專利名稱：干細(xì)胞歸巢的快捷方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明所涉及的是一種干細(xì)胞歸巢的快捷方法，具體說是利用磁場使干細(xì)胞迅速準(zhǔn)確歸巢。
背景技術(shù)：
干細(xì)胞是指一類具有自我更新能力和多向分化潛能的細(xì)胞，在適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)條件下，可分化為不同的功能細(xì)胞。隨著干細(xì)胞生物學(xué)研究的不斷深入，以干細(xì)胞為種子細(xì)胞的細(xì)胞治療在糖尿病、肝衰竭、心肌梗塞、早老性癡呆、帕金森病、視網(wǎng)膜損傷、癌癥、血友病、脊髓損傷、先天性免疫性疾病等難治性、終末期疾病的治療中越來越顯示出良好的應(yīng)用前景。研究中發(fā)現(xiàn)，哺乳動物體內(nèi)多種組織(包括骨髓、臍帶血等)來源的成體干細(xì)胞均具有“多能性”(即具有向多種組織細(xì)胞分化潛能)的特點(diǎn)，比如，其中的⑶34+Lin_細(xì)胞向造血系統(tǒng)各系細(xì)胞分化；c-Met+ β 2Μ細(xì)胞可以向成熟的肝細(xì)胞分化；間充質(zhì)干細(xì)胞可以向神經(jīng)元、心肌細(xì)胞或胰島β細(xì)胞分化等等。大量的基礎(chǔ)研究及臨床實(shí)踐證實(shí)，干細(xì)胞在適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)條件下，在體內(nèi)外均可定向分化為功能完備的肝細(xì)胞。如何選擇合適的誘導(dǎo)方法，促進(jìn)移植干細(xì)胞向肝臟遷移、分化，恢復(fù)肝臟解剖學(xué)結(jié)構(gòu)及生理功能，一直是眾多學(xué)者努力探索的問題。一般說來，只有足夠數(shù)量的干細(xì)胞向特定組織歸巢，才能有效分化成特定組織細(xì)胞，發(fā)揮生理功能。目前，干細(xì)胞移植的常用方法有特定組織直接注入和外周靜脈輸注法等。前者雖然可以保證干細(xì)胞能相對集中于特定組織中，但需通過開放性的手術(shù)實(shí)現(xiàn)，操作復(fù)雜，受者創(chuàng)傷大，并發(fā)癥多；后者方法簡單，易于操作，但是由于選用的干細(xì)胞隨血液循環(huán)流至全身各個器官，因而易于被某些富含網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的組織吞噬、滯留，使得定位于特定組織的干細(xì)胞數(shù)量相對減少，嚴(yán)重影響其修復(fù)功能的發(fā)揮。而尋找一種高效、簡單的干細(xì)胞歸巢方法具有非常重要的意義。如何誘導(dǎo)干細(xì)胞歸巢、分化，已經(jīng)成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種快捷高效的干細(xì)胞歸巢方法。本發(fā)明所提供的干細(xì)胞歸巢方法具體步驟包括a)用粒徑為40 60nm的免疫磁珠標(biāo)記干細(xì)胞；b)將標(biāo)記后的干細(xì)胞注入特定組織的循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)；c)將正負(fù)兩個磁極指向所述特定組織相對應(yīng)的體表部位，在所述循環(huán)系統(tǒng)的循環(huán)過程中，所述干細(xì)胞迅速準(zhǔn)確歸巢于所述特定組織內(nèi)；所述正負(fù)兩個磁極間的磁場強(qiáng)度為8400 18600GS。其中，所述干細(xì)胞為具有特定細(xì)胞表面標(biāo)志的、具有多向分化潛能的干細(xì)胞，可以來源于人骨髓、流產(chǎn)胎兒的不同組織、胎盤、臍帶血或來自大鼠骨髓。如以大鼠骨髓c-Met+β 2M細(xì)胞為例，采用免疫磁珠標(biāo)記所述干細(xì)胞的過程如下將針對所述干細(xì)胞表面標(biāo)志性抗原的特異性抗體與所述干細(xì)胞孵育，經(jīng)清洗后再與偶聯(lián)有抗所述特異性抗體的免疫磁珠孵育，清洗得到所述標(biāo)記后的細(xì)胞。所述特異性抗體為兔抗大鼠c-Met抗體和β2Μ抗體；所述免疫磁珠偶聯(lián)有山羊抗兔IgG。
為了能提高干細(xì)胞在特定組織中的歸巢效率，所述兩個異性磁極的材料可選用鐵氧體燒結(jié)永磁性材料，兩個異性磁極呈圓柱狀，且兩磁極靠近相對的一端直徑縮?。凰鰞蓚€異性磁極端面的距離為5 25mm。此時，在兩個磁極之間形成高強(qiáng)度、高梯度的磁場，磁場的高強(qiáng)度使免疫磁珠標(biāo)記的干細(xì)胞具有良好的歸巢能力，磁場的高梯度則使免疫磁珠標(biāo)記的細(xì)胞能選擇性地滯留于特定組織而不是其他組織。本發(fā)明將直徑在35納米左右的免疫磁珠通過抗原抗體親和反應(yīng)來特異性標(biāo)記細(xì)胞，由于該免疫磁珠的超順磁性，使得特定細(xì)胞在磁場的作用下迅速歸巢于特定組織，而且當(dāng)磁場消失后，免疫磁珠失去磁性，在特定組織內(nèi)的細(xì)胞不會因?yàn)橄嗷ノ奂汕蚨鴮?dǎo)致血管阻塞。在本發(fā)明中，免疫磁珠的主要制備原料均可以被生物體吸收、排泄，對機(jī)體無毒副作用。本發(fā)明合理利用超順磁性磁珠的磁特性，采用磁場定向技術(shù)使干細(xì)胞向特定組織歸巢，具有歸巢高效快捷等優(yōu)點(diǎn)，有很好的臨床應(yīng)用前景。


圖1為干細(xì)胞的免疫磁珠標(biāo)記；圖2為細(xì)胞在磁場中的篩分；圖3A為歸巢儀的結(jié)構(gòu)；圖3B為圖3A的俯視；圖4為體外免疫磁珠標(biāo)記細(xì)胞的富集操作流程圖；圖5為免疫磁珠標(biāo)記的干細(xì)胞向大鼠肝的歸巢照片。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1、C-Met +β 2M細(xì)胞的歸巢本實(shí)施例以肝損傷大鼠模型的肝臟作為靶組織。本實(shí)施例中所用免疫磁珠購于清華大學(xué)材料學(xué)院，該磁珠偶聯(lián)了山羊抗兔IgG，粒徑在35nm左右，具有良好的超順磁性。1、大鼠骨髓單個核細(xì)胞的獲得斷頸處死的大鼠經(jīng)75%乙醇消毒后，用剖腹的方法取出股骨，以含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液作為沖洗液，用5ml注射器反復(fù)沖洗骨髓腔，用100目篩網(wǎng)過濾沖出的細(xì)胞制成大鼠骨髓單細(xì)胞懸液，1200rpm離心后，將細(xì)胞重懸于PBS中，經(jīng)Ficoll (相對密度1.083g/ml)密度梯度離心后收集大鼠骨髓單個核細(xì)胞，洗滌后重懸于PBS中。2、用兩步間接免疫磁珠分離方法富集并標(biāo)記大鼠骨髓來源的c-Met+β 2M細(xì)胞如圖1所示，將步驟I所得細(xì)胞I先與兔抗大鼠β 2Μ抗體2于4°C孵育30min，經(jīng)PBS緩沖液洗滌后，再將其與偶聯(lián)了山羊抗兔IgG4的免疫磁珠3于4°C孵育30min，再經(jīng)PBS洗滌，從而使凡是表達(dá)β 2Μ的細(xì)胞都可被免疫磁珠標(biāo)記。如圖2所示，將該群細(xì)胞流過位于兩個磁極9之間的塑料軟管7，其中被免疫磁珠所標(biāo)記的表達(dá)β2Μ的細(xì)胞5(即陽性細(xì)胞)滯留于磁場內(nèi)，而未被標(biāo)記的細(xì)胞6(即陰性細(xì)胞)流出磁場，用Eppendorf管8收集細(xì)胞6 ;而滯留于磁場內(nèi)的細(xì)胞5在去掉磁場后用緩沖液沖洗收集。按照上述操作將收集到的β 2Μ-細(xì)胞群6先后與兔抗大鼠c-Met抗體及免疫磁珠標(biāo)記的山羊抗兔IgG孵育，再經(jīng)PBS洗滌。這樣，在β2Μ-的細(xì)胞群中，凡是表達(dá)c-Met的C-Met+ β 2Μ細(xì)胞均被免疫磁珠所標(biāo)記，流經(jīng)磁場時，該細(xì)胞滯留于磁場內(nèi)，將塑料軟管移離磁場后，用PBS將細(xì)胞沖出，獲得目的細(xì)胞-免疫磁珠標(biāo)記的c-Met+β2Μ細(xì)胞。為了有效檢測移植細(xì)胞在受者體內(nèi)的歸巢效率，該群細(xì)胞以熒光染料DAPI標(biāo)記并充分洗滌。3、近交系F344大鼠的飼養(yǎng)和肝損傷模型的制備雄性一級近交系F344大鼠，體重180 200g，室溫20 22°C飼養(yǎng)，光線12小時明暗交替，自由飲水、進(jìn)食。將丙烯醇按O. 62umol/kg體重經(jīng)腹膜下注射至F344大鼠體內(nèi)，制備藥物所致大鼠肝損傷模型，常規(guī)飼養(yǎng)3天后備用。4、C-Met+ β 2M 細(xì)胞的歸巢如圖3Α、圖3Β所示，磁歸巢定位儀包括有一支架10，支架10內(nèi)上下相對設(shè)置有二磁極，下磁極11垂向設(shè)置在支架10的底面，上磁極12與下磁極11相對應(yīng)的設(shè)置在支架10的頂面，上磁極12連接于螺桿14下端，而螺桿14上端設(shè)置有轉(zhuǎn)動把手13。通過旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)動把手13，可以使螺桿14轉(zhuǎn)動，從而使螺桿相對支架10的頂面沿垂向移動，也就可以帶動上磁極12移動，借此來改變上、下磁極之間的距離。二磁極成圓柱狀，為了保證兩磁極間的磁場強(qiáng)度，兩磁極靠近相對的一端直徑縮小，且直徑縮小的越多，兩磁極間的磁場梯度越大。此外，支架及二磁極的材料均選用鐵氧體燒結(jié)永磁性材料，可以有效的提高磁極間的磁場強(qiáng)度。將大鼠固定于磁歸巢定位儀中，使肝臟所對應(yīng)的體表投射區(qū)正對上下兩個磁極，然后通過大鼠外周靜脈(尾靜脈或股靜脈)將步驟2所得目的細(xì)胞一熒光素標(biāo)記的攜帶免疫磁珠的C-Met+ β 2Μ細(xì)胞輸注入體內(nèi)，這樣，標(biāo)記了免疫磁珠的目的干細(xì)胞可在磁力的引導(dǎo)下沿血液循環(huán)向分布于肝臟內(nèi)的各級血管富集，隨著大鼠在磁場內(nèi)停留時間的延長，目的干細(xì)胞便可穿越血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)入肝組織內(nèi)整合入肝細(xì)胞板，從而使c-Met+β 2Μ細(xì)胞歸巢于肝組織。 實(shí)施例2、細(xì)胞歸巢效果的檢測體外富集按照實(shí)施例1中步驟I 2的操作得到免疫磁珠標(biāo)記的β 2Μ細(xì)胞，PBS洗滌。然后配制含20%葡聚糖的生理鹽水作為流動相，將所得細(xì)胞懸浮于其中。調(diào)節(jié)蠕動泵流速為
O.1 15cm/s,使磁珠標(biāo)記的細(xì)胞流過磁場(調(diào)節(jié)兩磁極間的距離1. 6 2. 5cm,使場強(qiáng)波動于1. 33 O. 85T)，顯微鏡下計數(shù)流出和流入細(xì)胞的比值，得到磁場對磁珠標(biāo)記細(xì)胞的富集效率。操作過程如圖4所示，圖中15為加有免疫磁珠標(biāo)記的β 2Μ細(xì)胞的20%葡聚糖生理鹽水溶液；16為蠕動泵；17為磁場的兩個磁極；18為富集的細(xì)胞。結(jié)果表明，隨著磁場強(qiáng)度的增加，β 2Μ細(xì)胞富集效果逐漸加強(qiáng)，當(dāng)磁場強(qiáng)度在O. 75Te以上時，均能使磁珠標(biāo)記的細(xì)胞在磁極對應(yīng)的管道局部很好地富集，其效率達(dá)到95%以上。2、體內(nèi)歸巢取近交系F344大鼠，雌雄不限，按實(shí)施例1步驟4的方法制備肝損傷模型。動物分為3組G1外周靜脈(股靜脈)移植+磁場；G2開腹經(jīng)門靜脈移植；G3 :外周靜脈移植(對照組，不加磁場)。其中，Gl組的操作如下I)按實(shí)施例1中步驟I 2的方法制備免疫磁珠標(biāo)記的C-Met+ β 2Μ細(xì)胞，然后加入DAPI染液，室溫避光染色30min，用PBS洗4次，按IxlOVmL將細(xì)胞重懸于DMEM/F12培
養(yǎng)基中；
2)大鼠常規(guī)麻醉后置于磁歸巢定位儀中四肢固定，使其肝臟體表投影部位正對上下兩個磁極；3)于腹股溝切開皮膚暴露股靜脈，經(jīng)股靜脈緩慢注入處理好的細(xì)胞懸液，術(shù)后縫皮，燈照保暖，術(shù)后不同時間將大鼠移離磁場，正常飼養(yǎng)；4)術(shù)后分別于3d和IOd活殺大鼠，取肝組織制備冰凍切片，于熒光顯微鏡下觀察熒光標(biāo)記細(xì)胞在受體大鼠肝內(nèi)的分布。結(jié)果如圖5所不，圖5A為經(jīng)門靜脈移植后,大鼠固定于磁場內(nèi)20h細(xì)胞在肝臟的歸巢，圖5B為門靜脈細(xì)胞移植無磁場(對照)。結(jié)果表明，經(jīng)股靜脈移植DAP1-免疫磁珠標(biāo)記的細(xì)胞后,大鼠固定于磁場內(nèi)20h與2h者相比，標(biāo)記細(xì)胞在肺內(nèi)的截留明顯減少，而在肝內(nèi)的停留明顯增多；初步統(tǒng)計結(jié)果表明，滯留于肝臟內(nèi)的細(xì)胞數(shù)，依次為磁場內(nèi)20h >經(jīng)門靜脈移植>磁場內(nèi)2h和股靜脈移植(無磁場，對照組)，標(biāo)記細(xì)胞在肺內(nèi)的滯留與此相反。表明采用本發(fā)明方法能有效地使細(xì)胞歸巢于靶組 織內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種干細(xì)胞歸巢的快捷方法，具體步驟包括a)用粒徑為40 60nm的免疫磁珠標(biāo)記干細(xì)胞山)將標(biāo)記后的干細(xì)胞注入特定組織的循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)；c)將正負(fù)兩個磁極指向所述特定組織相對應(yīng)的體表部位，在所述循環(huán)系統(tǒng)的循環(huán)過程中，所述干細(xì)胞迅速準(zhǔn)確歸巢于所述特定組織內(nèi)；所述正負(fù)兩個磁極間的磁場強(qiáng)度為8400 18600GS。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述干細(xì)胞來源于人骨髓、流產(chǎn)胎兒的不同組織、胎盤、臍帶血或來自大鼠骨髓。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述免疫磁珠標(biāo)記所述干細(xì)胞的過程如下將針對所述干細(xì)胞表面標(biāo)志性抗原的特異性抗體與所述干細(xì)胞溫育，經(jīng)清洗后再與偶聯(lián)有抗所述特異性抗體的免疫磁珠溫育，清洗所得到的標(biāo)記干細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述干細(xì)胞為來源于大鼠骨髓的c-Met+β 2M細(xì)胞；所述特異性抗體為兔抗大鼠c-Met抗體和β 2Μ抗體；所述免疫磁珠偶聯(lián)有山羊抗兔IgG。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4任一所述的方法，其特征在于所述兩個異性磁極的材料為鐵氧體燒結(jié)永磁。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述兩個異性磁極呈圓柱狀，且兩磁極靠近相對的一端直徑縮??；所述兩個異性磁極端面的距離為6 30mm。
全文摘要
本發(fā)明提供的方法可使干細(xì)胞快速有效歸巢。本發(fā)明所提供的干細(xì)胞歸巢方法包括如下步驟1)用粒徑為40～60nm的免疫磁珠標(biāo)記干細(xì)胞；2)將標(biāo)記后的干細(xì)胞注入特定組織的循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)；3)將正負(fù)兩個磁極指向所述特定組織相對應(yīng)的體表部位，在所述循環(huán)系統(tǒng)的循環(huán)過程中，所述干細(xì)胞迅速準(zhǔn)確歸巢于所述特定組織內(nèi)；所述正負(fù)兩個磁極間的磁場強(qiáng)度為8400～18600Gs。本發(fā)明創(chuàng)新性地利用超順磁性磁珠的磁特性，采用磁吸引技術(shù)使干細(xì)胞在特定組織歸巢，可幫助干細(xì)胞在特定組織分化成有功能的成體細(xì)胞，為干細(xì)胞的臨床應(yīng)用開拓了新方向。
文檔編號A61N2/00GK103055418SQ201110323619
公開日2013年4月24日 申請日期2011年10月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月24日
發(fā)明者田杰 申請人:北京清美聯(lián)創(chuàng)干細(xì)胞科技有限公司