其組合所組成的組。通過以下解釋說明的實施例可以更好地理解本發(fā)明，但不解釋為本發(fā)明的限制。實施例實施例1:通過擠壓構(gòu)建的來自革蘭氏陰性細(xì)菌的人工微泡及其性質(zhì)由革蘭氏陰性菌通過擠壓構(gòu)建人造微泡。在該實驗中，使用革蘭氏陰性細(xì)菌大腸桿菌。將大腸桿菌在50mL的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至光密度為1.0 (600nm下)。以3，500x g離心10分鐘后，收集微球形式的細(xì)菌細(xì)胞，并且將細(xì)胞微球重懸于PBS (磷酸鹽緩沖鹽水)中。該細(xì)胞懸浮液通過每種膜濾器過濾三次，膜濾器的孔徑按順序依次為10 μ m、5 μ m和I μ m。在5mL超速離心管中，按順序地放置來自膜濾器的ImL的50% OptiPrep, ImL的5%OptiPrep和3mL的細(xì)胞懸浮液流出物。以100，OOOx g超速離心3小時,在50% OptiPrep和5% OptiPrep之間形成微泡層。分析由革蘭氏陰性菌構(gòu)建的人造微泡的性質(zhì)。來自革蘭氏陰性菌細(xì)胞的人造微泡在輝光放電碳包覆銅載網(wǎng)中吸附3分鐘。用蒸餾水清洗該銅載網(wǎng)，并用2%的乙酸雙氧鈾染色I(xiàn)分鐘，然后在JEMlOl電子顯微鏡(Jeol，日本)下觀察。結(jié)果如圖1所示。由圖1的透射電子顯微鏡的圖像可以看出，由細(xì)菌細(xì)胞通過擠壓構(gòu)建的人造微泡由脂質(zhì)雙分子層組成，并且基本上是10至IOOnm大小的球形。實施例2:來自革蘭氏陰性菌細(xì)胞的脫落的微泡的體內(nèi)抗癌活性為了用于本實驗，從革蘭氏陰性菌分離自然脫落的微泡。革蘭氏陰性菌大腸桿菌、綠膿假單胞菌、腸炎沙門氏菌被用作微泡的來源。將細(xì)菌接種到在錐形燒瓶中的IOOmL的LB中，并在37°C下培養(yǎng)6小時。將8mL培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到在2L的錐形燒瓶中的600mL的LB培養(yǎng)基中，并在37°C下培養(yǎng)5小時，至光密度為1.5 (600nm下)。將獲得的培養(yǎng)物分在500mL的高速離心管中，然后在4°C下，以10，OOOx g離心20分鐘。使上清液通過0.45 μ m孔徑的膜濾器一次，然后使用裝備有膜的Quixstand系統(tǒng)濃縮25倍，該膜具有IOOkDa的截留分子量。濃縮物通過0.22 μ m孔徑的膜濾器一次，并分在70mL的超離心管中，接著在4°C下，以150，OOOx g超速離心3小時以提供沉淀形式的來自細(xì)菌細(xì)胞的脫落的微泡。該沉淀物在PBS中懸浮。來自大腸桿菌、綠膿假單胞菌和腸炎沙門氏菌的脫落的微泡用于分析抗癌活性。以I X IO6細(xì)胞的劑量將小鼠結(jié)腸26細(xì)胞系皮下注射到小鼠體內(nèi)，并培養(yǎng)。一周后，含有I μ g或5 μ g的每種來自革蘭氏陰性菌細(xì) 胞的微泡以100 μ I的劑量通過尾靜脈按每周兩次注射給小鼠，將這些小鼠進(jìn)行分組，每組3只小鼠。移植癌細(xì)胞23天后，監(jiān)測結(jié)腸癌組織的尺寸。癌組織的體積用等式V=I X s2/2計算，其中I是腫瘤的最長軸的長度，s是與最長軸垂直的軸線長度。
皮下移植后，結(jié)腸癌組織的體積測量如圖2至圖4所示。與對照PBS相比，施用來自大腸桿菌的脫落的微泡以劑量依賴的方式降低了結(jié)腸癌組織的尺寸(圖2)，施用來自綠膿假單胞菌的脫落的微泡后獲得的結(jié)腸癌組織，其中結(jié)腸癌組織的尺寸顯著降低(圖3)。同樣，通過來自腸炎沙門氏菌的脫落的微泡減少了結(jié)腸癌組織的尺寸(圖4)。實施例3:來自革蘭氏陽性菌細(xì)胞脫落的微泡的體內(nèi)抗癌活性為了用于本實驗，從革蘭氏陽性菌分離自然脫落的微泡。革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌和嗜酸乳桿菌被用作微泡的來源。將細(xì)菌接種到在錐形燒瓶中的IOOmL的營養(yǎng)液體培養(yǎng)基中，并在37°C下培養(yǎng)6小時。將8mL培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到在2L的錐形燒瓶中的600mL的營養(yǎng)液體培養(yǎng)基中，并在37°C下培養(yǎng)5小時，至光密度為1.5(600nm下)。獲得的培養(yǎng)物分在500mL的高速離心管中，然后在4°C下，以10，000x g離心20分鐘。使上清液通過0.45 μ m孔徑的膜濾器一次，然后使用裝備有膜的Quixstand系統(tǒng)濃縮25倍，該膜具有IOOkDa的截留分子量。濃縮物通過0.22 μ m孔徑的膜濾器一次，并分在70mL的超離心管中，接著在4°C下，以150，OOOx g超速離心3小時以提供沉淀形式的來自細(xì)菌細(xì)胞的脫落的微泡。該沉淀物在PBS中懸浮。來自金黃色葡萄球菌和嗜酸乳桿菌的脫落的微泡被用于分析抗癌活性。以IXlO6細(xì)胞的劑量將小鼠結(jié)腸26細(xì)胞系皮下注射到小鼠體內(nèi)，并培養(yǎng)。一周后，含有10 μ g的每種來自革蘭氏陽性菌細(xì)胞的微泡以ΙΟΟμ I的劑量通過尾靜脈按每周兩次注射給小鼠，將這些小鼠進(jìn)行分組，每組3只小鼠。移植癌細(xì)胞23天后，監(jiān)測結(jié)腸癌組織的尺寸。癌組織的體積用等式V=I X s2/2計算，其中I是腫瘤的最長軸的長度，s是與最長軸垂直的軸線長度。

皮下移植后，結(jié)腸癌組織的體積測量如圖5和圖6所示。從圖中可以看出，與對照PBS相比，在施用來自金黃色葡萄球菌(圖5)或嗜酸乳桿菌(圖6)的脫落的微泡后獲得的結(jié)腸癌組織，其中結(jié)腸癌組織的尺寸顯著降低。實施例4:來自轉(zhuǎn)化的革蘭氏陰性菌脫落的微泡的體內(nèi)抗癌活性除了使用轉(zhuǎn)化以具有減少的脂多糖細(xì)胞毒性UsbB突變體)的大腸桿菌之外，以下實驗使用與實施例2相同的方式獲得的脫落的微泡。以IXlO6細(xì)胞的劑量將小鼠結(jié)腸26細(xì)胞系皮下注射到小鼠體內(nèi)，并培養(yǎng)。一周后，將PBS或含有Img來自野生型大腸桿菌或轉(zhuǎn)化以具有減少的脂多糖毒性的突變型大腸桿菌脫落的微泡的PBS溶液以IOOmL的劑量通過尾靜脈按每周兩次注射給小鼠，將這些小鼠進(jìn)行分組，每組3只小鼠。移植癌細(xì)胞23天后，監(jiān)測結(jié)腸癌組織的尺寸。癌組織的體積用等式V=I X s2/2計算，其中I是腫瘤的最長軸的長度，s是與最長軸垂直的軸線長度。皮下移植后，結(jié)腸癌組織的體積測量如圖7所示。如圖7所示，與僅施用PBS的對照相比，在施用來自轉(zhuǎn)化以具有減少的脂多糖毒性的突變型大腸桿菌脫落的微泡的小鼠組中，觀察到了腫瘤尺寸的顯著降低。同時，突變型組的結(jié)腸癌組織的尺寸也遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于野生型組的結(jié)腸癌組織的尺寸。實施例5:來自轉(zhuǎn)化的革蘭氏陽性菌脫落的微泡的體內(nèi)抗癌活性除了使用具有減少的脂多糖細(xì)胞毒性(LTA突變體)轉(zhuǎn)化的金黃色葡萄球菌之外，以下實驗使用與實施例3相同的方式獲得的脫落的微泡。以IXlO6細(xì)胞的劑量將小鼠結(jié)腸26細(xì)胞系皮下注射到小鼠體內(nèi)，并培養(yǎng)。一周后，將PBS或含有10 μ g來自野生型金黃色葡萄球菌或轉(zhuǎn)化以具有減少的脂磷壁酸毒性的突變型金黃色葡萄球菌脫落的微泡的PBS溶液以100 μ L的劑量通過尾靜脈按每周兩次注射給小鼠，將這些小鼠進(jìn)行分組，每組3只小鼠。移植癌細(xì)胞23天后，監(jiān)測結(jié)腸癌組織的尺寸。癌組織的體積用等式V=I X s2/2計算，其中I是腫瘤的最長軸的長度，s是與最長軸垂直的軸線長度。皮下移植后，結(jié)腸癌組織的體積測量如圖8所示。如圖8所示，與僅施用PBS的對照相比，在施用來自轉(zhuǎn)化以具有減少的脂磷壁酸毒性的突變型金黃色葡萄球菌脫落的微泡的小鼠組中，觀察到了腫瘤尺寸的顯著降低。同時，突變型組的結(jié)腸癌組織的尺寸也遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于野生型組的結(jié)腸癌組織的尺寸。實施例6:來自轉(zhuǎn)化的革蘭氏陰性菌脫落的微泡對于轉(zhuǎn)移癌的體內(nèi)治療效果除了使用轉(zhuǎn)化以具有減少的脂多糖毒性的大腸桿菌之外，以下實驗使用與實施例2相同的方式獲得的脫落的微泡。以I X IO5細(xì)胞的劑量將小鼠黑素瘤細(xì)胞系(B16BL6)通過尾靜脈注射到小鼠體內(nèi)，并培養(yǎng)。三天后，將PBS或含有Iyg來自轉(zhuǎn)化以具有減少的脂多糖毒性的大腸桿菌的脫落的微泡的PBS溶液以ΙΟΟμ I/天的劑量，通過尾靜脈注射給小鼠注射10天，將這些小鼠進(jìn)行分組，每組3只小鼠。注射黑素瘤細(xì)胞14天后，從小鼠體內(nèi)切除肺以計算轉(zhuǎn)移到肺的黑素瘤菌落的數(shù)量。圖9示出了 3只小鼠組中的每只小鼠中黑素瘤菌落轉(zhuǎn)移到肺的數(shù)量。如圖9所示，與PBS對照相比，在施用來自轉(zhuǎn)化以具有減少的脂多糖毒性的大腸桿菌脫落的微泡小鼠中，觀察到了黑素瘤菌落轉(zhuǎn)移到肺的數(shù)量較低。實施例7:共同施用來自細(xì)菌細(xì)胞的脫落的微泡與藥物的抗癌活性幾個世紀(jì) 以前，就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了炎癥在腫瘤發(fā)生中起到的作用。近年來，由于對該類研究的高度關(guān)注，所以發(fā)現(xiàn)了由VEGF/IL-6介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)、STAT3 (信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3)信號傳導(dǎo)，以及Thl7免疫應(yīng)答產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)對癌癥的發(fā)生和發(fā)展起著重要作用。此外，據(jù)報道阿司匹林可以降低患結(jié)直腸癌的風(fēng)險。本發(fā)明人最近發(fā)現(xiàn)阿司匹林抑制Thl7介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。在該實施例中，當(dāng)與抑制Thl7免疫應(yīng)答的藥物共同施用后，檢測了來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡的抗癌活性。關(guān)于這一點(diǎn)，使用與實施例2相同的方式獲得來自轉(zhuǎn)化以具有減少的脂多糖毒性的大腸桿菌的脫落的微泡，并將其與抑制Thl7免疫應(yīng)答的藥物阿司匹林共同施用。以IXlO6細(xì)胞的劑量將小鼠結(jié)腸26細(xì)胞系皮下注射到小鼠體內(nèi)，并培養(yǎng)。一周后，將PBS、含有18mg/kg的阿司匹林的PBS溶液、含有0.1 μ g的來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡的PBS溶液或含有0.1yg的來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡和18mg/kg的阿司匹林的PBS溶液，以IOOyL的劑量通過尾靜脈按每周兩次注射給小鼠，將這些小鼠進(jìn)行分組，每組4只小鼠。移植癌細(xì)胞23天后，監(jiān)測結(jié)腸癌組織的尺寸。癌組織的體積用等式V=I xs2/2計算，其中I是腫瘤的最長軸的長度，s是與最長軸垂直的軸線長度。皮下移植后，結(jié)腸癌組織的體積測量如圖10所示。如圖10所示，單獨(dú)施用阿司匹林的組與單獨(dú)施用PBS的對照組之間，結(jié)腸腫瘤的大小沒有差異。也就是說，沒有觀察到阿司匹林的抗癌效果。然而，當(dāng)共同施用來自轉(zhuǎn)化的具有減少的脂多糖毒性的大腸桿菌脫落的微泡和阿司匹林時，與單獨(dú)施用來自轉(zhuǎn)化的具有減少的脂多糖毒性的大腸桿菌脫落的微泡相比，結(jié)腸腫瘤的尺寸顯著的減小。綜合考慮，上述獲得的數(shù)據(jù)表明當(dāng)與抑制Thl7免疫應(yīng)答的藥物(諸如阿司匹林)共同施用后，本發(fā)明的來自細(xì)菌細(xì)胞脫落的微泡發(fā)揮了更強(qiáng)的抗癌活性。實施例8:負(fù)載抗癌藥物到來自革蘭氏陰性菌細(xì)胞脫落的微泡為了在以下實驗中使用，用實施例2相同的方式獲得來自轉(zhuǎn)化的具有減少的脂多糖毒性的大腸桿菌脫落的微泡。將脫落的微泡以1:1的比例與0.4mg/ml的阿霉素混合，并在4°C下培養(yǎng)12小時。此后，將懸浮液在4°C下，以150，000 Xg進(jìn)行超速離心3小時，以分離來自負(fù)載阿霉素的微泡的脫落的微泡。負(fù)載阿霉素的微泡與DiO —起培養(yǎng)，帶有綠色熒光的脂質(zhì)追蹤劑可以與細(xì)胞膜結(jié)合。將負(fù)載DiO的微泡滴注到蓋玻片上，接著在共聚焦顯微鏡下觀察以檢測阿霉素是否負(fù)載到了脫落的微泡上。圖11中示出了熒光圖像。如圖11所示，觀察到出現(xiàn)熒光紅色的阿霉素負(fù)載到了出現(xiàn)熒光綠色的脫落的微泡上。從這些結(jié)果可以理解，治療或診斷藥物可以有效地負(fù)載于來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡上。實施例9:負(fù)載抗癌藥物的來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡的體外抗癌活性分析負(fù)載抗癌劑的來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡的抗癌活性，以檢測抗癌劑的負(fù)載是否影響微泡本身的活性。使用阿霉素作為抗癌劑。為了在以下實驗中使用，用實施例8相同的方式獲得來自轉(zhuǎn)化的具有減少的脂多糖毒性的大腸桿菌脫落的微泡。以5X IO4細(xì)胞的密 度，將小鼠結(jié)腸癌26細(xì)胞系接種到24孔板中，并培養(yǎng)過夜。每個孔中的癌細(xì)胞用ImL的PBS或含有來自細(xì)菌細(xì)胞的負(fù)載阿霉素或沒有負(fù)載阿霉素的微泡的PBS溶液處理，然后培養(yǎng)18小時。在顯微鏡下計數(shù)有生命力的小鼠結(jié)腸癌26細(xì)胞系的數(shù)量，結(jié)果如圖12所示。如圖12所示，負(fù)載阿霉素的來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡比沒有負(fù)載阿霉素的來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡顯示更強(qiáng)的抑制癌細(xì)胞的活性。由該結(jié)果顯而易見的是，負(fù)載抗癌藥物的來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡的抗癌活性不僅是由來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡，而且還是由負(fù)載的抗癌藥物所發(fā)揮的活性，從而其抗癌活性大于施用單獨(dú)的來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡。實施例10:脂多糖抑制劑對于來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡的副作用的影響關(guān)于來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡的副作用，已知來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡的組分脂多糖在敗血癥的發(fā)病中起著重要作用。所以，用微泡保留的脂多糖的抑制劑檢測對于微泡的副作用的影響。在該實驗中，使用多粘菌素B作為脂多糖的抑制劑。根據(jù)實施例2所述的方法構(gòu)建來自大腸桿菌脫落的微泡。PBS、含有25 μ g來自大腸桿菌脫落的微泡的PBS溶液、含有25 μ g來自大腸桿菌脫落的微泡和250 μ g的多粘菌素B的PBS溶液，分別以ΙΟΟμ I的劑量腹膜內(nèi)注射到小鼠組中，之后以12小時的間隔監(jiān)測小鼠的存活率120小時。結(jié)果如圖13所示。如圖13所示，在施用含有25 μ g來自大腸桿菌脫落的微泡的PBS溶液120小時之后，小鼠的存活率為10%，但是在施用含有25 μ g來自大腸桿菌脫落的微泡和250 μ g的多粘菌素B的PBS溶液120小時之后，小鼠的存活率增加到55%。從該結(jié)果可以可出，來自大腸桿菌微泡的脂多糖活性的抑制藥物有效地抑制了來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡的副作用。實施例11:來自野生型革蘭氏陰性菌細(xì)胞的微泡和轉(zhuǎn)化的革蘭氏陰性菌細(xì)胞的微泡的副作用差異使用來自已轉(zhuǎn)化的具有減少的脂多糖(微泡的組分)毒性的微泡來檢查來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡中的脂多糖的副作用，其中脂多糖是來自革蘭氏陰性菌細(xì)胞的微泡的組分。在該實驗中，使用msbB突變體作為轉(zhuǎn)化的具有減少的脂多糖毒性的大腸桿菌。根據(jù)實施例2所述的相同方式構(gòu)建來自轉(zhuǎn)化的具有減少的脂多糖毒性的大腸桿菌中脫落的微泡。將PBS、含有25 μ g來自野生型大腸桿菌脫落的微泡的PBS溶液，及含有25 μ g來自突變型大腸桿菌脫落的微泡的PBS溶液，分別以ΙΟΟμ I的劑量腹膜內(nèi)注射到各個小鼠組中，之后以12小時的間隔監(jiān)測小鼠的存活率120小時。結(jié)果如圖14所示。如圖14所示，在施用含有25 μ g來自野生型大腸桿菌脫落的微泡的PBS溶液120小時之后，小鼠的存活率為45%，但是在施用含有25 μ g來自突變型大腸桿菌脫落的微泡的PBS溶液120小時之后，小鼠的存活率增加到65%。 從該結(jié)果可以看出，與來自野生型大腸桿菌的微泡相比，當(dāng)施用的微泡來自突變型大腸桿菌時，來自細(xì)菌細(xì)胞的 微泡的副作用能夠被有效降低，其中所述突變型大腸桿菌中的脂多糖活性通過改性負(fù)責(zé)生產(chǎn)脂多糖的基因而去除，而脂多糖則是微泡中引起副作用的組分之一。實施例12:降低由來自轉(zhuǎn)化的革蘭氏陰性菌的微泡所產(chǎn)生的副作用為了檢查由靜脈注射來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡可能產(chǎn)生的副作用，使用來自大腸桿菌脫落的微泡，所述大腸桿菌已轉(zhuǎn)化為具有減少的脂多糖毒性。由于副作用的指數(shù)可能隨著靜脈注射產(chǎn)生，所以檢查血小板的數(shù)目、血凝固和溶血作用。為了用于該試驗，從來自已轉(zhuǎn)化為具有減少的脂多糖毒性的大腸桿菌，用與實施例2中相同的方式分離脫落的微泡。以IXlO6細(xì)胞的劑量將小鼠結(jié)腸26細(xì)胞系皮下注射到小鼠體內(nèi)，并培養(yǎng)。一周后，將PBS或含有5 μ g的來自已轉(zhuǎn)化為具有減少的脂多糖毒性的大腸桿菌脫落的微泡的PBS溶液通過尾靜脈給小鼠注射，將這些小鼠進(jìn)行分組，每組2只小鼠。3或6小時之后，從小鼠中抽取血樣。在血塊的形成中，血小板起著重要角色。為了檢測靜脈內(nèi)注射來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡對血小板數(shù)目的影響，進(jìn)行了以下實驗。在稀釋液(Rees-Ecker液)中將血樣稀釋100倍，并在室溫下在血細(xì)胞計中培養(yǎng)10分鐘，之后在光學(xué)顯微鏡下計數(shù)血小板的數(shù)目。結(jié)果如圖15所示。如圖15所示，即使當(dāng)靜脈注射時，來自已轉(zhuǎn)化為具有減少的脂多糖毒性的大腸桿菌脫落的微泡對血小板也沒有影響，所述血小板在凝血過程中起著十分重要的角色。D 二聚體是纖維蛋白降解產(chǎn)物，在通過纖維蛋白溶解血塊后，血液中存在小的蛋白片段，并因此作為彌漫性血管內(nèi)凝血的診斷標(biāo)準(zhǔn)。為了檢測由已轉(zhuǎn)化為具有減少的脂多糖毒性的大腸桿菌脫落的微泡引發(fā)的血管內(nèi)凝血，進(jìn)行了以下實驗。將來自實施例12的血樣以1，300x g離心10分鐘。將由此獲得的血漿稀釋3倍并涂布到涂覆有識別D 二聚體的捕捉抗體的96孔板上。然后，加入特異性識別D 二聚體的結(jié)合過氧化氫酶的檢測抗體。接下來，用底物BM-POD顯色，結(jié)果如圖16所示。
如圖16所示，即使當(dāng)靜脈注射時，來自已轉(zhuǎn)化為具有減少的脂多糖毒性的大腸桿菌脫落的微泡也沒有激活凝血機(jī)制。進(jìn)行以下實驗以檢測來自已轉(zhuǎn)化為具有減少的脂多糖毒性的大腸桿菌脫落的微泡引發(fā)的溶血作用。將PBS及含有l(wèi)yg/ml或Zyg/ml來自突變型大腸桿菌脫落的微泡的PBS溶液，以10 μ I的量逐滴加入到血液瓊脂平皿中，并在37°C下培養(yǎng)12小時。結(jié)果如圖17所示。如圖17所示，來自已轉(zhuǎn)化為具有減少脂多糖毒性的大腸桿菌脫落的微泡不能破壞紅細(xì)胞。由圖15到圖17的數(shù)據(jù)顯而易見的是，即使當(dāng)靜脈注射時，來自已轉(zhuǎn)化為具有減少脂多糖毒性的大腸桿菌脫落的微泡也不能引起血小板數(shù)量的下降、血液凝固和溶血作用。因此，當(dāng)細(xì)菌為已轉(zhuǎn)化的具有減少脂多糖毒性的細(xì)菌時，來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡的副作用能有效的降低。實施例13:來自野生型革蘭氏陽性菌細(xì)胞的微泡和轉(zhuǎn)化的革蘭氏陽性菌細(xì)胞的微泡的副作用差異已知脂磷壁酸通過特異的免疫應(yīng)答誘發(fā)炎癥，并因此是來自革蘭氏陽性菌細(xì)胞的微泡產(chǎn)生副作用的原因，因為脂磷壁酸是革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁的組分。所以，使用來自已轉(zhuǎn)化的缺乏參與脂磷壁酸生物合成基因的細(xì)菌的微泡來評估脂磷壁酸對于來自革蘭氏陽性菌細(xì)胞的微泡引發(fā)的副作用的影響。在該實驗中，使用LTA突變體作為已轉(zhuǎn)化的從細(xì)胞壁去除脂磷壁酸的金黃色葡萄球菌。用與實施例3相同的方式從金黃色葡萄球菌中構(gòu)建脫落的微泡，所述金黃色葡萄球菌已轉(zhuǎn)化為具有減少的脂磷壁酸的毒性。從小鼠腹腔內(nèi)分離后，將巨噬細(xì)胞(2.5x105細(xì)胞)與0.5mL的PBS、0.5mL的含有0.1 μ g/ml的來自野生型金黃色葡萄球菌脫落的微泡的PBS溶液，及0.5mL的含有 0.1 μ g/ml的來自突變型金黃色葡萄球菌脫落的微泡的PBS溶液一起培養(yǎng)12小時，并以500x g離心條件培養(yǎng)基5分鐘。涂覆有IL-6捕捉抗體的96孔板的每孔用100 μ I的1% BSA (牛血清白蛋白)封閉I小時。將條件培養(yǎng)基稀釋1/2，加入到板中，并在室溫下培養(yǎng)2小時，然后在存在生物素化的抗IL-6的檢測抗體存在下繼續(xù)培養(yǎng)2小時。用I % BSA洗滌板，并用鏈霉親和素-POD培養(yǎng)30分鐘，接著用底物BM-POD顯色。結(jié)果如圖18所示。從圖18的數(shù)據(jù)顯而易見的是，與施用來自野生型金黃色葡萄球菌脫落的微泡相t匕，當(dāng)施用已轉(zhuǎn)化為具有減少的脂磷壁酸毒性的金黃色葡萄球菌脫落的微泡時，IL-6的水平降低。由該結(jié)果可以理解的是，與來自野生型的微泡相比，當(dāng)微泡來自突變型細(xì)菌時，來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡的副作用能夠被有效的減少，在所述突變型細(xì)菌中通過改性負(fù)責(zé)產(chǎn)生脂磷壁酸的基因而使得脂磷壁酸的活性降低，所述脂磷壁酸是引起副作用的微泡組分之一。實施例14:共同施用抗炎劑和/或抗凝血劑對來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡的副作用的影響來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡的副作用中，比較嚴(yán)重的是微泡觸發(fā)的免疫應(yīng)答，其減少了炎性介質(zhì)的釋放，引發(fā)局部或全身性炎癥反應(yīng)，并且微泡引發(fā)的凝血導(dǎo)致血栓栓塞或彌漫性血管內(nèi)凝血。在該試驗中，使用阿司匹林作為抗炎劑和抗凝血劑，其目的是減少來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡的副作用。以IXlO6細(xì)胞的劑量將小鼠結(jié)腸26細(xì)胞系皮下注射到小鼠體內(nèi)，并培養(yǎng)。以實施例2相同的方式，從已轉(zhuǎn)化的具有減少的脂多糖毒性的大腸桿菌中分離脫落的微泡。一周后，將PBS、含有18mg/kg的阿司匹林的PBS溶液、含有0.1 μ g的來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡的PBS溶液，及含有0.1 μ g的來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡和18mg/kg的阿司匹林的PBS溶液，以100 μ L的劑量通過尾靜脈按每周兩次注射給各組的四只小鼠。在第五次注射的6小時后，從每只小鼠眼部抽取0.2ml的血樣，并置于含有50mMEDTA (乙二胺四乙酸)的抗凝劑管中。10 μ I的血樣與90 μ I的I % HCl 一起混合，并在室溫下儲存7分鐘。在10 μ I的混合物中使用血細(xì)胞計數(shù)器計數(shù)作為全身性炎癥的指標(biāo)的白細(xì)胞。結(jié)果如圖19所示。如圖19所示，單獨(dú)施用阿司匹林的組和施用PBS的組之間白細(xì)胞水平?jīng)]有差異。施用來自已轉(zhuǎn)化的具有減少的脂多糖毒性的大腸桿菌中的微泡降低了白細(xì)胞的水平。然而，當(dāng)共同施用阿司匹林和來自已轉(zhuǎn)化的具有減少的脂多糖毒性的大腸桿菌的微泡時，白細(xì)胞恢復(fù)到正常水平。由該結(jié)果可知，共同施用來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡和抗炎劑和/或抗凝血劑能夠有效地降低來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡的副作用(白細(xì)胞減少)。實施例15:利用來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡將藥物遞送至癌組織在該實施例中，將對與實施例2中相同的方式制備的來自已轉(zhuǎn)化的具有減少的脂多糖毒性的大腸脫落的微泡進(jìn)行檢測遞送藥物的能力，及遞送有與藥物相關(guān)的各種尺寸的載體的能力。 以IX IO6細(xì)胞的劑量將小鼠結(jié)腸26細(xì)胞系皮下注射到小鼠體內(nèi)，并培養(yǎng)一周。將PBS、或含有5μ g的來自已轉(zhuǎn)化的具有減少的脂多糖毒性的大腸桿菌脫落的微泡的PBS溶液，以100 μ L的劑量靜脈注射給小鼠。6小時后，同樣靜脈注射IOOnm大小的綠色熒光珠，然后允許在體內(nèi)充分循環(huán)5分鐘。此后，用PBS代替小鼠所有的血液，以從血管中去除熒光珠。切除結(jié)腸癌組織，并冷凍切割成20 μ m厚，接著用10 μ g/ml的Hoechst染料給細(xì)胞核染色。在共聚焦顯微鏡下觀察存在于癌組織中的熒光珠。結(jié)果如圖20所示。當(dāng)注射來自已轉(zhuǎn)化的具有減少的脂多糖毒性的大腸桿菌脫落的微泡時，如圖20所示，在癌組織中觀察到存在IOOnm大小的熒光珠。相反，PBS并不使熒光珠靶向癌組織。從這些結(jié)果可以斷定，施用來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡導(dǎo)致隨后注射的抗癌藥物或負(fù)載抗癌藥物的載體更有效地遞送到癌組織，所述載體的尺寸為幾十到幾百納米。實施例16:來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡的主要成分OmpA的抗癌效果根據(jù)本發(fā)明人的蛋白質(zhì)組學(xué)分析，一種革蘭氏陰性菌的外膜蛋白的最豐富的蛋白之一的OmpA，在脫落的微泡中大量存在。因此，為了檢查OmpA是否能夠介導(dǎo)來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡的抗癌活性，分析了 OmpA的抗癌活性。以IXlO6細(xì)胞的劑量將小鼠結(jié)腸26細(xì)胞系皮下注射到小鼠體內(nèi)，并培養(yǎng)。一周后，將PBS及含有Img的重組OmpA蛋白的PBS溶液，以100 μ L的劑量通過尾靜脈按每周兩次注射給各組的四只小鼠。移植癌細(xì)胞21天后，監(jiān)測結(jié)腸癌組織的尺寸。癌組織的體積用等式V=I X s2/2計算，其中I是腫瘤的最長軸的長度，s是與最長軸垂直的軸線長度。測量結(jié)果如圖21所示。如圖21所示，與對照相比，施用重組的OmpA蛋白后，觀察到結(jié)腸癌組織的體積顯著的降低。該結(jié)果表明，存在于來自細(xì)菌細(xì)胞脫落的微泡的外膜的OmpA是介導(dǎo)來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡抗癌活性的因子。實施例17:來自缺乏外膜蛋白OmpF的細(xì)菌脫落的微泡的抗癌活性除了 OmpA，根據(jù)本發(fā)明人的蛋白質(zhì)組學(xué)分析，也發(fā)現(xiàn)外膜蛋白OmpF是一種來自細(xì)菌細(xì)胞脫落的微泡的主要成分。因此，分析了來自細(xì)菌細(xì)胞脫落的微泡的OmpF誘導(dǎo)的抗癌活性。關(guān)于此，除了使用缺乏OmpF的大腸桿菌外，使用與實施例2相同的方式獲得微泡。以IXlO6細(xì)胞的劑量將小鼠結(jié)腸26細(xì)胞系皮下注射到小鼠體內(nèi)，并培養(yǎng)。一周后，將PBS、含有I μ g的來自野生型大腸桿菌脫落的微泡的PBS溶液及含有I μ g的來自來自缺乏OmpF的大腸桿菌脫落的微泡的PBS溶液，以100 μ L的劑量通過尾靜脈按每周兩次給各小鼠組注射。移植癌細(xì)胞21天后，監(jiān)測結(jié)腸癌組織的尺寸。癌組織的體積用等式V=Ixs2/2計算，其中I是腫瘤的最長軸的長度，s是與最長軸垂直的軸線長度。測量結(jié)果如圖22所示。如圖22所示，來自缺乏OmpF的大腸桿菌脫落的微泡的抗癌活性低于來自野生型大腸桿菌脫落的微泡的抗癌活性。該結(jié)果證明，在來自細(xì)菌細(xì)胞脫落的微泡的外膜中存在的OmpF，與OmpA —起，作為負(fù)責(zé)來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡的抗癌活性的因子。實施例18:具有OmpA外膜蛋白的脂質(zhì)體的重組為了構(gòu)建脂質(zhì)體，將N-(羰基甲氧基聚乙二醇2000)-1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3磷脂酰乙醇胺鈉鹽(MPEG-DSPE)、完全氫化的大豆磷脂酰膽堿(HSPC)和膽固醇分別以
3.19mg/mL、9.58mg/mL和3.19mg/mL濃度溶解于氯仿中，并且三種脂質(zhì)溶液以1:1:1的比例混合。然后，使用氮?dú)馊コ确乱孕纬杀∧?。尿素緩沖液(344mM尿素，IOmM KCl, IOmMHEPES(pH7.0,3mM NaN3)加入到該薄膜中，接著在56°C下在水浴超聲波發(fā)生器中超聲波處理I小時。獲得的懸浮液通過I μ m孔徑的膜濾器5次，然后通過400nm孔徑的膜濾器5次，并且最后通過IOOnm孔徑的膜濾器5次從而提供脂質(zhì)體。向0.3ml的脂質(zhì)體中加入含有280 μ g的OmpA的0.7ml的尿素緩沖液，接著加入辛烷基-β-D-吡喃葡萄糖苷至終濃度為1.1%。在37°C下培養(yǎng)2小時后，加入15ml的尿素緩沖液。獲得的溶液以100，OOOx g超速離心I小時。小球懸浮于0.2ml的尿素緩沖液中，并加入到50% OptiPr印溶液中，以形成30%的終濃度。在5ml超速離心管中，將2ml的30%脂質(zhì)體懸浮液、Iml的20% OptiPrep及Iml的5% OptiPrep按順序加入。以100, OOOxg超速離心2小時后,在20% OptiPrep層和5% OptiPrep層之間形成負(fù)載OmpA的脂質(zhì)體層。在200ng的OmpA和5 μ g的負(fù)載OmpA的脂質(zhì)體分別與5x上樣染料混合后,混合物在100°C下煮沸5分鐘，并上樣到12%的聚丙烯酰胺凝膠中。以80V電泳2小時后，在400mA電流下轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)到PVDF膜2小時。該膜在3%脫脂乳的PBS中在室溫下封閉2小時，在4°C下與OmpA抗體一起培養(yǎng)12小時，并用PBS清洗兩次。接著在室溫下與過氧化物酶結(jié)合的二級抗體一起培養(yǎng)I小時，并用PBS清洗膜30分鐘，然后用ECL底物顯色。結(jié)果如圖23所示。如圖23所示，發(fā)現(xiàn)OmpA負(fù)載脂質(zhì)體。當(dāng)分離時，OmpA蛋白處于變性的形式，因為其與清潔劑一起存在。然而，當(dāng)重組到脂質(zhì)體中時，發(fā)現(xiàn)OmpA存在為折疊形式和變性形式。從該結(jié)果可以看出OmpA可以重組于脂質(zhì)體中。盡管本發(fā)明的優(yōu)選的實施方式已經(jīng)出于說明的目的進(jìn)行公開，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解各種改變、增加和替代都是可能的，而不脫離本發(fā)明的附屬的權(quán)利要求書所公開的范圍和精神。工業(yè)實用性作為說明，本發(fā)明的來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡能夠特異性地遞送治療或診斷各種疾病(包括癌癥)的物質(zhì)到目的細(xì)胞或目的組織，從而增加治療和診斷效果。此外，根據(jù)本發(fā) 明的負(fù)載治療和/或診斷物質(zhì)的來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡及其制備方法可用于體外和/或體內(nèi)治療、診斷或?qū)嶒灐?br> 權(quán)利要求
1.一種用于治療或診斷癌癥的藥物組合物，其包含來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其中所述細(xì)菌是天然存在的細(xì)菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的藥物組合物，其中所述細(xì)菌表達(dá)診斷或治療癌癥的物質(zhì)。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的藥物組合物，其中所述細(xì)菌表達(dá)靶向癌癥血管、癌組織或癌細(xì)胞的物質(zhì)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其中所述細(xì)菌是轉(zhuǎn)化的。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的藥物組合物，其中所述細(xì)菌是轉(zhuǎn)化的從而所述微泡具有降低的毒性。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的藥物組合物，其中所述細(xì)菌具有參與內(nèi)毒性形成的改性的基因。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的藥物組 合物，其中所述細(xì)菌被轉(zhuǎn)化以表達(dá)細(xì)胞膜融合物質(zhì)。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的藥物組合物，其中所述細(xì)菌被轉(zhuǎn)化以靶向癌癥血管、癌組織或癌細(xì)胞。
10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的藥物組合物，其中所述細(xì)菌被轉(zhuǎn)化以表達(dá)診斷或治療癌癥的物質(zhì)。
11.根據(jù)權(quán)利要求5所述的藥物組合物，其中所述細(xì)菌被轉(zhuǎn)化以表達(dá)至少一種選自下組的物質(zhì):該組由細(xì)胞粘附分子、抗體、靶向蛋白、細(xì)胞膜融合蛋白本身及其融合蛋白所組成。
12.根據(jù)權(quán)利要求5到11中任一項所述的藥物組合物，其中所述細(xì)菌被轉(zhuǎn)化兩次或多次。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其中所述細(xì)菌是革蘭氏陰性菌。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其中所述細(xì)菌是革蘭氏陽性菌。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合物，還進(jìn)一步包含抑制微泡引起的毒性的藥物。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的藥物組合物，其中所述藥物負(fù)載于微泡上。
17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的藥物組合物，其中所述藥物抑制內(nèi)毒素介導(dǎo)的毒性。
18.根據(jù)權(quán)利要求15所述的藥物組合物，其中所述藥物是多粘菌素B。
19.根據(jù)權(quán)利要求15所述的藥物組合物，其中所述藥物是阿司匹林。
20.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合物，還進(jìn)一步包含增強(qiáng)抗癌活性的藥物。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的藥物組合物，其中所述藥物負(fù)載于微泡上。
22.根據(jù)權(quán)利要求20所述的藥物組合物，其中所述藥物是阿司匹林。
23.根據(jù)權(quán)利要求20所述的藥物組合物，其中所述藥物抑制Thl7(輔助性T細(xì)胞17)介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。
24.根據(jù)權(quán)利要求20所述的藥物組合物，其中所述藥物抑制白介素-6的形成或活性。
25.根據(jù)權(quán)利要求20所述的藥物組合物，其中所述藥物抑制血管生成。
26.26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的藥物組合物，其中所述藥物抑制血管內(nèi)皮生長因子的形成或活性。
27.根據(jù)權(quán)利要求25所述的藥物組合物，其中所述藥物抑制血管內(nèi)皮生長因子受體介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)。
28.根據(jù)權(quán)利要求20所述的藥物組合物，其中所述藥物抑制STAT3(信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子)信號傳導(dǎo)。
29.根據(jù)權(quán)利要求20所述的藥物組合物，其中所述藥物是抗癌劑。
30.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其中所述來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡包含除了細(xì)菌細(xì)胞膜組分以外的其他物質(zhì)。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的藥物組合物，其中除了膜組分以外的其他物質(zhì)是環(huán)糊精或聚乙二醇。
32.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其中所述微泡具有化學(xué)改性的膜組分。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的藥物組合物，其中所述膜組分是用巰基或胺基化學(xué)改性的。
34.一種治療或診斷癌癥的方法，包括對所需受試者施用來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中所述細(xì)菌是天然存在的細(xì)菌。
36.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中所述細(xì)菌表達(dá)診斷或治療癌癥的物質(zhì)。
37.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中所述細(xì)菌表達(dá)靶向癌癥血管、癌組織或癌細(xì)胞的物質(zhì)。
38.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中所述細(xì)菌表達(dá)靶向癌癥血管、癌組織或癌細(xì)胞的物質(zhì)以及用于診斷或治療癌癥的物質(zhì)。
39.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中所述細(xì)菌是遺傳轉(zhuǎn)化的。
40.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中所述細(xì)菌是轉(zhuǎn)化的從而微泡具有降低的毒性。
41.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中所述細(xì)菌具有參與內(nèi)毒性形成的改性的基因。
42.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中所述細(xì)菌被轉(zhuǎn)化以表達(dá)細(xì)胞膜融合物質(zhì)。
43.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中所述細(xì)菌被轉(zhuǎn)化以靶向癌癥血管、癌組織或癌細(xì)胞。
44.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中所述細(xì)菌被轉(zhuǎn)化以表達(dá)診斷或治療癌癥的物質(zhì)。
45.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中所述細(xì)菌被轉(zhuǎn)化以表達(dá)至少一種選自下組的物質(zhì):該組由細(xì)胞粘附分子、抗體、靶向蛋白、細(xì)胞膜融合蛋白本身及其融合蛋白所組成。
46.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中所述細(xì)菌被轉(zhuǎn)化兩次或多次。
47.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中所述微泡負(fù)載有減輕微泡副作用的藥物或增強(qiáng)微泡抗癌活性的藥物。
48.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中所述來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡與減輕微泡副作用的藥物或增強(qiáng)微泡抗癌活性的藥物共同施用。
49.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中所述來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡與納米顆粒治療劑或細(xì)胞治療劑共同施用，所述納米顆粒治療劑或所述細(xì)胞治療劑負(fù)載有減輕微泡副作用的藥物或增強(qiáng)微泡抗癌活性的藥物。
50.根據(jù)權(quán)利要求47到49中任一項所述的方法，其中所述減輕微泡副作用的藥物抑制由內(nèi)毒性引起的毒性。
51.根據(jù)權(quán)利要求47到49中任一項所述的方法，所述減輕微泡副作用的藥物是多粘菌素B。
52.根據(jù)權(quán)利要求47到49中任一項所述的方法，所述減輕微泡副作用的藥物是阿司匹林。
53.根據(jù)權(quán)利要求47到49中任一項所述的方法，其中所述增強(qiáng)微泡抗癌活性的藥物抑制Thl7介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。
54.根據(jù)權(quán)利要求47到49中任一項所述的方法，其中所述增強(qiáng)微泡抗癌活性的藥物抑制白介素-6的形成或活性。
55.根據(jù)權(quán)利要求47到49中任一項所述的方法，其中所述增強(qiáng)微泡抗癌活性的藥物抑制血管生成。
56.根據(jù)權(quán)利要求47到49中任一項所述的方法，其中所述增強(qiáng)微泡抗癌活性的藥物抑制血管內(nèi)皮生長因子的形成或活性。
57.根據(jù)權(quán)利要求47到49中任一項所述的方法，其中所述增強(qiáng)微泡抗癌活性的藥物抑制血管內(nèi)皮生長因子受體介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)。
58.根據(jù)權(quán)利要求47到49中任一項所述的方法，其中所述增強(qiáng)微泡抗癌活性的藥物抑制STAT3信號傳導(dǎo)。
59.根據(jù)權(quán)利要求47到49中任一項所述的方法，其中所述增強(qiáng)微泡抗癌活性的藥物是抗癌劑。
60.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中所述細(xì)菌是革蘭氏陰性菌。
61.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中所述細(xì)菌是革蘭氏陽性菌。
62.一種制備用于治療或診斷癌癥的微泡的方法，包括: (a)向細(xì)菌或轉(zhuǎn)化細(xì) 菌中添加藥物以獲得含有所述藥物的細(xì)菌懸浮液；并且 (b)從所述細(xì)菌懸浮液中分離負(fù)載藥物的脫落的微泡。
63.一種制備用于治療或診斷癌癥的微泡的方法，包括: (a)向細(xì)菌或轉(zhuǎn)化細(xì)菌中添加藥物以獲得含有所述藥物的細(xì)菌懸浮液； (b)使用選自下組的方法對細(xì)菌懸浮液進(jìn)行處理以構(gòu)建微泡，該組由擠壓、超聲波處理、分裂、均質(zhì)化、凍融、電穿孔、機(jī)械降解和化學(xué)處理方法所組成；并且 (C)分離微泡。
64.一種制備來自細(xì)菌細(xì)胞的用于治療或診斷癌癥的微泡的方法，包括: (a)從細(xì)菌或轉(zhuǎn)化的細(xì)菌培養(yǎng)物中分離脫落的微泡；并且 (b)將分離的微泡懸浮液與藥物一起培養(yǎng)。
65.一種制備來自細(xì)菌細(xì)胞的用于治療或診斷癌癥的微泡的方法，包括: (a)使用選自下組的方法對細(xì)菌或轉(zhuǎn)化細(xì)菌懸浮液進(jìn)行處理以構(gòu)建微泡，該組由擠壓、超聲波處理、分裂、均質(zhì)化、凍融、電穿孔、機(jī)械降解和化學(xué)處理所組成； (b)分離所述微泡；以及 (c)將分離的微泡懸浮液與藥物一起培養(yǎng)。
66.根據(jù)權(quán)利要求64或65所述方法，還進(jìn)一步包括從微泡或者脫落的微泡懸浮液中分離負(fù)載藥物的微泡或脫落的微泡。
67.根據(jù)權(quán)利要求62至66中任一項所述的方法，其中使用以下組中的方法分離所述微泡，所述組由密度梯度、超速離心、過濾、透析和自由流電泳組成。
68.根據(jù)權(quán)利要求62至66中任一項所述的方法，還進(jìn)一步包括使用選自由抗生素處理、紫外線照射、Y射線照射和過濾組成的組中的方法滅菌所述微泡。
69.一種藥物組合物，包括負(fù)載用于治療或診斷癌癥藥物的來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡。
70.一種用于治療或診斷癌癥的藥物組合物，包含負(fù)載用于治療或診斷癌癥藥物的微泡，其來自已轉(zhuǎn)化為靶向癌細(xì)胞或癌組織的細(xì)菌。
71.一種用于遞送治療或診斷癌癥藥物到癌細(xì)胞或癌組織的方法，包括使用負(fù)載所述藥物的微泡，其來自已轉(zhuǎn)化為靶向癌細(xì)胞或癌組織的細(xì)菌。
72.根據(jù)權(quán)利要求71所述的方法，其中所述微泡負(fù)載兩種或多種不同的用于治療或診斷癌癥的藥物。
73.根據(jù)權(quán)利要求71所述的方法，其中使用兩種或多種不同的微泡，所述微泡負(fù)載用于治療或診斷癌癥的分別不同藥物。
74.根據(jù)權(quán)利要求73所述的方法，其中同時施用兩種或多種不同的微泡。
75.根據(jù)權(quán)利要求71所述的方法，其中按順序施用兩種或多種不同的微泡，其選自下組:負(fù)載一種治療或診斷物質(zhì)的微泡、負(fù)載兩種或多種不同的治療或診斷物質(zhì)的微泡及其組合。
76.一種治療或診斷癌癥的方法，包括使用負(fù)載用于治療或診斷癌癥藥物的微泡，其來自已轉(zhuǎn)化為靶向癌細(xì)胞或癌組織的細(xì)菌。
77.一種用于遞送治療或診斷疾病的物質(zhì)的組合物，其包含負(fù)載有所述物質(zhì)的來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡。
78.根據(jù)權(quán)利要求77所述的組合物，其中所述治療或診斷物質(zhì)選自由抗癌劑、抗炎齊U、血管生成抑制劑、肽類、蛋白質(zhì)、毒素、核酸、小珠、微粒和納米顆粒組成的組。
79.根據(jù)權(quán)利要求78所述的組合物，其中所述核酸選自由DNA、RNA、適體、LNA(鎖核酸)、PNA (肽核酸)及嗎啉寡聚核苷酸組成的組中。
80.根據(jù)權(quán)利要求78所述的組合物，其中所述納米顆粒選自由氧化鐵、金、碳納米管和磁珠組成的組中。
81.根據(jù)權(quán)利要求77所述的組合物，其中所述治療或診斷物質(zhì)發(fā)射熒光。
82.根據(jù)權(quán)利要求81所述的組合物，其中所述物質(zhì)是熒光蛋白或量子點(diǎn)。
83.一種用于遞送治療或診斷疾病的物質(zhì)的方法，其包括使用來自細(xì)菌細(xì)胞的負(fù)載有所述物質(zhì)的微泡。
84.根據(jù)權(quán)利要求83所述的方法，其中所述微泡負(fù)載兩種或多種不同的治療或診斷物質(zhì)。
85.根據(jù)權(quán)利要求83所述的方法，其中所述微泡分別負(fù)載兩種或多種不同的治療或診斷物質(zhì)。
86.根據(jù)權(quán)利要求83所述的方法，其中同時施用兩種或多種不同的微泡。
87.根據(jù)權(quán)利要求83所述的方法，其中按順序施用兩種或多種不同的微泡，所述微泡選自由負(fù)載一種治療或診斷物質(zhì)的微泡、負(fù)載兩種或多種不同的治療或診斷物質(zhì)的微泡及其組合組成的組。
88.—種遞送治療或診斷疾病的藥物到特定的細(xì)胞或組織的方法，其包括使用負(fù)載所述藥物的來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡，所述細(xì)菌細(xì)胞被轉(zhuǎn)化為靶向特定的細(xì)胞或者組織。
89.一種治療或診斷疾病的方法，其包括遞送負(fù)載治療或診斷疾病的藥物的來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡到靶細(xì)胞或靶組織。
90.一種用于診斷或治療疾病的藥物遞送系統(tǒng)，其使用負(fù)載治療或診斷疾病的藥物的來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡。
91.一種用于診斷疾病的試劑盒，其包含負(fù)載診斷疾病的物質(zhì)的來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡。
92.根據(jù)權(quán)利要求91所述的試劑盒，其中所述診斷物質(zhì)選自由引物、探針、反義核酸和抗體所組成的組。
93.一種治療癌癥的方法，包括施用來自細(xì)菌的微泡的組分。
94.根據(jù)權(quán)利要求93所述的方法，其中所述細(xì)菌是革蘭氏陰性菌。
95.根據(jù)權(quán)利要求93所述的方法，其中所述細(xì)菌是革蘭氏陽性菌。
96.根據(jù)權(quán)利要求93所述的方法，其中所述組分選自由蛋白質(zhì)、核酸和脂類組成的組。
97.根據(jù)權(quán)利要求93所述的方法，其中所述組分選自蛋白質(zhì)、核酸和脂類的組合。
98.根據(jù)權(quán)利要求97所述的方法,其中所述蛋白質(zhì)選自由OmpA、OmpF、OmpC、鞭毛蛋白和其結(jié)構(gòu)域組成的組中。
99.根據(jù)權(quán)利要求97所述的方法，其中所述蛋白質(zhì)是選自以下之一的突變體:OmpA、OmpF> OmpC和鞭毛蛋白，或突變體的結(jié)構(gòu)域。
100.根據(jù)權(quán)利要求98或99所述的方法，使用來自蛋白質(zhì)的肽。
101.根據(jù)權(quán)利要求97所述的方法，其中所述核酸是質(zhì)?；騌NA。
102.根據(jù)權(quán)利要求93所述的方法，其中所述組分是與下組的至少一種結(jié)合的物質(zhì):該組由細(xì)胞粘附分子、抗體、靶向蛋白、細(xì)胞膜融合蛋白本身、Fe肽及其融合蛋白所組成。
103.根據(jù)權(quán)利要求93所述的方法，其中所述組分與聚乙二醇結(jié)合。
104.根據(jù)權(quán)利要求93所述的方法，其中所述組分負(fù)載于納米顆粒載體上。
105.根據(jù)權(quán)利要求104所述的方法，其中所述納米顆粒載體選自由脂質(zhì)體、樹枝狀大分子、聚合物組成的組中。
106.根據(jù)權(quán)利要求93所述的方法，其中所述成分與減輕微泡副作用的藥物或增強(qiáng)微泡抗癌活性的藥物共同施用。
107.根據(jù)權(quán)利要求93所述的方法，其中所述微泡與納米顆粒治療劑或細(xì)胞治療劑共同施用，所述納米顆粒治療劑或所述細(xì)胞治療劑負(fù)載有減輕微泡副作用的藥物或增強(qiáng)微泡抗癌活性的藥物。
108.根據(jù)權(quán)利要求106或107所述的方法，其中用于減輕副作用或增強(qiáng)抗癌活性的所述藥物是阿司匹林。
109.根據(jù)權(quán)利要求106或107所述的方法，其中用于減輕副作用的藥物是抗炎劑。
110.根據(jù)權(quán)利要求106或107所述的方法，其中用于增強(qiáng)抗癌活性的藥物抑制Thl7介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。
111.根據(jù)權(quán)利要求106或107所述的方法，其中用于增強(qiáng)抗癌活性的藥物抑制白介素-6的形成或活性。
112.根據(jù)權(quán)利要求106或107所述的方法，其中用于增強(qiáng)抗癌活性的藥物抑制血管生成。
113.根據(jù)權(quán)利要求106或107所述的方法，其中用于增強(qiáng)抗癌活性的藥物抑制血管內(nèi)皮生長因子的形成或活性。
114.根據(jù)權(quán)利要求106或107所述的方法，其中用于增強(qiáng)抗癌活性的藥物抑制血管內(nèi)皮生長因子受體介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)。
115.根據(jù)權(quán)利要求106或107所述的方法，其中用于增強(qiáng)抗癌活性的藥物抑制STAT3(信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子)信號傳導(dǎo)。
116.根據(jù)權(quán)利要求106或107所述的方法，其中用于增強(qiáng)抗癌活性的藥物是抗癌劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于治療和/或診斷癌癥的方法，該方法使用來自細(xì)菌細(xì)胞的微泡，其在癌癥治療中提高癌癥治療效果并降低治療藥物的副作用。此外，本發(fā)明提供一種使用負(fù)載藥物的細(xì)菌細(xì)胞的微泡來遞送用于治療或診斷疾病的藥物，從而有效并且特異地治療和診斷疾病。
文檔編號A61K39/085GK103079592SQ201180041981
公開日2013年5月1日 申請日期2011年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月1日
發(fā)明者高用柗, 金晤妍, 張壽哲, 尹昶閔, 金潤根 申請人:浦項工科大學(xué)校產(chǎn)學(xué)協(xié)力團(tuán)