專(zhuān)利名稱(chēng)：一組動(dòng)物源性陽(yáng)離子抗菌肽及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一組新型動(dòng)物源性陽(yáng)離子抗菌肽及其衍生物在治療細(xì)菌感染的應(yīng)用， 抗菌肽可以抑制微生物的生長(zhǎng)，并制備成藥物組合物用于治療和預(yù)防由多種微生物所引起的感染，其中所述微生物包括革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌。
背景技術(shù)：
細(xì)菌感染性一直是威脅人類(lèi)生命的重要疾病之一，上個(gè)世紀(jì)30年代抗生素的發(fā)現(xiàn)并廣泛應(yīng)用于臨床治療，拯救了無(wú)數(shù)患者的生命(Neu，H.C. (1992) Science 257,1064-1073)。由于傳統(tǒng)抗生素的大量使用導(dǎo)致了耐藥病原微生物的迅速增長(zhǎng)。因此， 現(xiàn)在亟待開(kāi)發(fā)新型抗藥物以應(yīng)對(duì)世界范圍內(nèi)日益嚴(yán)重的病源菌的耐藥性(Travis，J. 1994 Science 264,360-362) 細(xì)菌性感染的防治是長(zhǎng)期以來(lái)困擾人們的重要難題，特別是細(xì)菌耐藥性的出現(xiàn)， 更突出了問(wèn)題的復(fù)雜性和解決問(wèn)題的迫切性。由于陽(yáng)離子抗菌肽作用機(jī)理獨(dú)特，體外未有耐藥菌株產(chǎn)生，且許多陽(yáng)離子抗菌肽的抗菌譜廣，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌及陰性菌均有作用，使它極可能成為傳統(tǒng)抗生素的理想替代品?？咕脑谧匀唤绶植紡V泛，是生物體產(chǎn)生的抵御外源性感染的內(nèi)源性物質(zhì)，歷經(jīng)數(shù)百萬(wàn)年而很少產(chǎn)生耐受性，具有作用迅速、高效、廣譜等特點(diǎn)。因而當(dāng)其發(fā)現(xiàn)之時(shí)，就引起了藥學(xué)界及高科技生物產(chǎn)業(yè)界的關(guān)注(Koczulla AR, Bals R. 2003. Drugs 63,389-406)?？咕氖且活?lèi)廣泛存在于微生物及動(dòng)植物體內(nèi)的小分子多肽，通常由30多個(gè)氨基酸殘基組成，分子量為2-7KDa?？咕牡臍⒕鷻C(jī)制在于它能破壞細(xì)菌的細(xì)胞膜，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物溢出，最終引起細(xì)菌死亡。陽(yáng)離子抗菌肽可以代表一類(lèi)新型的抗菌藥物，雖然陽(yáng)離子抗菌肽的作用機(jī)制還沒(méi)有確定，但幾乎所有兩親性陽(yáng)離子抗菌肽都與細(xì)胞膜產(chǎn)生相互作用，因而細(xì)胞膜是眾多抗菌肽的主要作用靶點(diǎn)?？咕姆肿涌稍诩?xì)胞膜上聚集而導(dǎo)致其通透性增加，致使細(xì)胞膜破裂而凋亡。因此，以細(xì)胞膜為靶點(diǎn)的抗菌肽幾乎不產(chǎn)生耐藥性，原因是產(chǎn)生抗藥性需要細(xì)胞膜脂質(zhì)成分發(fā)生實(shí)質(zhì)性改變。目前，在眾多抗菌肽中，陽(yáng)離子型的牛乳鐵蛋白素(Lactoferricin B)是最為常見(jiàn)的抗菌肽，特別是其抗菌核心序列Lactoferricin B4^9RRffQffR (Arg-Arg-Trp-Gln-Trp-Arg)依然有良好的抗菌活性，但是依然存在抗菌活性低、溶血毒性等問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種具有顯著抑制細(xì)菌生長(zhǎng)且長(zhǎng)效、無(wú)溶血毒性的新型動(dòng)物源性陽(yáng)離子抗菌肽及其衍生物；以及提供具有人工合成方便，成本低的制備方法。
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本發(fā)明目的的另一目的是提供所述新型動(dòng)物源性陽(yáng)離子抗菌肽及其衍生物的用途。實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)手段是一組動(dòng)物源性陽(yáng)離子抗菌肽，其特征在于，是對(duì)天然牛乳鐵素抗菌肽序列、結(jié)構(gòu)分析的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)合成，該抗菌肽序列包括
CQUT-a :Phe Arg Trp Trp Gln Arg ； CQUT-b :Arg Arg Gln Trp Phe Trp0一組動(dòng)物源性陽(yáng)離子抗菌肽系列，其特征在于，包括上述序列，還包括以上所述多肽或衍生物中N末端和/或C末端的修飾、氨基酸的取代、替換、環(huán)化、L-型氨基酸變D-型氨基酸、缺失或加入而得到的功能類(lèi)似的多肽或擬肽。進(jìn)一步，所述動(dòng)物源性陽(yáng)離子抗菌肽，在治療細(xì)菌感染的應(yīng)用。以及在抑制微生物的生長(zhǎng)，并制備成藥物組合物用于治療和預(yù)防由多種微生物所引起的感染，其中所述微生物包括革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌。本發(fā)明在已有天然發(fā)現(xiàn)的抗菌肽序列Lactoferricin B4_9 RRffQffR的基礎(chǔ)上，結(jié)合虛擬組合庫(kù)設(shè)計(jì)技術(shù)，DNAstar, Bioedit, sequence logo等分析軟件和網(wǎng)站，設(shè)計(jì)了一組含有6個(gè)氨基酸天然多肽序列，該組多肽相比LfcinB4_9極大提高了抗菌肽的殺菌和抑菌活性，且解決了 LfcinB4_9的溶血毒性問(wèn)題。相比天然動(dòng)物源型陽(yáng)離子抗菌肽，本發(fā)明具有顯著抑制細(xì)菌生長(zhǎng)且長(zhǎng)效、無(wú)溶血毒性的作用。本發(fā)明的一組動(dòng)物源性陽(yáng)離子抗菌肽還包括以上所述多肽或衍生物中N末端和/ 或C末端的修飾、氨基酸的取代、替換、環(huán)化、L-型氨基酸變D-型氨基酸、缺失或加入而得到的功能類(lèi)似的多肽或擬肽。本發(fā)明抗菌肽其制備方法可以是固相化學(xué)法直接合成。制備的抗菌肽通過(guò)質(zhì)譜鑒定。本發(fā)明抗菌肽在高效殺菌的同時(shí)也有可能作用于高等有機(jī)體包括人體細(xì)胞，因?yàn)榭咕牡淖饔梅绞蕉季窃诩?xì)胞膜上穿孔致使細(xì)胞發(fā)生滲漏死亡。所以，將抗菌肽能否使紅細(xì)胞發(fā)生滲漏作為其是否具有毒性的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，如果抗菌肽能使紅細(xì)胞中的血紅蛋白發(fā)生滲漏，可以通過(guò)檢測(cè)OD49tl值確定毒性的大小。本發(fā)明還檢測(cè)了抗菌肽對(duì)人體紅細(xì)胞的溶血活性，實(shí)驗(yàn)表明，在高濃度下抗菌肽溶血率依然非常低，說(shuō)明本發(fā)明抗菌肽的溶血毒性極綜上所述，本發(fā)明提供一組新型人工設(shè)計(jì)動(dòng)物源性型陽(yáng)離子抗菌肽的抗菌肽。這些抗菌肽可方便地采用固相化學(xué)法。該合成抗菌肽對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌具有廣譜殺傷活性，并較天然抗菌肽有更強(qiáng)的殺菌活性，且對(duì)動(dòng)、植物細(xì)胞無(wú)任何毒害作用。本發(fā)明所述一組新型動(dòng)物源性陽(yáng)離子抗菌肽抗菌譜廣、不需要任何修飾連接且結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、人工合成方便。實(shí)驗(yàn)證明無(wú)論是G+菌(革蘭氏陽(yáng)性菌)還是G—菌(革蘭氏陰性菌)都有顯著的抑菌和殺菌活性且持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)、無(wú)溶血毒性，顯示其在治療細(xì)菌感染疾病藥物的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用方面具有重要價(jià)值。


圖1是抗菌肽CQUT-a的質(zhì)譜圖；圖2是抗菌肽CQUT-b的質(zhì)譜圖。圖1中，MS參數(shù)
進(jìn)樣量anjection Volume) 1. 00 μ 1 ；分子量(MW) :978. 68 ；氣流量離子源 (Probe):ESI ；
DL 管的溫度(DL Temp) 300° C ；霧化器的流速(Gas Flow) 1. 5L/min ； 加熱快的溫度(Block Temp) 250° C ；流動(dòng)相的流速(T. Flow) :0. 2ml/min ； 流動(dòng)相的比例(B. conc) :50%H20/50%ACN。圖2中，MS參數(shù)
進(jìn)樣量 Gnjection Volume) 1. 00 μ 1 ；分子量(MW) 1008. 14 ；氣流量離子源 (Probe):ESI ；
DL 管的溫度(DL Temp) 300° C ；霧化器的流速(Gas Flow) 1. 5L/min ； 加熱快的溫度(Block Temp) 250° C ；流動(dòng)相的流速(T. Flow) :0. 2ml/min ； 流動(dòng)相的比例(B. conc) :50%H20/50%ACN。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明涉及的一組動(dòng)物源性陽(yáng)離子抗菌肽，是對(duì)天然牛乳鐵素抗菌肽序列、結(jié)構(gòu)分析的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)合成，該系列抗菌肽序列包括
序列 1 抗菌肽序列 CQUT-a =Phe Arg Trp Trp Gln Arg ； 序列 2 抗菌肽序列 CQUT-b :Arg Arg Gln Trp Phe Trp。本發(fā)明的構(gòu)思如下基礎(chǔ)Lactoferricin B4_9RRWQWR序列，經(jīng)過(guò)多次試驗(yàn)研究出本發(fā)明中的多肽序列，實(shí)驗(yàn)表明該系列新型動(dòng)物源性陽(yáng)離子抗菌肽均具有顯著抗菌活性，而且相比LfcinB4_9均未出現(xiàn)溶血毒性，有望用于治療細(xì)菌感染的新藥研究和開(kāi)發(fā)。為了深入研究本發(fā)明中生物活性抗菌肽結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，利用美國(guó)應(yīng)用系統(tǒng)生物公司生產(chǎn)的Pioneer多肽合成儀制備本發(fā)明中多肽和作為對(duì)照的抗菌肽，以供實(shí)驗(yàn)研利用瓊脂空板穴擴(kuò)散法和96孔板法檢測(cè)多肽的殺菌和抑菌活性，以預(yù)先合成的天然抗菌肽Lactoferricin B4_9RRWQWR為對(duì)照，進(jìn)行殺菌活性檢測(cè)，結(jié)果表明本發(fā)明中抗菌肽的殺菌活性顯著強(qiáng)于對(duì)照抗菌肽的殺菌活性。新型動(dòng)物源性陽(yáng)離子抗菌肽CQUT-ει，CQUT-b及對(duì)照抗菌肽Lactoferricin B4_9的固相合成。按照標(biāo)準(zhǔn)的Fmoc固相程序人工合成抗菌肽 CQUT-a (Phe-Arg-Trp-Trp-Gln-Arg)、CQUT-b (Arg-Arg-Gln-Trp-Phe-Trp)及對(duì)照抗菌肽 Lactoferricin B4_9 (Arg-Arg-Trp-Gln-Trp- Arg)合成肽經(jīng)反相 HPLC (Vydac 218TP1022 柱2.2X25cm)純化，采用乙腈/水/三氟乙酸系統(tǒng)洗脫，MALDI-T0F和EPI質(zhì)譜分析?？咕暮铣捎缮虾Ｗ嫌蛏锟萍加邢薰?Shanghai Ziyu Biotechnology Co. , Ltd. Shanghai, China)。1.抗菌肽的制備(以制備0. Immol量的CQUT_a為例) 以下所有制備抗菌肽的試劑均購(gòu)于美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司。
制備的CQUT-a 多肽序列為=Phe-Arg-Trp-Trp-Gln-Arg-NH2
制備從C端到N端逐個(gè)進(jìn)行，由合成儀自動(dòng)控制。首先稱(chēng)量0. Immol的結(jié)合了第一個(gè)氨基酸即Phe的樹(shù)脂(購(gòu)于美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)，裝柱，再用20%哌啶二甲基甲酰胺溶液保護(hù)，二甲基甲酰胺清洗，9-笏甲氧羰基(Fmoc)保護(hù)的游離氨基酸溶解于碳二亞胺 (DCC)，羥基苯并三唑(HOBt)/二異丙基乙基胺(DIPEA)，溶解后的溶液在柱上循環(huán)偶合反應(yīng)30min，三氟乙酸(TFA)清洗重復(fù)以上脫保護(hù)到偶合反應(yīng)步驟直到制備結(jié)束(具體操作步驟見(jiàn)pioneer多肽合成儀操作指南)，以乙醚將三氟乙酸中的多肽析出，清洗，形成固體粗品多肽。2.抗菌肽的純化
稱(chēng)量IOOmg干燥后的多肽，溶于0. 1%三氟乙酸10ml，樣品處理后反相液相色譜 (RP-HPLC)進(jìn)行純化。體系為0. 1%三氟乙酸(TFA)的H2O和0. 1%的乙腈(ACN)，收集洗脫峰。將液相色譜(HPLC)中純化出來(lái)的目標(biāo)峰放置凍干機(jī)(_50°C )中凍干，后再次進(jìn)行質(zhì)譜(MS)確認(rèn)正確與否，HPLC檢測(cè)純度。3.抗菌肽的鑒定
如圖1所示，制備的抗菌肽CQUT-a經(jīng)過(guò)質(zhì)譜(MQ分析，CQUT-a在質(zhì)譜圖中顯示計(jì)算出CQUT-a的分子量為978. 68。由多肽序列計(jì)算出的理論值為978. 12。證明制備的多肽即為設(shè)計(jì)的CQUT-a抗菌肽。鑒定合格的抗菌肽產(chǎn)物備用。抗菌肽CQUT-b及對(duì)照抗菌肽Lactoferricin B4_9采用類(lèi)似于CQUT_a抗菌肽的制備方法制備。1、動(dòng)物源性陽(yáng)離子抗菌肽的殺菌活性檢測(cè)
以下實(shí)施例中所使用的各種菌株購(gòu)于中國(guó)生物制品檢定所。采用瓊脂板擴(kuò)散法對(duì)動(dòng)物源型陽(yáng)離子抗菌肽的殺菌活性進(jìn)行檢測(cè)，并用固相化學(xué)法合成的抗菌肽Lactoferricin B4_9RRWQWR作為對(duì)照，以評(píng)價(jià)本發(fā)明中的兩條抗菌肽 CQUT-a和CQUT-b的殺菌活性。按以下步驟進(jìn)行測(cè)定抗菌肽的殺菌活性
菌種復(fù)蘇，接種斜面37°C培養(yǎng)過(guò)夜，挑菌于普通LB培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)過(guò)夜，稀釋菌液使菌濃度為IO5 IO6Cfu /ml，按每個(gè)平板100 μ 1菌液接種于15ml LB固體培養(yǎng)皿中，待凝固后，涂布均勻后，打孔5mm，3個(gè)/平板，分別加入濃度1 mg/ml 10 μ 1合成抗菌肽溶液和 LfcinB4^9溶液及超純水(LfcinB4_9作為陽(yáng)性對(duì)照，超純水作為陰性對(duì)照)，4°C靜置池后，將平板置于37°C培養(yǎng)他后，測(cè)量抑菌圈大小，判定殺菌能力，同時(shí)觀察抑菌圈在7d之內(nèi)的變化，判定殺菌持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)短。結(jié)果見(jiàn)表1。表1 1 mg/ml三種抗菌肽對(duì)不同細(xì)菌的抗菌活性的測(cè)定比較
權(quán)利要求
1.一組動(dòng)物源性陽(yáng)離子抗菌肽，其特征在于，該抗菌肽序列包括 CQUT-a :Phe Arg Trp Trp Gln Arg ；CQUT-b :Arg Arg Gln Trp Phe Trp0
2.一組動(dòng)物源性陽(yáng)離子抗菌肽系列，其特征在于，包括權(quán)利要求1所述序列，還包括多肽或衍生物中N末端和/或C末端的修飾、氨基酸的取代、替換、環(huán)化、L-型氨基酸變D-型氨基酸、缺失或加入而得到的功能類(lèi)似的多肽或擬肽。
3.如權(quán)利要求1所述動(dòng)物源性陽(yáng)離子抗菌肽，其特征在于，在治療細(xì)菌感染的應(yīng)用。
4.如權(quán)利要求1所述動(dòng)物源性陽(yáng)離子抗菌肽，其特征在于，在抑制微生物的生長(zhǎng)，并制備成藥物組合物用于治療和預(yù)防由多種微生物所引起的感染，其中所述微生物包括革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌。
5.如權(quán)利要求2所述動(dòng)物源性陽(yáng)離子抗菌肽系列，其特征在于，在治療細(xì)菌感染的應(yīng)用。
6.如權(quán)利要求2所述動(dòng)物源性陽(yáng)離子抗菌肽系列，其特征在于，在抑制微生物的生長(zhǎng)， 并制備成藥物組合物用于治療和預(yù)防由多種微生物所引起的感染，其中所述微生物包括革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌。
全文摘要
本發(fā)明提供一組新型人工設(shè)計(jì)動(dòng)物源性型陽(yáng)離子抗菌肽，是對(duì)天然牛乳鐵素抗菌肽序列、結(jié)構(gòu)分析的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)合成，該系列抗菌肽序列如下CQUT-aPheArgTrpTrpGlnArg；CQUT-bArgArgGlnTrpPheTrp。所述抗菌肽采用固相化學(xué)法獲得。本發(fā)明動(dòng)物源性陽(yáng)離子抗菌肽抗菌譜廣、不需要任何修飾連接且結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、人工合成方便。實(shí)驗(yàn)證明無(wú)論是G+菌(革蘭氏陽(yáng)性菌)還是G-菌(革蘭氏陰性菌)都有顯著的抑菌和殺菌活性且持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)、無(wú)溶血毒性，顯示其在治療細(xì)菌感染疾病藥物的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用方面具有重要價(jià)值。
文檔編號(hào)A61K38/08GK102391362SQ20111041461
公開(kāi)日2012年3月28日 申請(qǐng)日期2011年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月13日
發(fā)明者丁元, 林治華, 王遠(yuǎn)強(qiáng), 蔡家利, 韓英子 申請(qǐng)人:重慶理工大學(xué)