專利名稱：一種可穩(wěn)定表達(dá)VEGF shRNA的載體pCD－VEGF的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種可在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)VEGF shRNA的載體；本發(fā)明還涉及所說載體在腫瘤治療中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
血管在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。當(dāng)腫瘤長至1～2mm3時(shí)，需要有新血管的生成。新的血管將腫瘤與周圍的循環(huán)系統(tǒng)連接起來，為腫瘤的生長提供必需的物質(zhì)交換。此外，原發(fā)的腫瘤細(xì)胞也通過血管進(jìn)入血液循環(huán)，造成腫瘤的轉(zhuǎn)移。因此，血管新生是腫瘤生長、發(fā)展的必經(jīng)之路，與腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移有著密切的關(guān)系，這就是許多腫瘤僅在新的血管生成之后才出現(xiàn)臨床癥狀的原因。靶向血管生成的抗腫瘤治療，具有常規(guī)化療藥物無法取代的優(yōu)勢例如腫瘤組織內(nèi)部通常有較高的間質(zhì)壓，化療藥物很難到達(dá)腫瘤內(nèi)部；某些藥物即使到達(dá)了腫瘤內(nèi)部，也由于內(nèi)部缺氧環(huán)境不易發(fā)生氧化還原反應(yīng)，難以發(fā)揮療效；化療藥物幾乎對體內(nèi)所有快速分裂增殖的細(xì)胞包括癌細(xì)胞產(chǎn)生抑制或殺滅作用，即其缺乏對癌細(xì)胞增殖的特異性，在抑制癌細(xì)胞增殖的同時(shí)，對于骨髓細(xì)胞、胃腸粘膜上皮細(xì)胞及其他組織器官中快速分裂的細(xì)胞也會產(chǎn)生明顯的毒副作用；由于腫瘤細(xì)胞的多樣性及其基因的高突變性，使化療藥物對腫瘤尤其是已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移的腫瘤療效不佳。因此，抑制腫瘤血管生成已成為當(dāng)前腫瘤治療研究的一個(gè)新熱點(diǎn)。
血管的生成受到多種調(diào)節(jié)因子的控制，其中血管內(nèi)皮生長因子(vascularendothelial growth factor，VEGF)是一種主要的正調(diào)控因子。它是1989年由Ferrara等首先從牛垂體濾泡星狀細(xì)胞體外培養(yǎng)液中純化出來的糖蛋白，是在胚胎發(fā)生和創(chuàng)傷愈合過程中啟動血管形成的一個(gè)高度特異的有絲分裂原，也是一種有效的血管形成和血管通透性因子。1991年Tischer等首先闡明了人VEGF的基因結(jié)構(gòu)，該基因?yàn)閱我换?，長約14kb，由8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成。當(dāng)轉(zhuǎn)錄成mRNA后，可剪切拼接成5種異構(gòu)體VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF189和VEGF206，下方數(shù)字分別代表組成該異構(gòu)體的氨基酸數(shù)目。VEGF通過與細(xì)胞表面的受體結(jié)合，通過旁分泌或自分泌的方式來調(diào)節(jié)血管的生成。VEGF與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，VEGF表達(dá)高的腫瘤預(yù)后不良，常見的惡性腫瘤通常均有VEGF的過量表達(dá)。
迄今，以VEGF為靶點(diǎn)設(shè)計(jì)得到的藥物主要有抗體、反義核酸及小分子抑制劑。美國FDA已批準(zhǔn)一種抑制VEGF的單抗Avastin用于臨床，但價(jià)格異常昂貴。而反義核酸本身具有一定局限性，由于其特異性不強(qiáng)及給藥劑量偏高等問題，致使其進(jìn)一步的應(yīng)用研究進(jìn)展緩慢。
RNA干擾現(xiàn)象最早在C.elegan中被發(fā)現(xiàn)，它是指雙鏈RNA(dsRNA)特異性地誘導(dǎo)同源的mRNA降解，從而抑制靶蛋白的表達(dá)。外源的雙鏈RNA在細(xì)胞內(nèi)經(jīng)過RNA酶III Dicer的切割，成為21～23nt的短干擾RNA(small interferingRNA，siRNA)，其特征為3’端有兩個(gè)核苷酸突出的雙鏈RNA。siRNA與核酸酶等蛋白組分相結(jié)合，形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RNA-induced silencing complex，RISC)，RISC在ATP的作用下，引導(dǎo)siRNA的反義鏈與靶mRNA上的互補(bǔ)位置結(jié)合，切割靶mRNA，從而達(dá)到抑制靶基因表達(dá)的目的。雖然RNA干擾現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)還不到10年，但由于其作用的快速有效性和高度特異性，已成為特異性抑制基因表達(dá)的有效途徑之一。
目前獲得siRNA的方法主要有五種，即化學(xué)合成siRNA法、shRNA表達(dá)載體法、體外轉(zhuǎn)錄siRNA法(采用T7啟動子)、RNaseIII(Dicer)切割長雙鏈RNA法及PCR表達(dá)盒法。其中體外合成siRNA方法簡便迅速，但合成成本較高，使其應(yīng)用受到了限制。而shRNA表達(dá)載體法相對成本較低，具有可再生性，并在體內(nèi)外均能達(dá)到良好的RNA干擾效果，已成為近年來越來越受到重視的一種RNA干擾技術(shù)。
本發(fā)明的目的是，提供一種可長效表達(dá)VEGF shRNA的質(zhì)粒載體，以避免多次瞬時(shí)轉(zhuǎn)染造成的繁瑣操作和非特異性毒性，通過抑制VEGF的表達(dá)獲得治療腫瘤的更加效果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所說的可穩(wěn)定表達(dá)VEGF shRNA的載體pCD-VEGF，是由pcDNA3.0基本序列、人H1啟動子和可表達(dá)VEGF shRNA的DNA模板序列所組成。
本發(fā)明構(gòu)建了一個(gè)可在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)長時(shí)間表達(dá)VEGF shRNA的質(zhì)粒載體pCD-VEGF。該質(zhì)粒是建立在pcDNA3.0基本序列上，通過內(nèi)切酶切割，除去了原有的CMV啟動子，并連入可被RNA聚合酶III(PolIII)識別的人H1啟動子，在其中連入一段含有VEGF反向互補(bǔ)序列的DNA模板，該模板在轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞經(jīng)過轉(zhuǎn)錄后，形成shRNA(short hairpin RNA，即發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA)，通過堿基互補(bǔ)作用，與VEGF mRNA靶序列結(jié)合，從而干擾VEGF基因的表達(dá)。ELISA和Western Blotting檢測表明，對HT1080細(xì)胞轉(zhuǎn)染連入了針對VEGF的干擾質(zhì)粒pCD-VEGF并經(jīng)穩(wěn)定篩選后得到的單克隆細(xì)胞株HT1080-V3，其VEGF的表達(dá)水平明顯低于對照細(xì)胞和轉(zhuǎn)染了MOCK(即表達(dá)不針對任何特定基因的shRNA)質(zhì)粒的陰性對照細(xì)胞HT1080-M，其VEGF表達(dá)量為對照組的25.4％，HT1080-M組的30.5％；Matrigel侵襲實(shí)驗(yàn)表明，pCD-VEGF抑制了HT1080細(xì)胞的侵襲能力，穿過基底膜的細(xì)胞數(shù)分別為對照組的26.8％和HT1080-M組28.9％；劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，pCD-VEGF削弱了細(xì)胞的運(yùn)動能力；體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果表明，pCD-VEGF可顯著抑制HT1080細(xì)胞在體內(nèi)的生長，在接種后第24天，HT1080-V3組尚未出現(xiàn)可觸摸的瘤塊，此時(shí)HT1080-M組瘤塊體積均值已達(dá)1000mm3，至第54天時(shí)，HT1080-V3組瘤塊雖可觸及，但體積均值僅為43.4mm3，說明本發(fā)明構(gòu)建的pCD-VEGF效果明顯優(yōu)于對照組。
發(fā)明效果本發(fā)明根據(jù)RNA干擾基本原理，提供了一種可長效表達(dá)VEGF shRNA的質(zhì)粒載體，以避免多次瞬時(shí)轉(zhuǎn)染造成的繁瑣操作和非特異性毒性，通過抑制VEGF的表達(dá)可獲得治療腫瘤的更佳效果。


圖1質(zhì)粒pCD-VEGF的結(jié)構(gòu)示意2質(zhì)粒pCD-VEGF的構(gòu)建流程3各HT1080穩(wěn)定株細(xì)胞培養(yǎng)上清中VEGF分泌量的比較(ELISA結(jié)果)其中HT1080為未轉(zhuǎn)染任何質(zhì)粒的對照組細(xì)胞；HT1080-M為篩選出的轉(zhuǎn)染了pCD-MOCK質(zhì)粒的陰性對照細(xì)胞；HT1080-V1、HT1080-V2、HT1080-V3和HT1080-V4分別為篩選出的轉(zhuǎn)染了pCD-VEGF質(zhì)粒的細(xì)胞。
圖4各HT1080穩(wěn)定株細(xì)胞VEGF表達(dá)量的比較(Western Blotting結(jié)果)
其中HT1080為未轉(zhuǎn)染任何質(zhì)粒的對照組細(xì)胞；HT1080-M為篩選出的轉(zhuǎn)染了pCD-MOCK質(zhì)粒的陰性對照細(xì)胞；HT1080-V1、HT1080-V2、HT1080-V3和HT1080-V4分別為篩選出的轉(zhuǎn)染了pCD-VEGF質(zhì)粒的細(xì)胞。
圖5質(zhì)粒pCD-VEGF減弱了細(xì)胞對基底膜的侵襲能力其中HT1080為未轉(zhuǎn)染任何質(zhì)粒的對照組細(xì)胞HT1080-M為篩選出的轉(zhuǎn)染了pCD-MOCK質(zhì)粒的陰性對照細(xì)胞；HT1080-V3為轉(zhuǎn)染了pCD-VEGF質(zhì)粒并且經(jīng)篩選后持續(xù)低表達(dá)VEGF的細(xì)胞。
圖6質(zhì)粒pCD-VEGF減弱了細(xì)胞的運(yùn)動能力其中HT1080為未轉(zhuǎn)染任何質(zhì)粒的對照組細(xì)胞HT1080-M為篩選出的轉(zhuǎn)染了pCD-MOCK質(zhì)粒的陰性對照細(xì)胞；HT1080-V3為轉(zhuǎn)染了pCD-VEGF質(zhì)粒并且經(jīng)篩選后持續(xù)低表達(dá)VEGF的細(xì)胞。
圖7VEGF低表達(dá)細(xì)胞株HT1080-V3的裸鼠體內(nèi)成瘤性檢測其中HT1080為未轉(zhuǎn)染任何質(zhì)粒的對照組細(xì)胞HT1080-M為篩選出的轉(zhuǎn)染了pCD-MOCK質(zhì)粒的陰性對照細(xì)胞；HT1080-V3為轉(zhuǎn)染了pCD-VEGF質(zhì)粒并且經(jīng)篩選后持續(xù)低表達(dá)VEGF的細(xì)胞。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明實(shí)施例中在強(qiáng)調(diào)所構(gòu)建的發(fā)卡式短干擾RNA結(jié)構(gòu)時(shí)用shRNA來表示，在強(qiáng)調(diào)短干擾RNA的效應(yīng)時(shí)用siRNA來表示。
以下實(shí)施例僅為幫助本領(lǐng)域技術(shù)人員進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不限制本發(fā)明。
實(shí)施例1VEGF shRNA靶序列及其DNA模板的設(shè)計(jì)shRNA靶序列的選擇，主要是遵循Tushl原則(Methods 2002，26199-213)，如盡量避免起始密碼子下游50個(gè)核苷酸之內(nèi)和終止密碼子上游100個(gè)核苷酸之內(nèi)的序列；由于5’或3’的非翻譯區(qū)及起始密碼子附近調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合位點(diǎn)較多，所以一般也不選擇這些部位；序列應(yīng)避免過高的GC含量，并且在序列中應(yīng)避免連續(xù)出現(xiàn)3個(gè)或3個(gè)以上的G，等等。
選擇完之后需要進(jìn)行Blast搜索，以確保靶序列與其它基因的同源性很低，盡可能保證設(shè)計(jì)的siRNA具有最大的特異性基因沉默效果及最小的非特異性毒性和脫靶(off-target)效應(yīng)。
靶序列設(shè)計(jì)完畢后，需要按照現(xiàn)有規(guī)則(Science 2002，296550-553)合成shRNA的DNA模板，該模板包括正義、反義兩條互補(bǔ)的短DNA單鏈，其正義鏈的基本單位為BamHI位點(diǎn)、靶序列正義鏈、9bp的環(huán)序列、靶序列反義鏈、連續(xù)6個(gè)T、HindIII位點(diǎn)，DNA模板總長64bp。
所設(shè)計(jì)的VEGF shRNA的mRNA靶序列和寡DNA序列如下mRNA靶序列5’-UGUGAAUGCAGACCAAAGA-3’(SEQ ID No 1)寡DNA序列正義鏈5’-GATCCCTGTGAATGCAGACCAAAGATTCAAGAGATCTTTGGTCTGCATTCACATTTTTTGGAAA-3′(SEQ ID No 2)反義鏈5’-AGCTTTTCCAAAAAATGTGAATGCAGACCAAAGATCTCTTGAATCTTTGGTCTGCATTCACAGG-3’(SEQ ID No 3)本發(fā)明采用了一個(gè)靶序列不與任何基因同源的MOCK shRNA，使用的MOCK-shRNA的mRNA靶序列和寡DNA引物序列如下mRNA靶序列5’-GGAUAGUACGAGAUUACAC-3’寡DNA序列正義鏈5′-GATCCCGGATAGTACGAGATTACACTTCAAGAGAGTGTAATCTCGTACTATCCTTTTTTGGAAA-3′反義鏈5′-AGCTTTTCCAAAAAAGGATAGTACGAGATTACACTCTCTTGAAGTGTAATCTCGTACTATCCGG-3′
DNA序列中的劃線部分表示轉(zhuǎn)錄后將在此處形成互補(bǔ)，形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。所用DNA序列由賽百盛公司合成。將合成的DNA序列稀釋至1μg/μl后，分別取2μl與46μl的退火緩沖液混合，退火，退火條件為90℃，3min；37℃，60min；-20℃保存?zhèn)溆谩Ｐ蛄型嘶鸷笮纬傻碾p鏈DNA的5’端有BamHI酶切位點(diǎn)的粘末端，3’端有HindIII酶切位點(diǎn)的粘末端，可以直接用于連接。
實(shí)施例2pCD-VEGF質(zhì)粒的構(gòu)建為了能使質(zhì)粒在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)長時(shí)間持續(xù)表達(dá)，質(zhì)粒載體中需要具有真核復(fù)制信號和啟動子。為此，本發(fā)明選擇了目前常用的真核表達(dá)載體pcDNA3.0的主要序列作為基本序列(圖1)。為防止其原有的CMV啟動子對shRNA序列的表達(dá)產(chǎn)生影響，采用限制性內(nèi)切酶切割將CMV啟動子去除，再連入用于shRNA表達(dá)的H1啟動子，具體步驟如下1)、采用BamHI和BglII內(nèi)切酶對pcDNA3.0進(jìn)行雙酶切，切去CMV啟動子。由于pcDNA3.0上只有一個(gè)BamHI和一個(gè)BglII酶切位點(diǎn)，因此，酶切后電泳僅出現(xiàn)兩條帶，長度分別為0.9kb和4.5kb左右，低熔點(diǎn)膠電泳后回收4.5kb左右大片段，將其連接后，形成一個(gè)長度為4.5kb左右的環(huán)形質(zhì)粒。
2)、在連接后的環(huán)形質(zhì)粒中，存在一個(gè)EcoRI和一個(gè)XhoI限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，對該質(zhì)粒用EcoRI和XhoI進(jìn)行酶切，并回收大片段(4518bp)，同時(shí)對pCSH1-1質(zhì)粒(專利申請?zhí)?00510066531.1)用EcoRI和XhoI進(jìn)行酶切，回收小片段(167bp)，將回收得到的大、小片段進(jìn)行連接，在連入人H1啟動子的同時(shí)，引入了BamHI和HindIII酶切位點(diǎn)，得到的質(zhì)粒長度為4685bp。
3)、將上一步得到的質(zhì)粒用BamH I和HindIII雙酶切，除去其中原有BamHI-HindIII片段(64bp)，回收大片段(4621bp)，與人工合成的VEGF核苷酸(64bp)退火后形成的短雙鏈DNA連接，獲得質(zhì)粒載體pCD-VEGF(4685bp)(圖2)。
采用SP6反向序列測序，測得VEGF shRNA表達(dá)單位反義鏈序列為5’-AGCTTTTCCAAAAAATGTGAATGCAGACCAAAGATCTCTTGAATCTTTGGTCTGCATTCACAGG-3’，結(jié)果與設(shè)計(jì)序列(SEQ ID No 3)一致。采用類似方法構(gòu)建對照MOCK shRNA表達(dá)序列的質(zhì)粒，命名為pCD-MOCK。
實(shí)施例3干擾序列表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染及持續(xù)表達(dá)shRNA序列的哺乳動物細(xì)胞株的篩選本發(fā)明采用LipofectAMINETM2000脂質(zhì)體(Life Technologies，貨號11668-027)轉(zhuǎn)染人纖維肉瘤細(xì)胞株HT1080，轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒質(zhì)量(μg)和脂質(zhì)體體積(μl)比例為1∶2.5。所用的質(zhì)粒濃度為2μg/ml。所有操作均按脂質(zhì)體說明書進(jìn)行。轉(zhuǎn)染完畢24小時(shí)后，給細(xì)胞換液，換成含400μg/ml G418的培養(yǎng)液。以后每隔2～3天給細(xì)胞換液。待對照組細(xì)胞(即未轉(zhuǎn)染任何質(zhì)粒組)全部死亡后，將轉(zhuǎn)染pCD-VEGF質(zhì)粒組的細(xì)胞和轉(zhuǎn)染pCD-MOCK質(zhì)粒組的的細(xì)胞消化下來，計(jì)數(shù)后，用選擇性培養(yǎng)液(含400μg/ml G418及10％FBS的MEM-EBSS培養(yǎng)液)稀釋，加入到96孔板中，使每個(gè)孔內(nèi)的細(xì)胞≤1個(gè)。待細(xì)胞長滿后，將96孔板中由單個(gè)細(xì)胞長出的克隆轉(zhuǎn)移至24孔板，再依次轉(zhuǎn)至6孔板和25cm2培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，長滿后傳代并進(jìn)行鑒定。
實(shí)施例4持續(xù)低表達(dá)VEGF的HT1080細(xì)胞的篩選將挑出的細(xì)胞克隆進(jìn)行ELISA分析和Western Blot檢測，以篩選出VEGF表達(dá)最低的克隆。
1)、ELISA分析將挑出的各細(xì)胞克隆以每孔8萬的細(xì)胞數(shù)鋪于24孔板中，培養(yǎng)48小時(shí)后，換成含2％FBS的MEM-EBSS培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，收集培養(yǎng)上清，14000g、4℃離心15分鐘除去細(xì)胞碎片，-80℃凍存待測。同時(shí)對24孔中的細(xì)胞進(jìn)行消化、計(jì)數(shù)。采用VEGF ELISA檢測試劑盒(R&D Systems，Minneapolis，MN)對細(xì)胞培養(yǎng)上清中的VEGF含量進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，HT1080-V3細(xì)胞株的VEGF分泌量最低，為對照組HT1080細(xì)胞的25.4％，HT1080-M組的30.5％(圖3)。
2)、Western Blotting檢測待挑出的各細(xì)胞克隆長滿細(xì)胞培養(yǎng)瓶后，用新鮮配制的細(xì)胞裂解液(50mMTris-HCl，pH7.5；1％NP-40；150mM NaCl；1mg/ml aprotinin；1mg/ml leupeptin；1mM Na3VO4；1mM NaF)裂解細(xì)胞，收集細(xì)胞總蛋白，并定量。用10％的SDS-PAGE膠進(jìn)行變性電泳分離各蛋白，半干轉(zhuǎn)膜儀(Amersham Biosciences，HoeferTE 70)將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF(聚偏二氟乙烯)膜上。轉(zhuǎn)完的膜浸于含5％(w/v)脫脂奶粉-TBS(10mM Tris HCl，pH 7.5，150mM NaCl)溶液中室溫振搖封閉過夜。隨后用TBS室溫潤洗5次，每次5分鐘，將膜裝入雜交袋，用含1％BSA(牛血清白蛋白)的TBS溶液稀釋第一抗體，室溫振搖，與膜孵育3小時(shí)后，再用TBS室溫潤洗5次，每次5分鐘。將膜裝入新的雜交袋內(nèi)，用二抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記)室溫孵育3小時(shí)，TBS室溫潤洗5次，每次5分鐘。膜上滴加化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)劑(Santa Cruz Biotechnology sc-2048)，按照試劑說明書進(jìn)行操作，通過化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)ChemiImager5500(Alpha Innotech.)捕獲圖像?？贵w的稀釋比例如下，兔多克隆VEGF抗體(Santa Cruz產(chǎn)品，sc-152)1/200稀釋，羊多克隆Actin抗體(Santa Cruz產(chǎn)品，sc-1616)1/400稀釋，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔抗體(ZB-2301)和辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗羊抗體(ZB-2306)1/2000稀釋。結(jié)果表明，HT1080-V3細(xì)胞中VEGF的表達(dá)量最低(圖4)，與ELISA分析一致。
上述兩個(gè)實(shí)驗(yàn)均在質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞3個(gè)月后進(jìn)行，并且中途經(jīng)歷了細(xì)胞凍存和復(fù)蘇過程，因此可以確認(rèn)，pCD-VEGF可在HT1080細(xì)胞內(nèi)長時(shí)間持續(xù)地表達(dá)出VEGF shRNA，從而抑制VEGF蛋白的分泌和表達(dá)。
實(shí)施例5Matrigel侵襲實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞對基底膜的侵襲能力采用Transwell小室培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行檢測。在Transwell小室8.0μm的聚碳酸酯膜上方光滑面涂上1mg/ml的Matrigel(一種可在體外模擬體內(nèi)基底膜環(huán)境的基質(zhì))100μl，在37℃，5％CO2條件下干燥過夜。下室加入含有5μg/ml fibronectin(纖連蛋白)的培養(yǎng)液600μl。收集長至對數(shù)期的各組細(xì)胞，分別消化、吹打成單個(gè)細(xì)胞，計(jì)數(shù)，將105個(gè)細(xì)胞懸浮于含1％FBS的培養(yǎng)液100μl中，加入Transwell上室，輕輕搖晃，使其分布均勻。在37℃，5％CO2的條件下孵育20小時(shí)，取出上室，將膜進(jìn)行H&E染色，并封片，于顯微鏡下計(jì)侵襲細(xì)胞數(shù)。每組細(xì)胞取10個(gè)隨機(jī)視野，計(jì)平均數(shù)。結(jié)果表明，pCD-VEGF可顯著抑制細(xì)胞的侵襲能力(圖5)，穿過基底膜的HT1080-V3的細(xì)胞數(shù)僅為對照組HT1080的26.8％，HT1080-M組的28.9％。
實(shí)施例6劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的運(yùn)動能力將對數(shù)生長期的各組細(xì)胞消化、計(jì)數(shù)，以1×105細(xì)胞/ml/孔鋪于24孔板中，每組細(xì)胞設(shè)3個(gè)平行孔。細(xì)胞在37℃，5％CO2的條件下培養(yǎng)72小時(shí)，待細(xì)胞長至100％融合，用20μl微量移液槍頭在24孔板中垂直劃痕，劃痕后用培養(yǎng)液沖洗兩次，洗去細(xì)胞碎片，12小時(shí)后觀察細(xì)胞傷痕合攏情況。結(jié)果表明，pCD-VEGF可削弱細(xì)胞的運(yùn)動能力。12小時(shí)后，HT1080和HT1080-M組細(xì)胞變細(xì)變窄，逐漸被細(xì)胞覆蓋，而HT1080-V3組細(xì)胞傷痕仍清晰可見(圖6)。
實(shí)施例7體內(nèi)成瘤性比較實(shí)驗(yàn)給裸鼠接種各組細(xì)胞，以評價(jià)pCD-VEGF對細(xì)胞的異種移植成瘤能力的影響。取對數(shù)生長期的HT1080-V3、HT1080-M和HT1080細(xì)胞消化、吹成單個(gè)細(xì)胞、計(jì)數(shù)，將細(xì)胞懸液接種于5周齡雌性BALB/c(nu/nu)裸小鼠右側(cè)腋窩皮下，每只裸鼠接種量為200μl，無血清MEM-EBSS培養(yǎng)液中含有2×105細(xì)胞。每組接種8只裸鼠。腫瘤接種時(shí)記錄裸鼠重量，每周2次。對照組在接種后一周左右出現(xiàn)可觸摸的瘤塊。通過測量可觸摸腫瘤的長徑(a)和短徑(b)，以公式體積＝1/2ab2來計(jì)算腫瘤體積。每周測量3次。結(jié)果表明，HT1080-V3組細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的成瘤性明顯低于HT1080和HT1080-MOCK組(圖7)。
權(quán)利要求
1.一種可穩(wěn)定表達(dá)VEGF shRNA的載體pCD-VEGF，其特征是所說載體系由pcDNA3.0基本序列、人H1啟動子和可表達(dá)VEGF shRNA的DNA模板序列所組成。
2.如權(quán)利要求1所述VEGF shRNA的載體pCD-VEGF，其特征是所說DNA模板序列是根據(jù)VEGF mRNA靶序列設(shè)計(jì)的，mRNA靶序列為5’-UGUGAAUGCAGACCAAAGA-3’(SEQ ID No 1)。
3.如權(quán)利要求1或2所述VEGF shRNA的載體pCD-VEGF，其特征是所說DNA模板序列系由寡DNA正義鏈和反義鏈序列組成，正義鏈5’-GATCCCTGTGAATGCAGACCAAAGATTCAAGAGATCTTTGGTCTGCATTCACATTTTTTGGAAA-3′(SEQ ID No 2)；反義鏈5’-AGCTTTTCCAAAAAATGTGAATGCAGACCAAAGATCTCTTGAATCTTTGGTCTGCATTCACAGG-3’(SEQ ID No 3)。
4.如權(quán)利要求1所述VEGF shRNA的載體pCD-VEGF在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種可在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)VEGF shRNA的載體以及所說載體在腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移中的抑制作用，研究結(jié)果表明，針對VEGF基因設(shè)計(jì)的pCD－VEGF載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，可削弱細(xì)胞對基底膜的侵襲能力，降低細(xì)胞的運(yùn)動能力，并且顯著抑制腫瘤細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的生長，預(yù)示pCD－VEGF有望開發(fā)成為一種有效的抗腫瘤新藥。
文檔編號A61P35/00GK1834254SQ20061007224
公開日2006年9月20日 申請日期2006年4月14日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月14日
發(fā)明者邵榮光, 張敏, 劉鐵剛, 何紅偉, 歐陽志鋼, 張勝華 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所