專利名稱：淀粉樣蛋白纖維性寡聚體構(gòu)象型抗原表位多肽及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種淀粉樣蛋白纖維性寡聚體構(gòu)象型抗原表位多肽及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
近年來，淀粉樣蛋白或多肽自身的聚集導(dǎo)致的多種疾病對(duì)人類的健康造成了越來越大的危害。某些蛋白質(zhì)本身無毒性或毒性很小，但它們自身可聚集成具有毒性作用的寡聚物(oligomer)或纖維狀物(fibril)而引起一系列疾病，如由Beta-amyloid (A-Beta)引起的阿爾茨海默病(俗稱老年性癡呆)(Alzheimer，s disease, AD)，由alpha-synuclein 引起的帕金森病(Parkinson’ s disease, PD)，由朊病毒蛋白(Prion protein(PrP))引起的包括瘋牛病在內(nèi)的人和動(dòng)物的至少十余種腦病，由含有多聚谷氨酰胺(PolyQ)的多肽引起的包括亨廷頓病(Huntington's disease)的至少9種遺傳性神經(jīng)退行性疾病，由胰島淀粉樣多肽(islet amyloid polypeptide, IAPP，amy 1 in)引起的II型糖尿病及由長時(shí)間透析導(dǎo)致的溶菌酶(lysozyme)聚集沉積導(dǎo)致的疾病等。其中，對(duì)人類健康危害最大的為AD 和PD及II型糖尿病。醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)表明，我國和歐美國家中65歲以上老年人中5 6%患有 AD，并且發(fā)病率逐年上升。該病已被列為導(dǎo)致死亡的第四大疾病，僅次于心臟病、癌癥和中風(fēng)。另有約的65歲以上老年人患有PD。而患有II型糖尿病的人數(shù)可達(dá)總?cè)丝诘?% 以上。這些疾病對(duì)人類的健康造成了越來越大的危害，其發(fā)病的根本原因(或部分原因) 在于淀粉樣蛋白或多肽自身的聚集。研究表明，不同蛋白質(zhì)的聚集最先始于錯(cuò)誤折疊或變性的蛋白質(zhì)(或多肽)單體， 單體多肽鏈間氫鍵的形成導(dǎo)致了蛋白分子的聚合。首先形成由電子或原子力顯微鏡可觀察到的大小約3-lOnm的可溶性的球形寡聚物，某些寡聚物可進(jìn)一步結(jié)合成彎曲柔韌的絲狀物(protofibril)，進(jìn)而形成直徑為6-lOnm的表面光滑或呈螺旋的纖維。非同源性的蛋白質(zhì)最終可形成具有相似結(jié)構(gòu)的蛋白聚合物。由A-Bet^alpha-synuclein和amylin等各種各樣的淀粉樣蛋白聚集形成的纖維都含有“cross-Beta-sheet”結(jié)構(gòu)，其中Beta片層構(gòu)成的骨架與纖維縱軸垂直，而骨架中的氫鍵網(wǎng)與縱軸平行。多肽在Beta片層中排列為平行的 Beta鏈，在Beta片層中，氨基酸都有精確的位置。即使是不同來源的寡聚物或纖維也具有相似的特異結(jié)構(gòu)，寡聚物或纖維特異性識(shí)別抗體可以分別與由不同來源的淀粉樣蛋白單體形成的寡聚物和纖維結(jié)合，而不與它們的單體結(jié)合。這表明寡聚物或纖維可由蛋白多肽骨架形成獨(dú)立于其氨基酸一級(jí)序列之外的共同的寡聚物或纖維特有的抗原表位。研究發(fā)現(xiàn)， 淀粉樣蛋白可形成幾類寡聚體，其中包括纖維性寡聚體(fibrillar oligomer，F(xiàn)0)、前纖維性寡聚體(profibrillar oligomer, PF0)及其它類型寡聚體。FO形成了與淀粉樣蛋白纖維具有相似的空間結(jié)構(gòu)，并且具有不同氨基酸一級(jí)序列的淀粉樣蛋白所形成的FO也具有這類的空間結(jié)構(gòu)，即與A-beta形成的FO特異結(jié)合的抗體(OC)，能與A-beta纖維結(jié)合，還能夠與alpha-synuclein、IAPP和PolyQ等形成的FO及纖維結(jié)合，但不與各淀粉樣蛋白的單體結(jié)合。過去人們一直認(rèn)為淀粉樣蛋白疾病的發(fā)生是由蛋白質(zhì)聚集成的不溶性的纖維引起的。近年來大量的研究表明，許多淀粉樣蛋白疾病的關(guān)鍵致病因素是體積較小的水溶性的寡聚物。并且FO的致病作用要明顯強(qiáng)于PF0。由淀粉樣蛋白寡聚物引起的疾病存在著相似的機(jī)理，即細(xì)胞膜損傷、氧化應(yīng)激、線粒體功能失調(diào)、細(xì)胞死亡、信號(hào)傳遞異常等。但人們對(duì)寡聚物影響細(xì)胞正常的生理活動(dòng)的詳細(xì)機(jī)理尚不清楚。寡聚物的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)及其抗原表位如何，怎樣才能有效地抑制其細(xì)胞毒性等這些都是人們亟待探討和解決的問題。應(yīng)用主動(dòng)和被動(dòng)的免疫技術(shù)治療AD從而抑制A-Beta的聚集，并加快A-Beta的清除是AD研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。2000-2002年美國科研人員應(yīng)用A-Beta制成的疫苗進(jìn)行了動(dòng)物試驗(yàn)和一期臨床試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果令人鼓舞，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和病人的臨床癥狀明顯減輕，記憶力下降得到遏止，病理變化也顯著減退。同時(shí)，應(yīng)用抗A-Beta抗體對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的被動(dòng)免疫治療也收到了很好的療效。然而，不幸的是在二期臨床試驗(yàn)中，雖然大多數(shù)的病人仍表現(xiàn)出良好效果，卻有6%的病人表現(xiàn)出了腦膜炎的癥狀和病理變化，有的病人甚至發(fā)生死亡。因此， 對(duì)A-Beta疫苗和抗體的實(shí)驗(yàn)研究立即終止。盡管如此，從上述的研究可以看出A-Beta疫苗對(duì)AD的治療效果是應(yīng)該肯定的。研究表明由A-Beta疫苗導(dǎo)致的副作用可能是由該疫苗誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫反應(yīng)，并且該副作用的產(chǎn)生是由Thl而不是Th2 型免疫反應(yīng)造成的。為了克服A-Beta疫苗的副作用，在疫苗設(shè)計(jì)時(shí)應(yīng)加強(qiáng)誘發(fā)B細(xì)胞反應(yīng)和Th2型免疫反應(yīng)的發(fā)生，并且避開誘發(fā)Thl型免疫反應(yīng)?；贏-Beta寡聚物抗原表位肽設(shè)計(jì)的疫苗能夠容易地兼顧上述特性，還不會(huì)誘導(dǎo)機(jī)體形成抗A-Beta單體的抗體。后一特性可徹底消除疫苗與體內(nèi)A-Beta單體之間產(chǎn)生副作用的可能，并且還不會(huì)影響A-beta的正常生理功能。因此，根據(jù)A-Beta寡聚物抗原表位研制的肽疫苗將具有潛在的應(yīng)用價(jià)值， 而獲得A-Beta寡聚物抗原表位是該肽疫苗設(shè)計(jì)和研制的先決條件。所以，在科研和臨床研究和應(yīng)用中均需要獲取淀粉樣蛋白寡聚體構(gòu)象型抗原表位多肽。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種淀粉樣蛋白纖維性寡聚體構(gòu)象型抗原表位多肽。本發(fā)明提供的多肽，是如下1)或2)1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的多肽；2)將序列表中序列1所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與具有相同功能的由序列1衍生的多肽。上述蛋白中，一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。上述多肽中，2)所示的多肽為如下a、b、c中的任意一種a、由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的多肽；b、由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的多肽；C、由序列表中序列4所示的氨基酸序列組成的多肽；d、由序列表中序列5所示的氨基酸序列組成的多肽。上述多肽作為抗原得到的抗體為本發(fā)明保護(hù)的范圍。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種淀粉樣蛋白聚集抑制劑。本發(fā)明提供的抑制劑，其活性成分為上述的抗體；所述淀粉樣蛋白具體為 A β 42 (β淀粉樣蛋白)、PrP(朊蛋白)、amylin(胰淀素)或a-synucleir^ci突觸核蛋白)。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種淀粉樣蛋白的細(xì)胞毒性抑制劑。本發(fā)明提供的抑制劑，其活性成分為上述的抗體；所述細(xì)胞具體為SH-SY5Y細(xì)胞， 所述淀粉樣蛋白具體為A β 42、PrP、amyIin或α -synuclein。本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種預(yù)防和/或治療淀粉樣蛋白聚集引發(fā)疾病的產(chǎn)
P
ΡΠ O本發(fā)明提供的產(chǎn)品，其活性成分為如下1)或2) 1)上述的多肽；2)上述的抗體； 所述產(chǎn)品具體為藥物或疫苗；所述淀粉樣蛋白聚集引發(fā)疾病具體為阿爾茨海默病。上述抗體在抑制淀粉樣蛋白聚集和/或制備淀粉樣蛋白聚集抑制劑中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；在該應(yīng)用中，所述淀粉樣蛋白具體為Αβ 42、PrP、amylin或 α -synuclein。上述抗體在抑制淀粉樣蛋白的細(xì)胞毒性和/或制備淀粉樣蛋白的細(xì)胞毒性抑制劑中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；在該應(yīng)用中，所述細(xì)胞具體為SH-SY5Y細(xì)胞，所述淀粉樣蛋白具體為 A β 42、PrP、amylin 或 α -synuclein。上述多肽或上述抗體在制備預(yù)防和/或治療淀粉樣蛋白聚集引發(fā)疾病的產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；所述產(chǎn)品具體為藥物或疫苗；所述淀粉樣蛋白聚集引發(fā)疾病具體為阿爾茨海默病。上述多肽在制備預(yù)防和/或治療淀粉樣蛋白聚集引發(fā)疾病的產(chǎn)品的效果體現(xiàn)在提高空間記憶能力、減少腦內(nèi)老年斑的數(shù)量和/或降低Αβ含量中的應(yīng)用；在該應(yīng)用中，所述Αβ具體為Αβ42或Αβ40。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明提供的多肽在體外試驗(yàn)中可與抗體OC結(jié)合，證明了該多肽是多克隆抗體OC所對(duì)應(yīng)的抗原表位之一；該多肽具有良好的抗原特性，可有效刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體；該多肽是多種淀粉樣蛋白纖維性寡聚體上所共有的抗原表位；該多肽的抗體可以明顯抑制淀粉樣蛋白Αβ 42、PrP、amylin、α -synuclein, Iysozyme聚集；該多肽抗體能夠明顯抑制 A β 42、PrP、amylin、α -synuclein, Iysozyme 的細(xì)胞毒性。本發(fā)明的多肽及其抗體具體有如下有益效果1.本發(fā)明的多肽可以有效刺激機(jī)體產(chǎn)生識(shí)別淀粉樣蛋白寡聚體的特異性抗體，并且該抗體可以抑制淀粉樣蛋白的聚集和細(xì)胞毒性。2.基于本發(fā)明的疫苗可能不會(huì)誘導(dǎo)機(jī)體形成抗A-Beta單體的抗體，可消除疫苗與體內(nèi)A-Beta單體之間產(chǎn)生副作用的可能，并且還不會(huì)影響A-beta的正常生理功能。3.本發(fā)明的多肽具有較好的免疫原性，可有效刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，因而在淀粉樣蛋白疾病的治療或預(yù)防用疫苗的研制方面PEOS可作為良好的免疫原。


圖1為PEOS與OC結(jié)合的ELISA測定圖2為經(jīng)置換、缺失、插入氨基酸或改變氨基酸順序的PEOS與OC結(jié)合的ELISA測定圖3為經(jīng)PEOS免疫后小鼠血清中的抗體與PEOS結(jié)合圖4為經(jīng)PEOS免疫后的兔血清中的抗體與PEOS結(jié)合
圖5為PEOS抗體與多種淀粉樣蛋白的寡聚體和纖維結(jié)合圖6為ThT熒光測定PEOS抗體抑制淀粉樣蛋白的聚集圖7為PEOS抗體抑制淀粉樣蛋白的細(xì)胞毒性圖8為注射PEOS多肽的AD轉(zhuǎn)基因小鼠的水迷宮實(shí)驗(yàn)圖9為注射PEOS多肽的AD轉(zhuǎn)基因小鼠腦部老年斑的變化圖10為注射PEOS多肽的AD轉(zhuǎn)基因小鼠腦部老年斑面積的變化圖11為注射PEOS多肽的AD轉(zhuǎn)基因小鼠腦中可溶性A β 40水平圖12為注射PEOS多肽的AD轉(zhuǎn)基因小鼠腦中可溶性A β 42水平圖13為注射PEOS多肽的AD轉(zhuǎn)基因小鼠腦中不溶性A β 40和42水平
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實(shí)施例中的PBS緩沖液均為PH值為7. 2的緩沖液(配方為5. 84g NaCl, 4. 72g Na2HPO4, 2. 64g NaH2PO4. 2H20,用水配成 1 升，調(diào) pH 為 7. 2)。下述實(shí)施例中PEOS的所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)都是通過至少3次獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)獲得的，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表示為平均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差。數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析是應(yīng)用One-way ANOVA軟件進(jìn)行。對(duì)于水迷宮的記憶數(shù)據(jù)的處理分析是應(yīng)用兩因子重復(fù)數(shù)據(jù)的Two-way ANOVA進(jìn)行。下面實(shí)施例中的淀粉樣蛋白為A β 42 ( β淀粉樣蛋白)、PrP (朊蛋白)、amyIin (胰淀素)或a-synuclein(a突觸核蛋白)。實(shí)施例1、多肽PEOS及其衍生物和抗體的制備一、多肽PEOS的獲得本發(fā)明應(yīng)用噬菌體顯示技術(shù)，以特異性識(shí)別纖維性寡聚體和纖維的多克隆抗體 OC (Millipore, USA，產(chǎn)品目錄號(hào)為AB2286)為篩選底物，將1 X IO8種環(huán)形七肽進(jìn)行了四輪淘選，應(yīng)用噬菌體ELISA從中篩選出了可與OC明顯結(jié)合的噬菌體克隆，通過氨基酸測序得到。多肽 PE0S，其氨基酸序列為=Cys-Trp-Thr-Thr-His-Gln-Arg-Ser-Cys (序列 1， CWTTHQRSC)PEOS的合成制備方法為PEOS為一環(huán)形肽，加上兩端的2個(gè)半胱氨酸為9肽，可人工合成，由上海吉爾生化有限公司按常規(guī)方法合成制備(制備方法參見Weng C C，Peter D W. Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis :A Practical Approach. Oxford :University Press,2000. 1 8 ； Atherton Ε, Sheppard R C. Solid Phase Peptide Synthesis :A Practical Approach. Oxford =IRL Press, 1989) ；PEOS純度為大于或等于95 % ;PE0S保存于_20°C，避免反復(fù)凍融。同時(shí)合成連接有6個(gè)組氨酸作為標(biāo)簽的多肽PEOS (C端連接)。二、PEOS的衍生物的獲得將多肽PEOS (序列1)所示的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失、添加氨基酸或改變氨基酸順序，得到如下PEOS的衍生物具體如下
PEOS- Δ T 將PEOS多肽(序列1)刪除一個(gè)蘇氨酸得到的多肽，序列為=Cys-Trp-Thr-His-Gln-Arg-Ser-Cys (序列 2，CWTHQRSC)；PE0S-W/Y 將PEOS多肽(序列1)的色氨酸置換成酪氨酸得到的多肽，序列為Cy s-Tyr-Thr-Thr-Hi s-Gln-Arg-Ser-Cys (序列 3，CYTTHQRSC)；PEOS-G 將PEOS多肽(序列1)中插入甘氨酸得到的多肽，序列為=Cys-Trp-Thr-Thr-His-Gln-Gly-Arg-Ser-Cys (序列 4，CWTTHQGRSC)，PE0S-WT/GD 將PEOS多肽(序列1)改變氨基酸序列同時(shí)替換色氨酸及蘇氨酸分別為甘氨酸和天冬氨酸，序列為=Cys-His-Gln-Thr-Gly-Ser-Arg-Asp-Cys (序列5， CHQTGSRDC)。同時(shí)合成連接有6個(gè)組氨酸作為標(biāo)簽的多肽PEOS-Δ T、PEOS-W/Y、PEOS-G和 PEOS-WT/⑶(C端連接)。三、多肽PEOS抗體的獲得1、PEOS可誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生抗體應(yīng)用展示PEOS多肽的Μ13噬菌體(可將PEOS多肽的基因融合到Μ13噬菌體次要衣殼蛋白(PlII)上構(gòu)建成表達(dá)PEOS多肽的Μ13噬菌體(二硫鍵環(huán)內(nèi)的7肽表達(dá)在 PlII的N末端，第一個(gè)半胱氨酸緊接于丙氨酸后，第二個(gè)半胱氨酸后有一小段間隔多肽，由 Gly-Gly-Gly-Ser 組成，然后是野生型pill 蛋白，Μ13 噬菌體(New England Biolab Inc，產(chǎn)品目錄號(hào)為E8120SC)免疫BALB/c小鼠(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為BALB/c小鼠SPF級(jí))(7只/組)，每只每次免疫噬菌體1010個(gè)。每2周免疫一次，共免疫4次。第4次免疫后15天采血，分離血清。應(yīng)用ELISA檢測血清中抗PEOS抗體的含量將100μ 1不加標(biāo)簽的PE0S(由于PEOS肽鏈短，為了能使PEOS較好地吸附在酶聯(lián)板上， 并且不遮擋其與抗體結(jié)合的位點(diǎn)，在PEOS的C端加上兩個(gè)強(qiáng)疏水性氨基酸，則包被用的多肽序列為CWTTHQRSCIV) (ly g/孔)包被96孔酶聯(lián)免疫微孔板，置37°C 2h，&3%BSA 37°C 封閉2h (200 μ L/孔)。以PBS洗板3次，加入2000倍稀釋的血清，室溫孵育Ih后，用含有 0. 1% Tween-20的PBS洗滌3次。每孔加入100 μ 1稀釋后的羊抗鼠酶標(biāo)二抗(1 3000)， 室溫孵育Ih后，用含有0. 1 % Tween-20的PBS洗滌3次。每孔加入底物溶液TMB 100 μ L， 放置37°C 20min,然后每孔加入50 μ 1 lmmol/L硫酸終止反應(yīng)，于酶聯(lián)免疫檢測儀上測定OD 值(波長450nm)。結(jié)果如圖3所示，免疫PEOS的7只小鼠的OD值(波長450nm)分別為0. 45,0. 52、 0. 58,0. 61,0. 66,0. 82,0. 76 ；均比未有多肽展示的M13噬菌體免疫后的高，可以看出，免疫 PEOS的7只小鼠都能產(chǎn)生抗PEOS的抗體，表明PEOS具有良好的抗原特性，可有效刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體。2、多肽PEOS抗體的制備將連接KLH(匙孔血藍(lán)蛋白)的PEOS (PE0S的C端連接KLH)免疫新西蘭大白兔 (第一次基礎(chǔ)免疫添等體積加福氏完全佐劑(Sigma，F(xiàn)-5881)，以后的加強(qiáng)免疫添加等體積福氏不完全佐劑(Sigma，F(xiàn)5506))。每2周免疫一次，每次抗原用量為200 μ g/只。共免疫 4次。于最后一次免疫15天后，采集兔血清，并應(yīng)用實(shí)驗(yàn)1的ELISA方法鑒定血清抗體效價(jià)(以PEOS-KLH包被ELISA板)，陰性對(duì)照為不免疫收集血清；結(jié)果如圖4所示。免疫后的兔血清在稀釋1000、4000、16000、64000倍以后，ELISA測定的OD值分別為1. 42,1. 1、0· 74、0. 32，陰性對(duì)照血清為0. 146。此結(jié)果再次表明PEOS具有良好的抗原特性，可有效刺激機(jī)體產(chǎn)生抗PEOS抗體。以連接有PEOS多肽的瓊脂糖凝膠對(duì)兔血清進(jìn)行親和層析，采用偶聯(lián)PEOS的瓊脂糖凝膠(5ml)(由吉爾(上海)生化公司按通用的環(huán)氧化連接方法制備)，洗脫液為pH3. 0 的甘氨酸緩沖液(0. 2M甘氨酸水溶液，以鹽酸調(diào)pH值至3. 0)，流速為0. 7ml/min,洗脫3個(gè)柱體積，合并且保存第7-13ml洗脫液，即為純化的抗PEOS的抗體。實(shí)施例2、多肽PEOS及其抗體的應(yīng)用一、PEOS抗體的應(yīng)用UPEOS抗體與各淀粉樣蛋白纖維性寡聚體和纖維的結(jié)合將購買的A β 42 (美國 American Peptide Co.，產(chǎn)品目錄號(hào)為 62-0-80B)、 amylin(美國 American Peptide Co.，產(chǎn)口口口目錄號(hào)為 74-5—14B)、 α -Synuclein(美國rp印tide，產(chǎn)品目錄號(hào)S-1001-2)、PrP(美國American Peptide Co.，產(chǎn)品目錄號(hào)為 62-0-07B)進(jìn)行如下處理以六氟異丙醇(HFIP)溶解至lmg/ml，室溫(25°C )超聲波處理 lOmin，分裝到印idorf管中，真空環(huán)境中揮發(fā)HFIP，于-20°C保存。用前將HFIP處理過的 Αβ 42、amylin、α -synuclein在室溫放置20min，加入二甲基亞砜(DMSO)，使各蛋白濃度為 5mg/ml，然后以0. 02M pH7. 4的PBS緩沖液進(jìn)行稀釋至所需濃度。PrP則直接用0. 02M pH 7.4 PBS制備到所需濃度。此時(shí)，各淀粉樣蛋白為單體狀態(tài)。A β 42纖維性寡聚體的制備是將0. 3mg上述得到的單體A β 42溶于150 μ 1 HFIP 中，室溫放置20min。然后用水稀釋至80 μ M，樣品以14，000XG離心15min，取上清以氮?dú)獯嫡鬑FIP，樣品置室溫用微棒攪拌24h (轉(zhuǎn)速500RPM)。A β 42纖維的制備是將HFIP處理過的、DMSO溶解的A β 42單體以0. 02Μ ρΗ7. 4的 PBS緩沖液稀釋至10μΜ，37 孵育24h，以14，000XG離心15min取沉淀。amylin纖維性寡聚體的制備是將HFIP處理過的、DMSO溶解的amylin單體以 0. 02M pH7. 4的PBS緩沖液稀釋至20μΜ，37 孵育2h，以14，000XG離心15min取上清。amylin纖維的制備是將上述amylin溶液37°C孵育5h，以14，000XG離心15min 取沉淀。α -synuclein的纖維性寡聚體的制備是將HFIP處理過的、DMSO溶解的 α -synuclein 單體以 0. 02M ρΗ7· 4 的 PBS 緩沖液稀釋至 40 μ Μ, 37°C孵育 2d,以 14，000XG 離心15min取上清。α -synuclein 纖維的制備則是將 α -synuclein 溶液 37°C孵育 4d,以 14，000XG 離心15min取沉淀。PrP的纖維性寡聚體的制備是將PrP溶液以0. 02M pH7. 4的PBS緩沖液進(jìn)行稀釋至200μΜ，37 孵育2d，以14，000XG離心15min取上清。PrP纖維的制備則是將PrP溶液37°C孵育5d，以14，000XG離心15min取沉淀。上述的樣品制備完后，以常用的BCA蛋白檢測試劑盒(美國Merck，產(chǎn)品號(hào)為 71285-3)測定蛋白濃度。并以透射掃描電鏡觀察樣品中淀粉樣蛋白的聚集形態(tài)證實(shí)樣品的正確性。將上述100 μ 1的單體(monomer)、纖維性寡聚體(oligomer)和纖維(fibril)形式(1 μ g/孔)分別包被96孔酶聯(lián)免疫微孔板，BSA為陰性對(duì)照。以上述由實(shí)施例1得到的純化抗PEOS的抗體作為一抗，以HRP標(biāo)記的羊抗兔LgG (北京博奧森生物技術(shù)有限公司， 產(chǎn)品目錄號(hào)為bse-0295G)作為二抗，并按上述ELISA方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。結(jié)果如圖5所示，抗PEOS抗體分別與A β、PrP、amylin、α -synuclein的單體、BSA 結(jié)合后的 OD 值分別為 0. 11,0. 13,0. 08,0. 06,0. 07 ；抗PEOS抗體分別與A β、PrP、amylin、α -synuclein的纖維性寡聚體、BSA結(jié)合后的 OD 值分別為 0. 72,0. 66,0. 51,0. 38,0. 085 ；抗PEOS抗體分別與Αβ、PrP、amylin、α -synuclein的纖維、BSA結(jié)合后的OD值分別為 0. 58,0. 52,0. 41,0. 53,0. 066 ；可以看出，抗PEOS抗體可分別與A β、PrP、amylin、α -synuclein的纖維性寡聚體和纖維結(jié)合，表明PEOS是多種淀粉樣蛋白纖維性寡聚體和纖維上所共有的抗原表位。該特異結(jié)合淀粉樣蛋白的寡聚體的抗體可用于實(shí)驗(yàn)研究，并對(duì)淀粉樣蛋白疾病的治療和臨床診斷也具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。2, PEOS抗體體外抑制淀粉樣蛋白的聚集1)制備單體，方法同上述1，得到的Αβ42、amylin、α-synuclein單體用PBS稀釋，得至Ij A β 42、PrP、amylin、α -synuclein 溶液單體； 2)將上述由實(shí)施例1得到的純化抗PEOS的抗體以0. 02M pH7. 4的PBS緩沖液稀釋，然后加入到A β 42、PrP、amylin、α-synuclein溶液(pH7. 4的PBS緩沖液)中，使各蛋 S Αβ 42,PrP,amylin, α -synuclein 的終濃度分別為 10、200、20、40 μ M。各蛋白與純化抗 PEOS的抗體的摩爾比分別為1 1、10 1、1 1和2 1。以不加純化抗PEOS的抗體的蛋白溶液做為對(duì)照。將八3 421沖、_71^1、(1-巧皿(；1&11樣品于371分別放置1天、5天、 5小時(shí)和4天。3)將硫黃素(ThT)溶解在pH6. 5、50mM的磷酸鹽緩沖液使其濃度為5 μ Μ。取孵育后的樣品20 μ 1加入到含有180 μ 1 ThT溶液的黑色酶標(biāo)板中?；靹蚝笤诙喙δ苊笜?biāo)儀上以 450nm激發(fā)波長和482nm的發(fā)射波長測定ThT的熒光強(qiáng)度。將各樣品的熒光強(qiáng)度減去ThT 本身的背景熒光，并分析樣品之間的差異顯著情況。加入PEOS抗體后降低的蛋白熒光強(qiáng)度除以不加抗體的蛋白熒光強(qiáng)度即為抗體對(duì)蛋白聚集的抑制率。結(jié)果如圖6所示，可以看出，純化抗PEOS的抗體對(duì)A β 42、amylin、α -synuclein、 PrP的聚集抑制率分別為93%、96%、65%、35%，表明抗PEOS的抗體可明顯抑制各淀粉樣蛋白的聚集。3, PEOS抗體抑制淀粉樣蛋白的細(xì)胞毒性用含10%胎牛血清的培養(yǎng)基(MEM)將SH-SY5Y細(xì)胞(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤細(xì)胞庫，產(chǎn)品號(hào)為SH-SY5Y)配成單個(gè)細(xì)胞懸液，以每孔10000個(gè)細(xì)胞接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板， 每孔體積100 μ L。細(xì)胞于37°C培養(yǎng)24小時(shí)，培養(yǎng)箱CO2濃度為5%。每孔加入樣品(淀粉樣蛋白Αβ 42、PrP、amylin、α -synuclein與上述由實(shí)施例1得到的純化抗PEOS的抗體的混合物，單獨(dú)淀粉樣蛋白Aβ 42、PrP、amylin、α -synuclein寡聚體及PBS對(duì)照)，Αβ 42、 PrP、amylin、α-synuclein蛋白的終濃度分別為2、200、5、2μΜ，PEOS抗體的終濃度為1、 20、2. 5、1 μ Μ。細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)后，每孔加入MTT溶液(5mg/mL) 10 μ L，37°C孵育3小時(shí)，終止培養(yǎng)，每孔加100 μ L晶體溶解液(10% SDS和5%異丁醇溶解在0. OlM HCL中)， 37°C孵育過夜，使結(jié)晶物充分溶解。在多功能酶聯(lián)免疫檢測儀上以570nm波長測定各孔光吸收值。以樣品的吸光度除以不加樣品的細(xì)胞的吸光度作為細(xì)胞的活性指標(biāo)，并分析樣品之間的差異顯著情況(與各淀粉樣蛋白對(duì)照相比，*，P < 0. 05 ;#，P < 0. 01)。結(jié)果如圖7所示，單獨(dú)淀粉樣蛋白Αβ 42、PrP、amylin、α -synuclein的細(xì)胞相對(duì)活性分別為 58. 8%、46%、59%、53% ；淀粉樣蛋白Αβ 42、PrP、amylin、α -synuclein與PEOS抗體的混合物的細(xì)胞相對(duì)活性分別為 88%、82%、78%、70% ；說明，PEOS抗體能夠提高細(xì)胞活性，從而表明PE0S抗體能夠明顯抑制Aβ42、PrP、 amylin、α -synuclein 的對(duì) SH-SY5Y 細(xì)胞的毒性。二、PEOS多肽的應(yīng)用1、多肽PEOS及其衍生物與多克隆抗體OC結(jié)合1)、PEOS與多克隆抗體OC結(jié)合將100 μ 1多克隆抗體OC (0. 2和1 μ g/孔)包被96孔酶聯(lián)免疫微孔板(以不包被OC的孔作為陰性對(duì)照)，置37°C 2h，以3% BSA 37°C封閉2h，200 μ L/孔。以PBS洗板 3次。每孔加入100 μ 1帶有組氨酸標(biāo)簽的PE0S，0. 5 μ g/孔)，室溫(25°C )孵育Ih后，用含有0. 1 % Tween-20的PBS洗滌3次。室溫孵育Ih后，用含有0. 1 % Tween-20的PBS洗滌3次。每孔加入100 μ 1稀釋后的HRP標(biāo)記的抗組氨酸標(biāo)簽抗體，室溫孵育Ih后，用含有 0. 1 % Tween-20的PBS洗滌3次。每孔加入底物溶液TMB 100 μ L，放置37°C 20min,然后每孔加入50 μ 1 lmmol/L硫酸終止反應(yīng)，于酶聯(lián)免疫檢測儀上測定OD值(波長450nm)。結(jié)果如圖1所示，1 μ g0C、0. 2μ gOC、陰性對(duì)照的OD值分別為0. 72,0. 28,0. 051 ； 可以看出，與陰性對(duì)照相比，1 μ gOC和0. 2 μ gOC都可以被PEOS識(shí)別，也可以說，PEOS可被 OC特異識(shí)別。PEOS是以O(shè)C作為篩選底物獲得的多肽，它與OC的結(jié)合證實(shí)了它是多克隆抗體OC所對(duì)應(yīng)的抗原表位之一(與不包被PEOS的陰性對(duì)照相比，*，P < 0. 05，#，P < 0. 01)。2)、PEOS的衍生物與多克隆抗體OC結(jié)合為了能夠檢測改造后的多肽與OC的結(jié)合情況，將這些多肽與帶有組氨酸標(biāo)簽的未改造的 PEOS 競爭地與 OC 結(jié)合(PEOS-His tag+PEOS-ΔΤ、PEOS-His tag+PEOS-W/Y、 PEOS-His tag+PE0S-G、PEOS-His tag+PE0S-ffT/GD, PEOS-His tag、PEOS-His tag+PEOS)， 然后以ELISA檢測后者與OC的結(jié)合情況。具體如下將1 μ g 帶有標(biāo)簽的 PEOS 分別與 5 μ g PEOS- Δ Τ、PE0S-W/Y、PEOS-G, PEOS-WT/⑶、PEOS的混合物100 μ 1加入包被有OC的孔中，得到PEOS-His tag+PEOS-ΔΤ、 PEOS-His tag+PE0S-W/Y、PEOS-His tag+PEOS-G、PEOS-His tag+PEOS-WT/⑶、PEOS-Hi s tag+PEOS,以PEOS-His tag為對(duì)照，用ELISA檢測帶有標(biāo)簽的PEOS與OC的結(jié)合，測定OD 值，方法同上述1。以BSA為陰性對(duì)照。結(jié)果見圖2，其中，左側(cè)的柱形圖組為各組多肽與OC的結(jié)合，右側(cè)的柱形圖組為各組多肽與陰性對(duì)照(BSA)的結(jié)合，PEOS-His tag+PEOS-ΔΤ, PEOS-His tag+PE0S-ff/Y, PEOS-His tag+PE0S-G, PEOS-His tag+PEOS-WT/GD, PEOS-His tag+PEOS、PEOS-His tag 和 OC 結(jié)合后的 OD 值分別為 0. 31,0. 22,0. 33,0. 42,0. 23,0. 75 ；PEOS-His tag+PEOS-ΔΤ, PEOS-His tag+PE0S-ff/Y, PEOS-His tag+PE0S-G, PEOS-His tag+PE0S-WT/⑶、PEOS-His tag+PEOS、PEOS-His tag 和陰性對(duì)照(BSA)結(jié)合后的 OD 值分別為 0. 076,0. 044,0. 031,0. 035,0. 051,0. 048 ；可以看出，PEOS多肽某個(gè)氨基酸經(jīng)置換、缺失、在多肽中增加氨基酸或改變氨基酸順序后仍能與未修飾改造的帶有組氨酸標(biāo)簽的PEOS有效競爭結(jié)合0C，致使帶有標(biāo)簽的 PEOS與OC的結(jié)合明顯降低。2、PEOS多肽改善AD病的效果體現(xiàn)DPEOS多肽改善AD轉(zhuǎn)基因小鼠的記憶能力實(shí)驗(yàn)方法(1)應(yīng)用由實(shí)施例1得到的展示PEOS多肽的M13噬菌體及未有多肽展示的M13噬菌體(作為對(duì)照)免疫8月齡雌性AD轉(zhuǎn)基因小鼠(轉(zhuǎn)APP和PSl基因(APPsWe/PSldE9)小鼠購自Jackson Lab, Bar Harbor，ME，美國，產(chǎn)品目錄號(hào)為004462，繁殖后經(jīng)過鑒定得到含有APP和PSl基因的小鼠為轉(zhuǎn)APP和PSl基因(APPswe/PSldE9)的AD雌性小鼠)，得到兩組小鼠:AD+PE0S和AD con.；以8只野生型小鼠作為WT組(轉(zhuǎn)APP和PSl基因(APPswe/ PSldE9)小鼠購自Jackson Lab, Bar Harbor，ME，美國，產(chǎn)品目錄號(hào)為:004462，繁殖后經(jīng)過鑒定得到不含有APP和PSl基因的小鼠為野生型小鼠；WT)為對(duì)照。一共三組，每組8只；每只每次免疫噬菌體IOltl個(gè)。每2周免疫一次，共免疫4次。 第4次免疫后15天開始水迷宮實(shí)驗(yàn)。(2)記憶力訓(xùn)練小鼠水迷宮訓(xùn)練之前放在室溫25°C，濕度46%的環(huán)境適應(yīng)3天。 所有行為學(xué)檢測試驗(yàn)中均采用隨機(jī)雙盲的方式。訓(xùn)練前，除去平臺(tái)，在水槽中央輕輕放入， 讓其自由游動(dòng)60s。測定每組小鼠游泳象限偏好，選擇偏好對(duì)面水槽的壁，作為該小鼠初始釋放位置。第一次訓(xùn)練前讓小鼠站在平臺(tái)(平臺(tái)直徑10厘米)上15s，讓它記憶一下池 (直徑1.1米)中臺(tái)的空間位置。平臺(tái)放在第二象限中部，并且平臺(tái)的上表面距水面1.5厘米。池水中加入奶粉，以增加動(dòng)物的視覺反差，利于圖像記錄。將小鼠面朝池壁，輕輕放入水中，讓其在水槽中游泳。小鼠在臺(tái)上站立2s就停止計(jì)時(shí)，認(rèn)為上臺(tái)，訓(xùn)練時(shí)間每次最長為 90s。期間應(yīng)用軟件(購自中國醫(yī)科院藥物所)記錄其軌跡以及從入水到爬上平臺(tái)的時(shí)間， 即潛伏期。如果小鼠在90s內(nèi)找到平臺(tái)則讓其在平臺(tái)上停留10s。如果小鼠在90s內(nèi)找不到平臺(tái)，則在90s后由實(shí)驗(yàn)人員引導(dǎo)其上平臺(tái)，并讓其在平臺(tái)上停留10s。連續(xù)訓(xùn)練5天， 每天訓(xùn)練2次，兩次之間的間隔為3-4h。然后間隔24h，撤掉平臺(tái)，讓小鼠在水中尋找平臺(tái) 90s。以錄像和軟件系統(tǒng)記錄5天訓(xùn)練和探索實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，并以重復(fù)量數(shù)二因子變異數(shù)分析 (two-way AN0VA, repeated measures)處理實(shí)驗(yàn)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖8所示，隨著訓(xùn)練時(shí)間的增長，野生組小鼠找到平臺(tái)的潛伏期逐漸縮短，4天后即達(dá)平衡狀態(tài)。注射PEOS的AD小鼠(AD+PE0S)找到平臺(tái)的潛伏期在訓(xùn)練到第3、4、5天時(shí)，與對(duì)照AD小鼠(AD con.)相比具有顯著差異(與AD對(duì)照小鼠組相比，#, P < 0. 05)，結(jié)果見圖8A。撤掉臺(tái)后注射PEOS的AD小鼠(AD+PE0S)找到平臺(tái)的潛伏期也明顯小于AD對(duì)照組(AD con.)(圖8B)。注射PEOS的AD小鼠(AD+PE0S)穿過平臺(tái)所在位置的次數(shù)顯著高于AD對(duì)照組(AD con.)(圖8C)，并且注射PEOS后的AD小鼠在目標(biāo)象限中所在的時(shí)間顯著高于AD對(duì)照小鼠(圖8D)。這些結(jié)果表明免疫PEOS后的AD小鼠空間記憶能力明顯好于未注射PEOS的AD對(duì)照組。2), PEOS多肽降低AD轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)老年斑的數(shù)量應(yīng)用ThS熒光染色實(shí)驗(yàn)測定PEOS對(duì)AD轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)老年斑的影響
(1)將上述1的AD+PE0S組、AD con.組、WT組小鼠心臟灌流，取腦組織，應(yīng)用組織冷凍液及液氮進(jìn)行冷凍處理，并保存于-80°C。用時(shí)以冷凍切片機(jī)進(jìn)行切片，切片厚度 16 μ m,每隔9個(gè)切片取一個(gè)進(jìn)行染色觀察。(2)應(yīng)用lmg/ml ThS (以70%乙醇配制)浸染切片lOmin，然后以70%乙醇沖洗3次。(3)應(yīng)用熒光顯微鏡采集圖像(Olympus BX60)。檢測結(jié)果見圖9，其中A為AD con.組鼠腦皮質(zhì)；B為AD+PE0S組的鼠腦皮質(zhì)；C為 AD con.組鼠海馬；D為AD+PE0S組的鼠海馬，可以看出，注射PBS的AD (AD con.)小鼠腦皮層(A)和海馬(C)中的老年斑數(shù)量明顯多于注射免疫多肽PEOS AD小鼠(AD+PE0S組)腦皮層(B)和海馬中(D)老年斑數(shù)量。應(yīng)用軟件系統(tǒng)(visiopharm)測定注射多肽(η = 8)及對(duì)照小鼠(η = 8)海馬和皮層(每只動(dòng)物每個(gè)部位檢測10-12張切片)的老年斑面積。結(jié)果如圖10所示，可以看出，AD con.組鼠腦皮質(zhì)的老年斑面積所占比例(視野中老年斑面積占整個(gè)視野的比例)為11. 2% ；AD+PE0S組的鼠腦皮質(zhì)的老年斑面積所占比例為3. 7 % ；AD con.組鼠海馬的老年斑面積所占比例為13. 5% ；AD+PE0S組的鼠海馬的老年斑面積所占比例為4. 9% ；統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，注射免疫多肽PEOS的小鼠老年斑面積占切片面積的比例明顯減少(與注射PBS組相比，*，P < 0. 01)。3)、PEOS多肽降低AD轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)A β 40和A β 42水平上述1的AD+PE0S組、AD con.組小鼠的腦組織在含有蛋白酶抑制劑的PBS(pH7. 2) 中勻漿。然后以15000rpm離心30min，收集上清。沉淀加入5M的鹽酸胍(以tris_HCl緩沖液配制，PH8.0)，然后離心處理，收集上清。溶于和不溶于PBS的Αβ 40和Αβ 42水平由試劑盒(Invotrigen，USA，產(chǎn)品目錄號(hào)分別為KHB3441和KHB3482)按照ELISA方法測定。Αβ水平按照每克腦組織含有的Aβ量(ng或mg)表示，以ELISA方法測定OD值和Αβ標(biāo)準(zhǔn)曲線。(標(biāo)準(zhǔn)品為試劑盒中配備，Invotrigen，USA，產(chǎn)品目錄號(hào)分別為KHB3441 和 ΚΗΒ3482,Αβ 40 和 Αβ 42 的標(biāo)準(zhǔn)曲線的函數(shù)分別為 y = 625χ_14· 8 ;y = 636. 62χ_7· 15。 χ為OD值，y為A β 40或A β 42的質(zhì)量。)結(jié)果見圖11-13，其中圖11為注射PEOS多肽的AD轉(zhuǎn)基因小鼠腦中可溶性Αβ 40 水平；圖12為注射PEOS多肽的AD轉(zhuǎn)基因小鼠腦中可溶性A β 42水平；圖13為注射PEOS 多肽的AD轉(zhuǎn)基因小鼠腦中不溶性A β 40和42水平。圖11中，注射PEOS多肽的AD轉(zhuǎn)基因小鼠(AD+PE0S)、注射PBS的AD轉(zhuǎn)基因小鼠 (AD con.)腦中可溶性A β 40的含量分別為16.4ng/g腦蛋白和119. 2ng/g腦蛋白)，圖12中注射PEOS多肽的AD轉(zhuǎn)基因小鼠(AD+PE0S)、注射PBS的AD轉(zhuǎn)基因小鼠 (AD con.)腦中可溶性4 0 42的含量分別為0.82叫/^腦蛋白和2.351^/^腦蛋白，圖13中為注射PEOS多肽的AD轉(zhuǎn)基因小鼠(AD+PE0S)、注射PBS的AD轉(zhuǎn)基因小鼠 (AD con.)腦中不溶性A β 40含量分別為3. 2mg/g腦蛋白和8. 9mg/g腦蛋白，不溶性A β 42 含量分別為3. 48mg/g腦蛋白和9. 46mg/g腦蛋白；結(jié)果表明，AD小鼠注射免疫PEOS后腦內(nèi)PBS可溶性A β 40 (圖11)和A β 42 (圖12)水平及不溶性Αβ 40和Αβ 42水平(圖13)都明顯降低(與注射PBS組相比，*，P < 0. 05 ； #, P < 0. 01)。 以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種多肽，是如下1)或2)1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的多肽；2)將序列表中序列1所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與具有相同功能的由序列1衍生的多肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于2)所示的多肽為如下a、b、c中的任意一種a、由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的多肽；b、由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的多肽；c、由序列表中序列4所示的氨基酸序列組成的多肽；d、由序列表中序列5所示的氨基酸序列組成的多肽。
3.以權(quán)利要求1或2所示多肽作為抗原得到的抗體。
4.一種淀粉樣蛋白聚集抑制劑，其活性成分為權(quán)利要求3所述的抗體；所述淀粉樣蛋白具體為 A β 42、PrP、amylin 或 α -synuclein。
5.一種淀粉樣蛋白的細(xì)胞毒性抑制劑，其活性成分為權(quán)利要求3所述的抗體；所述細(xì)胞具體為SH-SY5Y細(xì)胞，所述淀粉樣蛋白具體為A β 42、PrP、amylin或α -synuclein。
6.一種預(yù)防和/或治療淀粉樣蛋白聚集引發(fā)疾病的產(chǎn)品，其活性成分為如下1)或2) 1)權(quán)利要求1或2所述的多肽；2)權(quán)利要求3所述的抗體；所述產(chǎn)品具體為藥物或疫苗； 所述淀粉樣蛋白聚集引發(fā)疾病具體為阿爾茨海默病。
7.權(quán)利要求3所述抗體在抑制淀粉樣蛋白聚集和/或制備淀粉樣蛋白的聚集抑制劑中的應(yīng)用；所述淀粉樣蛋白具體為A β 42、PrP、amylin或α-synuclein。
8.權(quán)利要求3所述抗體在抑制淀粉樣蛋白的細(xì)胞毒性和/或制備淀粉樣蛋白的細(xì)胞毒性抑制劑中的應(yīng)用；所述細(xì)胞具體為SH-SY5Y細(xì)胞，所述淀粉樣蛋白具體為A β 42、PrP、 amylin 或 α -synuclein。
9.權(quán)利要求1或2所述的多肽或權(quán)利要求3所述的抗體在制備預(yù)防和/或治療淀粉樣蛋白聚集引發(fā)疾病的產(chǎn)品中的應(yīng)用；所述產(chǎn)品具體為藥物或疫苗；所述淀粉樣蛋白聚集引發(fā)疾病具體為阿爾茨海默病。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種淀粉樣蛋白纖維性寡聚體構(gòu)象型抗原表位多肽及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的多肽，是如下1)或2)1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的多肽；2)將序列表中序列1所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與具有相同功能的由序列1衍生的多肽。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的多肽及其抗體具體有如下有益效果本發(fā)明的多肽可以有效刺激機(jī)體產(chǎn)生識(shí)別淀粉樣蛋白寡聚體的特異性抗體，并且該抗體可以抑制淀粉樣蛋白的聚集和細(xì)胞毒性，提高實(shí)驗(yàn)動(dòng)物空間記憶能力、減少腦內(nèi)老年斑的數(shù)量和/或降低Aβ含量。
文檔編號(hào)A61P25/28GK102504016SQ20111040550
公開日2012年6月20日 申請(qǐng)日期2011年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月8日
發(fā)明者劉瑞田, 孫曉霞, 趙敏 申請(qǐng)人:清華大學(xué)