專利名稱：Lect2蛋白及l(fā)ect2蛋白變體在制藥中應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及LECT2蛋白的應(yīng)用，具體涉及LECT2蛋白及LECT2蛋白變體在制藥中應(yīng)用。
背景技術(shù)：
白細(xì)胞衍生趨化因子(leukocyte cell-derived chemotaxin 2，LECT2 蛋白)是一個多功能的蛋白質(zhì)，分子量約為16 kDa，含三個分子內(nèi)二硫鍵，該分子結(jié)構(gòu)簡單，無糖基修飾。LECT2 —開始被認(rèn)為是一種嗜中性粒細(xì)胞趨化因子，隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)它還與骨骼和血管生長、肝移植損傷修復(fù)、植物毒素、非病原抗原等引起的病理和生理過程有關(guān)，如公布號為CN102159238，名稱為抑制病理性血管發(fā)生作用的組合物，就公開了包括有效量的LECT2蛋白或其類似物(LECT2蛋白變體)制備成抑制病理性血管發(fā)生作用和/或細(xì)胞增生性疾病的組合物。但是目前尚未有發(fā)現(xiàn)LECT2對巨噬細(xì)胞活性的影響以及對細(xì)菌性敗血癥的預(yù)防和治療作用。細(xì)菌性敗血癥是一種由細(xì)菌感染(革蘭氏陰性或革蘭氏陽性細(xì)菌)引起，產(chǎn)生強(qiáng)烈全身性炎癥反應(yīng)的疾病，引發(fā)或自發(fā)凝血、嚴(yán)重低血壓、多器官衰竭、休克并最終導(dǎo)致死亡； 通常諸如肺炎、外傷、外科手術(shù)和燒傷等事件或由諸如癌癥或AIDS等病癥會并發(fā)細(xì)菌性敗血癥。治療細(xì)菌性敗血癥的已知方法包括抗菌劑、抗體、小分子多肽、蛋白質(zhì)C、靜脈輸液和可提高血壓的藥物，如美國專利申請案第20030008822號中揭示使用抗IL-18抗體來治療細(xì)菌性敗血癥。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供LECT2蛋白及LECT2蛋白變體在制藥中應(yīng)用； LECT2蛋白及LECT2蛋白變體可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞活性變化，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞吞噬能力增強(qiáng)，對預(yù)防和治療細(xì)菌性敗血癥有效。本發(fā)明的上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為LECT2蛋白及LECT2蛋白變體在制藥中應(yīng)用，具體是在制備提高巨噬細(xì)胞的吞噬能力和/或預(yù)防和治療細(xì)菌性敗血癥藥物中的應(yīng)用。所述LECT2蛋白變體為所述LECT2蛋白的氨基酸序列修飾產(chǎn)物，包括改變、置換、 取代、插入或缺失編碼序列中的一個氨基酸或復(fù)數(shù)個氨基酸獲得，所述LECT2蛋白變體至少有60%氨基酸序列與LECT2蛋白的基酸序列相同。所述LECT2蛋白為重組LECT2蛋白；重組LECT2蛋白的制備可以依據(jù)Ovejero等公幵的 “Identification of the leukocyte cell-derived chemotaxin 2 as a direct target gene of beta-catenin in the liver，，( Hepatologyj 2004 年 7 月、40(1)， 167-176 )方法進(jìn)行制備，在此不作敘述。LECT2蛋白、LECT2蛋白變體可在哺乳動物中提取，可以依據(jù)可以依據(jù)Yamagoe 等公開白勺“Purification and primary amino acid sequence of a novel neutrophil chemotactic factor LECT2”( Immunol Lett, 1996年8 月、52 (1)，9-13)方法進(jìn)行提取，或者在動物細(xì)胞、低等真核生物或原核生物中重組表達(dá)。如包括猴COS細(xì)胞、CHO細(xì)胞、人類腎臟293細(xì)胞、人類表皮A431細(xì)胞、人類Colo205細(xì)胞、3T3細(xì)胞、CV-I細(xì)胞、其它經(jīng)轉(zhuǎn)化的靈長類細(xì)胞、正常的二倍體細(xì)胞、由體外培養(yǎng)的原生組織衍生的細(xì)胞株、原生移植體、Hela 細(xì)胞、老鼠L細(xì)胞、BHK、HL-60、U937、HaK或Jurkat細(xì)胞等動物細(xì)胞中提取?？稍诎ㄋ诰屏阎辰湍?Schizosaccharomyces 辦< )、克魯維酵母菌株(.Kluyveromyces strains、、免、 球菌屬(Candida)或任何可表達(dá)異源性蛋白的酵母菌中表達(dá)得到重組LECT2蛋白。或在包括大腸桿菌(fecAericAia co/i)、枯草芽孢桿菌UaciBm subtil is),鼠傷寒沙門氏菌或細(xì)菌等原核生物進(jìn)行表達(dá)得到重組LECT2蛋白；LECT2蛋白或重組LECT2蛋白進(jìn)一步可修飾為LECT2蛋白變體或重組LECT2蛋白變體，例如于適當(dāng)?shù)奈恢眠M(jìn)行磷酸化或糖基化，仍具有提高巨噬細(xì)胞的吞噬能力和預(yù)防和治療細(xì)菌性敗血癥的功能。LECT2蛋白或LECT2蛋白變體藥物，可以是純制劑，也可以是與藥學(xué)上可接受的載體組成的各種制劑，如注射劑、口服液、丸劑、片劑、膠囊等?？梢允强诜?、非腸胃吸入、直腸、 陰道、皮內(nèi)、經(jīng)皮或局部給予；本發(fā)明的LECT2蛋白或LECT2蛋白變體可一次給予，對小時內(nèi)多次給予或連續(xù)給予，劑量可以為每天純LECT2蛋白及LECT2蛋白變體0. 1 -50 μ g /g體重。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于LECT2蛋白及LECT2蛋白變體在制藥中應(yīng)用， 具體是在制備提高巨噬細(xì)胞的吞噬能力和/或預(yù)防和治療細(xì)菌性敗血癥藥物中的應(yīng)用， 其中LECT2蛋白變體為LECT2蛋白序列的修飾產(chǎn)物，包括改變、置換、取代、插入或缺失編碼序列中的一個氨基酸或復(fù)數(shù)個氨基酸獲得，LECT2蛋白變體至少有60%氨基酸序列與 LECT2蛋白氨的基酸序列相同；該LECT2蛋白及LECT2蛋白變體可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞活性變化，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞吞噬能力增強(qiáng)，可以預(yù)防和治療由細(xì)菌入侵引起的敗血癥，小鼠細(xì)菌性敗血癥模型的治療率可達(dá)40%以上。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。實(shí)施例1
每毫升巨噬細(xì)胞用5μ g的LECT2蛋白或LECT2蛋白變體(至少有60%氨基酸序列與 LECT2蛋白氨的基酸序列相同)處理M h，對照例用相同劑量的生理水處理，然后用熒光球 (美國Molecular Probes公司)采用熒光顯微鏡觀察巨噬細(xì)胞的吞噬能力，結(jié)果表明，生理水處理的對照例中巨噬細(xì)胞平均吞噬熒光微球為4. 2個/個細(xì)胞，LECT2蛋白處理的每個巨噬細(xì)胞平均吞噬熒光微球為8. 7個/個細(xì)胞，LECT2蛋白變體處理的每個巨噬細(xì)胞平均吞噬熒光微球為7. 9個/個細(xì)胞；說明LECT2或LECT2蛋白變體處理能顯著提高巨噬細(xì)胞數(shù)量，即巨噬細(xì)胞的吞噬能力增強(qiáng)。實(shí)施例2
對小鼠腹腔注射IO8 CFU/g體重的大腸桿菌(五C^i)或者IO6 CFU/g體重銅綠假單胞菌(A)，建立小鼠敗血癥模型，兩種致病菌在上述注射濃度下，48 h可致半
數(shù)以上小鼠得敗血癥死亡。大腸桿菌致病菌注射以后30 min，腹腔注射LECT2蛋白(注射量0.5 μ g/g體重)，銅綠假單胞菌注射以后30 min，腹腔注射LECT2蛋白變體(60%以上氨基酸序列與LECT2蛋白的基酸序列相同，注射量0.5 yg/g體重)，同時都設(shè)空白對照(同劑量生理鹽水)。比較注射后48 h、96 h及最終小鼠存活率，大腸桿菌感染的空白對照小鼠48 h存活率為43%左右，96 h及最終存活率為17%左右，大腸桿菌感染后注射LECT2蛋白小鼠 48 h存活率為84%左右，96 h及最終存活率為63%左右；銅綠假單胞菌感染的空白對照小鼠48 h存活率為18%左右，96 h及最終存活率為5%左右，銅綠假單胞菌感染后注射LECT2 蛋白變體小鼠48 h存活率為66%左右，96 h及最終存活率為43%左右；說明注射LECT2蛋白或注射LECT2蛋白變體對預(yù)防和治療由細(xì)菌入侵引起的敗血癥有效，且療效顯著。同時比較注射后96 h小鼠肝組織中大腸桿菌及銅綠假單胞菌的菌落數(shù)，空白對照小鼠96 h的大腸桿菌菌落數(shù)為42000左右，注射LECT2蛋白小鼠96 h的大腸桿菌菌落數(shù)為10000左右； 空白對照小鼠96 h的銅綠假單胞菌菌落數(shù)為3800左右，注射LECT2蛋白變體小鼠96 h的銅綠假單胞菌菌落數(shù)為500左右；說明注射LECT2蛋白或注射LECT2蛋白變體對大腸桿菌或銅綠假單胞菌的清除明顯。 上述實(shí)施例1、2的LECT2或LECT2蛋白變體可以是直接從動物中提取，也可以重組得到。
權(quán)利要求
1.LECT2蛋白及LECT2蛋白變體在制藥中應(yīng)用，其特征在于在制備提高巨噬細(xì)胞的吞噬能力和/或預(yù)防和治療細(xì)菌性敗血癥藥物中的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1所述的LECT2蛋白及LECT2蛋白變體在制藥中應(yīng)用，其特征在于所述 LECT2蛋白變體為所述LECT2蛋白的氨基酸序列修飾產(chǎn)物，包括改變、置換、取代、插入或缺失編碼序列中的一個氨基酸或復(fù)數(shù)個氨基酸獲得，所述LECT2蛋白變體至少有60%氨基酸序列與LECT2蛋白的基酸序列相同。
3.如權(quán)利要求1所述的LECT2蛋白及LECT2蛋白變體在制藥中應(yīng)用，其特征在于所述 LECT2蛋白為重組LECT2蛋白。
全文摘要
本發(fā)明公開了LECT2蛋白及LECT2蛋白變體在制藥中應(yīng)用，具體是在制備提高巨噬細(xì)胞的吞噬能力和/或預(yù)防和治療細(xì)菌性敗血癥藥物中的應(yīng)用，其中LECT2蛋白變體為LECT2蛋白序列的修飾產(chǎn)物，包括改變、置換、取代、插入或缺失編碼序列中的一個氨基酸或復(fù)數(shù)個氨基酸獲得，LECT2蛋白變體至少有60%氨基酸序列與LECT2蛋白氨的基酸序列相同；該LECT2蛋白及LECT2蛋白變體可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞活性變化，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞吞噬能力增強(qiáng)，可以預(yù)防和治療由細(xì)菌入侵引起的敗血癥，小鼠細(xì)菌性敗血癥模型的治療率可達(dá)40%以上。
文檔編號A61P37/04GK102552882SQ20111043405
公開日2012年7月11日 申請日期2011年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月22日
發(fā)明者史雨紅, 呂技能, 章瑞程, 虞朝暉, 裘芳, 陸新江, 陳炯 申請人:寧波大學(xué), 杭州永能生物科技有限公司, 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院