專利名稱：一種制備熱穩(wěn)定的包含氧載體的組合物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種制備熱穩(wěn)定的包含氧載體的藥物組合物的方法和由該方法制備的組合物。本發(fā)明還涉及所述熱穩(wěn)定的包含氧載體的藥物組合物在人和其他動物的癌癥治療、缺氧病癥(oxygen-d印rivation disorder)以及器官保存中的用途。
背景技術(shù)：
血紅蛋白在大多數(shù)脊椎動物中對于血管系統(tǒng)和組織之間的氣體交換具有重要作用。其負(fù)責(zé)經(jīng)由血液循環(huán)將氧從呼吸系統(tǒng)運(yùn)送至體細(xì)胞，并且還將代謝廢物二氧化碳從體細(xì)胞運(yùn)離至呼吸系統(tǒng)，在呼吸系統(tǒng)二氧化碳被呼出。由于血紅蛋白具有此氧運(yùn)輸特性，因此如果其在離體狀態(tài)下可以被穩(wěn)定并且可以在體內(nèi)使用，則其可以被用作有效的供氧器。
天然存在的血紅蛋白是四聚體，當(dāng)其存在于紅細(xì)胞內(nèi)時通常是穩(wěn)定的。然而，當(dāng)天然存在的血紅蛋白移出紅細(xì)胞中時，其在血漿中變得不穩(wěn)定，并且分裂成兩個α-β 二聚體。這些二聚體的每一個的分子量為約32kDa。這些二聚體當(dāng)通過腎臟過濾和分泌時可能導(dǎo)致實(shí)質(zhì)性的腎損傷。四聚體鍵的斷裂也負(fù)面地影響了功能性血紅蛋白在循環(huán)系統(tǒng)中的持久性。
為了解決所述問題，近年來在血紅蛋白加工方面的發(fā)展已經(jīng)引入了多種交聯(lián)技術(shù)來形成四聚體內(nèi)的分子內(nèi)鍵以及四聚體之間的分子間鍵，從而形成聚合血紅蛋白?，F(xiàn)有技術(shù)教導(dǎo)聚合血紅蛋白是增加血紅蛋白的循環(huán)半衰期的優(yōu)選形式。然而，本發(fā)明人確定，聚合血紅蛋白在血液循環(huán)中更容易轉(zhuǎn)變成為高鐵血紅蛋白。高鐵血紅蛋白不能結(jié)合氧因此不能氧合組織。因此，現(xiàn)有技術(shù)教導(dǎo)的導(dǎo)致形成聚合血紅蛋白的交聯(lián)作用是有問題的。在本領(lǐng)域中存在著對允許分子內(nèi)交聯(lián)從而形成穩(wěn)定的四聚體而不同時形成聚合血紅蛋白的技術(shù)的需求。
現(xiàn)有技術(shù)為穩(wěn)定血紅蛋白進(jìn)行的嘗試所存在的更多問題包括產(chǎn)生的四聚體血紅蛋白中包含無法接受的高百分比的二聚體單位；二聚體的存在使得血紅蛋白組合物不能令人滿意地施用于哺乳動物。血紅蛋白的二聚體形式可以導(dǎo)致哺乳動物機(jī)體的嚴(yán)重腎損傷； 此腎損傷可以嚴(yán)重到足以導(dǎo)致死亡的程度。因此，本領(lǐng)域中存在著對在終產(chǎn)物中形成含有檢測不到的二聚體形式的穩(wěn)定的四聚體血紅蛋白的需求。
現(xiàn)有技術(shù)血紅蛋白產(chǎn)品的另一個問題是在施用后血壓突然升高。過去，已經(jīng)從較早一代的基于血紅蛋白的氧載體記錄到血管收縮事件。例如，如由KatZ等，2010公開的那樣，Hemopure 產(chǎn)品(Biopure Co.，USA)導(dǎo)致較高的平均動脈壓(1 士9mmHg)或比基線 (96士 IOmmHg)高30%。過去解決此問題的嘗試依賴于巰基試劑與血紅蛋白巰基反應(yīng)，據(jù)說能防止內(nèi)皮衍生舒張因子與巰基的結(jié)合。然而，巰基處理的使用增加了加工步驟，導(dǎo)致成本和雜質(zhì)的增加，這些雜質(zhì)以后必須從血紅蛋白組合物中去除。因此，在本領(lǐng)域中存在著對當(dāng)施用于哺乳動物時不導(dǎo)致血管收縮和高血壓的血紅蛋白的制備方法的需求。
現(xiàn)有技術(shù)為形成穩(wěn)定的血紅蛋白進(jìn)行的嘗試所存在的更多問題包括蛋白雜質(zhì)諸如免疫球蛋白G的存在可以導(dǎo)致哺乳動物中的變態(tài)反應(yīng)效應(yīng)。因此，本領(lǐng)域中存在著對可以產(chǎn)生穩(wěn)定的四聚體血紅蛋白同時不含蛋白雜質(zhì)的工藝的需求。
除了上述問題以外，在本領(lǐng)域中存在著對穩(wěn)定的四聚體血紅蛋白的需求，所述四聚體血紅蛋白不含二聚體、不含磷脂并且能夠以工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種加工非聚合的、熱穩(wěn)定的、純化的交聯(lián)四聚體血紅蛋白的方法， 所述交聯(lián)四聚體血紅蛋白適合用于哺乳動物而不會導(dǎo)致嚴(yán)重的腎損傷、血管不利影響和嚴(yán)重的不良事件包括死亡。本發(fā)明去除了二聚體形式的血紅蛋白、未交聯(lián)的四聚體血紅蛋白、磷脂和蛋白雜質(zhì)。另外，本發(fā)明使用(1)快速細(xì)胞裂解設(shè)備，所述設(shè)備用于精確的和可控的低滲裂解，⑵流通柱色譜(flowthrough column chromatography), (3)短時間高溫 (HTST)設(shè)備，所述設(shè)備在純化過程中用于熱加工血紅蛋白溶液以去除不需要的不穩(wěn)定的血紅蛋白二聚體并去除蛋白雜質(zhì)，例如免疫球蛋白-G，使得可以避免腎損傷、血管不利影響和其他毒性反應(yīng)，和(4)氣密輸液袋包裝以避免氧侵入至產(chǎn)品中。
該方法包括哺乳動物全血的起始材料，所述全血至少包括紅細(xì)胞和血漿。將哺乳動物全血中的紅細(xì)胞與血漿分離，接著過濾從而獲得濾過的紅細(xì)胞級分。洗滌濾過的紅細(xì)胞級分從而去除血漿蛋白雜質(zhì)。在快速細(xì)胞裂解設(shè)備中以50-1000升/小時的流速通過可控的低滲裂解來破裂所述洗滌過的紅細(xì)胞足以裂解紅細(xì)胞卻不裂解白細(xì)胞的時間。進(jìn)行過濾從而從所述裂解產(chǎn)物中去除至少一部分廢截留物。從所述裂解產(chǎn)物中提取第一血紅蛋白溶液。
使用超濾濾器進(jìn)行第一超濾過程，所述超濾濾器被配置成從第一血紅蛋白溶液中去除分子量比四聚體血紅蛋白高的雜質(zhì)并且進(jìn)一步去除任何病毒和殘留的廢截留物，從而獲得第二血紅蛋白溶液。對所述第二血紅蛋白溶液進(jìn)行流通柱色譜(Flowthrough column chromatography)以去除蛋白雜質(zhì)、二聚體血紅蛋白和磷脂以形成無磷脂的血紅蛋白溶液。 使用濾器對所述無磷脂的血紅蛋白溶液進(jìn)行第二超濾過程，所述濾器被配置成去除雜質(zhì)， 產(chǎn)生濃縮純化的無磷脂的血紅蛋白溶液。
通過富馬酸二 _3，5-二溴水楊酸酯(bis-3, 5-dibromosalicyl fumarate)至少交聯(lián)純化的血紅蛋白的α-α亞單位從而形成熱穩(wěn)定的交聯(lián)血紅蛋白而不形成聚合血紅蛋白，使得得到的非聚合的交聯(lián)四聚體血紅蛋白的分子量為60_70kDa。本文中使用的表達(dá)“非聚合的”是指未與其他血紅蛋白分子或任何其他非血紅蛋白分子諸如PEG通過分子間交聯(lián)的四聚體血紅蛋白。用合適的生理緩沖液諸如磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)、乳酸鹽林格溶液、乙酸鹽林格溶液或Tris緩沖液交換交聯(lián)四聚體血紅蛋白。使用切向流過濾去除任何殘留的化學(xué)物質(zhì)。
在此步驟后，將交聯(lián)血紅蛋白熱處理以去除任何殘留的未交聯(lián)的四聚體血紅蛋白和任何不穩(wěn)定的血紅蛋白，例如，二聚體形式的血紅蛋白，和任何其他蛋白雜質(zhì)。在熱處理之前，任選地向所述交聯(lián)四聚體血紅蛋白加入約0. 2%濃度的N-乙酰半胱氨酸從而防止形成高鐵血紅蛋白。熱處理和冷卻后立即加入約0. 2-0. 4%濃度的N-乙酰半胱氨酸以進(jìn)一步防止高鐵血紅蛋白的形成。熱處理優(yōu)選地是在約70°C -95°C下進(jìn)行30秒至3小時的短時間高溫處理，然后冷卻至25° C。之后將在熱處理期間形成的任何沉淀物通過離心或過濾設(shè)備去除以形成澄清溶液。
然后將所述無二聚體、無磷脂、無蛋白雜質(zhì)、熱穩(wěn)定的非聚合的交聯(lián)四聚體血紅蛋白加入至藥學(xué)可接受的載體。
此后，將所述熱穩(wěn)定的交聯(lián)四聚體血紅蛋白配制并包裝在定制的和氣密的聚乙烯、乙烯-乙酸乙烯酯、乙烯-乙烯醇(PE、EVA、EV0H)輸液袋中。該包裝阻止氧污染，氧污染會導(dǎo)致形成無活性的高鐵血紅蛋白。
通過上述方法制備的熱穩(wěn)定的交聯(lián)四聚體血紅蛋白用于治療多種癌癥諸如白血病、結(jié)直腸癌、肺癌、乳腺癌、肝癌、鼻咽癌和食管癌。破壞癌細(xì)胞的機(jī)制是改善了低氧條件下腫瘤的氧合，從而提高了對放射線和化療劑的敏感性。該熱穩(wěn)定的交聯(lián)四聚體血紅蛋白也可用于在移植期間保存器官組織或用于在體內(nèi)缺少供氧的情況下(諸如在缺氧心臟中) 保存心臟。


圖1描繪了不同血紅蛋白的氨基酸序列比對；
圖2描繪了本發(fā)明的方法概述的流程圖3示意性描繪了本發(fā)明的方法中使用的快速細(xì)胞裂解設(shè)備(instant cytolysis apparatus)；
圖4描繪了對于(a)未經(jīng)熱處理的交聯(lián)四聚體血紅蛋白和(b)已經(jīng)在90°C下經(jīng)歷了 45秒至2分鐘的熱處理或在80°C下經(jīng)歷了 30分鐘的熱處理的熱穩(wěn)定的交聯(lián)四聚體血紅蛋白的高效液相色譜分析；
圖5描繪了對熱穩(wěn)定的交聯(lián)四聚體血紅蛋白的電噴霧電離質(zhì)譜(ESI-MS)分析；
圖6顯示了對(a)純化的血紅蛋白溶液和(b)熱穩(wěn)定的交聯(lián)四聚體血紅蛋白的圓二色性光譜分析；
圖7顯示了在正常組織中氧合的改善。注射0. 2g/kg熱穩(wěn)定的交聯(lián)四聚體血紅蛋白溶液導(dǎo)致(A)血漿血紅蛋白濃度和(B)至肌肉的氧輸送的顯著增加。與血漿血紅蛋白水平相比，觀察到氧合顯著增加持續(xù)更長的時間；
圖8顯示了在低氧的腫瘤組織中氧合的改善。注射0. 2g/kg熱穩(wěn)定的交聯(lián)四聚體血紅蛋白溶液導(dǎo)致頭頸部鱗狀細(xì)胞癌(HNSCC)異種移植物的氧輸送的顯著增加；
圖9顯示了在㈧鼻咽癌(NPC)和⑶肝腫瘤的嚙齒動物模型中部分腫瘤縮?。?br> 圖10證明了在用熱穩(wěn)定的交聯(lián)四聚體血紅蛋白治療后，嚴(yán)重失血性休克的大鼠模型中的平均動脈壓變化；
圖11是流通柱色譜的洗脫圖；血紅蛋白溶液處于流過級分中；
圖12示意性描繪了用于工業(yè)規(guī)模操作的具有超濾作用的流通CM柱色譜系統(tǒng)；
圖13是用于HTST熱處理加工步驟的設(shè)備的示意圖14證明HTST加工設(shè)備中的溫度曲線圖，和在該系統(tǒng)中在本發(fā)明的85°C和90°C 下去除不穩(wěn)定的四聚體(二聚體)所需的時間；
圖15證明在圖13的HTST加工設(shè)備中在85°C和90°C下該系統(tǒng)中高鐵血紅蛋白形成的速率；
圖16是用于本發(fā)明的熱穩(wěn)定的交聯(lián)四聚體血紅蛋白的輸液袋的示意圖17顯示了概括肝切除過程中手術(shù)和血紅蛋白產(chǎn)品施用步驟的示意圖18顯示了在肝切除術(shù)和缺血/再灌注操作后頂損傷組大鼠中誘發(fā)的肝內(nèi)肝癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移以及遠(yuǎn)處肺轉(zhuǎn)移的代表性實(shí)施例以及使用本發(fā)明的熱穩(wěn)定的交聯(lián)四聚體血紅蛋白的預(yù)防作用；以及
圖19顯示了在肝切除和頂損傷操作后4周時試驗(yàn)組和對照組中的組織學(xué)檢查。
具體實(shí)施方式
血紅蛋白是哺乳動物和其他動物的血液的紅細(xì)胞中含鐵的氧運(yùn)輸?shù)鞍?。血紅蛋白顯示蛋白質(zhì)的三級和四級結(jié)構(gòu)兩者的特性。血紅蛋白中的大多數(shù)氨基酸形成由短的非螺旋段連接的α螺旋。氫鍵穩(wěn)定血紅蛋白內(nèi)部的螺旋部分，產(chǎn)生其分子內(nèi)的吸引力，將各個多肽鏈折疊成特定的形狀。血紅蛋白分子由四個球狀蛋白亞單位組裝而成。每個亞單位由排列成一組α-螺旋結(jié)構(gòu)段的多肽鏈構(gòu)成，所述α-螺旋結(jié)構(gòu)段具有包埋的血紅素基團(tuán)的“肌紅蛋白折疊”排列方式連接。
血紅素基團(tuán)由固定在稱為卟啉的雜環(huán)中的鐵原子組成。鐵原子與位于一個平面中的環(huán)中心中所有4個氮原子同等地結(jié)合。然后氧能夠結(jié)合于與卟啉環(huán)的平面垂直的鐵中心。因此，單個血紅蛋白分子具有與四個氧分子結(jié)合的能力。
在成人中，最常見類型的血紅蛋白是稱為血紅蛋白A的四聚體，其由稱為α2β2 的兩個α和兩個β非共價結(jié)合的亞單位組成，每個亞單位分別由141和146個氨基酸殘基構(gòu)成。α和β亞單位的尺寸和結(jié)構(gòu)彼此非常類似。對于總分子量為約65kDa的四聚體，每個亞單位的分子量為約16kDa。四條多肽鏈通過鹽橋、氫鍵和疏水相互作用彼此結(jié)合。牛血紅蛋白的結(jié)構(gòu)與人血紅蛋白類似(α鏈中的同一性為90. 14% ；β鏈中的同一性為84. 35%)。不同之處在于牛血紅蛋白中位于β Cys 93處的兩個巰基，而人血紅蛋白中的巰基分別位于α Cys 104、β Cys 93和^Cys 112處。圖1顯示分別標(biāo)記為B、H、C、P和 E的牛、人、犬、豬和馬血紅蛋白的氨基酸序列比對。各種來源的不同氨基酸用陰影表示。圖 1表明當(dāng)比較其氨基酸序列時，人血紅蛋白與牛、犬、豬和馬具有高度的相似性。
在紅細(xì)胞內(nèi)部的天然存在的血紅蛋白中，α鏈與其相應(yīng)的β鏈的締合非常強(qiáng)并且在生理?xiàng)l件下不會離解。然而，在紅細(xì)胞外，一個α β 二聚體與另一個α β 二聚體的締合相當(dāng)弱。該結(jié)合具有分裂成兩個α β 二聚體的傾向，每個二聚體為約32kDa。這些不需要的二聚體足夠小從而能夠被腎臟過濾和分泌，結(jié)果造成潛在的腎損傷并導(dǎo)致其在血管內(nèi)存留時間實(shí)質(zhì)性減少。
因此，從功效和安全性兩方面來看，穩(wěn)定在紅細(xì)胞外使用的任何血紅蛋白是必要的。下面概述了制備穩(wěn)定的血紅蛋白的方法；本發(fā)明的方法的概況呈現(xiàn)在圖2的流程圖中。
首先，選擇全血來源作為來自紅細(xì)胞的血紅蛋白的來源。選擇哺乳動物全血，包括，但不限于，人、牛、豬、馬和犬全血。將紅細(xì)胞與血漿分離，過濾，和洗滌以去除血漿蛋白雜質(zhì)。
為了從紅細(xì)胞釋放血紅蛋白，裂解細(xì)胞膜。盡管多種技術(shù)可以用來裂解紅細(xì)胞，但本發(fā)明利用精確可控的低滲裂解技術(shù)，其規(guī)模適合于工業(yè)規(guī)模制備。為此，用來裂解紅細(xì)胞的快速細(xì)胞裂解設(shè)備可見圖3。低滲裂解形成裂解產(chǎn)物溶液，其包含血紅蛋白和廢截留物。 為了能夠進(jìn)行工業(yè)規(guī)模制備，小心地控制裂解作用使得僅紅細(xì)胞被裂解卻不裂解白細(xì)胞或其他細(xì)胞。在一個實(shí)施方案中，選擇快速細(xì)胞裂解設(shè)備的尺寸使得紅細(xì)胞在2至30秒內(nèi)或足以裂解紅細(xì)胞的時間內(nèi)，和優(yōu)選30秒內(nèi)穿越該設(shè)備。所述快速細(xì)胞裂解設(shè)備包括靜態(tài)混合器。去離子水和蒸餾水用作低滲溶液。當(dāng)然要理解使用具有不同的鹽濃度的其他低滲溶液將導(dǎo)致紅細(xì)胞裂解的時限不同。由于可控的裂解步驟僅裂解紅細(xì)胞，不破壞白細(xì)胞或細(xì)胞性物質(zhì)，因此其使毒性蛋白、磷脂或DNA從白細(xì)胞的釋放或其它細(xì)胞性物質(zhì)的釋放最小化。在30秒后，S卩，在含有紅細(xì)胞的溶液已經(jīng)穿越快速細(xì)胞裂解設(shè)備的靜態(tài)混合器部分后， 立即加入高滲溶液。得到的血紅蛋白與使用其他裂解技術(shù)得到的血紅蛋白相比具有較高的純度和較低水平的污染物諸如不合乎需要的DNA和磷脂。分別通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(檢出限=64pg)和高效液相色譜(HPLC，檢出限=1 μ g/ml)方法沒有在該血紅蛋白溶液中檢測到來自白細(xì)胞的不合乎需要的核酸和磷脂雜質(zhì)。
進(jìn)行兩個超濾過程一個過程在流通柱色譜前去除分子量比血紅蛋白大的雜質(zhì)， 另一個過程在流通柱色譜后去除分子量比血紅蛋白小的雜質(zhì)。后一超濾過程濃縮血紅蛋白。在一些實(shí)施方案中，IOOkDa濾器用于第一超濾過程，而30kDa濾器用于第二超濾過程。
流通柱色譜用來去除純化血紅蛋白溶液中的蛋白雜質(zhì)諸如免疫球蛋白-G、白蛋白和碳酸酐酶。在一些實(shí)施方案中，通過使用一種市售離子交換柱或其組合來進(jìn)行柱色譜，所述離子交換柱諸如DEAE柱，CM柱，羥磷灰石柱等。用于柱色譜的典型pH為6-8. 5。在一個實(shí)施方案中，使用流通CM柱色譜步驟在pH 8.0下去除蛋白雜質(zhì)。進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附測定 (ELISA)以檢測從柱色譜洗脫后樣品中殘留的蛋白雜質(zhì)和磷脂。此獨(dú)特的流通柱色譜分離能夠?qū)崿F(xiàn)用于工業(yè)規(guī)模制備的連續(xù)分離方案。ELISA結(jié)果顯示在洗脫的血紅蛋白中這些雜質(zhì)的量非常低(免疫球蛋白-G 44. 3ng/ml ；白蛋白20. 37ng/ml ；碳酸酐酶:81.2 μ g/ml)。 使用不同類型的柱采用不同的PH值去除蛋白雜質(zhì)的結(jié)果顯示在下面的表1中。
表 權(quán)利要求
1.一種制備高度純化的和熱穩(wěn)定的包含氧載體的藥物組合物的方法，所述包含氧載體的藥物組合物包含血紅蛋白，所述血紅蛋白基本上由非聚合的交聯(lián)四聚體血紅蛋白組成， 所述方法包括a)提供至少包含紅細(xì)胞和血漿的哺乳動物全血；b)將所述哺乳動物全血中的紅細(xì)胞與血漿分離；c)過濾與血漿分離的紅細(xì)胞從而獲得濾過的紅細(xì)胞級分；d)洗滌所述濾過的紅細(xì)胞級分從而去除血漿蛋白雜質(zhì)，得到洗滌過的紅細(xì)胞；e)在快速細(xì)胞裂解設(shè)備中通過精確控制的低滲裂解方法破裂所述洗滌過的紅細(xì)胞 2-30秒或足以裂解所述紅細(xì)胞的時間，從而以50-1000升/小時的流速形成包含破裂的紅細(xì)胞的裂解產(chǎn)物的溶液；f)進(jìn)行過濾以從所述裂解產(chǎn)物中去除至少一部分廢截留物；g)從所述裂解產(chǎn)物中提取第一血紅蛋白溶液；h)使用超濾濾器進(jìn)行第一超濾過程，所述超濾濾器被配置成去除分子量比血紅蛋白高的雜質(zhì)，以從第一血紅蛋白溶液中進(jìn)一步去除任何病毒和殘留廢截留物，從而獲得第二血紅蛋白溶液；i)對該純化的血紅蛋白溶液進(jìn)行流通柱色譜以去除蛋白雜質(zhì)；j)使用超濾濾器進(jìn)行第二超濾過程，所述超濾濾器被配置成去除雜質(zhì)和濃縮所述純化的血紅蛋白溶液；k)在缺氧環(huán)境中通過富馬酸二-3，5_二溴水楊酸酯至少交聯(lián)所述血紅蛋白的α-α亞單位以形成交聯(lián)血紅蛋白，其中所述交聯(lián)血紅蛋白是非聚合的交聯(lián)四聚體血紅蛋白；1)用合適的生理緩沖液交換所述交聯(lián)四聚體血紅蛋白；m)通過切向流過濾去除任何殘留的化學(xué)物質(zhì)；η)在缺氧環(huán)境中熱處理所述交聯(lián)血紅蛋白從而使任何殘留的未反應(yīng)的血紅蛋白、不穩(wěn)定的血紅蛋白(二聚體)和任何其他蛋白雜質(zhì)變性并沉淀，使得得到的熱穩(wěn)定的交聯(lián)四聚體血紅蛋白具有檢測不到濃度的二聚體并且基本上由非聚合的交聯(lián)四聚體血紅蛋白組成；ο)在熱處理所述交聯(lián)四聚體血紅蛋白后立即加入N-乙酰半胱氨酸從而保持低水平的高鐵血紅蛋白；P)通過離心或過濾設(shè)備去除沉淀物以形成澄清溶液；和q)將純化的和熱穩(wěn)定的交聯(lián)四聚體血紅蛋白加入至藥學(xué)可接受的載體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備高度純化的和熱穩(wěn)定的包含氧載體的藥物組合物的方法，其中所述熱處理是在約70°C -95°C下進(jìn)行30秒至3小時的短時間高溫過程，然后立即冷卻并且在冷卻后立即加入0. 2-0. 4%的量的N-乙酰半胱氨酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備高度純化的和熱穩(wěn)定的包含氧載體的藥物組合物的方法，其中所述全血是人、牛、豬、犬或馬全血。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備高度純化的和熱穩(wěn)定的包含氧載體的藥物組合物的方法，其中所述柱色譜包含一個或多個陽離子交換柱或陰離子交換柱。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備高度純化的和熱穩(wěn)定的包含氧載體的藥物組合物的方法，其中所述色譜柱為一個或多個DEAE柱、CM柱和/或羥磷灰石柱。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備高度純化的和熱穩(wěn)定的包含氧載體的藥物組合物的方法，其中所述藥學(xué)可接受的載體為生理緩沖液或水。
7.一種高度純化的和熱穩(wěn)定的包含氧載體的藥物組合物，其包含血紅蛋白，所述血紅蛋白基本上由通過權(quán)利要求1的方法形成的非聚合的交聯(lián)四聚體血紅蛋白組成。
8.一種制備高度純化的和熱穩(wěn)定的包含氧載體的藥物組合物的方法，所述包含氧載體的藥物組合物包含血紅蛋白，所述血紅蛋白基本上由非聚合的交聯(lián)四聚體血紅蛋白組成， 所述方法包括a)提供至少包含紅細(xì)胞和血漿的哺乳動物全血；b)將所述哺乳動物全血中的紅細(xì)胞與血漿分離；c)過濾與血漿分離的紅細(xì)胞從而獲得濾過的紅細(xì)胞級分；d)洗滌所述濾過的紅細(xì)胞級分從而去除血漿蛋白雜質(zhì)，得到洗滌過的紅細(xì)胞；e)在快速細(xì)胞裂解設(shè)備中通過精確控制的低滲裂解方法破裂所述洗滌過的紅細(xì)胞 2-30秒或足以裂解所述紅細(xì)胞的時間，從而以50-1000升/小時的流速形成包含破裂的紅細(xì)胞的裂解產(chǎn)物的溶液；f)進(jìn)行過濾以從所述裂解產(chǎn)物中去除至少一部分廢截留物；g)從所述裂解產(chǎn)物中提取第一血紅蛋白溶液；h)使用超濾濾器進(jìn)行第一超濾過程，所述超濾濾器被配置成去除分子量比血紅蛋白高的雜質(zhì)，以從第一血紅蛋白溶液中進(jìn)一步去除任何病毒和殘留廢截留物，從而獲得第二血紅蛋白溶液；i)對該純化的血紅蛋白溶液進(jìn)行流通柱色譜以去除蛋白雜質(zhì)；j)使用超濾濾器進(jìn)行第二超濾過程，所述超濾濾器被配置成去除雜質(zhì)和濃縮所述純化的血紅蛋白溶液；k)在缺氧環(huán)境中通過富馬酸二 _3，5-二溴水楊酸酯至少交聯(lián)所述血紅蛋白的α-α亞單位以形成交聯(lián)血紅蛋白，其中所述交聯(lián)血紅蛋白是非聚合的交聯(lián)四聚體血紅蛋白； 1)用合適的生理緩沖液交換所述交聯(lián)四聚體血紅蛋白； m)通過切向流過濾去除任何殘留的化學(xué)物質(zhì)；η)在約90°C至95°C的溫度下熱處理所述交聯(lián)血紅蛋白從而使任何殘留的未反應(yīng)的血紅蛋白、不穩(wěn)定的血紅蛋白(二聚體)和任何其他蛋白雜質(zhì)變性并沉淀，使得得到的熱穩(wěn)定的交聯(lián)四聚體血紅蛋白具有檢測不到濃度的二聚體并且基本上由非聚合的交聯(lián)四聚體血紅蛋白組成，并且立即冷卻至約25°C ；ο)在熱處理所述交聯(lián)四聚體血紅蛋白后立即加入N-乙酰半胱氨酸從而保持低水平的高鐵血紅蛋白；P)通過離心或過濾設(shè)備去除沉淀物以形成澄清溶液；和q)將純化的和熱穩(wěn)定的交聯(lián)四聚體血紅蛋白加入至藥學(xué)可接受的載體。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備高度純化的和熱穩(wěn)定的包含氧載體的藥物組合物的方法，其中所述熱處理在缺氧環(huán)境中進(jìn)行。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備高度純化的和熱穩(wěn)定的包含氧載體的藥物組合物的方法，其中所述熱處理進(jìn)行30秒至3分鐘，然后立即冷卻并且在冷卻后立即加入0. 2-0. 4%的量的N-乙酰半胱氨酸。
11.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備高度純化的和熱穩(wěn)定的包含氧載體的藥物組合物的方法，其中所述全血是人、牛、豬、犬或馬全血。
12.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備高度純化的和熱穩(wěn)定的包含氧載體的藥物組合物的方法，其中所述柱色譜包含一個或多個陽離子交換柱或陰離子交換柱。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的制備高度純化的和熱穩(wěn)定的包含氧載體的藥物組合物的方法，其中所述色譜柱為一個或多個DEAE柱、CM柱和/或羥磷灰石柱。
14.一種高度純化的和熱穩(wěn)定的包含氧載體的藥物組合物，其包含血紅蛋白，所述血紅蛋白基本上由通過權(quán)利要求8的方法形成的非聚合的交聯(lián)四聚體血紅蛋白組成。
15.一種制備高度純化的和熱穩(wěn)定的包含氧載體的藥物組合物的方法，所述包含氧載體的藥物組合物包含血紅蛋白，所述血紅蛋白基本上由非聚合的交聯(lián)四聚體血紅蛋白組成，所述方法包括a)提供至少包含紅細(xì)胞和血漿的哺乳動物全血；b)將所述哺乳動物全血中的紅細(xì)胞與血漿分離；c)過濾與血漿分離的紅細(xì)胞從而獲得濾過的紅細(xì)胞級分；d)洗滌所述濾過的紅細(xì)胞級分從而去除血漿蛋白雜質(zhì)，得到洗滌過的紅細(xì)胞；e)在快速細(xì)胞裂解設(shè)備中通過精確控制的低滲裂解破裂所述洗滌過的紅細(xì)胞2-30秒或足以裂解所述紅細(xì)胞的時間，從而以50-1000升/小時的流速形成包含破裂的紅細(xì)胞的裂解產(chǎn)物的溶液；f)進(jìn)行過濾以從所述裂解產(chǎn)物中去除至少一部分廢截留物；g)從所述裂解產(chǎn)物中提取第一血紅蛋白溶液；h)使用超濾濾器進(jìn)行第一超濾過程，所述超濾濾器被配置成去除分子量比血紅蛋白高的雜質(zhì)，以從第一血紅蛋白溶液中進(jìn)一步去除任何病毒和殘留廢截留物，從而獲得第二血紅蛋白溶液；i)對該純化的血紅蛋白溶液進(jìn)行流通柱色譜以去除蛋白雜質(zhì)；j)使用超濾濾器進(jìn)行第二超濾過程，所述超濾濾器被配置成去除雜質(zhì)和濃縮所述純化的血紅蛋白溶液；k)在缺氧環(huán)境中通過富馬酸二-3，5_二溴水楊酸酯至少交聯(lián)所述血紅蛋白的α-α亞單位以形成交聯(lián)血紅蛋白，其中所述交聯(lián)血紅蛋白是非聚合的交聯(lián)四聚體血紅蛋白； 1)用合適的生理緩沖液交換所述交聯(lián)四聚體血紅蛋白； m)通過切向流過濾去除任何殘留的化學(xué)物質(zhì)；η)將N-乙酰半胱氨酸加入至所述交聯(lián)四聚體血紅蛋白并在缺氧環(huán)境中在約70°C至 95°C的溫度下熱處理所述交聯(lián)血紅蛋白從而使任何殘留的未反應(yīng)的血紅蛋白、不穩(wěn)定的血紅蛋白(二聚體)和任何其他蛋白雜質(zhì)變性并沉淀，使得得到的熱穩(wěn)定的交聯(lián)四聚體血紅蛋白具有檢測不到濃度的二聚體并且基本上由非聚合的交聯(lián)四聚體血紅蛋白組成；ο)在熱處理所述交聯(lián)四聚體血紅蛋白后立即加入N-乙酰半胱氨酸從而保持低水平的高鐵血紅蛋白；P)通過離心或過濾設(shè)備去除沉淀物以形成澄清溶液；和q)將純化的和熱穩(wěn)定的交聯(lián)四聚體血紅蛋白加入至藥學(xué)可接受的載體。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的制備高度純化的和熱穩(wěn)定的包含氧載體的藥物組合物的方法，其中所述熱處理進(jìn)行30秒至3小時，然后立即冷卻至25°C并且在冷卻后立即加入約 0. 2-0. 4%的量的N-乙酰半胱氨酸。
17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的制備高度純化的和熱穩(wěn)定的包含氧載體的藥物組合物的方法，其中在熱處理前加入的N-乙酰半胱氨酸的量為約0. 2%。
18.根據(jù)權(quán)利要求15所述的制備高度純化的和熱穩(wěn)定的包含氧載體的藥物組合物的方法，其中所述全血是人、牛、豬、犬或馬全血。
19.一種高度純化的和熱穩(wěn)定的包含氧載體的藥物組合物，其包含血紅蛋白，所述血紅蛋白基本上由通過權(quán)利要求15的方法形成的非聚合的交聯(lián)四聚體血紅蛋白組成。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種高度純化和熱穩(wěn)定的交聯(lián)非聚合四聚體血紅蛋白，其適合用于哺乳動物而不導(dǎo)致腎損傷和血管收縮。進(jìn)行高溫和短時間(HTST)熱加工步驟以有效地去除不合乎需要的二聚體形式的血紅蛋白、未交聯(lián)的四聚體血紅蛋白和血漿蛋白雜質(zhì)。在熱處理后和任選地在熱處理前添加N-乙酰半胱氨酸保持了低水平的高鐵血紅蛋白。該熱穩(wěn)定的交聯(lián)四聚體血紅蛋白可以改善和延長正常和低氧組織中的氧合。在另一方面，該產(chǎn)品用于治療多種類型的癌癥諸如白血病、結(jié)直腸癌、肺癌、乳腺癌、肝癌、鼻咽癌和食管癌。本發(fā)明的四聚體血紅蛋白還可以用來預(yù)防手術(shù)切除腫瘤后的腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。此外，本發(fā)明的四聚體血紅蛋白可以在化療和放療之前施用于患者。
文檔編號A61K35/14GK102510753SQ201180001288
公開日2012年6月20日 申請日期2011年4月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月23日
發(fā)明者郭瑞儀, 黃炳镠 申請人:郭瑞儀, 黃炳镠