專利名稱：一種治療凍傷的黃酮類藥劑的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種治療凍傷的黃酮類藥劑的制備方法。
背景技術(shù)：
凍傷的化學(xué)藥物治療一般常用留體類抗炎藥、非留體類抗炎藥、血管活性藥、抗血小板藥及擴(kuò)充血容量藥物等。凍傷的中藥治療要求祛寒、行血化瘀、軟化損傷組織、改進(jìn)血液循環(huán)和防止感染等。傳統(tǒng)的治療凍傷的方法很多，有的以十滴水、復(fù)方山莨菪堿潰瘍性凍瘡膜、山莨菪堿、中草藥凍瘡膏、凍傷涂膜劑、凍瘡靈、風(fēng)痛靈、辣椒軟膏等對(duì)凍傷進(jìn)行治療；有的用家傳桃桂湯(含桃仁、桂枝、生姜等)治療凍傷；有的用當(dāng)歸、川芎、紅花、防風(fēng)、荊芥、羌活、獨(dú)活、白芷、芫花、甘草等同煎擦洗患處，治療凍傷；有的用透骨草、伸筋草、海桐皮、絡(luò)石藤、艾葉、蘇木、紅花、雞血藤、延胡索、五靈脂等置中等火焰上熬煮20min，熏后浸洗，五天為一療程，治愈；有的用紅花、赤芍、白鮮皮水煎去渣浸創(chuàng)面，治療凍傷；有的用甘草桂枝桔皮湯，即甘草、桂枝、桔皮加水煎煮，待溫?zé)釙r(shí)熏洗患處治療凍傷；有的用桂蘇酒，即桂枝、蘇木、各100g，細(xì)辛、艾葉、當(dāng)歸、生姜、花椒、樟腦、辣椒以酒精浸泡7天。無(wú)皮損者，外擦治療凍瘡；有的用紅靈酒，即當(dāng)歸、肉桂、紅花、花椒、干姜、樟腦、細(xì)辛等以酒精浸泡7d治療凍瘡；有的自制凍瘡酒，即大黃、黃柏、天冬、麥冬、辣椒、麻黃、干姜、甘草等用白酒滲漉，使用時(shí)溫水涂于患處，適于未破潰者；有的用松香、臘梅花等中藥醇浸物治療凍傷。有的用云南白藥酊治療凍瘡；有的用復(fù)方當(dāng)歸軟膏治療凍傷；有的用復(fù)方紅花軟膏治療凍瘡，據(jù)記載有效率達(dá)93.6% ;有的以細(xì)辛、川椒、桂枝、秦究、白芷、三七、生大黃、丹參、生甘草、樟腦等制成乳膏，外涂治療凍傷；有的由干辣椒、醋酸洗必泰、樟腦、干姜等自制凍瘡?fù)磕委焹霪?；櫻桃泡酒治療凍傷已被民間廣泛應(yīng)用且效果顯著，多種刊物上已有科普記載；有的曾取紅色較深的鮮櫻桃數(shù)枚，視涂搽面積而定，用手搓?duì)€，去核取汁，涂搽于冬日生凍瘡之處，同時(shí)按揉并曬干，24h后洗去，防治凍瘡百余例，療效顯著且不易復(fù)發(fā)。鮮櫻桃浸入80%的酒精中浸泡7天，涂抹凍傷處，對(duì) 初起凍傷可根治。中藥治療凍傷的有效經(jīng)驗(yàn)方很多，但現(xiàn)有的制劑多停留在醫(yī)院處方制劑水平上，不能廣泛推廣使用。而且，現(xiàn)有制劑組方復(fù)雜，基礎(chǔ)研究欠缺，且以傳統(tǒng)劑型為主。傳統(tǒng)劑型存在著一定缺陷，如湯劑使用不方便，酒劑、酊劑對(duì)皮膚有一定刺激性，皮膚有破損、潰瘍、創(chuàng)面則不宜涂敷；不宜用于已破潰的凍瘡，且容易引起接觸性皮炎等缺點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種成分單一、療效確切、使用方便治療凍傷的中藥新藥的一種治療凍傷的黃酮類藥劑的制備方法。本發(fā)明采用藥食同源的植物毛樓桃(Prunus tomentosa Thunb, PTTT),又稱山樓桃、野櫻桃，屬薔薇科野生或半野生植物，廣泛分布于我國(guó)的華北、西北及東北各地。單一的植物經(jīng)科學(xué)方法提取有效抗凍傷活性成分，經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)療效確切，組方簡(jiǎn)單、科學(xué)合理、使用方便、有利于推廣應(yīng)用。本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:黃酮類藥物的制備:①原材料:毛櫻桃提取物中抗凍傷的活性成份是黃酮類化合物(PrunusTomentosa Thunb Total Flavone7PTTTF) 采用紫外波譜分析、鹽酸-鎂粉反應(yīng)、三氯化招絡(luò)合反應(yīng)、鉛鹽反應(yīng)定性為黃酮類。②提取活性成分時(shí)，所用試劑為75%乙醇。③提取工藝步驟:稱取鮮毛櫻桃洗凈搗爛，去核得原液約，以1: 4體積比加入含I %鹽酸的75 %乙醇，超聲頻率為40KHZ，提取10-60min，回流提取l_6h，減壓濃縮使含醇量達(dá)75 %，然后避光靜置6-18h (蛋白質(zhì)、多糖等沉淀除去)，濾去沉淀，濾液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至近干。將濃縮物混懸分散于水中，過(guò)濾去除不溶物，濾液裝聚酰胺柱，加聚酰胺30倍量的水洗脫，棄去洗脫液，再加90%乙醇洗脫，至洗脫液無(wú)色，收集洗脫液并減壓濃縮，將濃縮物真空冷凍干燥，即得黃酮類藥物。所述藥物可以制成軟膏劑，軟膏劑的制備:①主藥成分為毛櫻桃活性提取物總黃酮；②處方中其它物料，單硬脂酸甘油酯，硬脂酸，白凡士林，液體石蠟，甘油，三乙醇胺，尼泊金乙酯，十二烷基硫酸鈉，蒸餾水；③制備工藝，將單硬脂酸甘油酯，硬脂酸，甘油，黃酮類藥物(油相)置于蒸發(fā)皿中，于80°C水浴上熔化，再將白凡士林，液體石蠟，`十二烷基硫酸鈉，三乙醇胺，尼泊金乙酯(水相)于水浴上加熱至80°C，將水相加入油相溶液中，邊加邊向同一方向攪拌至均勻。保持于80°C攪拌I 2分鐘，然后轉(zhuǎn)移至冷水浴中攪拌至室溫即得。④工藝條件，溫度80°C、潔凈環(huán)境條件下制備；本發(fā)明的藥物及其制劑主要用途是對(duì)凍傷具有明確的治療作用。毛櫻桃醇提取物的主要成分為黃酮類物質(zhì)，經(jīng)紫外-可見光掃描圖譜顯示很有可能為異黃酮、二氫黃酮及二氫黃酮醇類。醇提取工藝簡(jiǎn)單，無(wú)環(huán)境污染。聚酰胺柱色譜分離純化黃酮特異性高，產(chǎn)量較大，可以用來(lái)大量制備。使用時(shí)配制成IOmg πιΓ1，并調(diào)節(jié)pH至近中性，外用。配制的軟膏呈乳白色偏黃色，潤(rùn)滑，易于涂布，細(xì)膩，無(wú)粗糙感，性質(zhì)穩(wěn)定。放置一段時(shí)間后，不發(fā)生油水分離(破乳)。使用方便，易于清洗，不污染衣物。根據(jù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察:①毛櫻桃提取物黃酮類對(duì)兔耳局部?jī)鰝挠绊懀灰杂叶鲎陨韺?duì)照，造模后2h可見每組家兔左右耳均紅腫，且左右耳腫脹程度無(wú)明顯差異，毛櫻桃提取物組局部給藥第四天，可明顯抑制治療耳(左耳)炎癥局部毛細(xì)血管舒張、充血和水腫，而凍傷模型對(duì)照耳(右耳)炎癥局部毛細(xì)血管舒張、充血、水腫及青紫比較明顯，治療耳與對(duì)照耳比較，腫脹程度具有極顯著差異(P <0.001)，腫脹抑制率為26.84%，較陽(yáng)性對(duì)照組(腫脹抑制率為21.87%)治療作用明顯；給藥第七天，毛櫻桃提取物組治療耳充血水腫基本消退，治療耳與對(duì)照耳比較，腫脹程度具有極顯著差異(P
<0.001)，腫脹抑制率為32.52%，較陽(yáng)性對(duì)照組(腫脹抑制率29.68% )治療作用更明顯，對(duì)兔耳輕、中度凍傷有顯著的治療作用。組織病理學(xué)可見:毛櫻桃提取物組，Control耳光鏡下可見大量中性粒細(xì)胞滲出，紅細(xì)胞浸潤(rùn)，組織疏松水腫，而治療耳鏡下中性粒細(xì)胞少量滲出，無(wú)組織水腫；陽(yáng)性對(duì)照組對(duì)照耳，光鏡下可見大量中性粒細(xì)胞滲出，紅細(xì)胞浸潤(rùn)，組織疏松水腫，治療耳鏡下中性粒細(xì)胞少量滲出，組織水腫較輕。②毛櫻桃提取物黃酮類對(duì)小鼠巴豆油耳腫脹、角叉菜膠足腫脹、毛細(xì)血管通透性等影響；結(jié)果表明:與陰性對(duì)照組比較，毛櫻桃提取物50mg.kg-1能明顯減輕巴豆油所致的小鼠耳腫脹(P < 0.05)，腫脹抑制率為16.91%，毛櫻桃提取物IOOmg *kg-l顯著抑制巴豆油所致的小鼠耳腫脹(P < 0.01)，抑制率達(dá)25.23%，并有劑量依賴趨勢(shì)(見圖1)。結(jié)果表明:與Control組比較,毛樓桃提取物的IOOmg *kg-l劑量組均能明顯減輕角叉菜膠所致的小鼠左腿炎癥反應(yīng)，紅、腫等癥狀，顯著抑制角叉菜膠所致的小鼠足腫脹(P< 0.001)，抑制率達(dá) 57.82%。毛櫻桃提取物對(duì)醋酸所致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性增高的影響結(jié)果表明:與陰性對(duì)照組比較，毛櫻桃提取物IOmg.kg-Ι對(duì)小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性抑制率為12.2% (P > 0.05)，毛櫻桃提取物50mg.kg-1對(duì)小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性抑制率為20.67% (P < 0.05)，毛櫻桃提取物IOOmg.kg-Ι對(duì)小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性抑制率為37.6% (P < 0.01)，具有劑量依賴性(見圖2)。③毛櫻桃提取物黃酮類對(duì)凍傷小鼠血清PGE2、MDA、NO、TNF- a、IL-6含量及SOD活性的干預(yù)；通過(guò)對(duì)小鼠足部?jī)鰝M織勻漿檢測(cè)結(jié)果表明，與模型對(duì)照組比較，毛櫻桃提取物可明顯抑制小鼠足部?jī)鰝M織中PGE2生成，毛櫻桃提取物IOOmg.kg-Ι對(duì)PGE2生成的抑制率為 52.36% (P < 0.001)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:與模型對(duì)照組比較，毛櫻桃提取物可明顯抑制凍傷小鼠血中MDA生成，毛櫻桃提取物IOOmg.kg-Ι對(duì)MDA生成的抑制率為71.92% (P < 0.001)。結(jié)果表明:與模型對(duì)照組比較，毛櫻桃提取物可明顯提高凍傷小鼠血清SOD活性，毛櫻桃提取物IOOmg.kg-Ι對(duì)SOD活性的提高百分率為12.31% (P < 0.01)。結(jié)果表明:與模型對(duì)照組比較，毛櫻桃提取物可明顯減少凍傷小鼠血清中NO含量，毛櫻桃提取物IOOmg.kg-Ι對(duì)NO生成的抑制率為47.56% (P < 0.001)。④毛櫻桃提取物黃酮類對(duì)凍傷小鼠白細(xì)胞中IL-6及小鼠凍傷組織中MMP-9表達(dá)的干預(yù)。實(shí)驗(yàn)通過(guò)免疫組織化學(xué)手段對(duì)動(dòng)物凍傷組織進(jìn)行分析，以出現(xiàn)棕黃色物質(zhì)為表達(dá)陽(yáng)性，結(jié)果可見:小鼠足部?jī)鰝M織MMP-9的蛋白表達(dá)主要分布于皮下膠原細(xì)胞及血管內(nèi)皮中?？瞻讓?duì)照組小鼠足組織MMP-9表達(dá)不明顯(如圖3)。未見棕黃色、顆粒狀染色區(qū)。模型對(duì)照組小鼠足組織浸潤(rùn)的炎性細(xì)胞、新生血管的內(nèi)皮細(xì)胞胞漿及膠原纖維中MMP-9表達(dá)顯著增強(qiáng)，尤以潰瘍壞死區(qū)及新生血管內(nèi)皮區(qū)域?yàn)樯?，呈棕黃色顆粒狀，染色濃密(如圖
4);陽(yáng)性對(duì)照組和PTTTF組的MMP-9表達(dá)明顯弱于模型對(duì)照組，且炎性細(xì)胞少見(如圖5、6)。結(jié)論: 毛櫻桃提取物黃酮類對(duì)凍傷具有明確的治療作用，并有明確的抗炎作用、鎮(zhèn)痛作用和免疫調(diào)節(jié)作用。其主要作用可能是由于抑制TNF-a、IL-1 β、IL-6、PGE2、N0、MDA的生成及抑制MMP-9和提高SOD活性而實(shí)現(xiàn)的。臨床案例:(病例觀察:由北華大學(xué)附屬醫(yī)院提供。)78例門診患者，均為局部非凍結(jié)性凍傷，其中男38例，女40例；年齡最小6歲，最大者64歲。I度凍傷(凍傷局部紅腫、發(fā)癢、輕微刺痛或麻木)36例；II度凍傷(局部劇烈燒灼感，但感覺遲鈍，有明顯紅腫，并出現(xiàn)水泡)32例。凍傷部位分別為耳部、面部、手部、足部。治療方法:處方:單硬脂酸甘油酯4.5g硬脂酸IOg白凡士林5g液體石蠟15ml甘油IOg三乙醇胺0.22ml尼泊金乙酯0.5g 十二燒基硫酸鈉0.22g蒸餾水50m l藥物Ig取制備的毛櫻桃提取物軟膏劑，I度凍傷直接涂抹患處，然后用滅菌紗布包裹，每日2次；II度凍傷先在無(wú)菌的條件下操作，抽出水泡內(nèi)的水，然后涂抹藥物于患處，并用無(wú)菌紗布包裹，每日2-3次。7天為一個(gè)療程。治療結(jié)果:—療程治愈48例,兩療程治愈26例,三療程治愈4例。


圖.1毛櫻桃提取物對(duì)小鼠巴豆油耳腫脹的影響其中:i±s,η = 10，* P < 0.05，* * P < 0.01，* * * P < 0.001圖2毛櫻桃提取物對(duì)醋酸所致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性增高的影響其中士s ,η = 10，**Ρ < 0.01，***Ρ < 0.001 圖3為空白對(duì)照組毛櫻桃提取物對(duì)小鼠凍傷組織中ΜΜΡ-9表達(dá)的影響(X400)
圖4為模型對(duì)照組毛櫻桃提取物對(duì)小鼠凍傷組織中ΜΜΡ-9表達(dá)的影響(Χ400)圖5為毛櫻桃總黃酮組毛櫻桃提取物對(duì)小鼠凍傷組織中ΜΜΡ-9表達(dá)的影響(Χ400)圖6為陽(yáng)性對(duì)照組毛櫻桃提取物對(duì)小鼠凍傷組織中ΜΜΡ-9表達(dá)的影響(Χ400)
具體實(shí)施例方式下面通過(guò)具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步闡釋本發(fā)明，但本發(fā)明的內(nèi)容不限于此。實(shí)施例1稱取鮮毛櫻桃500g洗凈搗爛，去核得原液約400ml，以1: 4體積比加入含I %鹽酸的75%乙醇，超聲頻率為40KHz，提取40min，回流提取2h，減壓濃縮使含醇量達(dá)75%，然后避光4°C靜置12h(蛋白質(zhì)、多糖等沉淀除去)，濾去沉淀，濾液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至近干。將濃縮物混懸分散于水中，過(guò)濾去除不溶物，濾液裝聚酰胺柱，加聚酰胺30倍量的水洗脫，棄去洗脫液，再加90%乙醇洗脫，至洗脫液無(wú)色，收集洗脫液并減壓濃縮，將濃縮物真空冷凍干燥，即得黃酮類藥劑。采用HPLC法，以蘆丁為對(duì)照品，測(cè)得冷凍干燥物中總黃酮含量為68.3%，折合生藥含總黃酮量0.61%。實(shí)施例2軟膏劑黃酮類藥劑的制備:
將實(shí)施例1制得的黃酮類藥物與單硬脂酸甘油酯，硬脂酸，甘油(油相)置于蒸發(fā)皿中，于80°C水浴上熔化，再將白凡士林，液體石蠟，十二烷基硫酸鈉，三乙醇胺，尼泊金乙酯(水相)于水浴上加熱至80°C，將水相加入油相溶液中，邊加邊向同一方向攪拌至均勻。保持于80°C攪拌I 2分鐘，然后轉(zhuǎn)移至冷水浴中攪拌至室溫即得。
權(quán)利要求
1.一種治療凍傷的黃酮類藥劑的制備方法，包括以下步驟: 稱取鮮毛櫻桃洗凈搗爛，去核得原液約，以1: 4體積比加入含1%鹽酸的75%乙醇，超聲頻率為40KHz，提取10-60min，回流提取l_6h，減壓濃縮使含醇量達(dá)75%，然后避光靜置6-18h濾去沉淀，濾液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至近干；將濃縮物混懸分散于水中，過(guò)濾去除不溶物，濾液裝聚酰胺柱，加聚酰胺30倍量的水洗脫，棄去洗脫液，再加90 %乙醇洗脫，至洗脫液無(wú)色，收集洗脫液并減壓濃縮，將濃縮物真空冷凍干燥，即得黃酮類藥物。
2.權(quán)利要求1所述的一種治療凍傷的黃酮類藥劑的制備方法，其特征在于，所述黃酮類藥劑可以為軟膏劑。
3.權(quán)利要求2所述的一種治療凍傷的黃酮類藥劑的制備方法，其特征在于，所述軟膏劑采用如下工藝制取: 將單硬脂酸甘油酯，硬脂酸，甘油，黃酮類藥物置于蒸發(fā)皿中，于80°C水浴上熔化，再將白凡士林，液體石蠟，十二烷基硫酸鈉，三乙醇胺，尼泊金乙酯于水浴上加熱至80°C，將水相加入油相溶液中，邊加邊向同一方向攪拌至均勻；保持于80°C攪拌I 2分鐘，然后轉(zhuǎn)移至冷水浴中攪拌至室 溫即得軟膏劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種治療凍傷的黃酮類藥劑的制備方法，稱取鮮毛櫻桃洗凈搗爛，去核得原液約，以1∶4體積比加入含1％鹽酸的75％乙醇，超聲頻率為40KHz，提取10-60min，回流提取1-6h，減壓濃縮使含醇量達(dá)75％，然后避光靜置6-18h濾去沉淀，濾液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至近干。將濃縮物混懸分散于水中，過(guò)濾去除不溶物，濾液裝聚酰胺柱，加聚酰胺30倍量的水洗脫，棄去洗脫液，再加90％乙醇洗脫，至洗脫液無(wú)色，收集洗脫液并減壓濃縮，將濃縮物真空冷凍干燥，即得。本發(fā)明提供了一種成分單一、療效確切、使用方便的治療凍傷的黃酮類藥劑。
文檔編號(hào)A61K9/06GK103181961SQ201110455480
公開日2013年7月3日 申請(qǐng)日期2011年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月30日
發(fā)明者張成義, 王喜斌, 陳曦 申請(qǐng)人:北華大學(xué)