專利名稱：白藜蘆醇在制備治療P2X₃介導(dǎo)慢性痛疾病的藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及鎮(zhèn)痛藥物用途發(fā)明領(lǐng)域，尤其是涉及可用于防治疼痛的白藜蘆醇在制備治療P2&介導(dǎo)慢性痛疾病(如神經(jīng)病理痛)的藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
疼痛是大多數(shù)疾病具有的共同癥狀，是人類共有而個(gè)體差異很大的一種不愉快的感覺。由于疼痛給人們?cè)斐蓸O大痛苦，據(jù)2001年第二期《國(guó)際疼痛學(xué)會(huì)通迅》報(bào)道美國(guó) 106次國(guó)會(huì)通過(guò)一項(xiàng)決議，宣布從2001年元月一日起的十年為“疼痛控制和研究的十年” (Decade of Pain Control and Research)。由此說(shuō)明各國(guó)對(duì)疼痛研究的重視。根據(jù)疼痛時(shí)程可將疼痛分為急性痛(生理性痛)和慢性痛(病理性痛)。由于慢性痛機(jī)理復(fù)雜，其治療成為臨床上的難題。神經(jīng)病理痛是指由神經(jīng)系統(tǒng)損傷或疾病所引起的慢性痛綜合征，常常表現(xiàn)為自發(fā)性的疼痛，對(duì)機(jī)械、冷、熱等傷害性剌激會(huì)產(chǎn)生痛覺過(guò)敏；對(duì)非傷害性剌激會(huì)產(chǎn)生觸誘發(fā)痛、痛覺倒錯(cuò)和燒灼痛等神經(jīng)病理性痛覺過(guò)敏。由于慢性痛的持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，對(duì)人身心健康危害較大，其研究成為疼痛領(lǐng)域的熱點(diǎn)和重點(diǎn)。嘌呤類物質(zhì)三磷酸腺苷(ATP)作為重要的信使物質(zhì)參與痛覺信息傳遞。嘌呤 (Purine)受體分為嘌呤1和嘌呤2 (Purine LPurine 2 ;P1，P2)受體，ATP及其類似物作用于P2受體。P2受體分為配體門控性離子通道型受體(P2X受體)和G蛋白偶聯(lián)型受體(P2Y 受體)。P2X受體有七種亞型(P2X")。英國(guó)“自然”雜志報(bào)道ATP作用的P2&受體(P2X受體的一種亞型)特異性地在感覺傳入的背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglia, DRG)神經(jīng)元克隆表達(dá)。背根神經(jīng)節(jié)是初級(jí)感覺神經(jīng)。疼痛、傷害性剌激使損傷細(xì)胞、應(yīng)激細(xì)胞以及感覺神經(jīng)末梢本身釋放大量ATP，ATP及其作用的P2X受體涉及痛覺及傷害性信息在初級(jí)感覺神經(jīng)元的傳遞，其中主要是同聚性P2&受體參與初級(jí)感覺神經(jīng)元的痛覺及傷害性信息傳遞。基因敲除P2&受體的小鼠減小了對(duì)福爾馬林致痛試驗(yàn)的兩相反應(yīng)。P2&受體介導(dǎo)神經(jīng)病理痛的痛覺傳遞。神經(jīng)病理痛剌激時(shí)，P2X3受體和P2X3mRNA表達(dá)增加，感覺神經(jīng)元P2&受體介導(dǎo) ATP激活的門控通道電流明顯增強(qiáng)。應(yīng)用P2&受體反義寡核苷酸及RNA干擾技術(shù)可使炎性痛大鼠模型背根神經(jīng)節(jié)的P2&受體水平下調(diào)，進(jìn)而明顯減輕P2&受體激動(dòng)劑α，β -meATP 和福爾馬林所致的足底傷害性反應(yīng)。這些發(fā)現(xiàn)為神經(jīng)病理痛的發(fā)病機(jī)理提供了新的依據(jù)。 申請(qǐng)人:實(shí)驗(yàn)室以前的研究也顯示燒傷可導(dǎo)致背根感覺神經(jīng)元P2&受體表達(dá)增加。目前國(guó)外已有研究生產(chǎn)P2&受體拮抗劑(如R03)用于臨床治療疼痛的報(bào)道。目前化學(xué)藥物鎮(zhèn)痛仍是最主要的疼痛治療手段，主要包括阿片類鎮(zhèn)痛藥、中樞作用的非阿片類鎮(zhèn)痛藥、作用于外周的抗炎鎮(zhèn)痛藥和復(fù)方抗炎鎮(zhèn)痛藥。但阿片類等鎮(zhèn)痛藥物的副作用如呼吸抑制、惡心、嘔吐、嗜睡、尿潴留等發(fā)生率較高，而且長(zhǎng)期應(yīng)用易產(chǎn)生藥物耐受與依賴以及突然停藥導(dǎo)致的戒斷綜合征。消炎痛(Indometacin，吲哚美辛)為非甾體類抗炎藥，具有解熱、鎮(zhèn)痛及抗炎等作用，其作用機(jī)理為通過(guò)對(duì)環(huán)氧酶的抑制而減少前列腺素的合成，制止炎癥組織痛覺神經(jīng)沖動(dòng)的形成，抑制炎性反應(yīng)，包括抑制白細(xì)胞的趨化性及溶酶體酶的釋放等。由于消炎痛有多種嚴(yán)重的副作用，影響其使用范圍。因此，尋找以新的分
3子靶標(biāo)為基礎(chǔ)的鎮(zhèn)痛藥物成為目前的研究熱點(diǎn)和面臨的首要任務(wù)。白藜蘆醇(Reseratrol，Res)，化學(xué)名3，4，，5.三羥基二苯乙烯，屬于非黃酮類多酚化合物，具有抗腫瘤、抗心血管疾病、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗菌抗病毒、抗衰老及雌激素樣活性等。白藜蘆醇具有順式和反式兩種結(jié)構(gòu)，以反式結(jié)構(gòu)占主導(dǎo)地位。白藜蘆醇具有抗炎作用，可能具有抗傷害性反應(yīng)和影響痛覺的作用，但目前尚無(wú)白藜蘆醇直接具有鎮(zhèn)痛作用的報(bào)道，臨床上也無(wú)白藜蘆醇通過(guò)鎮(zhèn)痛作用機(jī)制進(jìn)行疼痛治療的報(bào)道。白藜蘆醇的嘌呤\受體(P2&受體)特異性拮抗劑作用作為相關(guān)應(yīng)用研究的藥物制劑具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供白藜蘆醇的第一個(gè)新用途，即白藜蘆醇在制備治療慢性痛的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供白藜蘆醇的第二個(gè)新用途，即白藜蘆醇在制備嘌呤 X3受體(P2X3受體)特異性拮抗劑的藥物中的應(yīng)用。白藜蘆醇可減輕神經(jīng)病理痛(慢性痛)行為反應(yīng)。白藜蘆醇在治療慢性痛的作用機(jī)理為阻斷P2&受體介導(dǎo)的疼痛信息傳遞，產(chǎn)生防治疼痛的作用。為了更好地理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，下面以實(shí)驗(yàn)和結(jié)果來(lái)證明白藜蘆醇的用途。一、材料和方法 1. 1動(dòng)物和分組
雄性SD大鼠，220-250g，南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部提供。將大鼠隨機(jī)分成5組， 每組12只。實(shí)驗(yàn)分組假手術(shù)組(sham組)；白藜蘆醇單獨(dú)對(duì)照組(Control+Reseratrol， Control+RES 組)；坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷組(Chronic constriction injury, CCI 組)； 坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷+白藜蘆醇處理組(CCI + Reseratrol，CCI+RES組);坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷+消炎痛處理組(CCI+hdocin，CCI+Indo組)。白藜蘆醇注射液溶解于生理鹽水，濃度為50 mg/ml。假手術(shù)組(sham)切開皮膚暴露坐骨神經(jīng)，不結(jié)扎神經(jīng)即縫合皮膚； 白藜蘆醇單獨(dú)對(duì)照組(Control+RES組)每天腹腔注射白藜蘆醇注射液Gml/kg);坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷+白藜蘆醇處理組(CCI+RES組)CCI術(shù)后第1天開始每天腹腔注射白藜蘆醇注射液Gml/kg)。坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷+消炎痛處理組(CCI+hdo組)實(shí)驗(yàn)大鼠于術(shù)前半小時(shí)和術(shù)后每天腹腔注射消炎痛-g/kg/d，每天一次至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。1.2藥物與試劑
白藜蘆醇(反式白藜蘆醇)，純度98%以上，陜西森弗生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；硫噴妥鈉，上海新亞藥業(yè)有限公司(生產(chǎn)批號(hào)050101);消炎痛片，廣東華南藥業(yè)有限公司生產(chǎn) (生產(chǎn)批號(hào)040801) ；SP試劑盒，原位雜交試劑盒及DAB試劑盒(北京中山生物技術(shù)有限公司)；P2X3抗體購(gòu)自美國(guó)CHEMIC0N INTERNATIONAL公司。1.3主要儀器
BME-403 Von Frey細(xì)絲(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所)；BME-410C型全自動(dòng)熱痛刺激儀(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所)；消毒紗布、手巾、棉簽等，碘酒及75% 酒精，手術(shù)器械包剪刀、眼科小彎鑷、血管鉗、絲線、有齒鑷、神經(jīng)剝離子等。1. 4慢性神經(jīng)病理痛模型制作
用硫噴妥鈉麻醉大鼠(30mg/kg，腹腔注射)，在無(wú)菌條件下于大鼠右大腿后外側(cè)切開皮膚，鈍性分離出坐骨神經(jīng)，以4-0含鉻腸線輕度結(jié)扎坐骨神經(jīng)，共結(jié)扎4道，每個(gè)結(jié)之間間隔約1mm。結(jié)扎過(guò)程中可見坐骨神經(jīng)被結(jié)扎處直徑略減小，并伴有右后肢一過(guò)性抽動(dòng)，并注意不要結(jié)扎太緊以至于完全阻斷神經(jīng)外周的血流。大鼠術(shù)后單籠飼養(yǎng)，分別于術(shù)前(Od)及術(shù)后1，3，5，7，9，11，14 d測(cè)量機(jī)械縮足反射閾值和熱縮足反射潛伏期(測(cè)定時(shí)間恒定于每日10 00-14 00，室溫維持在22士0.5 °C)。1. 5神經(jīng)病理痛大鼠機(jī)械痛敏檢測(cè)
用BME-403 Von Frey細(xì)絲(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所)測(cè)定機(jī)械縮足反射閾值(mechanical withdrawal threshold, MWT)。置大鼠于透明的有機(jī)玻璃箱 (22X 12X22cm3)中，有機(jī)玻璃箱底為1 X Icm2的鐵絲網(wǎng)。術(shù)后大鼠放置于實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，測(cè)試前將大鼠放在有機(jī)玻璃箱中適應(yīng)15 min。折力分別為0. 13，0.20，0.33，0.60，1.30， 3. 60，5. 00，7. 30，9. 90，20. lg，折力彡20. Ig時(shí)均記為20. Igo從最小折力開始，每根試驗(yàn)10次，直至出現(xiàn)縮足反射次數(shù)大于5 /10，即50%反應(yīng)閾值(即引起10次試驗(yàn)中5次反應(yīng)的值。重復(fù)三次，取其平均值)。每次刺激間隔時(shí)間至少大于15s，并待刺激引起的反應(yīng)(如舔足、甩腿等)完全消失。1. 6神經(jīng)病理痛大鼠熱痛敏檢測(cè)
將有機(jī)玻璃箱置于3mm厚的玻璃板上，用BME-410C型全自動(dòng)熱痛刺激儀(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所)照射大鼠足底。熱輻射刺激儀照射大鼠足底至出現(xiàn)抬腿回避時(shí)間為熱縮足反射潛伏期(thermal withdrawal latency, TWL)。切斷時(shí)間為30秒，以防止組織灼傷。1. 7大鼠背根神經(jīng)節(jié)(DRG) P2&受體的表達(dá)
五組實(shí)驗(yàn)大鼠于術(shù)后第14天腹腔注射硫噴妥鈉(30mg/kg)深麻醉，經(jīng)升主動(dòng)脈灌注 4%多聚甲醛(0. lmol/L PB，pH7. 4)，分離出大鼠L4、L5段DRG，取出固定，放入4%多聚甲醛/0. ImPBS(含0. 1%DEPC)中固定2小時(shí)，用20%蔗糖脫水，在恒冷箱切片機(jī)上行冰凍切片，厚度為15 urn.放入4%的多聚甲醛中保存。每只大鼠的DRG切片隔5張取一張二步法免疫組織化學(xué)染色測(cè)定DRG神經(jīng)元細(xì)胞P2)(3受體的表達(dá)，DAB顯色。與此同時(shí)對(duì) DRG切片進(jìn)行原位雜交測(cè)定P2&受體mRNA的表達(dá)，雜交前所用液體和器皿都經(jīng)0. 1 %的 DEPC嚴(yán)格處理。冰凍切片在0. 05%的H2A室溫下作用30分鐘，以去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶， 胃蛋白酶消化1 一 2分鐘，37 °(預(yù)雜交液中孵育2小時(shí)，棄去預(yù)雜交液，轉(zhuǎn)入雜交液于水浴中37 °C過(guò)夜。次日，用梯度枸櫞酸鹽水(2XSSC，0. 5XSSC和0. 2XSSC)沖洗切片各15分鐘。入37 °C封閉液30分鐘，轉(zhuǎn)入生物素化的地高辛中37 °C孵育30分鐘，0.05%的PBS 沖洗15分鐘，相繼在SABC-POD和生物素化的過(guò)氧化物酶中各孵育30分鐘，DAB顯色。結(jié)果用圖像分析系統(tǒng)軟件(武漢天平影像技術(shù)有限公司，HMIAS-2000高清晰彩色醫(yī)學(xué)圖文分析系統(tǒng))對(duì)P2&陽(yáng)性神經(jīng)元進(jìn)行平均光密度值分析。逆轉(zhuǎn)錄-多聚酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)測(cè)定P2&受體mRNA的表達(dá)。蛋白印跡(Western blotting)測(cè)定P2&受體蛋白的表達(dá)。1. 8實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)處理
_各組數(shù)據(jù)以X 士 Sem表示。多組間比較用單因素方差分析，繼以最小顯著差法 (LSD)行兩兩比較。用SPSS11.0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。P <0.05為差異有顯著性。二、結(jié)果
白藜蘆醇對(duì)P2&受體介導(dǎo)的神經(jīng)病理痛作用的研究結(jié)果。
各組大鼠術(shù)后均未見肢體運(yùn)動(dòng)障礙和自殘現(xiàn)象。1. 1行為學(xué)研究
1. 1. 1神經(jīng)病理痛大鼠熱痛敏檢測(cè)白藜蘆醇對(duì)CCI大鼠TWL的影響(每組n=6，數(shù)據(jù)用均數(shù)士 SEM表示)。坐骨神經(jīng)被結(jié)扎4天后神經(jīng)病理痛模型基本形成，坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷組(Chronic constriction injury，CCI)和坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷+白藜蘆醇處理組(CCI+ Reseratrol，CCI+RES)的熱縮足反射潛伏期(thermal withdrawal latency, TffL)較假手術(shù)組(sham)、單獨(dú)白藜蘆醇組(Control +Reseratrol, Control+RES)和坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷+消炎痛處理組(CCI+Indo)顯著性下降(p<0.01)，而sham組、 Control+RES組和CCI+hdo組之間相比較無(wú)顯著性差異(p>0. 05)。CCI+ RES組熱縮足反射潛伏期與sham組和Control+RES組之間相比較仍下降(p<0. 05)，但與CCI組之間比較顯著性增加(P<0.01)。14d后，CCI+ RES熱縮足反射潛伏期與sham組之間相比較無(wú)顯著性意義(p>0. 05)，而較CCI組增大(p<0. 01)。坐骨神經(jīng)被結(jié)扎4d后，CCI+Indo組與CCI 組實(shí)驗(yàn)大鼠比較其熱縮足反射潛伏期增大，有明顯差異(P<0. 01)，與sham組、Control+RES 組相比無(wú)明顯差異性(P>0. 05)。見圖1。1. 1. 2神經(jīng)病理痛大鼠機(jī)械痛敏檢測(cè)
坐骨神經(jīng)被結(jié)扎4d后神經(jīng)病理痛模型基本形成，CCI組和CCI+ RES組與sham組、 Control+RES組和CCI+Indo組相比，其機(jī)械縮足反射閾值(mechanical withdrawal threshold, MWT)顯著性下降(p<0. 01)，而 sham 組、Control+RES 組和 CCI+hdo 組之間相比較無(wú)顯著性差異(p>0.05)。坐骨神經(jīng)被結(jié)扎7d后，雖CCI + RES組與sham組相比， 其機(jī)械縮足反射閾值(mechanical withdrawal threshold, MWT)仍低(p<0. 05)，但較 CCI 組的機(jī)械縮足反射閾值(mechanical withdrawal threshold, MWT)顯著增加(p<0. 01 )。 CCI+Indo與CCI組實(shí)驗(yàn)大鼠比較其機(jī)械縮足反射閾值增大，有明顯差異(p<0. 01)，與sham 組、Control+RES組相比無(wú)明顯差異性(p>0. 05)。見圖2。1. 1. 3大鼠背根神經(jīng)節(jié)(DRG) P2X3受體的表達(dá)變化
術(shù)后14d，用免疫組織化學(xué)方法測(cè)定大鼠1^4丄5手術(shù)側(cè)背根神經(jīng)節(jié)(DRG)P2)(3受體的表達(dá)。每只大鼠背根神經(jīng)fL4、L5段切片中隔5張取一張切片，用圖像分析系統(tǒng)軟件分析P2& 陽(yáng)性神經(jīng)元的灰度變化。免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Sham組，Control+RES組，CCI+Indo組， CCI組，CCI+RES組大鼠手術(shù)側(cè)L4/5段背根神經(jīng)節(jié)(L4/5 DRG)P2X3受體蛋白表達(dá)的平均光密度值分別是 0. 200士0. 017(n=10) ,0. 198士0. 012(n=10) ,0. 224士 0. 008(n=10) ,0. 270士 0. 007(n=10),0. 200 士 0. 012(n=10)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，CCI組實(shí)驗(yàn)大鼠背根神經(jīng)節(jié)P2)(3 受體蛋白的表達(dá)明顯高于Sham組，Control+RES組，CCI+Indo組，CCI+RES組(ρ<0· 01)； Sham組，Control+RES組，CCI+Indo組，CCI+RES組之間P2&受體蛋白的表達(dá)無(wú)顯著性差異 (ρ>0· 05) ；CCI+RES組與CCI組相比L4/5 DRG P2X3受體蛋白的表達(dá)明顯下降(ρ <0. 01)， CCI+Indo組與CCI組相比P2X3受體蛋白的表達(dá)下降(P <0. 05)。白藜蘆醇(RES)對(duì)P2X3受體表達(dá)的抑制作用較消炎痛(Indo)明顯。見圖3。1.1.4大鼠背根神經(jīng)節(jié)(DRG) P2X3受體mRNA的表達(dá)變化
原位雜交技術(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Sham組，Control+RES組，CCI+Indo組，CCI組， CCI+RES組大鼠手術(shù)側(cè)L4/5段背根神經(jīng)節(jié)(L4/5 DRG) P2X3受體mRNA的平均光密度值分別是 0. 411 士 0. 029(n=10)，0. 397 士 0. 024(n=10)，0. 454 士 0. 019 (n=10)，0. 516 士0. 027(n=10),0. 396 士 0. 025(n=10)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，CCI組實(shí)驗(yàn)大鼠背根神經(jīng)節(jié)P2X3 受體 mRNA 的表達(dá)明顯高于 Sham 組，Control+RES 組，CCMndo 組，CCI+RES 組(ρ<0· 01)； Sham組，Control+RES組，CCI+Indo組之間P2&受體mRNA的表達(dá)無(wú)顯著性差異(p>0. 05)； CCI+RES組與CCI組相比L4/5 DRG P2&受體mRNA的表達(dá)明顯下降(ρ <0. 01), CCI+Indo 組與CCI組相比P2&受體mRNA的表達(dá)下降(ρ <0.05)。白藜蘆醇(RES)對(duì)P2&受體mRNA 表達(dá)的抑制作用較消炎痛(Indo)明顯。見圖4。1.1.5 RT-PCR檢測(cè)大鼠背根神經(jīng)節(jié)(DRG) P2X3的mRNA表達(dá)變化
SD 大鼠(體重 200 士20g)隨機(jī)分為 Siam 組，Control+RES 組，CCI+Indo 組，CCI 組， CCI+RES 組。引物設(shè)計(jì)選用β -actin作為內(nèi)參，引物序列如下 Primer P2X3 (產(chǎn)物長(zhǎng)度為 519bp)
S 5’ 一 CAACTTCAGGTTTGCCAAA 一 3’ A 5' - TGAACAGTGAGGGCCTAGAT 一 3' Primer β -actin (產(chǎn)物長(zhǎng)度為 MObp) S 5' - TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT 一 3' A 5' - CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC 一 3'
采用凝膠成像系統(tǒng)讀取目的電泳條帶的斑點(diǎn)密度(平均光密度)掃描值，將P2&條帶與其對(duì)應(yīng)的β -actin條帶的比值作為P2& mRNA表達(dá)的相對(duì)量。結(jié)果顯示，原位雜交技術(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示 Sham 組，Control+RES 組，CCI+Indo 組，CCI 組，CCI+RES 組 P2)(3 mRNA 表達(dá)相對(duì)量(經(jīng)對(duì)應(yīng)的 β-actin 標(biāo)化后)分別為0. 515士0.047 (n=8)、0. 525士0. 055 (n=8)、 0.603士0.018 (n=8)、0. 763士0. 033 (n=8)和 0. 5 士0. 026 (n=8)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，CCI 組實(shí)驗(yàn)大鼠背根神經(jīng)節(jié)P2&受體mRNA的表達(dá)明顯高于Sham組，Control+RES組，CCI+Indo 組，CCI+RES組(p<0. OD5Sham組，Control+RES組之間P2&受體mRNA的表達(dá)無(wú)顯著性差異 (ρ>0· 05) ；CCI+RES 組與 CCI 組相比 L4/5 DRG P2X3 受體 mRNA 的表達(dá)明顯下降(ρ <0. 01)， CCI+Indo組與CCI組相比P2X3受體mRNA的表達(dá)下降(ρ <0. 05)。白藜蘆醇(RES)對(duì)P2X3 受體mRNA表達(dá)的抑制作用較消炎痛(Indo)明顯。見圖5。1. 1. 6蛋白印跡檢測(cè)大鼠背根神經(jīng)節(jié)(DRG)P2X3蛋白表達(dá)變化
蛋白印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Sham組，Control+RES組，CCI+Indo組，CCI組，CCI+RES組大鼠手術(shù)側(cè)L4/5段背根神經(jīng)節(jié)(L4/5 DRG) P2X3受體蛋白表達(dá)的平均光密度值(經(jīng)對(duì)應(yīng)的 β-actin 標(biāo)化后)分別是 0. 759士 0. 012 (n=3)，0. 805士 0.022 (n=3)，0. 9833士 0.044 (η=3)，1·473士 0. 084(η=3)，0. 826士 0. 029 (η=3)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，CCI 組實(shí)驗(yàn)大鼠背根神經(jīng)節(jié)Ρ2)(3受體蛋白的表達(dá)明顯高于Sham組，Control+RES組，CCI+hdo組，CCI+RES 組(ρ<0· 01) ；Sham組，Control +RES組之間P2X3受體蛋白的表達(dá)無(wú)顯著性差異(p>0. 05)； CCI+RES組與CCI組相比L4/5 DRG P2&受體蛋白的表達(dá)明顯下降(ρ <0. 01 )，CCI+Indo組與CCI組相比P2&受體蛋白的表達(dá)下降(ρ <0.05)。白藜蘆醇(RES)對(duì)P2&受體蛋白表達(dá)的抑制作用較消炎痛(Indo)明顯。見圖6。1. 1. 7
申請(qǐng)人實(shí)驗(yàn)室的研究發(fā)現(xiàn)了白藜蘆醇可減輕神經(jīng)病理痛大鼠的痛行為反應(yīng)。非留體類抗炎鎮(zhèn)痛藥消炎痛處理組可明顯減輕CCI模型大鼠的機(jī)械和熱痛敏反應(yīng)，但對(duì)CCI模型大鼠背根初級(jí)感覺神經(jīng)細(xì)胞P2&受體表達(dá)的影響低于白藜蘆醇處理組。根據(jù)白藜蘆醇減小神經(jīng)病理痛大鼠背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元P2&受體的表達(dá)的研究結(jié)果，表明白藜蘆醇減輕慢性疼痛的作用機(jī)理是阻斷P2&受體介導(dǎo)的疼痛信息傳遞，具有防治疼痛的作用。此外，由于P2&嘌呤受體(P2X3受體)涉及體內(nèi)許多生理功能和病理作用，探尋出新的P2&受體特異性拮抗劑，將極大地推動(dòng)嘌呤信息系統(tǒng)在體內(nèi)各種生理功能和病理作用的研究工作。


圖1為白藜蘆醇神經(jīng)病理痛大鼠熱痛敏的影響圖，包括假手術(shù)組(Sham)、單獨(dú)白藜蘆醇組(Control+RES)、坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷組(CCI)、坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷+ 白藜蘆醇處理組(CCI+RES)、坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷+消炎痛處理組(CCI+Indo)；
圖2為白藜蘆醇神經(jīng)病理痛大鼠機(jī)械痛敏的影響圖，包括假手術(shù)組(Sham)、單獨(dú)白藜蘆醇組(Control+RES)、坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷組(CCI)、坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷+白藜蘆醇處理組(CCI+RES)、坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷+消炎痛處理組(CCI+Indo)；
圖3為免疫組織化學(xué)檢測(cè)白藜蘆醇對(duì)神經(jīng)病理痛大鼠背根神經(jīng)節(jié)P2&受體免疫反應(yīng)性的影響圖，包括假手術(shù)組(Sham),單獨(dú)白藜蘆醇組(Control+RES)、坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷組(CCI )、坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷+白藜蘆醇處理組(CCI+RES)、坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷+消炎痛處理組(CCI+Indo)；
圖4為原位雜交技術(shù)實(shí)驗(yàn)觀察白藜蘆醇對(duì)神經(jīng)病理痛大鼠背根神經(jīng)節(jié)P2&受體mRNA 表達(dá)的影響圖，包括假手術(shù)組(Sham)、單獨(dú)白藜蘆醇組(Control+RES)、坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷組(CCI)、坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷+白藜蘆醇處理組(CCI+RES)、坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷+消炎痛處理組(CCI+Indo)；
圖5為RT-PCR檢測(cè)白藜蘆醇對(duì)神經(jīng)病理痛大鼠背根神經(jīng)節(jié)P2&受體mRNA表達(dá)的影響圖，包括假手術(shù)組(Sham)、單獨(dú)白藜蘆醇組(Control+RES)、坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷組(CCI )、坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷+白藜蘆醇處理組(CCI+RES)、坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷+消炎痛處理組(CCI+Indo)；
圖6為蛋白印跡技術(shù)觀察白藜蘆醇對(duì)神經(jīng)病理痛大鼠背根神經(jīng)節(jié)P2&受體蛋白表達(dá)的影響圖，包括假手術(shù)組(Sham),單獨(dú)白藜蘆醇組(Control+RES)、坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷組(CCI)、坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷+白藜蘆醇處理組(CCI+RES)、坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷+消炎痛處理組(CCI+Indo)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例并對(duì)照附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。實(shí)施例1
用本技術(shù)領(lǐng)域公知的方法，制成適用于慢性痛治療的口服、注射或局部(如局敷)的白藜蘆醇制劑。與非留體類抗炎鎮(zhèn)痛藥消炎痛處理組大鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果相比表明白藜蘆醇是作用于P2)(3受體產(chǎn)生鎮(zhèn)痛效應(yīng)。相對(duì)于阿片類等鎮(zhèn)痛藥物的副作用大易產(chǎn)生藥物耐受與依賴以及戒斷綜合征，消炎痛等抗炎鎮(zhèn)痛藥毒副作用大等不足之處，白藜蘆醇毒副作用小，更利于其作為鎮(zhèn)痛藥物的開發(fā)應(yīng)用。
實(shí)施例2
用本技術(shù)領(lǐng)域公知的方法，制成適用于涉及P2&受體拮抗劑用于P2)(3受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的科學(xué)研究的白藜蘆醇制劑。通過(guò)該制劑的應(yīng)用研究為白藜蘆醇可能成為P2)(3受體介導(dǎo)疾病防治的藥物提供前期基礎(chǔ)。
權(quán)利要求
1.白藜蘆醇在制備治療慢性痛的藥物中的應(yīng)用。
2.白藜蘆醇在制備嘌呤\受體(P2&受體)特異性拮抗劑的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及白藜蘆醇在制藥領(lǐng)域中的新用途，即白藜蘆醇在制備P2X3介導(dǎo)慢性痛(神經(jīng)病理痛)藥物中的應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)觀察到白藜蘆醇可抑制痛覺行為反應(yīng)，進(jìn)而應(yīng)用免疫組化、原位雜交、RT-PCR及蛋白印跡等技術(shù)觀察到白藜蘆醇可抑制神經(jīng)病理痛模型大鼠背根神經(jīng)節(jié)P2X3受體的mRNA和蛋白表達(dá)。實(shí)驗(yàn)證實(shí)白藜蘆醇對(duì)慢性疼痛具有抑制作用的機(jī)理是拮抗初級(jí)感覺神經(jīng)節(jié)P2X3受體介導(dǎo)的痛覺信息傳遞。本發(fā)明為防治慢性疼痛(神經(jīng)病理痛)探明新方法，同時(shí)還表明白藜蘆醇具有P2X3受體拮抗劑的作用，這將有助于白藜蘆醇在制備嘌呤X3受體(P2X3受體)特異性拮抗劑的藥物中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61K31/05GK102389406SQ20111043104
公開日2012年3月28日 申請(qǐng)日期2011年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月21日
發(fā)明者劉雙梅, 彭海英, 李桂林, 梁尚棟, 涂桂花, 謝金燕 申請(qǐng)人:南昌大學(xué)