專利名稱：改善細(xì)胞對(duì)雜質(zhì)粒子滲透性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及改善細(xì)胞對(duì)雜質(zhì)離子滲透性的組合物和方法，所述雜質(zhì)離子包括本發(fā)明的探針。
技術(shù)背景
細(xì)胞是活的生物體的基本單位。幾乎所有細(xì)胞的 一個(gè) 共有的特征是他們都^皮細(xì)胞質(zhì)膜所環(huán)繞(或約束)。細(xì)胞膜包裹 細(xì)胞內(nèi)含物并調(diào)節(jié)物質(zhì)運(yùn)動(dòng)進(jìn)出細(xì)胞。只有能夠擴(kuò)散穿過(guò)細(xì)胞膜 或萍皮運(yùn)輸穿過(guò)細(xì)胞膜的分子肯以移動(dòng)進(jìn)出細(xì)月包。有些可以穿過(guò)脂 質(zhì)中心，有些必須乂人空中穿過(guò)。還有一些其它的分子，必須以一 種能量依賴的形式與載體相附著才能穿過(guò)細(xì)胞膜。同樣，細(xì)力包核 和其它細(xì)胞器官也具有膜結(jié)構(gòu)來(lái)調(diào)節(jié)分子流動(dòng)進(jìn)入或流出細(xì)月包 器官。
固定是一種化學(xué)過(guò)程，能夠在一種位置"放置"細(xì)胞 分子，從而可以研究細(xì)胞或組織。大多數(shù)用作固定劑的試劑(例 如，醇和醛，其中醇例如乙醇，醛例如多聚曱醛)是通過(guò)與細(xì)胞 分子，尤其是蛋白質(zhì)相交聯(lián)而起作用的。這些交聯(lián)過(guò)程防止胞內(nèi) 結(jié)構(gòu)的降解。許多固定劑非常適于通過(guò)不同的識(shí)別方法來(lái)保護(hù)不 同的胞內(nèi)分子和結(jié)構(gòu)物。以任意目的被選擇的這些固定劑可以通 過(guò)這些目的的特點(diǎn)所決定。
不幸的是，目前的固定方法經(jīng)常會(huì)妨礙隨后研究員或 者醫(yī)生進(jìn)4亍的細(xì)月包內(nèi)成分4企測(cè)。才奐句話說(shuō)，能夠預(yù)防細(xì)月包降解和 固定的方法同才羊可以妨石尋i午多依賴于大尺寸4企測(cè)分子的不同類 型的研究和診斷。據(jù)此，人們進(jìn)行了很多努力來(lái)滲透細(xì)胞或在固 定后制造渠道。
目前使用的在固定之后滲透細(xì)胞膜的方法并不是對(duì) 所有樣本都是有效的，且十分嚴(yán)格(因此，破壞被研究的結(jié)構(gòu)) 和/或需要昂貴的儀器。例如，Hoffman等(美國(guó)專利第6,835,393 號(hào))7>開(kāi)了聚羧酸聚合物的應(yīng)用和只用在無(wú)固定的才羊品中的用 于破壞細(xì)胞膜的pH值。Connelly等人(美國(guó)專利第5,597,688和 5,422,277號(hào))公開(kāi)了帶有2,4 - 二硝基苯磺酸，2,4 - 二硝基安 息香酸或2，4- 二硝基苯的組合物在細(xì)胞膜固定和滲透方面的應(yīng) 用，但是這些組合物限制研究員或醫(yī)生選擇固定劑，且因此，限 制必需的實(shí)驗(yàn)靈活性。機(jī)械性方法，例如超聲波降解法、電穿孔 等等通常只對(duì)未固定的樣品起作用且需要昂貴的儀器。
另外，現(xiàn)有技術(shù)中對(duì)許多胞內(nèi)靶分子，例如病原體來(lái) 講可利用的研究和i貪斷方法依賴于顯微4竟評(píng)1"介、細(xì)爿包形態(tài)學(xué)參 數(shù)、染色性質(zhì)和確定的法分子的存在和缺失。但是，這些診斷方 法中有許多并不完全準(zhǔn)確或不足夠靈敏。
目前最需要的是能夠改進(jìn)樣品細(xì)月包"莫對(duì)雜質(zhì)4立子;參 透性的組合物和方法，所述雜質(zhì)4立子例如帶標(biāo)記的4全測(cè)分子。另 外，還需要的是能夠改進(jìn)胞內(nèi)靶分子和病原體的檢測(cè)的組合物和 方法。發(fā)明內(nèi)容
在一個(gè)實(shí)施方案中，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體內(nèi)雜交能夠直接將靶分子或靶分子片斷從細(xì)胞中檢測(cè)出來(lái)，其中所述細(xì)胞來(lái)自細(xì)胞培養(yǎng)基或來(lái)自從病人身上獲得的樣品。在一種優(yōu)選i也實(shí)施方案中，所述細(xì)月包是病原體。該方法由幾個(gè)步驟組成，這些步驟4尤選^E不必須地按照所列出的順序進(jìn)行。將培養(yǎng)基或樣本中的樣品沉淀到玻璃4反上。將樣品在JE皮璃;f反上用加熱或者用固定劑固定。所述固定劑可以是，例4口，曱醇、甲醇乙酸、丙酮、甲醛或福爾馬林。用IDF溶液處理固定樣品(參見(jiàn)上下文)，并對(duì)才羊品進(jìn)4亍染色或用探針檢測(cè)并觀察。作為選擇，將樣本與IDF溶液相混合、培養(yǎng)，然后涂4未或放置在玻璃^反上，風(fēng)干并固定。IDF溶液可以由以下試劑的任意混和物組成離液鹽(例如，好u^C鹽酸胍或氬氯化物)、離子型去污劑(例如十二烷基磺酸鈉)和/或非離子型去污劑(例如，IPGEL、脫氧膽酸、膽酸或膽汁鹽類)或其他具有相似性質(zhì)的試劑、曱醇和乙酸。各種試劑在IDF溶液中的濃度依賴于例如被檢測(cè)的病原體的細(xì)胞壁。盡管本發(fā)明不受任何理^侖或機(jī)制的限制，但是應(yīng)該相信，IDF溶液能夠在病原體的細(xì)胞壁和/或膜(細(xì)胞膜或核膜)上制造"渠道"。這些渠道允許探針滲透細(xì)胞壁和細(xì)胞膜并進(jìn)入病原體原生質(zhì)和/或細(xì)胞核。本發(fā)明的探4十可以包括DNA、 RNA、 PNA、肽、糖肽、脂肽或醣脂類，或上述物質(zhì)的任意混和物。樣品中被固定的細(xì)胞的耙分子與探針復(fù)合物(所述探針復(fù)合物包括對(duì)靶分子有特異性的結(jié)合試劑)相4妄觸，所述探針復(fù)合物在適于雜交或結(jié)合的情況下對(duì)靶分子具有特異性(例如，如Shah和Harris在美國(guó)專利第6,165,723中描述的那樣，該專利通過(guò)引證在此全部并入本文)。然后，乂人樣品中洗 掉未雜交的或未結(jié)合的探針。在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)被洗滌的樣品用適當(dāng)?shù)膹?fù)染色劑(例如，伊文思藍(lán)、DAPI、高錳酸鉀等等)染色。通過(guò)例如顯微鏡，視覺(jué)4全測(cè)雜交的活結(jié)合的#:針復(fù)合物，探針復(fù)合物的存在是細(xì)胞靶分子存在的一種信號(hào)。該方法可以在不同的雜交緩沖液中進(jìn)行，Shah和Harris在美國(guó)專利第 6， 165,723號(hào)中公開(kāi)了本發(fā)明的 一些非限制性實(shí)施例，該專利通過(guò) 引證在此全部并入本文。使用的雜交緩沖液由使用的纟笨針性質(zhì)決 定。本發(fā)明的方法對(duì)于檢測(cè)細(xì)胞、細(xì)胞要素是有效的，且優(yōu)選地 對(duì)檢測(cè)樣本的病原體也是有效的。例如，這里7>開(kāi)了非限制性的 特異性探針復(fù)合物，所述復(fù)合物可有效用于;f全測(cè)分歧桿菌類病原 體。
本發(fā)明的方法在例如檢測(cè)來(lái)自多種樣本的核酸、肽、 醣肽、脂肽和醣脂是有效的。作為例子的樣本包括，例如，細(xì)胞、 細(xì)月包型、組織或重要的病原或病原體，包括，或者書(shū)f生自例如血 清、原生質(zhì)、唾液、尿、腦脊骨逸液、組織和乳液。本發(fā)明的《且合 物和方法可以在來(lái)自任意生物的任何樣本中 <吏用，所述生物包括-<旦不<又限于哺乳動(dòng)物、爬4亍動(dòng)物、魚(yú)、鳥(niǎo)、才直物禾口昆蟲(chóng)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種用于增加細(xì);l包壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞器官膜和核力莫滲透性的組合物(IDF溶液)， 所述組合物在一個(gè)實(shí)施方案中包括GuSCN (石克氰酸胍)、Tris-HC1、乙二胺二乙酸、IGEPAL (辛基苯氧基聚(乙氧基)乙醇)、 醋酸、曱醇、膽酸鈉和脫氧膽酸鈉。本發(fā)明進(jìn)一步預(yù)計(jì)硫氰酸胍 的濃度是大約2.0到3.3M;Tris-HCl的濃度大約是10到100 mM; Tris-HCl的pH值大約是7.0-9.0;乙二胺二乙酸的濃度大約是5 到50 mM; IGEPAL的濃度大約是百分之0.1到2.0;醋酸的;農(nóng)度 大約是百分之0.1到10.0;曱醇的濃度大約是百分之20到50; 膽酸鈉的濃度大約是百分之0.02到2.5，脫氧膽酸鈉的濃度大約 是百分之0.02到2.5。
在其他實(shí)施方案中，石克氰酸胍》爰沖滴j皮濃度為大約 2M到6M的鹽酸胍所取代。在另一個(gè)實(shí)施方案中，IGEPAL #皮濃度為0.01% - 2.0%的十二烷基磺酸鈉所取代。在依舊另一個(gè)實(shí)施 方案中，硫氰酸胍與鹽酸胍結(jié)合使用和/或IGEPAL與十二烷基磺 酸鈉結(jié)合4吏用。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種用于給細(xì)胞中 靶分子染色的方法，該方法包括a)將細(xì)胞與包括GuSCN (硫 氰酸胍)、Tris-HC1、乙二胺二乙酸、IGEPAL (辛基苯氧基聚(乙 氧基)乙醇)、醋酸、曱醇和脫氧膽酸鈉的組合物相4妻觸從而產(chǎn) 生一種具有通透性的細(xì)胞；b)將步驟a)所得的具有通透性的細(xì) 胞與一種能夠與所述靶分子特異性結(jié)合的結(jié)合試劑相接觸，和c) 才全測(cè)步驟b)所述的結(jié)合試劑。
在其他方面，本申請(qǐng)預(yù)期上述方法的靶分子選自由， 例如核酸、肽核酸、肽、糖蛋白、脂類、脂蛋白、病毒、朊病毒 和支原體所《且成的《且中。
在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明預(yù)期結(jié)合試劑選自由核 酸、肽核酸、肽、脂蛋白、糖蛋白、抗體或抗體片斷和脂類所組成的ia中。
本發(fā)明的結(jié)合試劑可以另外包括一種檢測(cè)基團(tuán)，此枱r 測(cè)基團(tuán)可以選自由例如熒光標(biāo)記、放射性標(biāo)記、染料、膠態(tài)金屬、 生物素/抗生素蛋白、山葵、過(guò)氧化物酶等等所組成的組中。在一 種有選的實(shí)施方案中，檢測(cè)是通過(guò)一種標(biāo)記的抗體，該抗體對(duì)耙 分子抗原具有親和性。 一種包括^r測(cè)基團(tuán)的結(jié)合試劑在這里^皮定 義為探針復(fù)合物。
在一個(gè)實(shí)施方案中，在試管中用IDF溶液處理臨床樣 品，隨后煮沸從而在溶液中釋放核酸。這一技術(shù)對(duì)于耙分子，例 如分歧桿菌、真菌和酵母是有效的，其中所述酵母需要利用例如機(jī)械水解(例如，通過(guò)超生作用)或與酶長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)的方法來(lái)消化細(xì)胞壁。重要的革巴分子可以進(jìn)一步#1以下步驟純化(1 )才示準(zhǔn) DNA純化技術(shù)或(2 )使用特異性探針進(jìn)行三明治雜交技術(shù)。然 后如果需要的話，在檢測(cè)之間可以分別通過(guò)PCR或RT-PCR才支術(shù) 擴(kuò)增純化的靶分子DNA和RNA。
在一種更為優(yōu)選的實(shí)施方案中，革巴分子是來(lái)自肺結(jié)核 分歧桿菌樣支生物的核酸，且結(jié)合試劑是 一 種與來(lái)自肺結(jié)核分Jt支4干 菌微生物的核酸互補(bǔ)的寡聚核苦酸(或PNA探針)。
在另一個(gè)方面，該方法還包括背景染色/人而更高的加 亮或顯現(xiàn)檢測(cè)基團(tuán)。背景染色和染色技術(shù)對(duì)于本領(lǐng)域普通4支術(shù)人 員來(lái)講是已知的。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明基于一種發(fā)現(xiàn)，此發(fā)現(xiàn)是一種改進(jìn)的方法，此 方法通過(guò)體內(nèi)雜交的方式能夠使探針滲透進(jìn)細(xì)胞(例如一種病原 體)的細(xì)胞壁和/或細(xì)胞膜，從而4企測(cè)來(lái)自培養(yǎng)基或個(gè)體(例如， 血涂片、活組織檢查切片、石蠟包裹的組織和)樣本的細(xì)胞中輩巴 分子核酸、蛋白質(zhì)、肽、脂肽、醣肽、脂質(zhì)體等等的存在。本發(fā)原體可以在例如，唾液、全血、中樞脊髓液(CSF)、其他體液或 受感染的組織中發(fā)現(xiàn)。更具體的，這里描述了對(duì)于傳統(tǒng)的固定/ 預(yù)處理方法的新型改進(jìn)，這種改進(jìn)允許探針(例如，寡居核苷探 4十)滲透進(jìn)入細(xì)月包(例》0，病原菌，比3口，細(xì)菌、病毒、真菌、 酵母和原生動(dòng)物)，這些可以^立于^皮感染的宿主細(xì)月包的內(nèi)側(cè)或外 側(cè)。另外，在與熒光標(biāo)記的探針進(jìn)行雜交之后進(jìn)行一種具有復(fù)染 劑(例如，DAPI、伊文斯藍(lán)、高錳酸鉀)的過(guò)程，從而允許帶 有雜交探針的生物體在培養(yǎng)基或臨床樣品中更加容易觀察到。
這里描述的新穎獨(dú)特的體內(nèi)雜交預(yù)處理過(guò)禾呈、4全測(cè)技 術(shù)和本發(fā)明組合物允許在細(xì)胞、孩i生物或組織部分中4吏用重組 DNA、 RNA、 PNA、肽、醣蛋白、月旨類和醣脂作為4罙4十，且與細(xì) 菌學(xué)、寄生蟲(chóng)學(xué)、組織學(xué)和病理學(xué)實(shí)—驗(yàn)中常用的顯賴U竟才企查方法 相匹配。本發(fā)明對(duì)樣品細(xì)胞(或組織)使用了經(jīng)過(guò)預(yù)處理的核苷 序列的核酸探針，并通過(guò)例如顯微鏡、電子顯微鏡、流式細(xì)J包計(jì) 數(shù)或放射成像(例如，X-射線成像、磷成像)的方法檢測(cè)樣品， 從而確定哪些細(xì)萬(wàn)包(或組織)含有重要的特異性革巴分子(例3口才亥 酸序列)。因此，在感染的全血涂片或組織切片中，病原-微生物 例力口細(xì)菌、病毒、原生動(dòng)物或真菌可以在凈皮感染的細(xì)月包之內(nèi)斥企測(cè) 出來(lái)。這種方法提供了游泳的診斷和科學(xué)信息，因?yàn)樘禺愋院怂?的存在或缺失與 一 種或 一 種以上的可觀察到的結(jié)構(gòu)和形態(tài)學(xué)有 關(guān)，且在這種情況下，提供了臨床診斷和預(yù)后。
用于乂人標(biāo)本中直4妻發(fā)現(xiàn)輩巴分子核酸片卓殳的方法有以下 步驟組成，優(yōu)選的，這些步驟4姿照所列順序進(jìn)4于。首先將乂人個(gè)體 處獲得的樣品;故置在載玻片上。用固定劑(例如，曱醇、曱醇-乙酸固定劑或者福爾馬林醋酸固定液)將樣品固定在載玻片上。 一旦樣品被固定，用本發(fā)明的組合物和方法滲透樣品細(xì)胞。估支為 選擇，在試管中將樣品與IDF溶液混合，培養(yǎng)然后放置在載^:片 上，風(fēng)干并固定。然后，在適于雜交的條件下用對(duì)靶分子有特異 性的探針接觸細(xì)胞。
在雜交足夠時(shí)間之后，從樣本中洗去所有未雜交的探 針。在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，隨后將樣品與一種復(fù)染色劑(例 如，伊文思藍(lán)、高錳酸鉀等等)相接觸。無(wú)論樣品是否被復(fù)染色 了，則與樣品靶分子雜交探針可以通過(guò)例如顯微鏡檢查法進(jìn)行視覺(jué)才企測(cè)。在樣本中#:針的存在是靶分子片#殳存在的一種表現(xiàn)。與本發(fā)明原位雜交試同時(shí)或者順序進(jìn)行的復(fù)染色樣品能夠清除的確定樣品中靶分子的位置，乂人而^是高本發(fā)明方法。這種4言息有 助于更清楚的確定基質(zhì)雜交作用。
本方法適用于從個(gè)體獲得的任何樣品。這包括zf旦不4又 限于，全血、血清、血漿、痰液、尿、母乳、大腦脊髓液和組織。 本方法還適合于纟果測(cè)昆蟲(chóng)質(zhì)粒、昆蟲(chóng)細(xì)胞、才直物細(xì)月包、真菌和細(xì) 菌細(xì)胞內(nèi)的病原體或者其他靶分子。
固定細(xì)胞或者組織的目的是將細(xì)月包固定并^f呆持細(xì)i包或 者組織的形態(tài)學(xué)，使細(xì)胞成分，例如，RNA在原位雜交期間凈皮 維持在細(xì)胞基質(zhì)之內(nèi)，并同時(shí)交聯(lián)和/或沉淀在細(xì)胞基質(zhì)中的蛋白質(zhì)，因此細(xì)胞或者組織對(duì)探:針:;參入和隨后的雜化作用^f呆持基本上開(kāi)》文的結(jié)構(gòu)。
在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的揮:針包括，例如 合成的或者生物學(xué)上生產(chǎn)的核酸(DNA、 RNA和等^f介物)；；肽 核酸(PNA;和等《介物)；包含特異性核酸的肽(和等價(jià)物)或 者在精確條件下與特異性細(xì)胞靶分子雜交的肽序列。在另 一實(shí)施 方案中，本發(fā)明的探針包括合成的或者生物學(xué)上生產(chǎn)的糖肽、脂 肽和朊病毒或者在精確的條件下與細(xì)胞內(nèi)特定的靶分子結(jié)合的 朊病毒-樣分子(或者其等價(jià)物)。
探針復(fù)合物的定義是包括一種標(biāo)記物基團(tuán)的探針，所 述標(biāo)記物基團(tuán)適合于檢測(cè)過(guò)程。如果探針是一種核酸，標(biāo)記物基 團(tuán)附屬于5'末端、3'末端、內(nèi)部或者在其任何一種結(jié)合物中。優(yōu) 選的標(biāo)記物基團(tuán)是一種識(shí)別標(biāo)記，例如》文射性同位素示蹤(例如， p32、 I125、 H3)、生物素標(biāo)記或者熒光標(biāo)記。做為選擇，所述探針 具有一種標(biāo)記的聚脫氧核苦酸尾部，該聚脫氧核苷酸尾部^皮用來(lái)斗全測(cè)探針復(fù)合物。該探針復(fù)合物可能還由多種不同的核酸序列、 PNA、肽、糖肽、脂肽或者朊病毒或者包括一個(gè)或一個(gè)以上標(biāo)記物基團(tuán)標(biāo)記的其任何一種結(jié)合物組成。如果大于一個(gè)一個(gè)纟罙4十基 團(tuán)被標(biāo)記，則最好用不同的標(biāo)記物基團(tuán)來(lái)標(biāo)記每一探針基團(tuán)。
寡聚核苷酸探針的核苷酸序列核苷酸序列基本上與至 少至少一部分耙分子耙分子核酸互補(bǔ)。靶分子核酸既是一種在固定細(xì)胞或者組織之內(nèi)正常存在的核酸，又是，喉支為選擇，在與異探針復(fù)合分子優(yōu)選由DNA或者RNA片段組成，DNA或者RNA 片^a的大小在大約10-50個(gè)核苷范圍內(nèi)。
肽探針包括，例如，抗體及已知能夠結(jié)合少見(jiàn)定的耙分 子或靼分子范圍的其他分子。非抗體探針的實(shí)施例包4舌，例如， 酶和酶底物和其作用部分。另外，已知的藥物或者化學(xué)試劑可以 選擇性地結(jié)合革巴分子蛋白質(zhì)(例如，抗生素可以結(jié)合細(xì)菌)。例 如，脂肽具有在細(xì)胞中檢測(cè)脂質(zhì)體基團(tuán)的用途，所述細(xì)胞包括細(xì) 月包中的特異性細(xì)月包器或者細(xì)月包器部分和內(nèi)在4匕細(xì)菌。例如，#唐肽 妨礙血小^反凝聚并因此可以用來(lái)耙向在血小々反起作用過(guò)程中必 需的分子，由此幫助凝結(jié)異常的研究和診斷。朊病毒或者朊病毒 一部分可以-陂用作，例如，對(duì)神經(jīng)學(xué)組織的揮:4十。同才羊，朊病毒 可以是固定樣品中的耙分子。
在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，被添加給樣品的探針多于 輩巴分子(例如，10:1、 100:1或者1000:1 )。這可以4吏雜交雜交反應(yīng)有效地進(jìn)行并促進(jìn)^:針靶分子的結(jié)合。
通常通過(guò)在纟羊品上添加一種纟果4f溶液，〗吏纟果針復(fù)合物(包括，例如，DNA、 RNA和/或PNA)與固定樣品的樣品輩巴分 子(例如，核酸)相接觸。適合于雜交作用的示范性的條件是能 夠提供適當(dāng)?shù)木彌_液環(huán)境的溶液。適用于雜交作用的溶液的一些 實(shí)施例是1 ) 一種包括大約10%到50%的曱酰胺、2X.SSC ( pH7.4)和1% NP40的4C沖液；2) —種包4舌大約1.5 M到4 M的 GuSCN緩沖液、5MGuSCN原料緩沖液的緩沖液；其中GuSCN 原料纟爰沖液由5 M GuSCN、 100 mM Tris曙HC1 ( pH 7.8)、 40 mM 乙二胺四乙酸、P/。NP40所組成。通過(guò)加入IxTE pH 7.8來(lái)3希釋 庫(kù)存緩沖液到指定的GuSCN摩爾濃度，乂人而產(chǎn)生上面^是到的 GuSCN -爰沖液的摩爾濃度。3) —種包括大約2到6 M GuHCl 緩沖液的緩沖液。8 M GuHCl緩沖液由8 M GuHCl、 200 mM Tris 隱HC1、 (pH7.8)、 40mM乙二胺四乙酸、P/oNP40所組成。通過(guò) 加入IxTEpH 7.8來(lái)稀釋庫(kù)存緩沖液到指定的GuHCl摩爾濃度， 從而產(chǎn)生上面提到的GuHCl緩沖液的摩爾濃度。4)一種包括曱酰 胺(20 - 50% )和GuSCN緩沖液的混合物的緩沖液，(例如，0.5M 到3M)。 5)—種包括GuSCN緩沖液、(例如0.5M到3M)和 GuHCL緩沖液(例如IM到5M)的混合物的纟爰沖液。
具體的組合物和雜交|￡沖液的濃度隨揮:針的種類或 使用的探針組合物的不同而變化。組合物和使用的緩沖液的濃度 還依賴探針的于Tm(熔化溫度雙鏈DNA分離形成兩個(gè)互補(bǔ)單鏈的溫度)、揮:針序列、揮:針長(zhǎng)度和雜交溫度，本領(lǐng)域技術(shù)人員 只需進(jìn)4亍常^見(jiàn)實(shí)-驗(yàn)方法就可以確定所述組合物和4吏用的l爰沖液濃度。
本發(fā)明不局限于1壬<可一種具體的雜交溫度，然而，應(yīng) 該理解，在雜交緩沖液中利用曱酰胺可以使雜交作用在比標(biāo)準(zhǔn)雜 交過(guò)程4氐得多的溫度下進(jìn)4亍。例如，在水相雜交纟爰沖液，例4口氯 化鈉中，對(duì)靶分子有特異性(對(duì)宿主細(xì)胞沒(méi)有特異性)的普通探 針復(fù)合物通常需要的溫度大約是60 - 65 :攝氏度。在上述雜交液 l)中進(jìn)行的相同雜交作用在大約42攝氏度下進(jìn)行，且具有相等 的特異性。
同才羊，GuSCN的4吏用也能夠4吏雜交作用在比標(biāo)準(zhǔn)雜交 過(guò)程低得多的溫度下進(jìn)行。例如，在普通步驟中，在水相雜交緩 沖液，例如氯化鈉中，對(duì)靶分子有特異性(對(duì)宿主細(xì)胞沒(méi)有特異 性)的普通探針復(fù)合物通常需要的溫度大約是60 - 65攝氏度。 在GuSCN或者GuHCl雜交緩沖液中進(jìn)行的相同雜交作用在大約 37攝氏度下進(jìn)行，且具有相等的特異性。
在雜交作用完成之后，通常通過(guò)使用 一系列洗滌緩沖 液洗滌從樣品中洗去未雜交的探針。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確定適 當(dāng)?shù)南礈炀彌_液和洗滌時(shí)間。在一個(gè)實(shí)施方案中，洗滌緩沖液包 括0.3M的氯化鈉、0.03M的檸檬酸鈉、和0.1o/。SDS。另 一種 適當(dāng)?shù)南礈炀彌_液包括磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)。
在洗清之后，可以對(duì)樣品進(jìn)行復(fù)染色。在一個(gè)實(shí)施方 案中，背景的復(fù)染色能夠提高雜交探針的顯色。優(yōu)選的復(fù)染色劑 是，例如，DAPI、伊文思藍(lán)和高4孟酸鉀。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知 一些其他適當(dāng)?shù)膹?fù)染色劑。當(dāng)使用熒光標(biāo)記的探針來(lái)檢測(cè)對(duì)靶分 子有特異性的核酸、蛋白質(zhì)、糖蛋白和脂蛋白時(shí)，通常會(huì)用到染 色步驟。盡管有一定幫助，但是本發(fā)明的實(shí)施方案不需要進(jìn)4亍復(fù) 染色。
通過(guò)使用適合特異性基團(tuán)的方法來(lái)檢測(cè)探針，其中所 述特異性基團(tuán)被用于標(biāo)記探針復(fù)合物。檢測(cè)熒光標(biāo)記探針的優(yōu)選 的方法是使用例如，特殊的綠色、紅色和藍(lán)色顯微鏡過(guò)濾器(即， 熒光顯孩H竟檢查法)。通過(guò)例如自動(dòng)射線照相術(shù)和磷光劑成^f象4支 術(shù)可以檢測(cè)到雜交的放射性標(biāo)記探針。生物素標(biāo)記的探針可以通 過(guò)酶催化檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)，這種檢測(cè)系統(tǒng)是可商業(yè)購(gòu)得的。
通過(guò)與4采針復(fù)合物進(jìn)行反應(yīng)，上面描述的方法可以在 單一臨床樣品中同時(shí)檢測(cè)到不同的病原體，所述纟采針復(fù)合物由i午多不同的核酸序列組成，每個(gè)都用不同的標(biāo)記物基團(tuán)標(biāo)記。為了同時(shí)沖企測(cè)不同的寡聚核苷酸揮:針，它們可以祐:i殳計(jì)成所有的揮:4十 復(fù)合序列具有非常相似的Tm (熔化溫度)值，其中，所述寡聚 核苷酸探針對(duì)存在于樣品中的不同靶分子的不同核酸具有特異 性。然后用不同的可4企測(cè)基團(tuán)(例如，不同的熒光基團(tuán))標(biāo)i己每 一特異性寡聚核苷酸。用含有許多組分的探針復(fù)合物進(jìn)行雜交。 雜交的樣品按照上邊的表述進(jìn)行處理，并通過(guò)適合于檢測(cè)4果針復(fù) 合物不同標(biāo)記的寡聚核苷酸的方法^L察才羊品(例如，如果〗吏用不 同的熒光基團(tuán)的話，則使用適當(dāng)?shù)倪^(guò)濾器觀察)，從而檢測(cè)在樣 品中存在哪些靶分子。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員和醫(yī)師可以識(shí)別與這里描述的原位雜交過(guò)程共同 <吏用的新型預(yù)處理過(guò)程與所有過(guò)去已知的監(jiān)測(cè) 方法和這里描述的方法兼容，且并不祐 使用的4企測(cè)方法所限制。 原位雜交過(guò)程已經(jīng)被革新，因此需要更少的操作，且因此能夠在 很短的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行。本發(fā)明的實(shí)施方案還包括試劑盒，所述試劑 盒包括本發(fā)明的組合物。以試劑盒形式存在的組合物能夠允許這 里所描述的過(guò)程以多種不同的實(shí)施方案實(shí)施，這里描述的過(guò)禾呈包 括已經(jīng)與多種檢測(cè)方法進(jìn)行簡(jiǎn)明性和兼容性優(yōu)化的方法?？梢灶A(yù) 料，這里制備的包含特別制備的試劑和探針的試劑盒更適合于在 臨床/診斷實(shí)驗(yàn)室中應(yīng)用，在臨床/診斷實(shí)驗(yàn)室中，檢測(cè)特異性 核酸存在或者缺少的能力可以用來(lái)陽(yáng)性地或者陰性地識(shí)別以具 體耙分子的存在為特征的病理狀態(tài)。
現(xiàn)有^支術(shù)中對(duì)于多種細(xì)月包病變可用的i貪斷方法耳又決于 微觀評(píng)價(jià)、細(xì)胞形態(tài)學(xué)參數(shù)、表面抗點(diǎn)蝕特性、和某些靶分子的 存在或者缺失。然而，許多診斷方法并不完全準(zhǔn)確或者不充分壽文 感。在原位雜交過(guò)程忠使用上面描述的規(guī)程和病原體特異性探針，能夠比較容易且更加準(zhǔn)確的識(shí)別樣品中的靶分子(包括但不ff曰.工4広乂Jr 、|> j > 7PV/;r、Y十、乂0
本發(fā)明提供了一種用于原位雜交過(guò)程的簡(jiǎn)單的預(yù)處理 方法，這些方法提高了探針對(duì)細(xì)胞的滲入性，且因此，與過(guò)去所 描述的過(guò)程相比改進(jìn)了雜交和才企測(cè)特性。這種改進(jìn)包^舌通過(guò)增加 特異性"信號(hào)"的雜交和探測(cè)效率來(lái)最大化試驗(yàn)的敏感性。盡管本 發(fā)明不局限于任何一種具體的機(jī)制，人們普遍相信增加的靈4文度 是由于改進(jìn)的雜交過(guò)程，雜交過(guò)程是通過(guò)改進(jìn)^笨針對(duì)細(xì)胞的滲透 作用來(lái)實(shí)現(xiàn)的，同時(shí)最大化靶分子(例如核酸序列)在細(xì)胞或者 組織中的保持力且最大化細(xì)胞或者組織樣品的另 一 種生物化學(xué) 和形態(tài)特征的保存。實(shí)施例
—種上述方法優(yōu)選的且非限制性使用在于從培養(yǎng)基或 從痰液中才全測(cè)結(jié)核分枝桿菌。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)該了解并理 解，新型的方法同樣適合于多種其他系統(tǒng)、細(xì)胞、組織培養(yǎng)和組 織，用于與重要的特異性核酸雜交(或者4企測(cè)^^細(xì)月包、組織或者 病原體其4也的細(xì)"包組分)，同時(shí)l呆持細(xì)力包完整和形態(tài)學(xué)。實(shí)施例
將培養(yǎng)物或者病人的痰液涂在玻璃平板上，并風(fēng)干。 洗滌被培養(yǎng)的細(xì)胞并通過(guò)離心作用濃縮。將洗滌的細(xì)胞懸浮在帶 有BSA的磷酸鹽緩沖液中。為了4吏細(xì)胞失活，在100纟聶氏度下 煮沸懸浮的細(xì)"包15分鐘。才羊品制備方法1
用1 ) NALC/NaOH或2 ) NALC/NaOH處理痰液隨 后在100 l聶氏度下煮沸經(jīng)過(guò)處理的痰液15分鐘，4吏樣品失活， 或3)用離液序列高的溶液，例如，鹽酸胍或石充^碌u酸鹽(簡(jiǎn)單 的i兌，才目對(duì)于疫液2隱3個(gè)體積、的5 M GuSCN或8 M的GuHCl才目 混合)處理痰液。在37才聶氏度下培養(yǎng)樣品20分鐘。離心才羊品4吏 細(xì)胞成J求狀。用^粦酸鹽緩沖溶液洗滌細(xì)胞。將洗滌后的細(xì)力包懸浮 在帶有1。/。 BSA或4) 一種離液序列高的溶液，例如，鹽酸胍或 硫代硫酸鹽的磷酸鹽緩沖溶液中，隨后煮沸(如上面步驟3所述)， 此外，在100攝氏度下煮沸懸浮在帶有1。/。BSA磷酸緩沖液中的 細(xì)月包15分鐘，從而殺死分纟支4干菌。隨后將所-彈的培養(yǎng)物或痰液 才羊品涂布到^皮璃纟反上，然后風(fēng)干。
用甲醇或乙酸甲酯或乙醇固定樣品。用IDF溶液處理 固定的涂片(如Supra所公開(kāi)的)10分鐘。IO分鐘之后，用磷 酸》爰沖液洗滌涂片3次，并風(fēng)干。才羊品制備方法2(Supra)在試管中混合并在室溫(20-25攝氏度)下混合15分 鐘。隨后將痰液-IDF混合物涂布到玻璃4反上，風(fēng)干并用曱醇固定。 省去雜交之前對(duì)固定涂片進(jìn)行的IDF處理過(guò)程。在雜交之前用磷 酸緩沖液洗滌玻璃板3次。才羊品制備方法3
在20-25攝氏度下(室溫條件下)用含有2 %的戊二 醛的磷酸緩沖液處理玻璃^反上甲醇固定的痰液-IDF混合物5分 鐘，然后用磷酸緩沖液洗滌三次，并風(fēng)干。省去雜交之前對(duì)固定 涂片進(jìn)行的IDF處理過(guò)程。才羊品制備方法4
將1體積的未處理過(guò)的病人痰液與兩體積的IDF溶液 (Supra)在試管中混合并在室溫(20-25攝氏度)下混合15分 鐘。將痰液-IDF混合物煮沸15分鐘來(lái)釋;^文溶液中的核酸并同時(shí) 4吏才羊品無(wú)傳染性。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)才支術(shù)可以將核酸乂人煮沸的樣品中純化 出來(lái)，或者所需要的靶分子核酸可以使用特異性探針和磁珠通過(guò) 三明治雜交篩選出來(lái)，如Shah等人所述(Shah J. S.， King W， Liu J.， Smith J., Serpe G. and Popoff S.， and. (1997) . Assay improvements. 美國(guó)專利第5，629，156號(hào)。該專利通過(guò)引證在此全部并入本文)。 通過(guò)PCR (對(duì)于DNA靶分子)或RT-PCR (對(duì)于RNA靶分子) 過(guò)禾呈可以擴(kuò)增純4匕的草巴分子。樣品探測(cè)
—種寡聚核苷酸揮:4十由一種DNA序列組成，所述 DNA序列能夠特異性的與肺結(jié)核分歧桿菌的23 S核糖體RNA雜 交，^口 Shah, Nietupski和Liu(美國(guó)專矛j第5,521,300號(hào))戶斤述。聲斤 述寡聚核苷酸優(yōu)選的用語(yǔ)4全測(cè)細(xì)月包中肺結(jié)核分歧桿菌的存在。合 適的探針復(fù)合物的例子是PI. TB探針5'_羅丹明纟錄-AGA — ACA — CGC - CAC — TAT - TCA _ CAC —GCG — CGT — ATG — C - 3 ' [SEQ ID NO: 1] 66.5cP2 -Tb-1 51-2c5'-羅丹明纟錄—TTC _ GAG — GTT — AGA — TGC — CC - 3' [SEQ ID NO: 2]P3.分歧桿菌探針5'陽(yáng)熒光淬滅基團(tuán)陽(yáng)ATC GCC CGC ACG CTC ACA GTT AAG CCG TGA GAT TTC隱3' [SEQ ID NO: 3] 68.7cP4 —分歧桿菌屬揮:4十-54.1c 5'-熒光淬滅基團(tuán)—GCA — TTA — CCC — GCT — GGC畫(huà)3' [SEQ ID NO: 4]P5 -伯克霍爾德氏菌探針5' — FAM — CTT — GGC — TCT — AAT — ACA — GTC — GG - S' [SEQ BD NO: 5] tm52cPNA探針.
在一個(gè)實(shí)施方案中，在37攝氏度條件下，該探針復(fù) 合物與經(jīng)過(guò)固定/預(yù)處理的樣品中的核酸相4妄觸，其中，所述經(jīng)過(guò) 固定/預(yù)處理的才羊品<立于2.5 M GuSCN， 50 mM Tris (pH 7.8), 20 mM乙二胺四乙酸和1%NP40的雜交緩沖液中。在一個(gè)可選擇的 實(shí)施方案中，該揮:針復(fù)合物在42才聶氏度下與固定樣品中的核酸 相接觸，所述固定樣品位于50 %甲酰胺，2X SSC (pH 7.4), 20 mM乙二胺四乙酸，1%NP40的雜交緩沖液中。
用于檢測(cè)分歧桿菌屬的交替探針復(fù)合物中使用的合 適的寡聚核苷酸序列的例子是P2 -Tb-1 51-2c5'陽(yáng)羅丹明纟錄_ TTC _ GAG — GTT — AGA _ TGC — CC — 3 ' [SEQ ID NO: 2]P3.分歧桿菌屬探針5'-熒光淬滅基團(tuán) -ATC GCC CGC ACG CTC ACAGTTAAGCCGTGAGATTTC -3'[SEQIDNO: 3] 68.7cP4 -分歧桿菌屬揮:針-54.1c 5'-熒光淬滅基團(tuán)—GCA — TTA _ CCC — GCT _ GGC - 3' [SEQ ID NO: 4]SEQIDNOs:3和4及其互補(bǔ)序列適用于檢測(cè)分歧桿菌屬。 SEQIDNOs:l和2及其互補(bǔ)序列適用于4企測(cè)肺結(jié)核分歧桿菌。 SEQIDNO: 5適用于才企測(cè)伯克霍爾德氏菌。
由于在細(xì)菌細(xì)胞中存在大量的rRNA ( 1,000- 10,000 拷貝)，所以在檢測(cè)分歧桿菌病原體時(shí)選擇使用核糖體RNA序 列。優(yōu)選的探針復(fù)合物的寡聚核苷酸是一種DNA,該DNA帶有 與肺結(jié)核分歧桿菌rRNA的互補(bǔ)序列。優(yōu)選用熒光素在3，和5， 末端對(duì)寡聚核苷酸進(jìn)行標(biāo)記。應(yīng)當(dāng)理解，RNA寡聚核苷酸探針 同才羊也可以^皮z使用。
如上所述，揮:針總量是一種預(yù)計(jì)的量，該量應(yīng)該超過(guò) ^=羊品中可能具有的可利用rRNA的估計(jì)量(大約100 : 1 ), 乂人而 使雜交反應(yīng)更為有效且能夠促進(jìn)高速率的探針靶分子退火。在 定量術(shù)語(yǔ)中，這需要探針由30個(gè)核苷長(zhǎng)度的寡聚核苷酸組成， 且使用的濃度范圍為1-10 ng/ml，從而在背景上產(chǎn)生可靠的信號(hào)。
應(yīng)當(dāng)理解，使用GuSCN還能夠使雜交過(guò)程在比普通 雜交過(guò)程低得多的溫度下進(jìn)行。對(duì)靶分子有特異性(但對(duì)宿主細(xì) 胞無(wú)特異性)的特異性探針在水相雜交溶液，例如氯化鈉中進(jìn)行 雜交作用，需要大約60-65攝氏度的溫度。但是在上述GuSCN 或GuHCl雜交緩沖液中進(jìn)行的雜交作用在37才聶氏度下就可以確 保專一性。
原4立雜交方法的 一 個(gè) <尤勢(shì)在于相7+少量的細(xì)"包包4舌 一種樣品，大量的一致才羊品可以在短時(shí)間內(nèi)^皮處理。這里所描述 的獨(dú)特的原位雜交方法是十分簡(jiǎn)單的。本發(fā)明的方法還可以用于 很多樣品中，包括，但不僅限于石蠟包裹的組織部分、丙酮固定 的樣品。
這些試驗(yàn)的結(jié)果顯示出在被試驗(yàn)的樣品中檢測(cè)到靶 分子(病原體DNA)，在對(duì)照樣品中沒(méi)有才企測(cè)到輩巴分子。在用本 發(fā)明IDF溶液處理過(guò)的樣品中檢測(cè)到的輩巴分子通常比較好。在不 進(jìn)行過(guò)度試驗(yàn)的情況下，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)可以認(rèn)識(shí)、理 解并明白本發(fā)明的IDF溶液可以在許多需要4罙4十(或其他小物 質(zhì))有歲丈進(jìn)入細(xì)月包、病原體(例如，l立于細(xì)月包中的病原體)或細(xì) 胞器官的情況下使用。
從以上敘述可以明白，本發(fā)明^是供了用于增加細(xì)胞、 細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞器官和細(xì)胞器官膜滲透性的組合物和方法， 用于幫助，例如才企測(cè)細(xì)月包內(nèi)成分和/或病原體。
權(quán)利要求
1.一種用于增加細(xì)胞壁、細(xì)胞膜和核膜滲透性的組合物，包括GuSCN(硫氰酸胍)、Tris-HCL、乙二胺四乙酸、IGEPAL(辛基苯氧基聚(乙烯氧基)乙醇)、乙酸、甲醇、氯化鈉和脫氧膽酸鈉。
2. 根據(jù)4又利要求1所述的組合物:約是2.0到3.3 M。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物:大約是10到100 mM。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物:值大約是7.0到9.0。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物, 度大約是5到50 mM。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物， 約是百分之0.1到百分之2.0。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物， 百分之1.0到百分之10。
8. 4艮據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物, 百分之20到百分之50。
9. 才艮據(jù)纟又利要求1所述的組合物, 是百分之0.02到百分之2.5。3核膜滲透性的組合物，包括 CL、乙二胺四乙f臾、IGEPAL乙醇)、乙酸、曱醇、氯4b鈉 其中所述好L氰酸胍的濃度大其中所述Tris - HCL的濃度 其中所述Tris - HCL的pH 其中所述乙二胺四乙酸的濃 其中所述IGEPAL的濃度大 其中所述乙酸的濃度大約是 其中所述曱醇的濃度大約是 其中所述^^酸鈉的濃度大約
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述脫氧膽酸鈉的濃度 大約是百分之0.02到百分之2.5。
11. 一種用于對(duì)細(xì)月包中草巴分子染色的方法，包4舌a) -使細(xì)月包與 一種組合物相4妄觸乂人而產(chǎn)生一種可滲透細(xì)月包，所述組合物包 括GuSCN (碌u氰酸胍)、Tris - HCL、乙二胺四乙酸、IGEPAL(辛基苯氧基聚(乙烯氧基)乙醇)、乙酸、曱醇、氯化鈉 和脫氧膽酸鈉；b)將步驟(a)的可滲透細(xì)胞與對(duì)結(jié)合所述 靶分子有特異性的粘合劑相接觸，和；c)一全測(cè)步驟(b)所述 的粘合劑。
12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述靶分子選自由核酸、 肽核酸、肽、糖蛋白、脂質(zhì)體、脂蛋白、病毒和朊病毒所組 成的《且中。
13. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述粘合劑選自由核酸、 肽核酸、肽、脂蛋白、糖蛋白和脂質(zhì)體所組成的組中。
14. 才艮據(jù)4又利要求11所述的方法，其中所述粘合劑還包括一種 才企測(cè)基團(tuán)。
15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中檢測(cè)基團(tuán)選自由熒光標(biāo) 記物、放射性標(biāo)記物、染料、膠態(tài)金屬、生物素/抗生物素蛋 白和山葵過(guò)氧化物酶所組成的組中。
16. 才艮據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述4企測(cè)作用是通過(guò)一 種對(duì)所述粘合劑有親合性的標(biāo)記抗體完成的。
17. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的組合物，其中所述GuSCN的濃度大 纟々是2.0多J 3.3 M。
18. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的組合物，其中所述Tris-HCL的濃度 大約是10到100 mM。
19. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的組合物，其中所述Tris - HCL的pH 值大約是7.0到9.0。
20. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的組合物，其中所述乙二胺四乙酸的 ;農(nóng)度大約是5到50 mM。
21. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的組合物，其中所述IGEPAL的濃度大 約是百分之0.1到百分之2.0。
22. 一艮據(jù)權(quán)利要求11所述的組合物, 是百分之1.0到百分之10。
23. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的組合物， 是百分之20到百分之50。
24. 4艮據(jù)4又利要求11所述的組合物， 約是百分之0.02到百分之2.5。其中所述乙酸的濃度大約 其中所述曱醇的濃度大約 其中所述膽酸鈉的濃度大
25. 才艮據(jù)^又利要求11所述的組合物，其中所述脫氧月旦酸鈉的濃 度大約是百分之0.02到百分之2.5。
26. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述靶分子是一種來(lái)自 孩吏生物結(jié)核分枝桿菌的核酸。
27. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述粘合劑是一種與來(lái) 自孩t生物結(jié)核分枝桿菌的核酸互補(bǔ)的寡聚核苷酸。
28. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述方法還包括背景染 色法。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種方法，用于允許雜質(zhì)離子非常有效的滲透細(xì)胞的細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞器官膜和/或核膜，并與細(xì)胞中的補(bǔ)體靶分子雜交或結(jié)合。所述細(xì)胞來(lái)自培養(yǎng)基或來(lái)自病人體內(nèi)獲得的樣本。雜質(zhì)離子可以是探針，所述探針由以下物質(zhì)單獨(dú)或兩個(gè)或兩個(gè)以上的結(jié)合體組成，例如DNA、RNA、肽核酸(PNA)、糖肽、脂肽、醣脂類或朊病毒。所述靶分子是一種細(xì)胞、一種細(xì)胞成分或者優(yōu)選地一種病原體或病原體成分。所述病原體可以是例如細(xì)菌、真菌、酵母或者病毒。
文檔編號(hào)A61K31/155GK101272773SQ200680035276
公開(kāi)日2008年9月24日 申請(qǐng)日期2006年7月27日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月28日
發(fā)明者J·S·沙阿, 海倫娜·威奧特曼 申請(qǐng)人:Id-菲什技術(shù)公司