專利名稱：一種靶向-葡聚糖-uspio 復(fù)合粒子及其制造方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種靶向氧化鐵納米粒，尤其是一種具有更好的水相穩(wěn)定性、更好的表面親水性的靶向-葡聚糖氧化鐵納米粒；本發(fā)明還涉及此類納米粒的制造方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
核磁共振成像(Magnetic resonance imaging, MRI)是一項完全無創(chuàng)性檢查， 其安全性好，沒有離子輻射，可以快速地提供患者全身任何部位、任意方向(矢狀面、冠狀面、橫斷面)、任意斷層的高分辨率解剖圖像，清晰度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過計算機(jī)斷層掃描(Computer AssistedTomography, CT)。MRI應(yīng)用于人體腦部、神經(jīng)系統(tǒng)、腹部及心血管造影，對于檢測組織壞死、局部缺血和多種惡性腫瘤的探查特別有效，可以滿足病灶早期診斷的要求，被視為一種頗具潛力的診斷方法，在臨床醫(yī)學(xué)影像學(xué)診斷中得到迅速廣泛的應(yīng)用。超順磁性氧化鐵造影劑即為超順磁性氧化鐵顆粒(Superparamagnetic Iron Oxide，SPI0)，為一種核殼結(jié)構(gòu)，由超順磁性核芯和包被外殼構(gòu)成。包被外殼由多糖、脂類及表面活性劑等親水性材料構(gòu)成，核芯為Y -Fe2O3或!^e3O4晶核，晶核的尺度大小決定了超順磁性氧化鐵造影劑的磁學(xué)特性和MRI效率。粒徑范圍為10-30nm的USPI0，氧化鐵核心直徑僅為6 lOnm，大部分為單疇晶粒氧化鐵。USPIO因粒徑小，一定程度上減少了肝臟、脾臟中網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)對其的吞噬，使得血漿半衰期大幅延長，保證了腫瘤病灶對USPIO的有效結(jié)合時間和攝入時間，可作為心血管造影劑和血池造影劑；同時又由于USPIO更多被淋巴結(jié)組織及骨髓組織中單核/巨噬細(xì)胞攝取，因此可用于腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶探查。在超順磁性氧化鐵的外殼層裝配特異性配體分子，稱為靶向SPI0，配體有抗體、多肽配體、小分子配體等，借助于受體-配體特異性結(jié)合作用，靶向USPIO (超小型超順磁性氧化鐵)可以與體內(nèi)組織或器官的特異性表面受體結(jié)合，從而達(dá)到對特定靶細(xì)胞、組織、器官進(jìn)行MRI增強(qiáng)成像的目的。如外表面裝配有阿拉伯半乳聚糖的AG-USPIO可以特異地與肝細(xì)胞表面的去唾液酸糖蛋白受體結(jié)合，而不與其它組織細(xì)胞結(jié)合，達(dá)到肝特異性MRI增強(qiáng)成像的目的。采用血管粘附分子-1 (VCAM-I)特異性靶向肽構(gòu)建的anti-VCAM-Ι-靶向SPIO 可以早期探查動脈粥樣硬化病斑。靶向性USPIO是當(dāng)前及將來SPIO的主要研發(fā)熱點(diǎn)，由于其所具有的主動性特異靶向作用，應(yīng)用范圍將會被大大擴(kuò)展，可發(fā)展為特定細(xì)胞、組織、 器官的靶向MRI造影劑，如腫瘤病灶探查、動脈粥樣硬化病斑探查、干細(xì)胞移植體內(nèi)發(fā)育示蹤、細(xì)胞標(biāo)記等。常規(guī)方法制備的葡聚糖表面修飾SPI0，因葡聚糖是依靠表面物理吸附作用包裹在 SPIO核心上，因此葡聚糖表面易從表面脫落，造成葡聚糖SPIO在生理溶液中穩(wěn)定性差，不適合長期保存。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，提供一種靶向-葡聚糖-USPio復(fù)合粒子，葡聚糖在USPIO表面形成了具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的共聚物，不但穩(wěn)定性增強(qiáng)，而且更適合多肽標(biāo)記，本發(fā)明還提供此類網(wǎng)狀交聯(lián)葡聚糖表面修飾的氧化鐵納米粒的制造方法及其應(yīng)用。本發(fā)明的靶向-葡聚糖-USPIO復(fù)合粒子，所述靶向-葡聚糖-USPIO復(fù)合粒子以USPIO為核心，外層包覆葡聚糖，記為Dextran-USPIO ；單分子葡聚糖上的羥基與環(huán)氧氯丙烷反應(yīng)，通過醚鍵在葡聚糖上共價結(jié)合上環(huán)氧基，所述葡聚糖上的環(huán)氧基與另一單分子葡聚糖上的羥基反應(yīng)，將所述外層的葡聚糖交聯(lián)為網(wǎng)狀聚合物，形成靶向-網(wǎng)狀 Dextran-USPIO,記為靶向-CLN-Dextran-USPIO。優(yōu)選的是在所述USPIO和葡聚糖之間還包覆一層油酸鈉。優(yōu)選的是所述USPIO的核心粒徑為5-10nm，所述靶向-CLN-Dextran-USPIO的粒徑為 15-50nm。優(yōu)選的是所述USPIO的核心粒徑為6-8nm，所述靶向-CLN-Dextran-USPIO的粒徑為 20-30nm。優(yōu)選的是所述復(fù)合粒子的靶向?yàn)镻l :GARYCRGDCFDG、P4 :ALNGREESP、P6 ARYCRGDCFDALNGREESP、P8 :GAPPRGALNGREESP 中的一種。采用環(huán)氧氯丙烷促使Dextran-USPIO表面的葡聚糖交聯(lián)為網(wǎng)狀聚合物，同時在 Dextran-USPIO表面引入活性的環(huán)氧基，以便靶向多肽的連接。從而提高了 Dextran在!^e3O4 粒子表面的結(jié)合牢度，增強(qiáng)USPIO的表面親水性，加強(qiáng)復(fù)合粒子在水溶液中的分散穩(wěn)定性， 減少其在體內(nèi)的非特異性吸附。環(huán)氧氯丙烷與葡聚糖中羥基的反應(yīng)機(jī)制是(1)活化反應(yīng)(主反應(yīng))堿性條件下環(huán)氧氯丙烷同葡聚糖上羥基反應(yīng)，通過醚鍵在葡聚糖上共價結(jié)合上環(huán)氧基。該末端游離的環(huán)氧基可作為多肽連接的活性反應(yīng)基團(tuán)，從而在CLN-Dextran-USPIO表面引入靶向多肽。(2)交聯(lián)反應(yīng)(副反應(yīng))堿性條件下，葡聚糖上的環(huán)氧基可以同另一單分子的葡聚糖的羥基反應(yīng)，從而將葡聚糖交聯(lián)為網(wǎng)狀聚合物，經(jīng)過交聯(lián)反應(yīng)，可以使葡聚糖交聯(lián)聚合物穩(wěn)定地包覆在USPIO表面。(3)其他副反應(yīng)-水解反應(yīng)環(huán)氧氯丙烷高溫下長時間與堿液接觸會逐步水解生成甘油。通過控制反應(yīng)時間和pH值來控制主反應(yīng)和副反應(yīng)的發(fā)生程度，減少副反應(yīng) (3)的發(fā)生，從而既保證USPIO表面葡聚糖發(fā)生交聯(lián)，生成具有網(wǎng)狀葡聚糖表面修飾的 CLN-Dextran-USPIO，同時又保留了部分活性環(huán)氧基，用于后續(xù)的多肽配體聯(lián)接。采用硫代硫酸鈉滴定法測定環(huán)氧基的密度，在25°C時，將活化反應(yīng)時間控制在 4-8小時比較合適，這樣環(huán)氧基的密度較高，有利于下一步的偶聯(lián)反應(yīng)的進(jìn)行。一種制造上述靶向-葡聚糖-USPIO復(fù)合粒子的方法，包括以下步驟(1)將USPIO懸浮液加入到15%的葡聚糖水中，在80°C的條件下攪拌60分鐘，葡萄糖和溶液中四氧化三鐵的比例為1 1-9 1，制備得到葡聚糖-USPIO復(fù)合粒子；(2)在pH值為11-13的堿性條件下，將純化后的葡聚糖-USPIO復(fù)合粒子和環(huán)氧氯丙烷混合，其中，環(huán)氧氯丙烷水基磁流體(ν/ν)范圍為1 20-1 4，在20-42°C的條件下反應(yīng)2-8個小時，洗滌、重懸，得到環(huán)氧基活化的葡聚糖-USPIO復(fù)合粒子的水基磁流體；(3)將緩沖液和靶向多肽加入到環(huán)氧基活化的葡聚糖-USPIO復(fù)合粒子的水基磁流體中，室溫震蕩反應(yīng)5個小時；所得即為靶向-CLN-葡聚糖-USPIO復(fù)合粒子。優(yōu)選的是所述步驟(1)中葡萄糖和溶液中四氧化三鐵的比例為7 1。優(yōu)選的是所述步驟O)中反應(yīng)溫度為30°C，反應(yīng)時間為3個小時。優(yōu)選的是所述步驟(3)反應(yīng)完畢后還可加入甘油，震蕩反應(yīng)8-16個小時。本發(fā)明還公開了一種腫瘤特異性MRI成像造影劑，包含上述的靶向-葡聚糖-USPIO復(fù)合粒子?？疾彀邢駽LN-Dextran-USPIO對荷瘤裸鼠的磁共振成像效果，在動物水平上考察其血漿半衰期，研究其在動物體內(nèi)各臟器的生物分布及代謝情況。結(jié)果表明 Dextran-USPIO的血漿半衰期約為2. 8hrs, CLN-Dextran-USPIO的血漿半衰期則約為 6. airs，這說明CLN-Dextran-USPIO的穩(wěn)定性明顯提高；同時，因其表面親水性能的改變， 能夠更好地逃避網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬，是更好的腫瘤特異性成像造影劑。荷瘤裸鼠磁共振成像實(shí)驗(yàn)表明腫瘤/非瘤組織之間的MR信號為1. 83倍，能夠在磁共振圖像上更好地顯示出5mm以下的腫瘤，具有較大的應(yīng)用價值。對Target-CLN-Dextran-USPIO的實(shí)驗(yàn)動物組織分布和藥物代謝研究表明=Target-CLN-Dextran-USPIO可以在腫瘤中特異性濃聚，且主要通過肝臟，脾臟和腎臟進(jìn)行代謝。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明采用了環(huán)氧氯丙烷法制備了一種具有網(wǎng)狀交聯(lián)葡聚糖表面修飾的 USPIO(Cross-linked Network-USPIO, CLN-Dextran-USPIO)復(fù)合粒子，葡聚糖在USPIO表面形成了具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的共聚物，不但穩(wěn)定性增強(qiáng)，而且更便于和靶向多肽進(jìn)行結(jié)合。同時解決了網(wǎng)狀交聯(lián)、多肽標(biāo)記這兩個問題，優(yōu)選的是后期又加入了甘油，殘余環(huán)氧基同甘油反應(yīng)，使甘油分子結(jié)合在納米粒上，從而進(jìn)一步改善納米粒表面親水性。通過實(shí)驗(yàn)研究表明CLN-Dextran-USPIO具有更好的表面親水性，其在水相中的穩(wěn)定性也明顯改善。采用普魯士蘭染色法和鐵標(biāo)準(zhǔn)曲線測定法測定本發(fā)明的復(fù)合粒子同腫瘤細(xì)胞的體外結(jié)合，表明Target-CLN-Dextran-USPIO具有更好的結(jié)合能力，荷瘤裸鼠實(shí)驗(yàn)也表明該種 Target-CLN-Dextran-USPIO在腫瘤MRI成像診斷方面具有潛在的應(yīng)用價值。


圖1為本發(fā)明中油酸鈉-納米狗304的Tg-DSC圖。圖2為本發(fā)明中油酸鈉-納米Fe53O4的透射電鏡照片。圖3為本發(fā)明中油酸鈉-納米!^e3O4的XRD圖。圖4為本發(fā)明中油酸鈉-納米Fe53O4的紅外譜圖。圖5為本發(fā)明中葡聚糖-USPIO的紅外圖譜。圖6為本發(fā)明中靶向-CLN-Dextran-USPIO的環(huán)氧化交聯(lián)反應(yīng)的紅外光譜圖。圖7為本發(fā)明中靶向-CLN-Dextran-USPIO的環(huán)氧氯丙烷處理接多肽的紅外光譜圖。圖8為本發(fā)明的靶向-CLN-Dextran-USPIO的SEM投射電鏡照片。圖9為本發(fā)明的靶向-CLN-Dextran-USPIO的體外HUVEC細(xì)胞結(jié)合實(shí)驗(yàn)對比圖。圖10為本發(fā)明的靶向-CLN-Dextran-USPIO結(jié)合細(xì)胞后的鐵含量對比圖。圖11為本發(fā)明的靶向-CLN-Dextran-USPIO的血漿半衰期的測定圖。圖12-13為本發(fā)明的靶向-CLN-Dextran-USPIO在荷瘤裸鼠體中的磁共振成像及其組織分布圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的說明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于此。下文中，超微型超順磁性氧化鐵納米微粒為USPIO(Ultrasmall Superparamagnetic IronOxide)；葡聚糖-USPIO 為 Dextran-USPIO ；網(wǎng)狀葡聚糖-USPIO 為 CLN-Dextran-USPIO(Cross-1inked Network-Dextran-USPI0)；和配體結(jié)合后的 CLN-Dextran-USPIO 為靶向-CLN-Dextran-USPIO，也可記為 Target-CLN-Dextran-USPIO。實(shí)施例1靶向雜合多肽的合成采用固相多肽合成法合成多肽，合成的4個靶向多肽的氨基酸序列分別為Pl GARYCRGDCFDG ；P4 :ALNGREESP ；P6 :ARYCRGDCFDALNGREESP ；P8 :GAPPRGALNGREESP。合成在 FMOC-Tyr-Wang-Resin樹脂上完成，樹脂溶漲和脫保護(hù)后，采用Fmoc保護(hù)氨基酸，依照標(biāo)準(zhǔn)的HBTU+NMM或DIC+H0BT縮合法依次進(jìn)行氨基酸耦聯(lián)?？s合完成后切割洗滌。合成后進(jìn)行氧化環(huán)化。SHIMADZU高效液相色譜儀進(jìn)行純化。鑒定采用質(zhì)譜儀。樣品密封后_20°C保存。 本發(fā)明采用的多肽PI、P4、P6、P8購買自上海輝瑞生物科技有限公司。實(shí)例2油酸鈉-Dextran-USPIO的制備首先配制i^eCl2/FeCl3混合液和NaOH溶液，各物質(zhì)用量下表所示
權(quán)利要求
1.一種靶向-葡聚糖-USPIO復(fù)合粒子，其特征是所述靶向-葡聚糖-USPIO復(fù)合粒子以USPIO為核心，外層包覆葡聚糖，記為Dextran-USPIO ；單分子葡聚糖上的羥基與環(huán)氧氯丙烷反應(yīng)，通過醚鍵在葡聚糖上共價結(jié)合上環(huán)氧基，所述葡聚糖上的環(huán)氧基與另一單分子葡聚糖上的羥基反應(yīng)，將所述外層的葡聚糖交聯(lián)為網(wǎng)狀聚合物，再通過網(wǎng)狀交聯(lián)葡聚糖表面的環(huán)氧基，連接上靶向多肽，形成靶向-網(wǎng)狀Dextran-USPIO，記為靶向-CLN-Dextran-USPIO。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的復(fù)合粒子，其特征是在所述USPIO和葡聚糖之間還包覆一層油酸鈉。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的復(fù)合粒子，其特征是所述USPIO的核心粒徑為5-lOnm，所述靶向-CLN-Dextran-USPIO 的粒徑為 15_50nm。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的復(fù)合粒子，其特征是所述USPIO的核心粒徑為6-8nm，所述靶向-CLN-Dextran-USPIO 的粒徑為 20_30nm。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的復(fù)合粒子，其特征是所述復(fù)合粒子的靶向?yàn)镻l GARYCRGDCFDG、P4 :ALNGREESP、P6 :ARYCRGDCFDALNGREESP、P8 :GAPPRGALNGREESP 中的一種。
6.一種制造如權(quán)利要求1所述的靶向-葡聚糖-USPIO復(fù)合粒子的方法，其特征在于 包括以下步驟(1)將USPIO懸浮液加入到15%的葡聚糖水溶液中，在80°C的條件下攪拌60分鐘，葡萄糖和溶液中四氧化三鐵的比例為1 1-9 1，制備得到葡聚糖-USPIO復(fù)合粒子；(2)在pH值為11-13的堿性條件下，將純化后的葡聚糖-USPIO復(fù)合粒子和環(huán)氧氯丙烷混合，其中，環(huán)氧氯丙烷水基磁流體(v/V)范圍為1 20-1 4，在20-42°C的條件下反應(yīng)2-8個小時，洗滌、重懸，得到環(huán)氧基活化的葡聚糖-USPIO復(fù)合粒子的水基磁流體；(3)將緩沖液和靶向多肽加入到環(huán)氧基活化的葡聚糖-USPIO復(fù)合粒子的水基磁流體中，室溫震蕩反應(yīng)5個小時；所得即為靶向-CLN-葡聚糖-USPIO復(fù)合粒子。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征是所述步驟(1)中葡萄糖和溶液中四氧化三鐵的比例為7 1。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征是所述步驟( 中反應(yīng)溫度為30°C，反應(yīng)時間為3個小時。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征是所述步驟C3)反應(yīng)完畢后還可加入甘油，震蕩反應(yīng)8-16個小時。
10.一種腫瘤特異性MRI成像造影劑，包含如權(quán)利要求1-5任一項所述的靶向-葡聚糖-USPIO復(fù)合粒子。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種靶向-葡聚糖-USPIO復(fù)合粒子及其制造方法和應(yīng)用，所述靶向-葡聚糖-USPIO復(fù)合粒子以USPIO為核心，外層包覆葡聚糖，記為Dextran-USPIO；單分子葡聚糖上的羥基與環(huán)氧氯丙烷反應(yīng)，通過醚鍵在葡聚糖上共價結(jié)合上環(huán)氧基，所述葡聚糖上的環(huán)氧基與另一單分子葡聚糖上的羥基反應(yīng)，將所述外層的葡聚糖交聯(lián)為網(wǎng)狀聚合物，形成靶向-網(wǎng)狀Dextran-USPIO。葡聚糖在USPIO表面形成了具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的共聚物，不但穩(wěn)定性增強(qiáng)，且表面親水性也大為改善，通過實(shí)驗(yàn)研究表明CLN-Dextran-USPIO具有更好的表面親水性，其在水相中的穩(wěn)定性也明顯改善，網(wǎng)狀葡聚糖交聯(lián)葡聚糖修飾層的存在使得此復(fù)合粒子和腫瘤細(xì)胞具有更好的結(jié)合能力，荷瘤裸鼠實(shí)驗(yàn)也表明其在腫瘤MRI成像診斷方面具有潛在的應(yīng)用價值。
文檔編號A61K49/18GK102397565SQ20111034139
公開日2012年4月4日 申請日期2011年11月2日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月2日
發(fā)明者史景云, 吳秋芳, 張霖倩, 粟波, 趙印敏, 陳晉, 陳雪梅 申請人:上海華明高技術(shù)(集團(tuán))有限公司, 上海市肺科醫(yī)院