專利名稱：一種新型乙肝治療性疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物工程領(lǐng)域，具體涉及一種新型乙肝治療性疫苗及其制備方法抗體化抗原的(Antibodyzed Antigen)的基本思想是利用抗體可變區(qū)CDR結(jié)構(gòu)的外顯、限構(gòu)和強(qiáng)免疫原性的特點(diǎn)，將抗原表位克隆表達(dá)于抗體分子中，使抗原分子抗體化，實(shí)現(xiàn)以抗體為載體、以抗原表位為基礎(chǔ)的新型免疫分子的設(shè)計(jì)。這一新型的免疫分子至少具備以下特點(diǎn)1)以抗體為載體表達(dá)抗原表位多肽，解決了常規(guī)方法不能表達(dá)抗原表位短肽的缺點(diǎn)；2)CDR限定的空間構(gòu)象可保證表位正確及穩(wěn)定的免疫原性，解決了常規(guī)多肽交聯(lián)蛋白構(gòu)象不穩(wěn)定的缺點(diǎn)；3)CDR結(jié)構(gòu)上的外顯，使得表位的可接近性(Accessibility)好，易被吞噬及提呈，解決了常規(guī)交聯(lián)技術(shù)導(dǎo)致的表位內(nèi)陷而致的空間構(gòu)型障礙(Stereohindrance)；4)抗體分子因其本身巨大的分子量，是一很好的抗原載體，更增強(qiáng)了抗原表位的抗原性。目前國外尚無有關(guān)抗體化抗原制備乙肝治療性疫苗的應(yīng)用性開發(fā)研究報(bào)道。
本發(fā)明采用了裸質(zhì)粒DNA免疫技術(shù)，以抗體分子為載體、以抗原表位為基礎(chǔ)，將抗原中激發(fā)免疫應(yīng)答最關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)功能單位—抗原表位克隆到抗體分子中，將抗原、抗體集于同一分子中，制成新型乙肝治療性疫苗。
本發(fā)明的技術(shù)方案是通過下述步驟實(shí)現(xiàn)的1.選擇及克隆表達(dá)乙肝病毒B細(xì)胞抗原表位根據(jù)以往的工作基礎(chǔ)及計(jì)算機(jī)輔助分析，確定了用于HBV特異性新型治療性疫苗分子設(shè)計(jì)的B細(xì)胞抗原表位HBpreSAg 133-145aa，其氨基酸序列為DPRVPGLYFPAGG。以質(zhì)粒Bluescript II KS(商售)為骨架，以氨芐青霉素抗性基因(Ampr)為篩選標(biāo)志，自雜交瘤細(xì)胞中克隆抗體重鏈VH基因及其表達(dá)調(diào)控元件，亞克隆至Bluescript IIKS，并將人工合成引物并退火形成的P133-145編碼基因序列插入該質(zhì)粒Asp718位點(diǎn)，再將其亞克隆于含人IgG完整CH編碼基因的真核表達(dá)載體γ1Neo中，與人抗體恒定區(qū)編碼基因連接，獲得了可表達(dá)該抗原表位的全抗體重鏈分子的真核表達(dá)重組體γB，經(jīng)酶切分析及DNA測序證實(shí)序列和插入方向的正確性。2.γB構(gòu)象限定性表達(dá)乙肝病毒B細(xì)胞抗原表位抗原表位被認(rèn)為是最理想的新型疫苗的靶抗原成分。然而，表位多肽的小分子量、構(gòu)象的不穩(wěn)定性很大程度上限制了抗原表位的實(shí)際應(yīng)用。盡管各類交聯(lián)載體如脂質(zhì)體、ISCOMS等及各種構(gòu)建方法如SMAA、MAP等一定程度上改善了表位多肽的免疫原性，但難以以化學(xué)結(jié)構(gòu)明確、結(jié)構(gòu)外顯、空間限構(gòu)的方式同時(shí)表達(dá)抗原表位?；谶@一背景，本發(fā)明選擇在抗體CDR中表達(dá)抗原表位，構(gòu)建了γB，以γB轉(zhuǎn)染Ig重鏈缺失的J558L細(xì)胞，以G418篩選陽性克隆，獲得穩(wěn)定傳代和表達(dá)Ig的細(xì)胞株。結(jié)果證實(shí)抗體分子克隆乙肝B細(xì)胞抗原表位后，并不改變抗體的分泌功能；重組的重鏈在體外轉(zhuǎn)染細(xì)胞中與內(nèi)源性輕鏈結(jié)合，裝配成H2L2結(jié)構(gòu)，抗原表位能有效表達(dá)，并且能與相應(yīng)抗體結(jié)合，提示抗體CDRs表達(dá)的表位多肽具有與天然蛋白中抗原表位類似的空間構(gòu)象。3、γB可誘導(dǎo)乙肝特異性免疫應(yīng)答以純化的重組表達(dá)的γB抗原化抗體免疫C57BL雌性小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)免疫后一周左右便可在全部免疫小鼠外周血中檢出抗HBV PreS2120-145肽段的IgG抗體，抗體效價(jià)在1∶200-1∶400，以后抗體效價(jià)逐漸升高至1∶800，并維持一較長的時(shí)間，約6周以上。
以γB DNA直接經(jīng)脾免疫小鼠，結(jié)果自接種后的第五天起幾乎所有小鼠血清中均可檢出人源化抗體，高峰持續(xù)約二周。表明γB在體內(nèi)均可正確轉(zhuǎn)錄、翻譯；表達(dá)的轉(zhuǎn)基因可與內(nèi)源性的Ig輕鏈結(jié)合，裝配成完整Ig分子，自分泌出細(xì)胞。
以γB直接免疫6-8周齡BALB/c雌性小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)單次DNA接種后2周左右便可檢出HBV特異性抗體，其效價(jià)可高達(dá)1∶800；持續(xù)至少10周以上；進(jìn)一步分類檢測IgM抗體和IgG，結(jié)果發(fā)現(xiàn)特異性IgM自免疫后第2周便可檢出，第6周左右達(dá)到高峰，滴度為1∶600，持續(xù)時(shí)間可達(dá)10周；特異性IgG抗體水平較低，僅在第6至第8周間略有一過性升高。
以同一抗體化抗原基因(γB)免疫C57BL/6小鼠，在體內(nèi)亦誘導(dǎo)出持久的、高水平的特異性抗體；其IgM抗體平均滴度與BALB/c中相似，并在免疫后第6周左右有一高峰，滴度為1∶1200；在C57BL/6中IgG抗體應(yīng)答于第2周達(dá)高峰，滴度為1∶800，持續(xù)檢出達(dá)6周左右。表明該疫苗具有較強(qiáng)的免疫原性，可誘生乙肝特異性免疫應(yīng)答，提示具有治療慢性乙肝的潛能。4.制備本發(fā)明新型乙肝治療性疫苗1)選擇克隆一HBV特定序列作為乙肝病毒特異性B細(xì)胞抗原表位序列；
2)合成該序列的編碼基因，克隆于抗體分子的CDRs中；3)轉(zhuǎn)化原核細(xì)胞，大規(guī)模抽提該質(zhì)粒DNA；4)將純化的上述DNA溶解于生理鹽水中，使其達(dá)到2μg/μl濃度，得本發(fā)明疫苗，該溶液可直接接種宿主。本發(fā)明新型乙肝治療性疫苗的特點(diǎn)是1)是一種抗體分子；2)是一種經(jīng)乙肝病毒B細(xì)胞表位抗原化的抗體分子；3)該抗體化抗原可有效表達(dá)乙肝B細(xì)胞抗原表位；4)有效表達(dá)的B細(xì)胞抗原表位可誘生乙肝特異性免疫應(yīng)答；5)該抗體化抗原是有治療慢性乙肝的作用。


圖1是γ1-HB DNA序列測定結(jié)果圖2是γB的SDS-PAGE結(jié)果圖3是多能抗原化抗體中B細(xì)胞抗原表位的檢測其中A.Anti-HBV PreS2；B.unspecific Ab1；C.unspecific Ab2圖4是多能抗原化抗體基因免疫小鼠后轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的體表達(dá)其中a.BALB/c小鼠；b.C57BL/6小鼠；圖5基因免疫BALB/c小鼠血清中抗HBV特異性抗體的檢測其中a.特異性總抗體；b.特異性IgM抗體；c.特異性IgG抗體圖6是基因免疫C57BL/6小鼠血清中抗HBV特異性抗體的檢測其中a.特異性總抗體；b.特異性IgM抗體；c.特異性IgG抗體
權(quán)利要求
1.一種新型乙肝治療性疫苗，其特征在于以抗體分子為載體、以抗原表位為基礎(chǔ)，將抗原中的抗原表位克隆到抗體分子中，將抗原、抗體集于同一分子中，制成新型乙肝治療性疫苗。HBpreSAg 133-145aa，其氨基酸序列為DPRVPGLYFPAGG。
2.按權(quán)利要求1所述的新型乙肝治療性疫苗，其特征在于所述的抗原表位是針對乙肝病毒的抗原表位，HBpreSAg 133-145aa，其氨基酸序列為DPRVPGLYFPAGG；所述的抗體分子是人體免疫球蛋白。
3.一種新型乙肝治療性疫苗的制備方法，其特征在于按下述步驟進(jìn)行1)選擇克隆一HBV特定序列作為乙肝病毒特異性B細(xì)胞抗原表位序列；2)合成該序列的編碼基因，克隆于抗體分子的CDRs中；3)轉(zhuǎn)化原核細(xì)胞，大規(guī)模抽提該質(zhì)粒DNA；4)將純化的上述DNA溶解于生理鹽水中，使其達(dá)到2μg/μl濃度，得本發(fā)明疫苗。
全文摘要
本發(fā)明屬生物工程領(lǐng)域,具體涉及一種新型乙肝治療性疫苗及其制備方法,本發(fā)明采用抗體化抗原技術(shù),以抗體分子為載體、以抗原表位為基礎(chǔ),將抗原中激發(fā)免疫應(yīng)答最關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)功能單位一抗原表位克隆到抗體分子中,將抗原、抗體集于同一分子中,制成新型乙肝治療性疫苗。該疫苗具有較強(qiáng)的免疫原性,可誘生乙肝特異性免疫應(yīng)答,具有治療慢性乙肝的潛能。
文檔編號(hào)A61K39/29GK1356142SQ0112689
公開日2002年7月3日 申請日期2001年9月27日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月27日
發(fā)明者熊思東 申請人:復(fù)旦大學(xué)