專利名稱：：皮膚滲透性、細(xì)胞攝取率及腫瘤傳遞性增強(qiáng)的納米載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種皮膚滲透性、細(xì)胞攝取率以及血管給藥時(shí)的癌癥傳遞性增強(qiáng)的納米載體。
背景技術(shù)：
：為了將治療用蛋白質(zhì)或藥物傳遞至生體內(nèi)而使用的大部分納米粒子都通過使用有機(jī)溶劑的乳劑蒸發(fā)(emulsionevaporation)法制備而成，由此會(huì)造成從制備到干燥的制備工序的復(fù)雜性，并導(dǎo)致制備時(shí)間延長，此外，使用有機(jī)溶劑，不僅引起費(fèi)用增加，而且還會(huì)誘發(fā)生體內(nèi)的問題。(T.G.Park,etal.,Biomacromolecules8(2007)650-656；Τ.G.Park,etal.,Biomacromolecules7(2006)1864-1870；D.Τ.Birnbaum,etal.,J.Control.Rel.650000)375-387)?；谏鲜鲈颍T多研究者一直潛心致力于開發(fā)出用于制備納米粒子的新型技術(shù)，以防止充填到納米粒子的藥物的變性并確保它們的穩(wěn)定性。為了解決乳劑蒸發(fā)法中所存在的問題，其他研究者還曾使用超臨界流體來制備納米粒子。但在這種制備工藝中，由于大部分醫(yī)療用高分子在可溶解于超臨界流體的溶解性上受到限制，因而未能普及使用(K.S.Soppimathetal.，J.Control.Rel.70(2001)1-20)。并且，在美國專利第5，019，400號(hào)中，還通過將作為生物相容性高分子的聚(D，L-乳酸-co-乙醇酸)(以下稱作“PLGA”)噴射到超低溫制冷劑來制備了蛋白質(zhì)藥物傳遞用微粒子，但由于為了溶解PLGA而使用的有機(jī)溶劑的疏水性而引發(fā)了問題。此外，在美國專利第6，586，011號(hào)中，通過將蛋白質(zhì)傳遞用納米粒子體系噴射到超低溫制冷劑的方式來進(jìn)行了制備，但因在制備納米粒子時(shí)所使用的交聯(lián)劑而在蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性上引發(fā)了嚴(yán)重問題。并且，作為制備納米粒子的方法，還使用溶劑蒸發(fā)法(solventevaporation),但這種方法也因使用有機(jī)溶劑而引發(fā)了諸多問題。另一方面，還開發(fā)出了鹽析法(salting-out)，該方法不使用疏水性和毒性強(qiáng)的有機(jī)溶劑，而使用與水充分混合的有機(jī)溶劑(丙酮等)取而代之來制備聚(D，L-乳酸)(以下稱作“PLA”)納米粒子，但不僅導(dǎo)致了蛋白質(zhì)藥物的活性降低，也未能解決穩(wěn)定性問題(E.Allemannetal.,Pharm.Res.10(1993)1732-1737)。另一方面，關(guān)于由作為天然聚合物的典型代表的殼聚糖引發(fā)的變性(modification)或功能化(functionalization)，韓國專利第766820號(hào)提出了就作為一種聚合物的蛋白質(zhì)使殼聚糖功能化來改善蛋白質(zhì)的經(jīng)粘膜遞送的發(fā)明。并且，W02008/136773號(hào)提出了用殼聚糖進(jìn)行了表面變性的納米粒子，這種納米粒子能夠用作分子成像劑、生物傳感劑以及給藥系統(tǒng)(drugdeliverysystem，DDS)。另一方面，藥物的經(jīng)皮給藥具有如下優(yōu)點(diǎn)能夠以規(guī)定速度持續(xù)進(jìn)行藥物傳遞；能夠降低產(chǎn)生副作用的可能性；能夠增加治療效果；能夠改善口服給藥時(shí)低的生體利用率；能夠降低給藥次數(shù)；需要時(shí)，能夠中止藥物給藥。然而，在經(jīng)皮給藥劑的開發(fā)方面，尤其在如分子量大的蛋白質(zhì)等生物醫(yī)藥的經(jīng)皮給藥劑的開發(fā)方面，仍未開發(fā)出令人滿意的經(jīng)皮給藥劑。實(shí)體瘤的光熱治療(又名光熱消融(ablation)、光熱散發(fā)或光學(xué)溫?zé)岈F(xiàn)象)作為以最小限度的侵蝕性方式治療實(shí)體瘤的方式，備受矚目(1-6)。典型地包括通過非放射性機(jī)理將所吸收的光轉(zhuǎn)換成局部熱量的步驟的該項(xiàng)技術(shù)相對(duì)而言具有便于進(jìn)行癌細(xì)胞消融，且恢復(fù)快、病發(fā)癥發(fā)生率低、住院時(shí)間短等諸多優(yōu)點(diǎn)(7)。尤其是，通過一般組織吸收低的近紅外線，用于這種方法的近紅外線(NIR)不會(huì)破壞一般的生體組織，并具有高的空間精密度，且能夠滲透至組織深處(8-10)。就幾種納米結(jié)構(gòu)體，例如聚集性金納米粒子(11)、金納米殼(12-14)、金納米籠(15)、空的AuiVg樹枝晶(7)、金納米棒(GoldNanorod)(16-18)以及碳納米管等，都曾進(jìn)行研究，以用于近紅外線(NIR)光活性癌癥治療。其中，等離子-共振金納米棒備受人們矚目，其原因是它能夠利用縱橫比(aspectratio)來精密地調(diào)整光的吸收區(qū)域，而這源于等離子-共振金納米棒具有大規(guī)模有效合成的優(yōu)點(diǎn)，且容易功能化，還具有高的光熱轉(zhuǎn)換性以及膠體穩(wěn)定性00-21)。盡管具有這些優(yōu)點(diǎn)，但由于在金納米棒的表面進(jìn)行合成和包裹的過程中殘留過多的用作模板的十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)而造成若干細(xì)胞毒性，所以在臨床應(yīng)用上會(huì)受到限制(18)。由此，提出了通過金納米棒的表面置換來降低細(xì)胞毒性效果的報(bào)告，例如，進(jìn)行了磷脂酰膽堿(PC)處理的金納米棒、涂敷有聚苯乙烯磺酸鹽(PSS)的納米棒、嵌入了金納米棒的聚合物性納米粒子以及進(jìn)行了聚乙二醇(PEG)處理的金納米棒相比用CTAB覆蓋的金納米棒表現(xiàn)出低的細(xì)胞毒性。進(jìn)而，用于進(jìn)行有效的癌癥的光熱治療的另一重要問題是，將金納米棒選擇性地傳遞到靶腫瘤。用適體(Aptamer)-結(jié)合金納米棒以及RGD(氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)結(jié)合樹枝狀聚合物進(jìn)行處理的金納米棒證明了選擇性且有效的靶腫瘤細(xì)胞的光熱治療。雖然與這些特異基質(zhì)相結(jié)合的金納米棒在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)(invitro，生體外)中對(duì)癌細(xì)胞的光熱治療非常有效，但在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)(invivo，生體內(nèi))中，卻因在血管循環(huán)時(shí)金納米棒過多地蓄積在肝中而導(dǎo)致光熱治療效果受到限制。基于金納米棒堅(jiān)硬的特性，在注射到靜脈內(nèi)后經(jīng)過0.5小時(shí)之后，CTAB-穩(wěn)定化的金納米棒在肝中表現(xiàn)出高水平的局部化、2、。為了在這種動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中改善癌癥光熱治療時(shí)存在的金納米棒局限性效果，導(dǎo)入了金納米棒的聚乙二醇化藥物修飾(PEGylation)技術(shù)(27)，但可能是因?yàn)轶w外排出進(jìn)行得快(1小時(shí)的半衰期)而導(dǎo)致了癌癥光熱治療效果受到限制。由此，需要想出有效地將金納米棒傳遞至腫瘤部位內(nèi)的新型方法。本說明書全文中參考了大量論文以及專利文獻(xiàn)，其引用均已標(biāo)明。所引用的論文以及專利文獻(xiàn)的公開內(nèi)容以其整體作為參考通過引用結(jié)合在本說明書中，以更明確地說明本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的水準(zhǔn)以及本發(fā)明的內(nèi)容。
發(fā)明內(nèi)容技術(shù)問題本發(fā)明人一直致力于制備不僅表現(xiàn)出溫度敏感性的同時(shí)大幅改善用于經(jīng)皮給藥的皮膚滲透性，而且有利于細(xì)胞攝取率、向癌組織的選擇傳遞性以及光熱治療的納米載體。其結(jié)果確認(rèn)到，在利用帶有能夠光交聯(lián)的官能團(tuán)的水溶性的生物相容性聚合物以及殼聚糖來制備納米載體的情況下，能夠制備出上述特性得以改善的納米載體，故而完成了本發(fā)明。由此，本發(fā)明的一目的在于，提供一種皮膚滲透性、細(xì)胞攝取率(cellularuptake)以及向癌組織的傳遞性增強(qiáng)，且有利于光熱治療的納米載體。本發(fā)明的再一目的在于，提供一種經(jīng)皮給藥用組合物。本發(fā)明的另一目的在于，提供一種在應(yīng)用于生體(invivo)時(shí)的腫瘤或癌的成像用組合物。本發(fā)明的還一目的在于，提供一種癌癥光熱治療用組合物。本發(fā)明的又一目的在于，提供一種以皮膚滲透性、細(xì)胞攝取率(cellularuptake)或向癌組織的傳遞性增強(qiáng)為特征的殼聚糖-改性納米載體的制備方法。本發(fā)明的其他目的以及優(yōu)點(diǎn)通過以下的
發(fā)明內(nèi)容、所附的權(quán)利要求書以及附圖會(huì)更明確。技術(shù)解決方法根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式，提供一種納米載體(nano-carrier)，其是使通過在末端的能夠光交聯(lián)(photo-crosslinkable)的官能團(tuán)來交聯(lián)的水溶性的生物相容性聚合物與殼聚糖相結(jié)合的殼聚糖-改性納米載體，其特征在于，上述殼聚糖-改性納米載體的直徑隨著溫度變化而變化，與未結(jié)合殼聚糖的裸(bare)納米載體相比，上述殼聚糖-改性納米載體的皮膚滲透性、細(xì)胞攝取率(cellularuptake)、向癌組織的選擇傳遞性或光熱效應(yīng)(photothermaleffect)±曾強(qiáng)。本發(fā)明人一直致力于制備既表現(xiàn)出溫度敏感性的同時(shí)大幅改善用于經(jīng)皮給藥的皮膚滲透性，而且有利于細(xì)胞攝取率、向癌組織的選擇傳遞性以及光熱治療的納米載體。其結(jié)果確認(rèn)到，在利用帶有能夠光交聯(lián)的官能團(tuán)的水溶性的生物相容性聚合物以及殼聚糖來制備納米載體的情況下，能夠制備出上述特性得以改善的納米載體。在本說明書中，術(shù)語“生物相容性聚合物”是指具有不會(huì)因與生體組織或血液相接觸而使組織壞死或使血液凝固的組織相容性(tissuecompatibility)以及抗血液相容性(bloodcompatibility)的高分子。術(shù)語“水溶性的生物相容性聚合物”是溶解于水或水-混合性溶劑(water-miscib1esolvent，例如甲醇、乙醇、丙酮、乙腈、N，N-二甲基甲酰胺以及二甲基亞砜)的生物相容性聚合物，優(yōu)選為表示溶解于水的生物相容性聚合物。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施列，本發(fā)明所能夠利用的水溶性的生物相容性聚合物為具有聚乙二醇、聚環(huán)氧乙烷、聚乙烯醇、聚環(huán)氧乙烷-聚環(huán)氧丙烷嵌段共聚物、烷基纖維素、羥烷基纖維素、肝素、透明質(zhì)酸、葡聚糖或藻酸鹽結(jié)構(gòu)的聚合物。從上述水溶性生物相容性聚合物中選用因具有疏水性及親水性部分而表現(xiàn)出與表面活性劑類似狀態(tài)的聚合物的情況下，優(yōu)選為向該聚合物追加導(dǎo)入疏水性部分，這有利于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明所要達(dá)成的技術(shù)目的。更優(yōu)選地，本發(fā)明所能夠利用的水溶性的生物相容性聚合物為泊洛沙姆系列的聚合物。最優(yōu)選地，本發(fā)明所能夠利用的水溶性的生物相容性聚合物為由以下化學(xué)式1表示的聚合物。化學(xué)式1(PCl)-(PE)x-(PPO)y-(PE)z_(PC2)在上述化學(xué)式中，PE表示環(huán)氧乙烷，PPO表示環(huán)氧丙烷，PCl及PC2表示能夠光交聯(lián)的官能團(tuán)，X、Y以及Z分別獨(dú)立地表示1-10000的整數(shù)。優(yōu)選地，能夠光交聯(lián)的(photo-crosslinkable)官能團(tuán)與生物相容性聚合物的兩個(gè)末端結(jié)合。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施列，上述能夠光交聯(lián)的官能團(tuán)為帶有C=C雙鍵的官能團(tuán)。更優(yōu)選地，能夠光交聯(lián)的官能團(tuán)為丙烯酸酯、二丙烯酸酯、低聚丙烯酸酯、丙烯酸甲酯、二甲基丙烯酸酯、低聚丙烯酸甲酯、香豆素、胸腺嘧啶或肉桂酸，進(jìn)而優(yōu)選為丙烯酸酯、二丙烯酸酯、低聚丙烯酸酯、丙烯酸酯甲酯、二甲基丙烯酸酯或低聚丙烯酸甲酯，最優(yōu)選為丙烯酸酯。本發(fā)明所利用的通過能夠光交聯(lián)的官能團(tuán)來交聯(lián)的水溶性的生物相容性聚合物，由適合的殼聚糖進(jìn)行了改性(modification)。在本發(fā)明中，為了使水溶性的生物相容性聚合物改性而使用的殼聚糖包含本領(lǐng)域公知的任意的殼聚糖，優(yōu)選為殼聚糖、肝素、藻酸鹽、透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、5-硫酸皮膚素(dermatan5-sulfate)、硫酸角質(zhì)素、纖維素、半纖維素、羧甲基纖維素、葡聚糖以及硫酸葡聚糖中的任一種或兩種以上的組合，最優(yōu)選為殼聚糖。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施列，殼聚糖通過能夠光交聯(lián)的(photo-crosslinkable)官能團(tuán)結(jié)合在上述水溶性生物相容性聚合物。殼聚糖上的能夠光交聯(lián)的官能團(tuán)如上所述。另一方面，在本發(fā)明中，作為為了使生物相容性聚合物改性而使用的殼聚糖的最優(yōu)選例子的殼聚糖(chitosan)是一種在自然界緊次于纖維素而存在最多的天然有機(jī)高分子，由年產(chǎn)量達(dá)1000億噸以上的幾丁質(zhì)制備而成，通過使分布在螃蟹、蝦等甲殼類，螞蚱、蜻蜓等昆蟲類，金針菇、香菇等真菌類，細(xì)菌的細(xì)胞膜等中的幾丁質(zhì)進(jìn)行去乙?；瘉慝@取。從化學(xué)結(jié)構(gòu)上來講，從有N-乙酰-D-葡萄胺(N-acetyl-D-glucosamine)單體以β_1，4鍵的直鏈狀連接的幾丁質(zhì)中去除存在于胺基的乙酰基來形成殼聚糖(ErringtonN,etal.,Hydrodynamiccharacterizationofchitosanvaringinmolecularweightanddegreeofacetylation.IntJBiolMacromol.15:1123-7(1993))。與幾丁質(zhì)相比，殼聚糖由于存在于胺基的乙?；蝗コ蚨谒嵝匀芤褐幸远嗑坳栯x子(polycation)存在。由此，在酸性水溶液中針對(duì)水的溶解性變好，因而可加工性優(yōu)異且干燥后的機(jī)械強(qiáng)度比較優(yōu)異，所以殼聚糖成型成粉末、纖維、薄膜、凝膠、珠子等形態(tài)而進(jìn)行使用(E.Guibal，etal.,Ind.Eng.Chem.Res.,37:1454-1463(1998))。殼聚糖根據(jù)所連接的單體的數(shù)量而分成具有12個(gè)左右的單體的低聚物和屬于高分子的聚合物，聚合物分成分子量小于15萬的低分子殼聚糖、分子量達(dá)到70萬至100萬的高分子殼聚糖以及分子量在中間范圍的中分子殼聚糖。殼聚糖因其穩(wěn)定性和環(huán)保性、生物降解性以及生物相容性優(yōu)異而廣泛地應(yīng)用于諸多產(chǎn)業(yè)領(lǐng)域和醫(yī)療領(lǐng)域。并且，殼聚糖還被公知為安全、促進(jìn)免疫力且無副作用。殼聚糖在生體內(nèi)被溶菌酶(lysozyme)分解成N-乙酰葡糖胺，該N-乙酰葡糖胺使用于糖蛋白質(zhì)合成之后以二氧化碳的形態(tài)排出(ChandyT,SharmaCP.Chitosanasabiomaterial.BiomatArtCellsArtOrg.181-24(1990))本發(fā)明的特征在于，與其他生物相容性聚合物一同將生物相容性優(yōu)異的殼聚糖用作載體，在殼聚糖-改性納米載體用作經(jīng)皮給藥劑或癌靶向分子的情況下，發(fā)揮出非常優(yōu)異的功效。作為本發(fā)明所利用的殼聚糖，雖然也能夠利用通常的任意的殼聚糖，但優(yōu)選利用分子量為500-20000的殼聚糖。如果本發(fā)明所利用的殼聚糖的分子量小于500，則存在作為殼聚糖的載體的功能微弱的問題，而如果殼聚糖的分子量大于20000，則存在在水溶液中形成自聚體的問題。因而本發(fā)明所利用的殼聚糖優(yōu)選為低聚物水平的殼聚糖。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施列，本發(fā)明的殼聚糖-改性納米載體的直徑隨著溫度降低而增大，相反，如果溫度升高，本發(fā)明的殼聚糖-改性納米載體的直徑就減小。優(yōu)選地，40°C條件下的殼聚糖-改性納米載體的直徑相比400°C下的直徑增加3倍-20倍，更優(yōu)選為4倍-15倍，進(jìn)而優(yōu)選為5倍-12倍，最優(yōu)選為7倍-10倍。本發(fā)明的殼聚糖-改性納米載體的這種直徑的增減是可逆的。隨著直徑的增減，形成在殼聚糖-改性納米載體的孔的大小發(fā)生變化。例如，在低溫(例如4°C)下對(duì)要向孔的大小增加的殼聚糖-改性納米載體遞送的藥物進(jìn)行封裝(encapsulation)之后將其應(yīng)用于人體時(shí)，孔的大小減小而形成所封裝的藥物的緩釋(sustainedrelease)0根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施列，本發(fā)明的溫度敏感性殼聚糖-改性納米載體在37°C下的孔大小為3nm-20nm，更優(yōu)選為3nm_15nm，最優(yōu)選為5nm_10nm。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施列，本發(fā)明的殼聚糖-改性納米載體分散在水溶液分散相。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施列，本發(fā)明的殼聚糖-改性納米載體在37°C下的孔大小為3nm-20nm。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施列，本發(fā)明的殼聚糖-改性納米載體為納米粒子(nanoparticulate)，而不是水溶膠。本發(fā)明的殼聚糖_改性納米載體具有呈圓形狀的納米粒子形態(tài)。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施列，本發(fā)明的納米載體的直徑為50nm-500nm，更優(yōu)選為100歷-400歷，最優(yōu)選為120nm-300nm。鑒于本發(fā)明的殼聚糖-改性納米載體使用滅菌過濾器簡(jiǎn)單地進(jìn)行滅菌過程，其直徑優(yōu)選為200nm以下。并且有利的是，殼聚糖-改性納米載體的多分散(polydispersity)指數(shù)為0.1以下，這是因?yàn)?，一般將多分散指?shù)為0.1以下的情況視為具有穩(wěn)定的單分散分布的納米粒子。殼聚糖-改性納米載體的優(yōu)選多分散指數(shù)為0.01-0.1。能夠通過本發(fā)明的殼聚糖-改性納米載體遞送的物質(zhì)不受特別限制，包含表現(xiàn)出治療學(xué)功效的各種物質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施列，遞送對(duì)象的物質(zhì)是蛋白質(zhì)、肽、核酸分子、糖類、脂質(zhì)、納米粒子、化合物、無機(jī)物或熒光物質(zhì)。通過本發(fā)明的殼聚糖-改性納米載體遞送的蛋白質(zhì)或肽不受特別限制，包含激素、激素類似體、酶、酶抑制劑、信號(hào)傳遞蛋白質(zhì)或其一部分、抗體或其一部分、單鏈抗體、結(jié)合蛋白質(zhì)或其結(jié)合結(jié)構(gòu)、抗原、黏附蛋白質(zhì)、結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)、調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)、毒素蛋白質(zhì)、細(xì)胞因子、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子、血凝因子以及疫苗等，但不局限于此。更詳細(xì)地，通過本發(fā)明的藥物載體遞送的蛋白質(zhì)或肽包含胰島素、胰島素樣生長因子(insulin-likegrowthfactor1，IGF-1)、生長激素、促紅細(xì)胞生成素、粒細(xì)胞-集落刺激因子(granulocyte-colonystimulatingfactors，G-CSFs)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞克隆刺激因子抗原(granulocyte/macrophage-colonystimulatingfactors,GM-CSFs)、干擾素-α、干擾素-β、干擾素-Y、白細(xì)胞介素-1α、白細(xì)胞介素-1β、白細(xì)胞介素_3、白細(xì)胞介素_4、白細(xì)胞介素-6，白細(xì)胞介素-2、表皮生長因子(印idermalgrowthfactors，EGFs)、降血鈣素(calcitonin)、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(vascularendothelialcellgrowthfactor，VEGF)、成纖維細(xì)胞生長因子(fibroblastgrowthfactor,FGF)、血小板衍生生長因子(platelet-derivedgrowthfactor,PDGF)>W-tl/l1M#S(adrenocorticotropichormone,ACTH)^生長因子-β(transforminggrowthfactorbeta,TGF-β)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bonemorphogeneticprotein,BMP)、月中瘤壞死因子(tumornecrosisfactor,TNF)、阿托西班(atobisban)、布舍瑞林(buserelin)、西曲瑞克(cetrorelix)、地洛瑞林(deslorelin)、去氨加壓素(desmopressin)、強(qiáng)啡肽A(dynorphinA)(1-13)、依降鈣素(elcatonin)、章魚唾腺精(eleidosin)、依替巴肽(印tifibatide)、生長激素釋放激素-II(growthhormonereleasinghormone-II，GHRH-II)>戈那瑞林(gonadorelin)、戈舍瑞林(goserelin)、組氨瑞林(histrelin)、亮丙瑞林(Ieuprorelin)、賴氨力口壓素(Iypressin)、奧曲肽(octreotide)、催產(chǎn)素(oxytocin)、力口壓素(pitressin)、胰泌素(secretin)、辛卡利特(sincalide)、特利加壓素(terlipressin)、胸腺噴丁(thymopentin)、胸腺素(thymosine)α1、曲普瑞林(triptorelin)、比伐盧定(bivalirudin)、卡貝縮宮素(carbetocin)、環(huán)孢霉素、艾塞那肽(exedine)、蘭瑞肽(Ianreotide)、促黃體激素釋放激素(luteinizinghormone-releasinghormone,LHRH)、那法瑞林(nafarelin)、甲狀旁腺激素、普蘭林肽(pramlintide)、T-20(enfuvirtide，恩夫韋地)、胸腺法新(thymalfasin)以及齊考諾肽，但不局限于此。能夠通過本發(fā)明的殼聚糖-改性納米載體遞送的核酸分子例如包含DNA、DNA適體、RNA適體、核酶、miRNA、反義寡核苷酸、siRNA、shRNA、質(zhì)粒以及載體(例如，腺病毒載體、反轉(zhuǎn)錄病毒載體)，但不局限此。優(yōu)選地，能夠通過本發(fā)明的殼聚糖-改性納米載體遞送的物質(zhì)為藥物，例如包含抗炎藥、止痛藥、抗關(guān)節(jié)炎藥、鎮(zhèn)痙藥、抗抑郁藥、抗精神病藥、鎮(zhèn)靜安定藥、抗焦慮藥、麻醉藥品拮抗劑、抗帕金森疾病藥物、膽堿能受體激動(dòng)劑、抗癌藥、血管生成抑制劑、免疫抑制劑、抗病毒藥、抗生素、食欲抑制劑、鎮(zhèn)痛劑、抗膽堿藥、抗組胺藥、抗偏頭痛藥、激素藥、冠狀血管、腦血管或末梢血管擴(kuò)張劑、避孕藥、抗血栓劑、利尿劑、抗高血壓藥、心血管疾病治療藥物、美容成分(例如，皺紋改善劑、抗皮膚衰老劑以及皮膚美白劑)等，但不局限于此。最優(yōu)選地，能夠通過本發(fā)明的殼聚糖-改性納米載體遞送的物質(zhì)為抗癌藥。能夠應(yīng)用于本發(fā)明的抗癌藥包含本領(lǐng)域所公知的任意的抗癌藥，例如包含順鉬(cisplatin)、卡鉬(carboplatin)、甲基節(jié)餅(procarbazine)、氮芥(mechlorethamine)、環(huán)憐酉先胺(cyclophosphamide)、異環(huán)磷酰胺(ifosfamide)、美法侖(melphalan)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、白消安(bisulfan)、亞硝服(nitrosourea)、放線菌素(dactinomycin)、柔紅霉素(daunorubicin)、多柔比星(doxorubicin)、博來霉素(bleomycin)、普卡霉素(plicomycin)、絲裂霄素(mitomycin)、依托泊昔(etoposide)、他莫昔芬(tamoxifen)>紫杉醇(taxol)、吡啶類反鉬(transplatinum)、5氟尿嘧啶(5_fluorouracil)、阿霉素(adriamycin)、長春新堿(vincristin)、長春堿(vinblastin)以及甲氨蝶呤(methotrexate)，但不局限于此。能夠通過本發(fā)明的殼聚糖-改性納米載體遞送的納米粒子，例如包含金納米粒子、銀納米粒子、鐵納米粒子、過度金屬納米粒子以及金屬氧化物納米粒子(例如鐵氧體納米粒子)，但不局限于此。例如，在本發(fā)明的殼聚糖-改性納米載體遞送鐵氧體納米粒子的情況下，能夠用作磁共振(magneticresonance,MR)顯影劑(imagingagent)。在利用本發(fā)明的殼聚糖-改性納米載體來遞送熒光物質(zhì)的情況下，優(yōu)選地，熒光物質(zhì)結(jié)合在殼聚糖-改性納米載體的表面。例如，能夠使熒光物質(zhì)與蛋白質(zhì)或金屬納米粒子(例如，磁性納米粒子)結(jié)合來加以利用。上述熒光物質(zhì)的例子包含熒光素及其衍生物、若丹明及其衍生物、螢光黃、B-藻紅蛋白、9-吖啶異硫氰酸鹽、螢光黃VS、4-乙酰氨基-4’-異硫-氰酸芪-2，2’_二磺酸、7-二乙氨基-3-(4’_異硫氰酸苯基)-4-甲基香豆素、琥珀酰亞胺基吡啶酸鹽、4-乙酰氨基-4'-異硫氰酸芪-2，2’-二磺酸衍生物、LCTM-Red640、LCTM-Red705、Cy5、Cy5.5、麗絲胺、異硫氰酸酯、赤蘚紅異硫氰酸酯、二乙烯三胺五乙酸、1-二甲氨基萘-5-磺酸鹽、1-苯胺基-8-萘磺酸鹽、2-p-濤荻尼(至罕01Cl^)-6-萘磺酸鹽、3-苯基-7-異氰酸香豆素、9-異硫氰酸吖啶、吖啶橙、N-(p-(2-苯并惡唑基)苯基)馬來酰亞胺、苯并氧雜惡二唑、芪以及芘，但不局限于此。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施列，本發(fā)明的納米載體所包含的蛋白質(zhì)、肽、核酸分子、糖類、脂質(zhì)、化合物、無機(jī)物或熒光物質(zhì)具有高分子量。本發(fā)明的最大特征之一在于，在殼聚糖-改性納米載體封裝遞送對(duì)象的物質(zhì)的過程中，只要簡(jiǎn)單地將上述兩種物質(zhì)混合即可實(shí)現(xiàn)自然封裝(spontaneousencapsulation)。即，不需要進(jìn)行任何追加處理，而只需要進(jìn)行能使納米載體和遞送對(duì)象的物質(zhì)相接觸(contacting)的操作，就能自然而然地在殼聚糖-改性納米載體含有遞送對(duì)象的物質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施列，在將藥物封裝到殼聚糖-改性納米載體的情況下，不使用有機(jī)分散相，而在水溶液分散相實(shí)施。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施列，在0°C-20°C，更優(yōu)選為4°C-10°C，最優(yōu)選為4°C_6°C的溫度條件下實(shí)施封裝的步驟。通過本發(fā)明的殼聚糖-改性納米載體進(jìn)行的在水溶液相的自然封裝具有大幅增強(qiáng)所要含有的藥物、尤其是蛋白質(zhì)醫(yī)藥的穩(wěn)定性的優(yōu)點(diǎn)。雖然能夠通過自然封裝而在本發(fā)明的殼聚糖-改性納米載體含有藥物，但封裝效率(encapsulationefficiency)高達(dá)90%以上。并且，由于在含有藥物的過程中不利用有機(jī)溶劑，且不需要高速均勻化過程或超聲波處理過程，因而本發(fā)明的方法能夠避免所要含有的藥物的變性或凝聚。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施列，能夠在本發(fā)明的殼聚糖-改性納米載體的表面結(jié)合有靶向配位體。上述靶向配位體的例子包含激素、抗體、細(xì)胞-黏附蛋白質(zhì)(cell-adhesionmolecules)、糖類以及神經(jīng)遞質(zhì)，但不局限于此。根據(jù)本發(fā)明的其他實(shí)施方式，本發(fā)明提供一種包括使包含遞送對(duì)象的物質(zhì)的上述殼聚糖-改性納米載體與對(duì)象(subject)接觸的步驟的遞送對(duì)象(cargo)的遞送方法。根據(jù)本發(fā)明的其他實(shí)施方式，本發(fā)明提供一種殼聚糖-改性納米載體的制備方法，其特征在于，上述殼聚糖-改性納米載體的直徑隨著溫度變化而變化，與未結(jié)合殼聚糖的裸(bare)納米載體相比，上述殼聚糖-改性納米載體的皮膚滲透性、細(xì)胞攝取率(cellularuptake)或向癌組織的傳遞性增強(qiáng)。上述殼聚糖-改性納米載體的制備方法包括如下步驟步驟(a)，準(zhǔn)備帶有能夠光交聯(lián)(photo-crosslinkable)的官能團(tuán)的水溶性的生物相容性聚合物的分散液；步驟(b)，準(zhǔn)備帶有能夠光交聯(lián)(photo-crosslinkable)的官能團(tuán)的水溶性的殼聚糖的分散液；步驟(c)，準(zhǔn)備上述生物相容性聚合物的分散液與殼聚糖的分散液的混合物；步驟(d)，向上述混合物添加引發(fā)劑；以及步驟(e)，向上述步驟(d)的產(chǎn)物照射光使上述聚合物和殼聚糖交聯(lián)來制備殼聚糖-改性納米載體。適合于本發(fā)明的方法的引發(fā)劑不受特別限制，優(yōu)選地，本發(fā)明所能夠利用的引發(fā)劑為能夠通過照射紫外線或可視光線來引發(fā)自由基(radical)反應(yīng)的自由基型光引發(fā)劑(radicalphotoinitiator)。本發(fā)明所能夠利用的光引發(fā)劑的例子有乙基曙紅、2，2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮、2-甲氧基-2-苯基苯乙酮、2-羥基-l-[4(2-羥乙氧基)苯基]-2-甲基一1-丙麗(Irgacure2959或Darocur2959)、棒腦酉昆(camphorquinone)、苯乙麗、苯乙麗芐基縮酮、1-羥基環(huán)已基苯基甲酮、2，2_二甲氧基-2-苯基苯乙酮、氧雜蒽酮、芴酮、安息香醛、芴、蒽醌、三苯基胺、咔唑、3-甲基苯乙酮、4-氯二苯甲酮、4，4’-二甲氧基二苯甲酮、4，4’-二氨基二苯甲酮、安息香丙醚、安息香乙醚、芐基二甲基縮酮、1-(4-異丙苯基)-2-羥基-2-甲基丙烷-1-酮、2-羥基-2-甲基-1-苯基丙烷-1-酮、噻噸酮、二乙基噻噸酮、2-異丙基噻噸酮、2-氯噻噸酮、2-甲基-144-(甲硫基)苯基]-2-嗎啉基-丙烷-1-酮、2，4，6-三甲基苯甲酰基二苯基氧化膦以及雙-(2，6_二甲氧基苯甲酰基)-2，4，4_三甲基戊基氧化膦。如以下實(shí)施例所述，在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例中使用了IrgaCure2959，其被公知為生體內(nèi)毒性非常小的引發(fā)劑(KristiS.Anseth,etal.，CytocompatibilityofUVandvisiblelightphotoinitiatingsystemsonculturedNIH/3T3fibroblastsinvitro.J.Biomater.Sci.PolymerEdn.，2000.11(5):Ρ·439—457)。在步驟(e)中，通過照射可視光線或紫外線來使聚合物及殼聚糖的能夠光交聯(lián)的官能團(tuán)來使聚合物及殼聚糖進(jìn)行交聯(lián)，從而制備納米載體。優(yōu)選地，利用紫外線來進(jìn)行交聯(lián)。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例，為了照射紫外線，能夠利用薄層色譜法(ThinLayerChromatography)用紫外線燈，它具有價(jià)格比其他固化用紫外線燈低廉、且容易到手的優(yōu)點(diǎn)，并且還適合于通過在特定365nm波長的紫外線照射來引發(fā)自由基反應(yīng)的引發(fā)劑(例如，Irgacure2959)。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，上述步驟(a)至步驟(e)不使用有機(jī)分散相，而唯獨(dú)在水溶液分散相實(shí)施。即，在單相(singlephase)實(shí)現(xiàn)制備納米載體的全部過程。更詳細(xì)地，通過向分散有生物相容性聚合物、殼聚糖以及引發(fā)劑的水溶液照射光，來實(shí)現(xiàn)納米載體的完整制備。進(jìn)而，本發(fā)明的反應(yīng)可以通過一鍋(one-pot)反應(yīng)實(shí)施，在這種層面上，本發(fā)明的方法可謂是“一鍋法，單相合成法(one-pot，singlephasesynthesis)”。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，能夠解決以往技術(shù)中所存在的問題，例如，利用有害的有機(jī)溶劑，過程復(fù)雜，生產(chǎn)成本高，含有能力低等。并且，本發(fā)明的方法由于不需要進(jìn)行在以往技術(shù)中通常利用的高速均勻化過程或超聲波處理過程，因而能夠避免所要含有的藥物的變性或凝聚。根據(jù)本發(fā)明的其他實(shí)施方式，本發(fā)明提供一種包含上述殼聚糖-改性納米載體的經(jīng)皮給藥用組合物。根據(jù)本發(fā)明的其他實(shí)施方式，本發(fā)明提供一種包括使包含遞送對(duì)象的物質(zhì)的上述殼聚糖-改性納米載體與對(duì)象(subject)的皮膚接觸的步驟的遞送對(duì)象的經(jīng)皮遞送方法。根據(jù)本發(fā)明的其他實(shí)施方式，本發(fā)明提供一種包含上述殼聚糖-改性納米載體的生體內(nèi)腫瘤或癌的成像用組合物。根據(jù)本發(fā)明的其他實(shí)施方式，本發(fā)明提供一種包括如下步驟的對(duì)象(subject)的生體內(nèi)腫瘤或癌的成像用組合物步驟(a)，按包含遞送對(duì)象的物質(zhì)的上述殼聚糖-改性納米載體的診斷學(xué)有效劑量向上述對(duì)象(subject)給藥；以及步驟(b)，掃描上述對(duì)象來獲取可視(visible)圖像。根據(jù)本發(fā)明的其他實(shí)施方式，本發(fā)明提供一種包含上述殼聚糖-改性納米載體的癌癥光熱治療用組合物。根據(jù)本發(fā)明的其他實(shí)施方式，本發(fā)明提供一種包括按包含遞送對(duì)象的物質(zhì)的上述殼聚糖-改性納米載體的治療學(xué)有效劑量向?qū)ο?subject)給藥的步驟的癌癥的光熱治療方法。本發(fā)明的組合物包含上述殼聚糖-改性納米載體作為有效成分，因而其之間的共同內(nèi)容將省略其詳細(xì)說明，以避免反復(fù)說明引起本說明書變得過于復(fù)雜。如以下實(shí)施例所證明，與未結(jié)合有殼聚糖的納米載體相比，本發(fā)明的殼聚糖-改性納米載體表現(xiàn)出非常優(yōu)異的皮膚滲透性。并且，與未結(jié)合有殼聚糖的納米載體相比，本發(fā)明的殼聚糖-改性納米載體的腫瘤細(xì)胞或癌細(xì)胞攝取率非常大，這種特性表明，本發(fā)明的殼聚糖-改性納米載體能夠用作生體(invivo)腫瘤或癌的成像用組合物以及癌癥光熱治療用組合物。本發(fā)明的經(jīng)皮給藥用組合物基本為藥劑學(xué)組合物，還包含藥劑學(xué)上允許的載體。通過本發(fā)明的經(jīng)皮給藥用組合物所利用的殼聚糖改性納米載體遞送的物質(zhì)不受特別限制，優(yōu)選為能夠在皮膚或頭皮發(fā)揮功效的皺紋改善劑、保濕劑、粉刺治療劑、老年斑消除劑、皮膚彈力改善劑、毛發(fā)生長促進(jìn)劑、抗皮膚衰老劑或皮膚表皮干細(xì)胞增殖劑。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施列，在經(jīng)皮給藥用組合物中，納米載體包含高分子量的蛋白質(zhì)、肽、核酸分子、糖類、脂質(zhì)、化合物或無機(jī)物。在本說明書中，術(shù)語“高分子量”表示具有無法穿透皮膚(優(yōu)選為人的皮膚)，，的大小的分子量，優(yōu)選地，高分子量是指具有500Da以上的分子量的物質(zhì)。一般眾所周知，具有500Da以下的分子量的物質(zhì)能夠穿透皮膚(BosJD,etal,.Exp.Dermatol9165-169(2000))ο如上所述，本發(fā)明的納米載體的皮膚滲透性大幅提高，因而能夠封裝被判斷為不能穿透皮膚的高分子量的物質(zhì)(例如，蛋白質(zhì)藥物)來實(shí)現(xiàn)經(jīng)皮傳遞。本發(fā)明的藥劑學(xué)組合物所包含的藥劑學(xué)上允許的載體通常用于制劑，其包含乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯橡膠、磷酸鈣、藻酸鹽、動(dòng)物膠、硅酸鈣、微細(xì)結(jié)晶性纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、水、糖漿、甲基纖維素、羥苯甲酯、羥苯丙酯、滑石、硬脂酸鎂以及礦物油等，但不局限于此。本發(fā)明的藥劑學(xué)組合物除了上述成分之外，還包含潤滑劑、濕潤劑、甘味劑、香味劑、乳化劑、懸浮劑、保存劑等。適合的藥劑學(xué)上允許的載體以及制劑已在Remington，sPharmaceuticalSciences(19thed.，1995)中詳細(xì)記載。本發(fā)明的經(jīng)皮給藥用藥劑學(xué)組合物以經(jīng)皮給藥方式給藥。本發(fā)明的藥劑學(xué)組合物的適宜給藥量根據(jù)制劑化方法、給藥方式、患者的年齡、體重、性另I」、病狀、飲食、給藥時(shí)間、給藥途徑、排泄速度以及反應(yīng)過敏性等因素而各不相同，一般而言，技術(shù)嫻熟的醫(yī)生能夠就所希望的治療或預(yù)防有效的給藥量輕松進(jìn)行決定并下處方。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施列，本發(fā)明的藥劑學(xué)組合物的每日給藥量為0.001-100mg/kg。本發(fā)明的藥劑學(xué)組合物通過按照本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員能夠容易實(shí)施的方法來利用藥劑學(xué)上允許的載體和/或賦形劑來進(jìn)行制劑化，從而制備成單位劑量形態(tài)或者封裝到多容量容器內(nèi)來進(jìn)行制備。此時(shí)，劑型可以是油或水性介質(zhì)中的溶液、懸濁液或乳化液形態(tài)或者浸膏劑、粉末劑、顆粒劑、片劑或膠囊劑形態(tài)，還包含分散劑或穩(wěn)定劑。本發(fā)明的經(jīng)皮給藥用藥劑學(xué)組合物使遞送對(duì)象的物質(zhì)與各種對(duì)象(優(yōu)選為哺乳動(dòng)物，最優(yōu)選為人類)的皮膚接觸來經(jīng)皮遞送。本發(fā)明的癌癥光熱治療用組合物利用的是本發(fā)明的殼聚糖-改性納米載體的腫瘤細(xì)胞或癌細(xì)胞攝取率非常高的特性。在本發(fā)明的癌癥光熱治療用組合物中，能夠利用的藥劑學(xué)上允許的載體以及制劑化方法將通過引用上述經(jīng)皮給藥用組合物中的記載加以了解。本發(fā)明的癌癥光熱治療用組合物所利用的殼聚糖-改性納米載體作為光敏劑(photosensitizer)或放熱物質(zhì)包含適合的物質(zhì)，優(yōu)選為包含金屬粒子。上述金屬粒子例如包含金粒子、硅粒子以及磁性納米粒子(例如，氧化鐵納米粒子、鐵氧體、磁鐵礦或坡莫合金(permalloy))，但不局限于此。優(yōu)選地，本發(fā)明的癌癥光熱治療用組合物通過電磁輻射(electromagneticradiation)來放熱。例如，在利用金粒子的情況下，照射紅外線(infrared)激光而放熱來殺滅腫瘤或癌細(xì)胞。在利用磁性納米粒子的情況下，附加高頻磁場(chǎng)來放熱。優(yōu)選地，本發(fā)明的癌癥光熱治療用組合物以非口服方式給藥。在以非口服方式給藥的情況下，能夠通過靜脈內(nèi)注射、皮下注射、肌肉注射、腹腔注射、腫瘤內(nèi)注射或病變內(nèi)(intralesional)注射等方式進(jìn)行給藥。本發(fā)明的組合物的適宜給藥量可根據(jù)制劑化方法、給藥方式、患者的年齡、體重、性別、病狀、飲食、給藥時(shí)間、給藥途徑、排泄速度以及反應(yīng)過敏性等因素而下各種處方。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施列，本發(fā)明的藥劑學(xué)組合物的每日給藥量為0.001-100mg/kg。本發(fā)明的藥劑學(xué)組合物通過按照本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員能夠容易實(shí)施的方法來利用藥劑學(xué)上允許的載體和/或賦形劑來進(jìn)行制劑化，從而制備成單位劑量形態(tài)或者封裝到多容量容器內(nèi)來進(jìn)行制備。此時(shí)，劑型可以是油或水性介質(zhì)中的溶液、懸濁液或乳化液形態(tài)或者浸膏劑、粉末劑、顆粒劑、片劑或膠囊劑形態(tài)，還包含分散劑或穩(wěn)定劑。本發(fā)明的癌癥光熱治療用組合物能夠有效地靶向殺滅胃癌、肺癌、乳房癌、卵巢癌、肝癌、支氣管癌、鼻竇癌、喉癌、胰臟癌、頭頸癌、膀胱癌、結(jié)腸癌、宮頸癌、腦癌、前列腺癌、骨癌、皮膚癌、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌以及尿管癌等各種癌癥中的癌細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的其他實(shí)施方式，本發(fā)明提供一種包含上述殼聚糖-改性納米載體的生體(invivo)腫瘤或癌的成像用組合物。如以下實(shí)施例所證明，本發(fā)明的殼聚糖-改性納米載體因其腫瘤細(xì)胞或癌細(xì)胞攝取率非常高，而能夠用作生體(invivo)腫瘤或癌的成像劑。在這種情況下，本發(fā)明的殼聚糖-改性納米載體包含適合的顯影劑或成像劑。例如，用光學(xué)熒光進(jìn)行生體(invivo)腫瘤或癌的成像的情況下，將適合的熒光物質(zhì)封裝到殼聚糖-改性納米載體的內(nèi)部或使適合的熒光物質(zhì)與殼聚糖-改性納米載體的表面結(jié)合來進(jìn)行使用。能夠使用的熒光物質(zhì)的例子如上所述。在通過磁共振成像(MRI)方式進(jìn)行生體(invivo)腫瘤或癌的成像的情況下，為了進(jìn)行適合的Tl或T2顯影，在殼聚糖-改性納米載體包含順磁性(paramagnetic)、超順磁性(superparamagnetic)或質(zhì)子密度(protondensity)信號(hào)產(chǎn)生粒子。例如包含Gd(III)、Mn(II)、Cu(II)、Cr(III)、Fe(II)、Fe(III)、Co(II)、Er(II)、Ni(II)、Eu(III)、Dy(III)、純鐵、磁性氧化鐵(例如、磁鐵礦、狗304)、γ-F^O3、鐵酸錳、鐵酸鈷、鐵酸鎳以及全氟碳作為顯影劑。利用本發(fā)明的成像組合物來獲取單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層成像術(shù)(SinglePhotonEmissionComputedTomography,SPECT)或正電子發(fā)身寸斷層成像術(shù)(PositronEmissionTomography,PET)圖像的情況下，本發(fā)明的殼聚糖-改性納米載體包含正電子發(fā)射同位素，例如Hdi4CKi5CKi2Nj3Nj5Fj7Fj8Fj2CL33CL34Cdj4Sd51MrK52MrK52Fh53Fh55廣56廣58廣61廣62廣62v63v64廣65v66廣66廣67廣68廣69廣69a70A70o71cCoλCoλCoλCuλCuλZnλZn、Cu、Zn、Ga、Ge、Ge、Ga、Ge、As、As、Se、Se、71AsJ2AsJ3SeJ4KrJ4BrJ5BrJ6BrJ7BrJ7KrJ8BrJ8RbJ9Rb,79Kr,81Rb,82Rb,84Rb,84Zr,85Y,86Y,87Y、82r、88Y、89Zr、92TC、93TC、94TC、95TC、95RU、95Rh、96Rh、97Rh、98Rh、99Rh、1°°Rh、1°1Ag、1°2Ag、1°2Rh、WAg^lg^sAg^lg、1,!!、1^!!、11、、11、、1"^、11、^115!^、116!^、117!^、117!、11”、11^、119ν119-,119T120-,120v121v121T122T123v124T126T128T129丁130丁131丁132τ133丁Xeλ1、le、1、Xe、Xe、丄、丄、Xe、丄、丄、丄、La、La、La、La、La、135La、136La、14°Sm、141Sm、142Sm、144Gd、145Gd、145EU、146Gd、146Eu、147EU、147Gd、148EU、15°EU、19°AU、191A^192AU、193AU、193Tl、194Tl、194AU、195Tl、196Tl、197Tl、198Tl、2°°Tl、2°°Bi、2°2Bi、2°3Bi、2°5Bi、206Bi或其衍生物。利用本發(fā)明的成像組合物來獲取電子計(jì)算機(jī)X射線斷層(computedtomography,CT)成像的情況下，本發(fā)明的殼聚糖-改性納米載體包含碘粒子或金粒子等CT顯影劑。發(fā)明效果本發(fā)明的特征以及優(yōu)點(diǎn)概括如下(a)與沒有殼聚糖的裸(bare)納米載體相比，本發(fā)明的殼聚糖-改性納米載體的皮膚滲透性改善到驚人的程度，因而作為經(jīng)皮載體發(fā)揮出非常優(yōu)異的功效；(b)本發(fā)明的殼聚糖-改性納米載體的向腫瘤細(xì)胞以及癌細(xì)胞的細(xì)胞攝取率大幅改善，因而能夠非常有效地應(yīng)用于腫瘤細(xì)胞以及癌細(xì)胞的成像以及光熱治療；(c)具有溫度敏感性，且直徑以及孔的大小隨著溫度變化而可逆地發(fā)生變化；(d)根據(jù)本發(fā)明的方法，能夠以一鍋單相方式制備殼聚糖-改性納米載體；(e)能夠在本發(fā)明的納米載體自然封裝藥物；(f)本發(fā)明的納米載體在人體內(nèi)溫度條件下的孔的大小減小，因而能夠用作緩釋性藥物載體；(g)根據(jù)本發(fā)明，能夠解決以往技術(shù)中所存在的問題，例如，利用有害的有機(jī)溶劑，過程復(fù)雜，生產(chǎn)成本高，含有能力低等；(h)由于不需要進(jìn)行在以往技術(shù)中通常利用的高速均勻化過程或超聲波處理過程，因而能夠避免所要含有的藥物的穩(wěn)定性。圖Ia是關(guān)于用于制備本發(fā)明的殼聚糖-改性納米載體的甲基丙烯酸縮水甘油酯化殼低聚糖(glycidylmetaacrylatedchiotooliogosaccharide,GMA-C0S)的制備過程的示意圖Ib是確認(rèn)出圖Ia的GMA-COS的合成的1H-NMR(核磁共振)波譜結(jié)果；圖2是關(guān)于本發(fā)明的殼聚糖-改性納米載體的制備過程的示意圖；圖3是殼聚糖-改性納米載體的大小以及電動(dòng)電勢(shì)的測(cè)定結(jié)果；圖如是皮膚滲透性測(cè)定用斯泰特弗朗茲(StaticFranz)類型擴(kuò)散細(xì)胞的示意圖；圖4b是含有FITC-BSA的殼聚糖-改性納米載體的生體外皮膚滲透性的測(cè)定結(jié)果；圖如是用熒光顯微鏡測(cè)定的含有FITC-BSA的殼聚糖-改性納米載體的皮膚滲透分布結(jié)果；圖4d是含有Cy5.5的殼聚糖-改性納米載體的生體外皮膚滲透性的測(cè)定結(jié)果；圖fe是測(cè)定殼聚糖-改性納米載體針對(duì)SCC7細(xì)胞株的生體外細(xì)胞攝取的流式細(xì)胞術(shù)(FlowCytometry)結(jié)果；圖恥是在移植了SCC7細(xì)胞的腫瘤小鼠模型中顯示出殼聚糖-改性納米載體(含有Cy5.5)的實(shí)時(shí)腫瘤靶向的生體內(nèi)OTR熒光圖像；圖5c是關(guān)于殼聚糖-改性納米載體(含有Cy5.5)的生體內(nèi)腫瘤靶向的定量結(jié)果以及速度論結(jié)果；圖5d是對(duì)殼聚糖-改性納米載體(含有Cy5.5)的組織分布以及腫瘤蓄積結(jié)果進(jìn)行了定量化的曲線圖；圖k表示用于確認(rèn)殼聚糖-改性納米載體(含有Cy5.5)的組織分布以及腫瘤蓄積的結(jié)果，是器官以及腫瘤的活體外OTR熒光圖像；圖6a是關(guān)于利用于生活成像或生體內(nèi)成像的殼聚糖-改性納米載體的金納米棒的TEM(透射電子顯微鏡)圖像以及OTR光譜規(guī)律；圖6b是對(duì)含有金納米棒的殼聚糖-改性納米載體的穩(wěn)定性進(jìn)行分析的結(jié)果；圖6c是表示金納米棒以及含有金納米棒的殼聚糖-改性納米載體的細(xì)胞攝取的圖像；圖6d是利用含有金納米棒的殼聚糖-改性納米載體進(jìn)行的生體外光熱治療結(jié)果白勺SK象(禾1Jffl41.5W/cm2白勺CWlaser(adiodecontinuous-wavelaser,—1^光器)；圖6e利用含有金納米棒的殼聚糖-改性納米載體進(jìn)行的生體外光熱治療結(jié)果的圖像(利用26.4W/cm2的cwlaser(adiodecontinuous-wavelaser，二極管連續(xù)波激光器)；圖7a是對(duì)金納米棒、納米載體所含有的金納米棒、殼聚糖結(jié)合納米載體所含有的金納米棒所吸收的波長進(jìn)行分析的TEM圖像；圖7b是納米載體以及含有金納米棒的納米載體的大小(直徑)以及電動(dòng)電勢(shì)的測(cè)定結(jié)果；圖8是在PBS(磷酸鹽緩沖液)中測(cè)定的納米載體所含有的金納米棒、殼聚糖結(jié)合納米載體分別從載體內(nèi)部向外漏出的金納米棒值的曲線圖；圖9是將金納米棒、含有金納米棒的納米載體、含有殼聚糖-結(jié)合金納米棒的納米載體注射到細(xì)胞之后用顯微鏡在暗處觀察是否進(jìn)行細(xì)胞攝取的細(xì)胞圖像；圖10為了觀察針對(duì)SCC7癌細(xì)胞(圖a)以及NIH/3T3成纖維細(xì)胞(圖b)的選擇性近紅外線光熱治療效果，而在780nm波長下照射兩種強(qiáng)度的電力密度5以及26.4W/cm2)激光時(shí)用于判斷是否發(fā)生細(xì)胞毒性的圖像；圖11是將金納米棒、含有金納米棒的納米載體、含有殼聚糖-結(jié)合金納米棒的納米載體注射到靜脈內(nèi)來用于觀察是否吸收到腫瘤細(xì)胞以及肝細(xì)胞的銀染色法照片；圖1是表示將金納米棒、含有金納米棒的納米載體、含有殼聚糖-結(jié)合金納米棒的納米載體注射到靜脈內(nèi)后經(jīng)過M小時(shí)之后照射近紅外線激光時(shí)發(fā)生的腫瘤大小變化的曲線圖；圖12b是表示將金納米棒、含有金納米棒的納米載體、含有殼聚糖-結(jié)合金納米棒的納米載體注射到靜脈內(nèi)后經(jīng)過M小時(shí)之后照射近紅外線激光時(shí)發(fā)生的腫瘤大小變化的小鼠腫瘤照片；圖12c是表示將金納米棒、含有金納米棒的納米載體、含有殼聚糖-結(jié)合金納米棒的納米載體注射到靜脈內(nèi)后經(jīng)過M小時(shí)、48小時(shí)之后照射一次到兩次近紅外線激光時(shí)發(fā)生的腫瘤大小變化的曲線圖；圖12d是表示將金納米棒、含有金納米棒的納米載體、含有殼聚糖-結(jié)合金納米棒的納米載體注射到靜脈內(nèi)后經(jīng)過M小時(shí)、48小時(shí)之后照射一次到兩次近紅外線激光時(shí)發(fā)生的腫瘤大小變化的小鼠腫瘤照片；圖13是以靜脈注射方式分別將嵌段共聚物納米載體以及殼聚糖-結(jié)合嵌段共聚物納米載體注射到裸鼠之后72小時(shí)內(nèi)蓄積在腫瘤細(xì)胞的量的對(duì)比照片(A是整個(gè)小鼠體的圖像，B是腫瘤部位的放大圖像)；圖14是嵌段共聚物納米載體以及納米載體內(nèi)含有金納米棒的制備方法的圖表；圖15是分別對(duì)癌細(xì)胞以及成纖維細(xì)胞改變金納米棒的濃度來將金納米棒、含有金納米棒的納米載體、含有殼聚糖-結(jié)合金納米棒的納米載體注射到細(xì)胞內(nèi)時(shí)判斷出細(xì)胞生存率之差的曲線圖；圖16是表示培養(yǎng)2小時(shí)、12小時(shí)及M小時(shí)后被SCC7癌細(xì)胞(a)以及NIH/3T3成纖維細(xì)胞(b)吸收的納米載體量的曲線圖。具體實(shí)施例方式下面，將通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的說明。但這些實(shí)施例只用以更具體地說明本發(fā)明，根據(jù)本發(fā)明的主旨，本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的范圍并不局限于這些實(shí)施例。實(shí)施例實(shí)施例1:GMA-chiotooligosaccharide(GMA-COS)的制備根據(jù)圖Ia所述的方法，利用殼低聚糖以及甲基丙烯酸縮水甘油酯來制備甲基丙煉酸縮水甘油酉旨化殼低聚糖(glycidylmetaacrylatedchiotooliogosaccharideGMA-C0S)。圖Ib是關(guān)于最終制備而成的GMA-COS的IH-核磁共振波譜法(JNM-LA30WBFT-NMR光譜儀，日本電子株式會(huì)社，日本)分析結(jié)果，由此可知，GMA-COS已成功制備出。實(shí)施例2殼聚糖-改性納米載體的制備根據(jù)由本發(fā)明者在從前曾報(bào)告的方法(32、33)，使二丙烯酸酯化嵌段共聚物(DA-Pluronic)以及丙烯酸酯化殼聚糖進(jìn)行光聚合，制備出嵌段共聚物納米載體(nanocarrier,NC)的裸(bare)型(NC(PF68))以及殼聚糖-改性型(Chito-NC(PF68))。簡(jiǎn)要說明的話，就裸(bare)型而言，將二丙烯酸酯化嵌段共聚物溶液(0.5wt%)的稀釋的水溶液(2mL)與光引發(fā)劑溫和混合，并利用蒽彼得(詞)紫外線燈(VL-4.LC，8W，韋伯路馬特(VILBERL0URMAT)公司，法國)在1.3mff/cm2的強(qiáng)度下UV-照射15分鐘。就殼聚糖-改性型而言，將水溶性甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)-結(jié)合殼聚糖(2.8mg，0.2ymol)溶解于去離子水，并添加到DA-嵌段共聚物溶液來制備0.5wt%的DA-嵌段共聚物。在與利用于上述裸(bare)型的條件相同的條件下使上述混合物光聚合來使GMA-結(jié)合殼聚糖的乙烯基結(jié)合在交聯(lián)納米載體內(nèi)。為了去除未反應(yīng)物質(zhì)，利用透析袋[纖維素酯(celluloseester)，300kDa的截留分子量(MWCO)]對(duì)整體溶液進(jìn)行透析，第一次是在0.IM的NaCl中進(jìn)行透析，接著在去離子水中進(jìn)行透析。之后，利用安裝有激光二極管光源(638nm)以及光電倍增管檢測(cè)器(165°散射角)的電泳光散射測(cè)定器(ELS-Z2，大冢電子株式會(huì)社，日本)來分析納米載體的大小以及表面電荷。就殼聚糖-改性型而言，殼聚糖結(jié)合量為16wt%，這是利用茚三酮(Ninhydrin)分析測(cè)定的值。實(shí)施例3殼聚糖-改性納米載體的經(jīng)皮滲透性的分析(利用FITC-BSA)利用在上述實(shí)施例中制備的殼聚糖-改性納米載體來填充作為模型蛋白質(zhì)的異硫氰酸焚光素標(biāo)記牛血清白蛋白(Fluoresceinisothiocyanate-labelledbovineserumalbumin=FITC-BSA,西格瑪)。向殼聚糖-改性納米載體溶液添加作為模型蛋白質(zhì)的FITC-BSA，在4°C下放置12小時(shí)，同時(shí)將模型蛋白質(zhì)填充到自發(fā)性地膨脹的納米載體內(nèi)。使用旋轉(zhuǎn)過濾器(spinfilter)在常溫下去除未填充的模型蛋白質(zhì)。殼聚糖-改性納米載體的FITC-BSA封裝效率以及含有量在室溫下以HOOOrpm旋轉(zhuǎn)過濾10分鐘之后根據(jù)如F.Q.Li，etal.，Int.J.Pharm.，2008，349，274所記載的方法進(jìn)行計(jì)算。含有FITC-BSA-的納米載體的經(jīng)皮滲透性利用斯泰特弗朗茲類型擴(kuò)散細(xì)胞來進(jìn)行測(cè)定(參照?qǐng)D4a)。實(shí)驗(yàn)組為，只有FITC-BSA(200ug)、NC(F127)+FITC-BSA、NC(F68)+FITC-BSA、Chito-NC(F127)+FITC-BSA,Chito-NC(F68)+FITC-BSA,只有殼聚糖(chitosan)以及Chito_F127。實(shí)驗(yàn)條件如下給體槽(Donorchamber)在DIWK200yL)內(nèi)1-5組；薄膜(Membrane)表皮和真皮(人類皮膚，M/58，背部或大腿)(源自韓士生科)；受體槽(Receptorchamber):PBS(pH7.4)(5mL)；37°C，600rpm，時(shí)間點(diǎn)(0.5小時(shí)、1小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)、8小時(shí)、12小時(shí)、18小時(shí)和M小時(shí))；取樣(Sampling)在一個(gè)給定時(shí)間500uL。利用熒光分光光度計(jì)來測(cè)定熒光強(qiáng)度，并通過熒光顯微鏡獲取熒光圖像。由圖4b確認(rèn)出，本發(fā)明的殼聚糖-改性納米載體相比未結(jié)合有殼聚糖的納米載體[NC(F127)以及NC(F68)]表現(xiàn)出非常優(yōu)異的皮膚滲透性。雖然，在本發(fā)明的殼聚糖-改性納米載體中，殼聚糖結(jié)合在嵌段聚合物，但與未進(jìn)行光交聯(lián)的Chito-F127相比時(shí)也表現(xiàn)出了非常優(yōu)異的皮膚滲透性。圖4c是將含有FITC-BSA-的殼聚糖-改性納米載體應(yīng)用于人類皮膚而獲取的熒光圖像。在這種情況下也能確認(rèn)出，本發(fā)明的殼聚糖-改性納米載體相比未結(jié)合有殼聚糖的納米載體[NC(F127)以及NC(F68)]表現(xiàn)出非常優(yōu)異的皮膚滲透性。實(shí)施例4殼聚糖-改性納米載體的經(jīng)皮滲透性的分析(利用Cy5.5)按照與實(shí)施例3相似的方法對(duì)結(jié)合有Cy5.5熒光物質(zhì)的納米載體進(jìn)行皮膚滲透性分析。由圖4b確認(rèn)出，本發(fā)明的殼聚糖-改性納米載體相比未結(jié)合有殼聚糖的納米載體[NC(F127)以及NC(F68)]表現(xiàn)出非常優(yōu)異的皮膚滲透性。實(shí)施例5利用殼聚糖-改性納米載體的生體內(nèi)成像對(duì)結(jié)合有Cy5.5熒光物質(zhì)的本發(fā)明的殼聚糖-改性納米載體的生體(invivo,即為生體內(nèi))的成像應(yīng)用性進(jìn)行評(píng)價(jià)。首先，對(duì)鱗狀上皮細(xì)胞癌(squamouscellcarcinoma，SCC7)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)來調(diào)查(invitro，生體外)細(xì)胞攝取。由圖fe確認(rèn)出，殼聚糖-改性納米載體相比裸(bare)納米載體所表現(xiàn)出的細(xì)胞攝取率非常高。如此增強(qiáng)的生體外細(xì)胞攝取與移植了SCC7細(xì)胞的腫瘤小鼠模型中的生體(invivo)腫瘤蓄積密切相關(guān)(圖恥、圖5c及圖5d)，由圖恥可看出，納米載體的時(shí)間-依賴性釋放規(guī)律以及腫瘤蓄積通過實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)近紅外線熒光強(qiáng)度來予以清晰的可視化。就裸(bare)納米載體[NC(F68)以及NC(F127)]而言，注射到腫瘤部位后在16小時(shí)之內(nèi)熒光強(qiáng)度快速減小。但本發(fā)明的殼聚糖-改性納米載體的高熒光強(qiáng)度在腫瘤部位維持72小時(shí)。由注射后第72小時(shí)開始的活體外(exvivo)OTR熒光圖像(圖5d及圖k)確認(rèn)出，組織分布(肝、肺、腎臟、脾臟以及心臟)以及腫瘤蓄積的分析結(jié)果，本發(fā)明的殼聚糖-改性納米載體相比裸(bare)納米載體在腫瘤位置表現(xiàn)出高的熒光強(qiáng)度。這表明，殼聚糖-改性納米載體具有更加延長的血流時(shí)間以及更加增強(qiáng)的腫瘤蓄積能力。實(shí)施例6利用殼聚糖-改性納米載體進(jìn)行的生體外(invitro)細(xì)胞培養(yǎng)中的癌癥光熱治療(photothermalcancertherapy)在上述實(shí)施例5中查明的殼聚糖-改性納米載體的腫瘤細(xì)胞攝取增強(qiáng)能力以及腫瘤組織蓄積能力暗示，殼聚糖-改性納米載體能夠用作光熱癌癥治療劑。下面對(duì)殼聚糖-改性納米載體的癌癥光熱治療功效進(jìn)行調(diào)查。首先，利用種子-介導(dǎo)的生長方法(seed-mediatedgrowthmethod)在水溶性CTAB溶液中合成金納米棒(36)。將HAuC14W.5mM，5mL，小島化學(xué)藥品株式會(huì)社(日本柏原，日本)]添加到CTAB(0.2M，5mL)，接著充分混合來制備金種子。接著，在劇烈攪拌的條件下添加新制備的冰涼的NaBH4(0.01M,600μL，西格瑪奧德里奇集團(tuán)，美國)，來形成呈褐色的黃色溶液。在室溫下保管1-3小時(shí)上述溶液后用作用于合成金納米棒的種子溶液。然后，在劇烈攪拌的條件下將HAuC14(ImM,5mL)添加到CTAB溶液(0.2M，5mL，西格瑪奧德里奇集團(tuán)，美國)來制備生長溶液，將4mM的AgN03(硝酸銀)400μL以及0.0788M的抗壞血酸(西格瑪奧德里奇集團(tuán)，美國)70yL添加到上述溶液，之后溫和混合。在該過程中，混合物(生長溶液)的顏色從黃色變成無色。接著，將12yL種子溶液注入到生長溶液內(nèi)并進(jìn)行劇烈攪拌，接著在37°C、IOOrpm的搖蕩槽放置3小時(shí)。金納米棒溶液呈亮紫色。為了去除過量CTAB，用離心分離器以IlOOOrpm提純金納米棒溶液10分鐘，直到充分提純到最小5倍為止，并使其重新分散在去離子水。最終，利用UV-分光光度計(jì)(安捷倫(Agilent)8453，美國加利福尼亞州圣克拉拉，美國)來測(cè)定金納米棒的紫外可見光線吸收光譜，并利用透射電子顯微鏡(TEMJEM-2100，日本電子板式會(huì)社，日本)來測(cè)定金納米棒的大小以及縱橫比。另一方面，按以下方法制備含有金納米棒的嵌段共聚物納米載體來調(diào)查其特性。為了將金納米棒載入嵌段共聚物納米載體內(nèi)，在粉末狀態(tài)的納米載體(750yg)添加金納米棒溶液(50μg/ΙΟΟμL)，在4°C下培養(yǎng)12小時(shí)以上，誘導(dǎo)金納米棒自發(fā)性地進(jìn)入納米載體內(nèi)。與以往的研究相同，在常溫下以IlOOOrpm速度旋轉(zhuǎn)過濾10分鐘來分離出未載入的金納米棒，并進(jìn)行計(jì)算來測(cè)定膠囊化效率(90%以上)以及在納米載體內(nèi)含有的金納米棒的量G4)。利用UV-分光光度計(jì)來在可見區(qū)域-近紅外線區(qū)域帶中測(cè)定只有金納米棒的吸收光譜以及含有金納米棒的納米載體的吸收光譜。在2%(w/v)磷鎢酸(西格瑪奧德里奇集團(tuán)，美國)溶液中進(jìn)行負(fù)染并利用TEM來測(cè)定金納米棒以及含有金納米棒的納米載體的形態(tài)學(xué)。在37°C的去離子水中利用電泳光散射測(cè)定器(ELS-Z》分析金納米棒以及含有金納米棒的納米載體的粒子直徑以及表面電荷(電動(dòng)電勢(shì))。所有測(cè)定均進(jìn)行三次。金納米棒以及含有金納米棒的納米載體的形態(tài)學(xué)在利用TEM(圖7a的插入物)用磷鎢酸(phosphotungsticacid)進(jìn)行負(fù)染(negativestaining)之后進(jìn)行成像。與納米載體的球形變化無關(guān)，兩種形態(tài)均適當(dāng)?shù)睾薪鸺{米棒。在37°C下，納米載體的粒子直徑(hydrodynamicdiameters)以及表面電荷(電動(dòng)電勢(shì))沒有因含有金納米棒而受到影響。如圖7b所示，納米載體其本身與含有金納米棒的納米載體具有相似的平均大小。在CTAB溶液穩(wěn)定化的金納米棒的電動(dòng)電勢(shì)表現(xiàn)出帶高的正電荷的表面狀態(tài)(+36.5士2.4mV)，相反，含有金納米棒的納米載體帶有與納米載體本身的電動(dòng)電勢(shì)相似的表面電荷，由此確認(rèn)出，能夠有效地在納米載體內(nèi)含有金納米棒。在特定時(shí)間點(diǎn)(timepoint)對(duì)分散在水溶液的金納米棒以及含有金納米棒的納米載體的光學(xué)穩(wěn)定性進(jìn)行調(diào)查(圖7a)。金納米棒本身表現(xiàn)出藍(lán)移(短波長)光譜，但已經(jīng)在以往的研究中提出過金納米棒在水溶相進(jìn)行重構(gòu)(reshaping)(37、38)，由此確認(rèn)出，在水溶相利用金納米棒時(shí)受到限制。相反，在納米載體內(nèi)含有金納米棒的情況下確認(rèn)出，盡管到了第7天，吸收光譜仍未發(fā)生變化，由此因納米載體與金納米棒之間的相互作用而包含在納米載體內(nèi)，并防止金納米棒的不穩(wěn)定的重構(gòu)化(38)。下面對(duì)含有金納米棒的納米載體的生體內(nèi)穩(wěn)定性進(jìn)行分析。為了分析在納米載體內(nèi)含有的金納米棒的光學(xué)穩(wěn)定性，在搖蕩槽中以27°C、100rpm培養(yǎng)一周存在于去離子水(ImL)中的金納米棒(對(duì)照用)以及含有金納米棒的納米載體溶液，在規(guī)定時(shí)間點(diǎn)監(jiān)測(cè)350nm至IOOOnm區(qū)域的UV-Vis(紫外可見光吸收光譜)來進(jìn)行分析。為了確認(rèn)金納米棒是否穩(wěn)定地貯存在納米載體內(nèi)，測(cè)定從納米載體漏出的金納米棒。將含有金納米棒的納米載體溶液(100μL)放入到透析袋(纖維素酯，300kDa的MWC0)。將透析袋浸漬在含有10%胎牛血清(Gibco生物制劑公司，美國紐約州格蘭德島)的5mL的PBS中，并在37°C下以IOOrpm啟動(dòng)搖蕩槽。每到各時(shí)間點(diǎn)就更換一次金納米棒全部排放(release)的培養(yǎng)基，以維持最大的漏槽狀態(tài)。在各時(shí)間點(diǎn)漏出的金納米棒量利用UV-分光溶解度計(jì)進(jìn)行分析，其濃度則用標(biāo)準(zhǔn)校正曲線(calibrationcurve)進(jìn)行測(cè)定。作為對(duì)照組，在設(shè)置相同的透析袋的條件下分析所排放的金納米棒的量。與對(duì)照組中漏出近80%相比，包含在納米載體內(nèi)的金納米棒的漏出量?jī)H為15%左右，這就表明，納米載體能夠在其內(nèi)部有效地捕獲金納米棒(圖8)。下面對(duì)含有金納米棒的納米載體的生體外細(xì)胞毒性進(jìn)行分析。利用鱗狀上皮細(xì)胞癌(squamouscellcarcinoma，SCC7)腫瘤細(xì)胞株以及NIH/3T3(胚胎成纖維細(xì)胞)成纖維細(xì)胞株來對(duì)金納米棒以及含有金納米棒的納米載體的細(xì)胞毒性進(jìn)行分析。兩種細(xì)胞類型均以5XIO4細(xì)胞密度接種到24-孔板，并在37°C條件下培養(yǎng)M小時(shí)。接著，在1-250μg/mL(以金納米棒量為基礎(chǔ))的范圍內(nèi)將金納米棒或含有金納米棒的納米載體(含有6.7wt%的金納米棒)添加到板孔。在37°C下再培養(yǎng)2小時(shí)細(xì)胞。之后，將培養(yǎng)基更換成包含稀釋10倍的WST-I(拜爾迪生物公司，美國山景城，美國)的825μL的新培養(yǎng)基，在37°C條件下再培養(yǎng)2小時(shí)細(xì)胞。利用掃描多孔分光光度計(jì)(FL600，伯騰，美國佛蒙特州，美國)來觀察變色培養(yǎng)基吸收450nm波長的狀況。從以往的研究開始便在SCC7細(xì)胞應(yīng)用了嵌段共聚物納米載體本身的細(xì)胞毒性(3，并使用如向OTH/3T3成纖維細(xì)胞的細(xì)胞毒性一樣的協(xié)議來特定。在SCC7以及NIH/3T3兩種類型中，在金納米棒為高濃度的情況下，細(xì)胞生存率相比含有金鈉米棒的納米載體的生存率非常低。相反，金納米棒的濃度直到100μg/mL(以金納米棒的量為基礎(chǔ))為止，金納米棒以及含有金納米棒的納米載體均沒有對(duì)細(xì)胞的兩種類型的新陳代謝的活性造成任何影響(圖1及圖15b)。在達(dá)到250μg/mL時(shí)，含有金納米棒的納米載體表現(xiàn)出相當(dāng)高的細(xì)胞生存率，由此可以確認(rèn)，納米載體對(duì)細(xì)胞毒性效果造成的影響具有正面意義。對(duì)含有金納米棒的納米載體的生體外細(xì)胞攝取程度進(jìn)行分析。利用胰蛋白酶EDTA(乙二胺四乙酸)(Gibco生物制劑公司，美國紐約州格蘭德島，美國)來提取SSC7或NIH/3T3成纖維細(xì)胞，并在24-孔組織培養(yǎng)板中將5XIO4細(xì)胞接種到涂敷有動(dòng)物膠的玻璃蓋(12mm)上，并在37°C下培養(yǎng)M小時(shí)。玻璃蓋預(yù)先放入于70%乙醇進(jìn)行消毒處理，并暴露于UV下過一宿，為了確保最佳的細(xì)胞生長，而涂敷2%的動(dòng)物膠。在培養(yǎng)基中培養(yǎng)2小時(shí)包含金納米棒或含有金納米棒的納米載體(以金納米棒計(jì)50μ/mL)的細(xì)胞，以進(jìn)行細(xì)胞攝取。培養(yǎng)之后，利用PBS溶液清洗細(xì)胞，并在裝有4%福爾馬林溶液的PBS中固定30分鐘，所固定的細(xì)胞用PBS清洗，之后再用去離子水清洗。利用配有TV透鏡C-0.45攝像頭的暗視野顯微鏡(ECLIPSEL150，尼康，日本東京)來記錄光散射圖像。通過光散射圖像(以金納米棒計(jì)50μ/mL，圖9)來區(qū)分金納米棒的細(xì)胞攝取。通過金納米棒被攝取到納米載體內(nèi)使得金納米棒的細(xì)胞攝取得以大幅提高。與在直接處理金納米棒的情況下未出現(xiàn)任何信號(hào)的情況相比，從細(xì)胞質(zhì)中觀察到了從金納米棒排出的亮斑(spot)，針對(duì)相同的納米載體，與正常成纖維細(xì)胞相比，從腫瘤細(xì)胞觀察到更高的細(xì)胞攝取，由此可確認(rèn)，與正常細(xì)胞相比，向腫瘤細(xì)胞的金納米棒的細(xì)胞攝取更加有效。進(jìn)而，與裸(bare)納米載體相比，在殼聚糖-改性納米載體所表現(xiàn)出的金納米棒的細(xì)胞攝取率更高。并且，使用Cy5.5-標(biāo)記的納米載體特定化的納米載體本身的細(xì)胞攝取在光散射圖像中表現(xiàn)出的相似的結(jié)果(圖16a及圖16b)(33)。正如所料，在各培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，殼聚糖-改性納米載體的細(xì)胞攝取程度相比裸(bare)納米載體的細(xì)胞攝取程度明顯高。下面對(duì)含有金納米棒的納米載體的生體外光熱效應(yīng)進(jìn)行分析。將SCC7或NIH/3T3成纖維細(xì)胞以8XIO4密度接種到24-孔組織培養(yǎng)板，在37°C下幾乎在培養(yǎng)基一整面培養(yǎng)M小時(shí)。接著，將培養(yǎng)基更換成ImL的包含金納米棒或含有金納米棒的納米載體(以金納米棒計(jì)50y/mL)的培養(yǎng)基。培養(yǎng)2小時(shí)之后，為了避免細(xì)胞非特異性地被吸收或去除在培養(yǎng)基殘留的納米物質(zhì)，而用PBS緩沖溶液清洗三次。添加新的培養(yǎng)基之后，利用連續(xù)波鈦寶石激光器(c.a.CWTi-sapphirelaser)(M1RA900，相干公司，美國加利福尼亞州圣克拉拉，美國)將直徑為1.3mm孔-大小以及不同輸出密度(41.5W/cm2及沈.4W/cm2)的780nm激光照射到各個(gè)孔，照射4分鐘。細(xì)胞生存率通過利用吖啶橙(A0，西格瑪奧德里奇集團(tuán)，美國密蘇里州圣路易斯)以及碘化丙啶(PI，西格瑪奧德里奇集團(tuán)，美國密蘇里州圣路易斯)的雙重染色過程進(jìn)行判斷，在這里，在AO中綠色熒光表示活細(xì)胞，在PI中的紅色熒光表示死細(xì)胞。概括地說，向各個(gè)孔添加包含0.67μM的AO以及75μM的PI的培養(yǎng)基lmL，并在37°C下的暗處培養(yǎng)30分鐘。用PBS清洗之后，利用倒立熒光顯微鏡(TE2000-U，尼康，美國紐約州梅爾維爾，美國)將活細(xì)胞以及死細(xì)胞可視化。金納米棒或含有金納米棒的納米載體(5(^8/!^的金納米棒量)與腫瘤細(xì)胞以及成纖維細(xì)胞一同進(jìn)行處理，接著用不同的電力密度4ff/cm2)照射4分鐘波長為780nm的激光。之后，用吖啶橙以及碘化丙啶對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色來了解細(xì)胞生存率。如圖IOa及圖IOb所示1)利用含有金納米棒的納米載體的光熱分解效果相比直接利用金納米棒的情況提高，其結(jié)果，大部分細(xì)胞都沒死；2)含有金納米棒的納米載體相比正常細(xì)胞(ΝΙΗ/3Τ;3)在癌細(xì)胞(SCC7)表現(xiàn)出更佳的光熱效應(yīng)；幻殼聚糖-改性納米載體相比裸(bare)納米載體表現(xiàn)出更強(qiáng)的光熱分解。這些結(jié)果均如所料與細(xì)胞攝取結(jié)果一致，且激光強(qiáng)度越強(qiáng)得到的結(jié)果就越好。實(shí)施例7利用殼聚糖-改性納米載體的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(invivo)中的癌癥光熱治療(photothermalcancertherapy)所有動(dòng)物均從東方生物公司(韓國首爾)購買，并遵照韓國光州科學(xué)技術(shù)院(GIST)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)的方針進(jìn)行處理。為了誘發(fā)實(shí)體瘤，在出生6-7周的無胸腺裸鼠(CAnN.Cg-Foxn)的后胯左右部位的各皮下層注射SCC7細(xì)胞(以IXlO6存在于50μLPBS)。當(dāng)腫瘤長到直徑約為5mm時(shí)，將在85%的生理鹽水(100μL)處于混濁狀態(tài)的金納米棒或含有金納米棒的納米載體(以金納米棒計(jì)的100μg)通過微靜脈注射到靜脈內(nèi)。生理鹽水作為對(duì)照組。首先，為了比較蓄積在肝或腫瘤的納米物質(zhì)，而在靜脈注射(i.V.injection)后經(jīng)過M小時(shí)之后從小鼠取下肝和腫瘤組織。切開腫瘤和肝組織后在4%福爾馬林中固定對(duì)小時(shí)，并嵌入最佳切割溫度(OCT)化合物(Tissue-Teks，日本櫻花醫(yī)療集團(tuán)，日本東京)。為了冷凍切片，在-20°C下冷凍塊兒后切開。接著，利用銀加強(qiáng)試劑盒(西格瑪奧德里奇集團(tuán)，美國密蘇里州圣路易斯)根據(jù)制備人員的指示對(duì)組織切片進(jìn)行10分鐘的染色。利用倒立熒光顯微鏡檢查被染色的組織切片。之后，為了比較實(shí)體瘤的光熱消滅效果，給小鼠(左側(cè)腫瘤不照射激光，作為對(duì)照組，右側(cè)腫瘤照射激光)靜脈(i.v.)注射納米物質(zhì)，經(jīng)過M小時(shí)之后，照射4分鐘近紅外線光(808nm二極管激光器，900mff,在連續(xù)波4W/cm2下5mm光線直徑，動(dòng)力科技，美國阿肯色州亞力山大)。并且，為了后續(xù)實(shí)驗(yàn)，給小鼠靜脈(i.v.)注射后經(jīng)過M小時(shí)及48小時(shí)之后照射4分鐘近紅外線。在規(guī)定的時(shí)間點(diǎn)，用數(shù)字卡尺測(cè)定治療后的腫瘤大小，并用數(shù)碼相機(jī)拍照。所有測(cè)定均進(jìn)行三次。用學(xué)生t分布進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，在所有比較實(shí)驗(yàn)中以ρ<0.05的最小注意量進(jìn)行準(zhǔn)備。最終，為了在生體內(nèi)模型動(dòng)物中將光熱治療效果可視化而用銀進(jìn)行染色。圖11是作為陰性對(duì)照組，從金納米棒樣本或來自用生理鹽水處理的小鼠的腫瘤以及肝的代表區(qū)域的銀染色圖像。含有金納米棒的殼聚糖-改性納米載體在腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出非常高的強(qiáng)度(暗色)，這表示更有效地向腫瘤細(xì)選擇傳遞。相反，直接用金納米棒處理時(shí)，銀-染色圖像在肝表現(xiàn)得最強(qiáng)，這表明金納米棒本身更容易被攝取到肝中。就含有金納米棒的納米載體而言，被腫瘤細(xì)胞攝取有所增加，而被肝細(xì)胞攝取有所減小。但是用殼聚糖-改性納米載體進(jìn)行處理的情況下，在銀染色分析時(shí)，被腫瘤細(xì)胞攝取顯著增強(qiáng)。為了在實(shí)體瘤的光熱消融中分析含有金納米棒的納米載體的治療效果，而向小鼠靜脈內(nèi)注射后經(jīng)過M小時(shí)之后照射4分鐘近紅外線激光(808nm，4W/cm2)(左側(cè)腫瘤未照射激光，作為對(duì)照組，右側(cè)腫瘤照射激光)，如圖1至圖12d所示，含有金納米棒的納米載體表現(xiàn)出腫瘤成長的強(qiáng)效抵制，相反，與鹽分處理的組的結(jié)果相比，直接用金納米棒處理時(shí)在腫瘤消退上未示出統(tǒng)計(jì)性差別。正如所料，與裸(bare)形態(tài)相比，在殼聚糖_改性納米載體表現(xiàn)出顯著的腫瘤生長抑制，1周期間未出現(xiàn)腫瘤體積的增加，照射一次激光之后，觀察到腫瘤體積緩慢增加，這表明，殼聚糖-改性納米載體表現(xiàn)的有效的腫瘤蓄積以及非常有效的光熱效應(yīng)。本發(fā)明人經(jīng)過兩次照射4分鐘近紅外線激光來進(jìn)行追加測(cè)試，以挑戰(zhàn)更有效的癌癥光熱治療，含有金納米棒的納米載體的靜脈內(nèi)注射之后，第一次是經(jīng)過M小時(shí)后及48小時(shí)之后照射激光。第二天再照射一次激光時(shí)，在殼聚糖-改性形態(tài)的情況下得到了腫瘤完全被去除的結(jié)果。在其他實(shí)驗(yàn)組中再次照射時(shí)，腫瘤大小也發(fā)生了若干變化，而在直接應(yīng)用金納米棒的事例中，腫瘤卻沒有受到充分抑制(圖12c及圖12d)，其大小也沒發(fā)生什么變化(沒有統(tǒng)計(jì)性差別)。值得注意的是，殼聚糖-改性形態(tài)(Chito-NC(PF68))(參照?qǐng)D12c的放大照片)的情況下，在光熱治療后的初期到6天內(nèi)，腫瘤被完全去除。以上，對(duì)本發(fā)明的特定部分進(jìn)行了詳細(xì)說明。但對(duì)于本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，應(yīng)當(dāng)了解，具體技術(shù)只作為優(yōu)選的實(shí)施例，并不用以限定本發(fā)明的范圍。由此，本發(fā)明實(shí)際要求保護(hù)的范圍由所附的權(quán)利要求書及其等同替代進(jìn)行定義。參考文獻(xiàn)1.Tong,L.etal.,GoldNanorodsMediateTumorCellDeathbyCompromisingMembraneIntegrity.Adv.Mater.2007，19，3136-3141.2.Huang,X.etal.,CancerCellImagingandPhotothermalTherapyintheNear-InfraredRegionbyUsingGoldNanorods.J.Am.Chem.Soc.2006,128,2115-2120.3.Chen,C.L.etal.,InSituReal-TimeInvestigationofCancerCellPhotothermolysisMediatedbyExcitedGoldNanorodSurfacePlasmons.Biomaterials2010，31，4104-4112.4.vonMaltzahn,G.etal.,SERS-CodedGoldNanorodsasaMultifunctionalPlatformforDenselyMultiplexedNear-InfraredImagingandPhotothermalHeating.Adv.Mater.2009，21，3175—3180.5.Kuo,ff.S.etal.,GoldNanorodsinPhotodynamicTherapy,asHyperthermiaAgents,andinNear-InfraredOpticalImaging.Angew.Chem.Int.Ed.2010,49,2711-2715.6.Gobin,A.M.etal.,Near-InfraredResonantNanoshellsforCombinedOpticalImagingandPhotothermalCancerTherapy.NanoLett.2007,7,1929-1934.7.Hu,K.W.etal.,ANewPhotothermalTherapeuticAgent:Core_FreeNanostructuredAuxAgl-χDendrites.Chem.Eur.J.2008,14,2956-2964.8.Helmchen,F.etal.,Nat.Methods2005，2，932-940.9.Anderson,R.R.；Parrish,J.A.SelectivePhotothermolysis:PreciseMicrosurgerybySelectiveAbsorptionofPulsedRadiation.Science1983,220,524-527.10.Chen，W.R.etal.，；Adams，R.L.；Carubelli,R.；Nordquist，R.Ε.Laser-PhotosensitizerAssistedImmunotherapy:ANovelModalityforCancerTreatment.CancerLett.1997，115，25-30·11.Zharov,V.P.etal.，SynergisticEnhancementofSelectiveNanophotothermolysiswithGoldNanoclusters:PotentialforCancerTherapy.LasersSurg.Med.2005，37，219-226.12.Hirsch,L.R.etal.,Nanoshell-MediatedNear-InfraredThermalTherapyofTumorsunderMagneticResonanceGuidance.Proc.Natl.Acad.Sci.USA2003，100，13549-13554.13.Loo,C.etal.,ImmunotargetedNanoshellsforIntegratedCancerImagingandTherapy.NanoLett.2005，5，709—711.14.Kim,J.etal.，DesignedFabricationofMultifunctionalMagneticGoldNanoshellsandTheirApplicationtoMagneticResonanceImagingandPhotothermalTherapy.Angew.Chem.Int.Ed.2006，45，7754-7758.15.Chen,J.etal.,ImmunoGoldNanocageswithTailoredOpticalPropertiesforTargetedPhotothermalDestructionofCancerCells.NanoLett.2007，7，1318-1322.16.Li,J.L.etal.，Ultra-LowEnergyThresholdforPhotothermalTherapyofCancerUsingTransferrin-ConjugatedGoldNanorods.Adv.Materr.2008，20，3866-3871.17.Sau,T.K.etal.,SeededHighYieldSynthesisofShortAuNanorodsinAqueousSolution.Langmuir2004，20，6414-6420.18.Alkilany,A.M.etal.,CellularUptakeandCytotoxicityofGoldNanorods:MolecularOriginofCytotoxicityandSurfaceEffects.Small2009，5，701-708.19.Chakravarty,P.etal.，ThermalAblationofTumorCellswithAntibody-FunctionalizedSingle-WalledCarbonNanotubes.Proc.Natl.Acad.Sci.U5A2008，105,8697-8702.20.Zhou,W.etal.,ZwitterionicPhosphorylcholineasABetterLigandforGoldNanorodsCellUptakeandSelectivePhotothermalAblationofCancerCells.Chem.Commun.2010，46，1479-1481.21.Huang,H.C.etal.,SimultaneousEnhancementofPhotothermalStabilityandGeneDeliveryEfficacyofGoldNanorodsUsingPolyelectrolytes.ACSNano2009，3，2941-2952.22.Connor,E.E.etal.，GoldNanoparticlesAreTakenUpbyHumanCellsbutDoNotCauseAcuteCytotoxicity.Small2005，1，325-327.23.Huang,X.etal.，GoldNanorods:FromSynthesisandPropertiestoBiologicalandBiomedicalApplications.Adv.Mater.2009，21，4880-4910.24.Takahashi,H.etal.，ModificationofGoldNanorodsUsingPhosphatidylcholinetoReduceCytotoxicity.Langmuir2006，22，2-5.25.Hauck,T.S.etal.，AssessingtheEffectofSurfaceChemistryonGoldNanorodUptake,Toxicity,andGeneExpressioninMammalianCells.Small2008，4，153-159.26.Kim,E.etal.，SynthesisofGoldNanorod-EmbeddedPolymericNanoparticlesbyANanoprecipitationMethodforUseasPhotothermalAgents.Nanotechnology2009，20，365602.27.Niidome,T.etal.,Poly(ethyleneglycol)-ModifiedGoldNanorodsasAPhotothermalNanodeviceforHyperthermia.J.Biomater.Sci.Polym.Ed.2009，20，1203-1215.28.Huang，Y.F.etal.，SelectivePhotothermalTherapyforMixedCancerCellsUsingAptamer-ConjugatedNanorods.Langmuir2008，24，11860—11865.29.Huff,T.B.etal.，HyperthermicEffectsofGoldNanorodsonTumorCells.Nanomed.2007，2，125-132.30.Li,Z.etal.,RGD-ConjugatedDendrimer-ModifiedGoldNanorodsforInVivoTumorTargetingandPhotothermalTherapy.Mol.Pharm.2010,7,94-104.31.Dickerson,E.B.etal.,GoldNanorodAssistedNear-InfraredPlasmonicPhotothermalTherapy(PPTT)ofSquamousCellCarcinomainMice.CancerLett.2008,269,57-66.32.Choi,W.1.etal.,OnePot，SinglePhaseSynthesisofThermo-SensitiveNano-CarriersbyPhoto-CrosslinkingofADiacrylatedPluronic.J.Mater.Chem.2008，18，2769-2774.33.Kim,J.-Y.etal.，In-VivoTumorTargetingofPluronic-BasedNano-Carriers.J.Contol.Release2010，147，109-117.34.Jain,P.K.etal.,CalculatedAbsorptionandScatteringPropertiesofGoldNanoparticlesofDifferentSize,Shape，andComposition-ApplicationsinBiologicalImagingandBiomedicine.J.Phys.Chem.B.2006，110，7238-7248.35.Kumar,S.etal.，PlasmonicNanosensorsforImagingIntracellularBiomarkersinLiveCells.NanoLett·2007，7，1338-1343.36.Nikoobakht,B.etal.，PreparationandGrowthMechanismofGoldNanorods(NRs)UsingSeed-MediatedGrowthMethod.Chem.Mater.2003,15,1957-1962.37.Iqbal，M.；Tae,G.UnstableReshapingofGoldNanorodsPreparedbyAWetChemicalMethodinthePres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殼聚糖-改性納米載體的直徑隨著溫度變化而變化，與未結(jié)合有殼聚糖的裸納米載體相比，表現(xiàn)出皮膚滲透性或細(xì)胞攝取率以及向癌組織的選擇傳遞性增加，且有利于光熱治療的特性。與沒有殼聚糖的裸納米載體相比，本發(fā)明的殼聚糖-改性納米載體的皮膚滲透性改善到驚人的程度，因而作為經(jīng)皮載體發(fā)揮出非常優(yōu)異的功效，本發(fā)明的殼聚糖-改性納米載體的向腫瘤細(xì)胞以及癌細(xì)胞的細(xì)胞攝取率大幅改善，因而能夠非常有效地應(yīng)用于腫瘤細(xì)胞以及癌細(xì)胞的成像以及光熱治療。文檔編號(hào)A61K9/48GK102573923SQ201180002457公開日2012年7月11日申請(qǐng)日期2011年1月21日優(yōu)先權(quán)日2010年1月21日發(fā)明者太琪戎,崔源日,李宗炫,金慈永,金泳夏申請(qǐng)人:光州科學(xué)技術(shù)院