專利名稱：胡柚皮黃酮的制備工藝及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于中藥活性物質(zhì)的制備工藝技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種胡柚皮黃酮的制備工藝及其用途。
背景技術(shù)：
常山胡柚(Citrus changshan-huyou Y. B chang),又名胡柚、金柚，是柚 [C. grandis(Linn. )osbeek]與甜橙[C. sinensis (Linn.) osbeek]的雜交品種，以浙江常山為重點產(chǎn)區(qū)。其皮秋末冬初采集，分割5 7瓣，懸起曬干或陰干，作為藥材。其性溫、味辛甘苦、無毒，在《唐本草》、《本草求原》、《列子》、《綱目》等文獻中均有記載。其功用主治為 化痰、消食、下氣、快膈；治氣郁胸悶、脘腹冷痛、食滯、咳喘、疝氣。目前，國內(nèi)外研究結(jié)果表明，胡柚皮中存在種類繁多、含量豐富的黃酮類化合物， 其中尤以橙皮苷為最多，其次是柚皮苷。這些黃酮類化合物在工業(yè)上都是很好的染料和抗氧化劑。近幾十年來，人們發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物具有多種生理功能和較大的藥用價值，如橙皮苷有調(diào)節(jié)血管滲透性和類似維生素P的作用，這已在許多國家成為法定藥物；柚皮苷有抗炎作用。另外，橙皮苷和柚皮苷還有抗病毒、抗變態(tài)反應、保護心血管系統(tǒng)、抗癌防癌、利膽及作為一種新型甜味劑等作用，具有很大的開發(fā)和利用價值。現(xiàn)代醫(yī)學認為造成心腦血管疾病的直接原因是動脈粥樣硬化(atherosclerosis， AS)，而高血脂和脂質(zhì)代謝紊亂是動脈粥樣硬化形成的主要原因，最終引發(fā)腦出血、血栓和心肌梗塞并導致死亡。高脂血癥分為高膽固醇血癥、高甘油三酯血癥及高膽固醇合并高甘油三酯血癥三大類。研究指出心腦血管發(fā)病率與血漿膽固醇含量呈線性正相關(guān)。根據(jù)損傷反應學說，AS的發(fā)生和發(fā)展與血液中總膽固醇(total cholesterol, TC)和甘油三酯 (triglyceride, TG)等水平密切相關(guān)；低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterin, LDL-C) > 極低密度月旨蛋白膽固醇(very low density lipoprotein cholesterol,VLDL-C)是主要因素，其濃度與冠心病(coronary heart disease,CHD)發(fā)病率呈正相關(guān)，而高密度脂蛋白膽固醇(high densitylipoprotein cholesterin, HDL-C)可抑制細胞對LDL-C的攝取，把過多的膽固醇以酯的形式從細胞中轉(zhuǎn)運出來，阻止膽固醇在細胞內(nèi)的堆積。高脂血癥的形成與膳食因素關(guān)系密切，可以通過藥物或膳食降低血清膽固醇水平，阻止膽固醇在細胞內(nèi)的堆積，有效的降低CHD的發(fā)病率，是預防與治療心腦血管病的主要途徑。高脂飲食能誘導氧化損傷和脂代謝紊亂，氧自由基攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，弓I發(fā)脂質(zhì)過氧化作用。血管壁如有過多氧化劑時，可使LDL氧化，形成氧化LDL，LDL 的脂質(zhì)過氧化物對動脈硬化斑的形成起著重要作用。Vladimirov報道動脈硬化患者血清 LPO(氧自由基氧化細胞膜上磷脂形成的脂質(zhì)過氧化物)含量升高，LPO增多可誘發(fā)血管內(nèi)皮細胞損傷，而內(nèi)皮細胞損傷在動脈粥樣硬化的發(fā)病機理中起重要作用。因此，氧化應激與高脂血癥及動脈粥樣硬化之間關(guān)系十分密切。MDA在組織中的含量間接反應了機體細胞受自由基攻擊的嚴重程度。超氧化物歧化酶(SOD)廣泛地存在于各種生物中，它專一地清除超氧陰離子，保護細胞免受損傷。S0D、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)與過氧化氫酶(CAT)構(gòu)成了機體清除活性氧的酶促系統(tǒng)，三者協(xié)同作用對減少活性氧的產(chǎn)生、防止脂質(zhì)過氧化及其中間代謝產(chǎn)物對機體的損害具有十分重要的作用。因此，血液或肝組織中SOD與MDA的水平直接反映了體內(nèi)的氧化應激水平。柚皮苷、橙皮苷及多甲基黃酮等柑橘類黃酮化合物能明顯降低動物或人體TC、TG、 LDL及一些相關(guān)酶，如β -羥基- β -甲基戊二酰CoA(HMG-COA)、膽固醇?；D(zhuǎn)移酶(ACAT 酶)的活力。然而，關(guān)于胡柚皮黃酮(Pure Total Flavonoids Citrus,PTFC)對高脂血癥、 高脂飲食所致脂質(zhì)代謝紊亂引起的氧化應激是否具有調(diào)節(jié)作用，目前尚無文獻報導。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種胡柚皮黃酮新的制備工藝；本發(fā)明另一目的在于提供胡柚皮黃酮在輔助降血脂功能的保健食品和治療高脂血癥藥物中的應用。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是胡柚皮黃酮的制備工藝，其按如下步驟(1)前處理將胡柚分揀、清洗，再將清洗后的胡柚的果皮與果肉分離，取新鮮成熟果皮切成絲，待用；(2)提取向胡柚皮絲中加入6 20倍的乙醇溶液，浸泡0. 5 4小時，加熱至沸騰提取30 ISOmin得提取液，所述的乙醇質(zhì)量濃度為5 95% ；(3)濃縮將提取液濃縮處理，回收乙醇至無醇味，提取物濃縮至總黃酮含量達 38. 33mg/mL以上的濃縮物；(4)分離、純化對步驟(3)得到的濃縮物，調(diào)節(jié)pH至3. O 5. 0，將2BV(BV 柱體積)的濃縮物，以1. 5 2. 5BV/h上樣速度上大孔樹脂層析柱內(nèi)進行吸附，靜止吸附0. 5 1.證后，用8 12BV蒸餾水洗脫后，用3 5BV的30% 90%乙醇為洗脫劑，流速為1 3mL/min洗脫黃酮類物質(zhì)，收集洗脫液；(5)干燥將洗脫液減壓回收乙醇至無醇味，濃縮液冷凍干燥成干粉，干粉的總黃酮純度達76%以上。所述的胡柚皮黃酮制備工藝的步驟O)中，所述的提取的次數(shù)為2 4次，每次提取間隔為0. 5 0.他，且在第1次提取時進行0. 5 4小時的浸泡處理。所述的胡柚皮黃酮制備工藝的步驟(3)中，所述的提取液濃縮處理為提取液在溫度40 60°C，真空度-0. 05 -0. IMpa條件下真空減壓濃縮至總黃酮含量達38. 33mg/ mL以上的濃縮物。所述的胡柚皮黃酮制備工藝的步驟(3)中，所述的提取液濃縮處理為先將提取液真空減壓濃縮至原體積的40 70%得濃縮液，向濃縮液中加質(zhì)量濃度為92 98%的乙醇并靜置12 M小時初級醇沉，濃縮液與乙醇的體積比為1 2 5，取初級醇沉的上清液待用；向初級醇沉的沉淀物中加質(zhì)量濃度為92 98%的乙醇并靜置1 3小時次級醇沉； 取次級醇沉的上清液與初級醇沉的上清液混合得混合液，將混合液真空減壓濃縮至與提取液濃縮后的濃縮液的體積相等，然后將濃縮后的混合液注入大孔樹脂層析，洗脫，洗脫液真空減壓濃縮至固形物含量達40%以上；所述的真空減壓濃縮的條件為溫度50 80°C，真空度-0. 05 -0. IMpa0所述的胡柚皮黃酮制備工藝的步驟中，選用的大孔樹脂型號為HPD-100、 HPD-300、HPD-750 的任意一種。
所述的胡柚皮黃酮制備工藝的步驟中，可用聚酰胺樹脂或離子交換樹脂代替大孔樹脂。上述濃縮后的混合液注入量為大孔樹脂的8 12倍，所述的洗脫為先用水沖洗至流出液澄清，再用質(zhì)量濃度為40 80%的食用乙醇洗脫。所述的胡柚皮黃酮在具輔助降血脂功能的保健食品和治療高脂血癥的藥物中的應用包括能降低血脂，治療心血管疾病，增強心血管功能。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明胡柚皮黃酮新的制備工藝其工藝穩(wěn)定、可行，成品的黃酮含量均比原工藝高；提高了原料的利用率、有效成分的提取率；且胡柚皮黃酮可用于治療高脂血癥，降低血脂，治療心血管疾病，增強心血管功能。大孔樹脂吸附法是目前應用廣泛的一種分離、純化方法。從顯微結(jié)構(gòu)上看，大孔吸附樹脂含有很多具有微觀小球的網(wǎng)狀孔穴結(jié)構(gòu)，顆粒的總表面積很大，且包含一定量的極性基團，使大孔樹脂具有較大的吸附能力；另外，這些網(wǎng)狀孔穴的孔徑有一定的范圍，使它們對通過孔徑的化合物根據(jù)其分子量的不同而具有一定的選擇性?；谖叫院头肿雍Y原理，有機化合物在大孔吸附樹脂上經(jīng)一定的溶劑洗脫而達到分離的目的。經(jīng)大孔樹脂吸附技術(shù)處理后，可有效地去除提取液中大量的糖類、無機鹽、黏液質(zhì)等雜質(zhì)成分，有利于增強植物提取物產(chǎn)品的穩(wěn)定性。大孔樹脂吸附技術(shù)所需設(shè)備簡單，生產(chǎn)周期短。利用大孔吸附樹脂提取黃酮類化合物的一般方法是將植物提取液通過大孔樹脂，有效成分吸附到樹脂上， 首先用水洗脫除去可溶性糖類、蛋白質(zhì)、果膠等，再用不同濃度的醇溶液洗脫所吸附的黃酮類物質(zhì)，洗脫液回收，干燥洗脫液，得到有效成分提取物的半成品。選用的大孔樹脂型號為HPD-100、HPD-300或HPD-750中的任意一種；是從上樣液 PH值、上樣液濃度、洗脫溶劑及洗脫溶劑用量等方面進行了考察，旨在確定胡柚皮有效部位柱層析分離條件，為今后產(chǎn)業(yè)化應用和開發(fā)胡柚皮黃酮類產(chǎn)品奠定基礎(chǔ)。本文所涉及的試劑之間均為體積份。


圖1是本發(fā)明中正常對照組大鼠肝臟組織HE病理圖片；圖2是本發(fā)明中模型對照組大鼠肝臟組織HE病理圖片；圖3是本發(fā)明中低劑量組大鼠肝臟組織HE病理圖片；圖4是本發(fā)明中中劑量組大鼠肝臟組織HE病理圖片；圖5是本發(fā)明中高劑量組大鼠肝臟組織HE病理圖片；圖6是本發(fā)明中陽性對照組大鼠肝臟組織HE病理圖片；圖7是不同溶酶濃度對胡柚皮總黃酮提取率的影響(n = 3)；圖8是不同提取時間對胡柚皮總黃酮提取率的影響(n = 3)；圖9是不同固液比對胡柚皮總黃酮提取率的影響(n = 3)；圖10是八種樹脂的等溫吸附動力學曲線。
具體實施例方式涉及的具體儀器和材料如下(一 )實驗儀器
UV-2550紫外分光光度儀(日本島津)；R系列旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海申生科技有限公司)；TC-15恒溫電熱套(海寧市華星儀器廠)；W501B型恒溫水浴鍋(上海申生科技有限公司)；KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；HN101-2電熱恒溫鼓風干燥箱(南通滬南科學儀器有限公司)；電子天平(上海天平儀器廠)；SHB-3T循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；ACS-E2電子秤(上海三積分電子有限公司)。( 二)實驗材料胡柚皮(批號20091010 ；采自浙江常山)，由浙江中醫(yī)藥大學藥學院資源鑒定教研室熊耀康教授鑒定為蕓香科柑橘屬常山胡柚(Citrus ChangShan-huyou Y. B. Chang)的新鮮成熟果皮；甲醇(一級色譜純，天津市四友精細化學品有限公司出品，批號071030101)；柚皮苷(中國藥品生物制品檢定所，批號UNN0. 1230CN. 32058)；乙醇(浙江省建德市蓮花化工試劑廠，批號20090506)。(三)實驗方法1)胡柚皮總黃酮及柚皮苷含量測定胡柚皮總黃酮和柚皮苷分析方法，采用紫外/可見分光光度法和高效液相色譜法，分別在波長處測定溶液的吸光度和峰面積，并代入回歸方程，計算濃度和含量。2)胡柚皮總黃酮提取得率計算胡柚皮總黃酮的提取得率可按以下公式計算胡柚皮總黃酮得率(mg/g)= (CX IOX 100)/(0. 5XWX 1000)式C-根據(jù)回歸方程計算得到的樣品溶液中總黃酮濃度(μ g/mL) ；10、100_稀釋倍數(shù)；0. 5-取0. 5mL待測液；W-原料胡柚皮的質(zhì)量(g) ； 1000-單位換算數(shù)量級。以下通過具體實施方式
對本發(fā)明的技術(shù)方案作進一步說明。實施例1胡柚皮黃酮的制備工藝，所述的制備工藝包括如下步驟(1)前處理將胡柚分揀、清洗，再將清洗后的胡柚的果皮與果肉分離，取新鮮成熟果皮切成絲，待用；(2)提取精密稱取胡柚皮絲500g，向果皮中加入6倍的乙醇溶液，浸泡0. 5小時， 加熱至沸騰，提取2次，每次提取間隔為30min得提取液，所述的乙醇質(zhì)量濃度為25% ；(3)濃縮提取液在溫度40°C，真空度-0. OSMpa條件下真空減壓濃縮，濃縮至原體積的40%的濃縮液，向濃縮液中加質(zhì)量濃度為92%的乙醇并靜置12小時初級醇沉，濃縮液與乙醇的體積比為1 2，取初級醇沉的上清液待用；向初級醇沉的沉淀物中加質(zhì)量濃度為 92%的乙醇并靜置1小時次級醇沉；取次級醇沉的上清液與初級醇沉的上清液混合得混合液，將混合液真空減壓濃縮至與提取液濃縮后的濃縮液的體積相等，然后將濃縮后的混合液注入型號為HPD-100大孔樹脂層析，洗脫，洗脫液真空減壓濃縮至固形物含量達40% ；回收乙醇至無醇味，提取物濃縮至總黃酮含量為40mg/mL的濃縮物；
(4)分離、純化對步驟(3)得到的濃縮物，調(diào)節(jié)PH至3.0，將2BV的濃縮物，以 1. 5BV/h上樣速度上型號為HPD-100的大孔樹脂層析柱內(nèi)進行吸附，靜止吸附0. 5h后，用 8BV蒸餾水洗脫后，用3BV的70%乙醇為洗脫劑，流速為lmL/min洗脫黃酮類物質(zhì)，收集洗脫液；濃縮后的混合液注入量為大孔樹脂的8倍，所述的洗脫為先用水沖洗至流出液澄清，再用質(zhì)量濃度為70%的乙醇洗脫。(5)干燥將洗脫液在溫度50°C，真空度-0. OSMpa的條件下減壓回收乙醇至無醇味，濃縮液冷凍干燥成干粉。上述制備得到的干粉為10. 85克，經(jīng)檢測干粉的總黃酮純度為76%，胡柚皮總黃酮提取得率為2. 17%。實施例2胡柚皮黃酮的制備工藝，所述的制備工藝包括如下步驟(1)前處理將胡柚分揀、清洗，再將清洗后的胡柚的果皮與果肉分離，取新鮮成熟果皮切成絲，待用；(2)提取精密稱取胡柚皮絲500g，向果皮中加入10倍的乙醇溶液，浸泡1. 5小時，加熱至沸騰，提取3次，每次提取間隔為30min得提取液，所述的乙醇質(zhì)量濃度為50% ；(3)濃縮提取液在溫度50°C，真空度-0. 06Mpa條件下真空減壓濃縮，濃縮至原體積的50%得濃縮液，向濃縮液中加質(zhì)量濃度為94%的食用乙醇并靜置16小時初級醇沉，濃縮液與食用乙醇的體積比為1 3，取初級醇沉的上清液待用；向初級醇沉的沉淀物中加質(zhì)量濃度為94%的乙醇并靜置1. 5小時次級醇沉；取次級醇沉的上清液與初級醇沉的上清液混合得混合液，將混合液真空減壓濃縮至與提取液濃縮后的濃縮液的體積相等，然后將濃縮后的混合液注入型號為HPD-300的大孔樹脂層析，洗脫，洗脫液真空減壓濃縮至固形物含量達50% ；回收乙醇至無醇味，提取物濃縮至總黃酮含量為50mg/mL的濃縮物；(4)分離、純化對步驟(3)得到的濃縮物，調(diào)節(jié)PH至3.5，將2BV的濃縮物，以 2BV/h上樣速度上大孔樹脂層析柱內(nèi)進行吸附，靜止吸附0. 8h后，用9BV蒸餾水洗脫后，用 4BV的70%乙醇為洗脫劑，流速為1. 5mL/min洗脫黃酮類物質(zhì)，收集洗脫液；選用的大孔樹脂型號為HPD-300 ；濃縮后的混合液注入量為大孔樹脂的10倍，所述的洗脫為先用水沖洗至流出液澄清，再用質(zhì)量濃度為60%的乙醇洗脫。所述的胡柚皮黃酮制備工藝的步驟中，低溫連續(xù)干燥為在溫度為70°C，真空度-0. 08Mpa下干燥至水分含量5. 5%。所述的胡柚皮黃酮制備工藝的步驟中，噴霧干燥為將濃縮物霧化噴入溫度為 280°C環(huán)境下干燥至水分含量5. 5%。(5)干燥將洗脫液在溫度60°C，真空度-0. 07Mpa的條件下減壓回收乙醇至無醇味，濃縮液冷凍干燥成干粉。上述制備得到的干粉為12. 85克，經(jīng)檢測干粉的總黃酮純度為80%，胡柚皮總黃酮提取得率為2.57%。實施例3胡柚皮黃酮的制備工藝，所述的制備工藝包括如下步驟
(1)前處理將胡柚分揀、清洗，再將清洗后的胡柚的果皮與果肉分離，取新鮮成熟果皮待用；(2)提取精密稱取胡柚皮絲500g，向果皮中加入16倍的乙醇溶液，浸泡3小時， 加熱至沸騰，提取3次，每次提取間隔為48min得提取液，所述的乙醇質(zhì)量濃度為60% ；(3)濃縮提取液在溫度55°C，真空度-0. OSMpa條件下真空減壓濃縮，濃縮至原體積的50%得濃縮液，向濃縮液中加質(zhì)量濃度為96%的乙醇并靜置20小時初級醇沉，濃縮液與乙醇的體積比為1 4，取初級醇沉的上清液待用；向初級醇沉的沉淀物中加質(zhì)量濃度為 96%的乙醇并靜置2小時次級醇沉；取次級醇沉的上清液與初級醇沉的上清液混合得混合液，將混合液真空減壓濃縮至與提取液濃縮后的濃縮液的體積相等，然后將濃縮后的混合液注入型號為HPD-300大孔樹脂層析，洗脫，洗脫液真空減壓濃縮至固形物含量達60% ；回收乙醇至無醇味，提取物濃縮至總黃酮含量為60mg/mL的濃縮物；(4)分離、純化對步驟(3)得到的濃縮物，調(diào)節(jié)pH至4，將2BV的濃縮物，以2BV/ h上樣速度上大孔樹脂層析柱內(nèi)進行吸附，靜止吸附Ih后，用IOBV蒸餾水洗脫后，用4BV的 70%乙醇為洗脫劑，流速為2mL/min洗脫黃酮類物質(zhì)，收集洗脫液；選用的大孔樹脂型號為 HPD-300 ；濃縮后的混合液注入量為大孔樹脂的11倍，所述的洗脫為先用水沖洗至流出液澄清，再用質(zhì)量濃度為70%的乙醇洗脫。所述的胡柚皮黃酮制備工藝的步驟中，低溫連續(xù)干燥為在溫度為80°C，真空度-0. 09Mpa下干燥至水分含量5%。所述的胡柚皮黃酮制備工藝的步驟中，噴霧干燥為將濃縮物霧化噴入溫度為 300°C環(huán)境下干燥至水分含量5%。(5)干燥將洗脫液在溫度70°C，真空度-0. 06Mpa的條件下減壓回收乙醇至無醇味，濃縮液冷凍干燥成干粉。上述制備得到的干粉為13. 55克，經(jīng)檢測干粉的總黃酮純度為85%，胡柚皮總黃酮提取得率為2.71%。實施例4胡柚皮黃酮的制備工藝，所述的制備工藝包括如下步驟(1)前處理將胡柚分揀、清洗，再將清洗后的胡柚的果皮與果肉分離，取新鮮成熟果皮切成絲，待用；(2)提取精密稱取胡柚皮絲500g，向果皮中加入20倍的乙醇溶液，浸泡4小時， 加熱至沸騰，提取3次，每次提取間隔為60min得提取液，所述的乙醇質(zhì)量濃度為95% ；(3)濃縮提取液在溫度60°C，真空度-0. IMpa條件下真空減壓濃縮，濃縮至原體積的70%得濃縮液，向濃縮液中加質(zhì)量濃度為98%的乙醇并靜置M小時初級醇沉，濃縮液與食用乙醇的體積比為1 5，取初級醇沉的上清液待用；向初級醇沉的沉淀物中加質(zhì)量濃度為98%的乙醇并靜置3小時次級醇沉；取次級醇沉的上清液與初級醇沉的上清液混合得混合液，將混合液真空減壓濃縮至與提取液濃縮后的濃縮液的體積相等，然后將濃縮后的混合液注入苯乙烯型大孔樹脂層析，洗脫，洗脫液真空減壓濃縮至固形物含量達70% ；回收乙醇至無醇味，提取物濃縮至總黃酮含量為70mg/mL的濃縮物；(4)分離、純化對步驟(3)得到的濃縮物，調(diào)節(jié)PH至5，將2BV的濃縮物，以2. 5BV/h上樣速度上大孔樹脂層析柱內(nèi)進行吸附，靜止吸附1.證后，用12BV蒸餾水洗脫后， 用5BV的70%乙醇為洗脫劑，流速為3mL/min洗脫黃酮類物質(zhì)，收集洗脫液；選用的大孔樹脂型號為HPD-750 ；濃縮后的混合液注入量為苯乙烯型大孔樹脂的12倍，所述的洗脫為先用水沖洗至流出液澄清，再用質(zhì)量濃度為80%的乙醇洗脫。所述的胡柚皮黃酮制備工藝的步驟中，低溫連續(xù)干燥為在溫度為100°C，真空度-0. IMpa下干燥至水分含量4. 5%。所述的胡柚皮黃酮制備工藝的步驟中，噴霧干燥為將濃縮物霧化噴入溫度為 350°C環(huán)境下干燥至水分含量4. 5%。(5)干燥將洗脫液在溫度60°C，真空度-0. IMpa的條件下減壓回收乙醇至無醇味，濃縮液冷凍干燥成干粉。上述制備得到的干粉為14. 65克，經(jīng)檢測干粉的總黃酮純度為88%，胡柚皮總黃酮提取得率為2.93%。以下通過具體實驗對本發(fā)明的制備方法進行分析說明一、胡柚皮黃酮提取工藝研究由于影響到提取過程的因素主要包括溶酶濃度、提取時間、固液比及提取次數(shù)等因素；以下通過實驗，對影響提取的各因素進行單因素考察，以確定正交試驗優(yōu)選的范圍。 以紫外可見分光光度法測定不同因素單因素試驗中胡柚皮提取液的總黃酮含量，并以該含量為指標，考察各因素不同水平對胡柚皮總黃酮提取率的影響。(一)、實驗方法1、溶酶濃度精密稱取胡柚皮絲100g，分別加10倍量10 %、30 %、50 %、70 %、90 %乙醇，加熱至沸，沸后煎煮提取30min，提取1次，濾取提取液，濃縮至IOOmL,精密量取0. ImL,置IOOmL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，即得供試品溶液(含生藥lmg/mL)，紫外分光光度法測定總黃酮的含量，考察溶酶濃度對胡柚皮總黃酮提取率的影響。2、提取時間精密稱取胡柚皮絲100g，加10倍量70 %乙醇，加熱至沸，沸后分別煎煮提取 15min、30min、45min、60min、90min，濾取提取液，濃縮至 IOOmL,精密量取 0. ImL,置 IOOmL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，即得供試品溶液(含生藥lmg/mL)，紫外分光光度法測定總黃酮的含量，考察不同提取時間對胡柚皮總黃酮提取率的影響。3、固液比精密稱取胡柚皮絲100g，分別加8、10、12、14、16倍量70 %乙醇，加熱至沸，沸后煎煮提取1. Oh,濾取提取液，濃縮至IOOmL,精密量取0. ImL,置IOOmL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，即得供試品溶液(含生藥lmg/mL)，紫外分光光度法測定總黃酮的含量，考察不同料液比對胡柚皮總黃酮提取率的影響。4、提取次數(shù)精密稱取胡柚皮絲100g，分別加10倍量70 %乙醇，加熱至沸，沸后煎煮提取1. Oh, 提取4次，每次提取液，濃縮至IOOmL,精密量取0. ImL,置IOOmL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，即得供試品溶液(含生藥lmg/mL)，紫外分光光度法測定總黃酮的含量，分別測定1、2、3、4次黃酮提取率，考察提取次數(shù)對胡柚皮總黃酮提取率的影響。5、正交試驗研究5.1正交試驗設(shè)計根據(jù)單因素實驗結(jié)果，選擇對胡柚皮總黃酮提取率具有顯著影響的四個因素提取時間(A)、固液比⑶、溶酶濃度(C)、提取次數(shù)⑶作為考察因素，以總黃酮含量與浸膏粉得率為考察指標，采用正交試驗綜合評分法優(yōu)化提取工藝，以正交表“(34)安排實驗，見表 1。表1因素水平表
因素水平因素A 提取時間/hB 固液比C 溶酶濃度/%D 提取次數(shù)10.51:1260121.01:1470231.51:16803 5. 2正交試驗精密稱取胡柚皮9份，每份100g，按正交試驗安排表進行提取，合并提取液，過濾后濃縮至IOOmL,取90mL濃縮干燥至浸膏粉，精密稱取浸膏粉重量，計算浸膏粉得率。另 IOmL精密量取0. ImL,置IOOmL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，即得供試品溶液(含生藥 lmg/mL)，紫外分光光度法測定總黃酮的含量，采用HPLC法測定提取液中柚皮苷的含量。5. 3工藝驗證試驗按正交試驗優(yōu)選后的最佳工藝條件進行三次驗證性試驗，考察工藝的穩(wěn)定性和可行性。(二)、實驗結(jié)果1、溶酶濃度的確定不同溶酶濃度的總黃酮提取量如圖7所示，可見，起始階段，隨著提取溶酶濃度的增加，總黃酮提取量明顯增加，但溶酶濃度達70%以上，當溶酶濃度繼續(xù)增加，總黃酮的提取量趨于平穩(wěn)。因此，溶酶濃度為70%時就可以提取出絕大部分胡柚皮總黃酮。2、提取時間的確定不同提取時間的總黃酮提取率如圖8所示，起始階段，隨著提取時間的延長，總黃酮的提取量明顯增加；達到60min后，當提取時間繼續(xù)增加，總黃酮的提取量增加逐漸趨于平穩(wěn)。因此，提取時間為60min時就可以提取出絕大部分胡柚皮總黃酮。3、固液比的確定從圖9中可以看出，液固比對胡柚皮總黃酮得率的影響表現(xiàn)為先增大后趨于平緩并略有下降。在固液比為1 14條件下，總黃酮提取率達最大值0.95%。固液比增加主要是增加了物料體系與提取劑體系間有效成分的濃度差，有利于物質(zhì)的溶出。從原料節(jié)省方面考慮，固液比確定為1 14。
4、提取次數(shù)的確定設(shè)定提取溶酶為70%乙醇，固液比為1 10，提取時間為lh，取胡柚皮100g，提取 4次，分別測定提取1、2、3、4次總黃酮的提取量分別為6. 034mg/g,4. 578mg/g、l. 125mg/g、 0. 25aiig/g，為了減少后期濃縮的困難以及節(jié)省能耗考慮，以提取2次為宜。5、正交試驗結(jié)果5.1正交試驗分析通過單因素實驗發(fā)現(xiàn)在胡柚皮總黃酮的提取過程中，某些條件如溶酶濃度、提取時間，固液比、提取次數(shù)等會影響胡柚皮總黃酮的提取得率。以下通過正交實驗設(shè)計法，分析各因素的主次順序以及對實驗指標的影響規(guī)律。本文通過1^9(34)進行正交實驗，全面考察上述四個因素對胡柚皮總黃酮提取得率的影響。實驗方案及結(jié)果見表2。表2胡柚皮總黃酮提取工藝正交試驗結(jié)果
權(quán)利要求
1.胡柚皮黃酮的制備工藝，其特征是按如下步驟(1)前處理將胡柚分揀、清洗，再將清洗后的胡柚的果皮與果肉分離，取新鮮成熟果皮，切成絲，待用；(2)提取向胡柚皮絲中加入體積為6 20倍的乙醇溶液，浸泡0.5 4小時，加熱至沸騰提取30 ISOmin得提取液，所述的乙醇質(zhì)量濃度為5 95% ；(3)濃縮將提取液濃縮處理，回收乙醇至無醇味，提取物濃縮至總黃酮含量達 38. 33mg/mL以上的濃縮物；(4)分離、純化對步驟(3)得到的濃縮物，調(diào)節(jié)pH至3.0 5.0，將2BV的濃縮物，以 1. 5 2. 5BV/h上樣速度上大孔樹脂層析柱內(nèi)進行吸附，靜止吸附0. 5 1.釙后，用8 12BV蒸餾水洗脫后，用3 5BV的30% 90%乙醇為洗脫劑，流速為1 3mL/min洗脫黃酮類物質(zhì)，收集洗脫液；(5)干燥將洗脫液減壓回收乙醇至無醇味，濃縮液冷凍干燥成干粉，干粉的總黃酮純度達76%以上。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的胡柚皮黃酮的制備工藝，其特征在于步驟( 所述的提取的次數(shù)為2 4次，每次提取間隔為0. 5 0. 8h，且在第1次提取時進行0. 5 4小時的浸泡處理。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的胡柚皮黃酮的制備工藝，其特征在于步驟C3)所述的提取液濃縮處理為提取液在溫度40 60°C，真空度-0. 05 -0. IMpa條件下真空減壓濃縮至總黃酮含量達38. 33mg/mL以上的濃縮物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的胡柚皮黃酮的制備工藝，其特征在于步驟C3)所述的提取液濃縮處理為先將提取液真空減壓濃縮至原體積的40 70%得濃縮液，向濃縮液中加質(zhì)量濃度為92 98%的乙醇并靜置12 M小時初級醇沉，濃縮液與乙醇的體積比為 1 2 5，取初級醇沉的上清液待用；向初級醇沉的沉淀物中加質(zhì)量濃度為92 98%的乙醇并靜置1 3小時次級醇沉；取次級醇沉的上清液與初級醇沉的上清液混合得混合液， 將混合液真空減壓濃縮至與提取液濃縮后的濃縮液的體積相等，然后將濃縮后的混合液注入大孔樹脂層析，洗脫，洗脫液真空減壓濃縮至固形物含量達40%以上。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的胡柚皮黃酮的制備工藝，其特征在于所述的真空減壓濃縮的條件為溫度50 80°C，真空度-0. 05 -0. IMpa0
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的胡柚皮黃酮的制備工藝，其特征在于濃縮后的混合液注入量為大孔樹脂的8 12倍，所述的洗脫為先用水沖洗至流出液澄清，再用質(zhì)量濃度為40 80%的乙醇洗脫。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的胡柚皮黃酮的制備工藝，其特征在于步驟中選用的大孔樹脂型號為HPD-100、HPD-300、HPD-750中的任意一種。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的胡柚皮黃酮的制備工藝，其特征在于步驟中選用的大孔樹脂可由聚酰胺樹脂或離子交換樹脂替換。
9.一種如權(quán)利要求1-8所述胡柚皮黃酮的應用，其特征在于所述的胡柚皮黃酮在具輔助降血脂功能的保健食品和治療高脂血癥的藥物中的應用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的胡柚皮黃酮的應用，其特征在于所述的胡柚皮黃酮能降低血脂，治療心血管疾病，增強心血管功能。
全文摘要
本發(fā)明屬于中藥活性物質(zhì)的制備工藝技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種胡柚皮黃酮的制備工藝及其用途。所述的制備工藝包括如下步驟(1)前處理取新鮮成熟果皮切成絲，待用；(2)提取向胡柚皮絲中加入乙醇溶液，浸泡、加熱至沸騰提取提取液；(3)濃縮提取物濃縮至總黃酮含量達38.33mg/mL以上的濃縮物；(4)分離、純化；(5)干燥。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明胡柚皮黃酮新的制備工藝其工藝穩(wěn)定、可行，成品的黃酮含量均比原工藝高；提高了原料的利用率、有效成分的提取率；且胡柚皮黃酮可用于治療高脂血癥，降低血脂，治療心血管疾病，增強心血管功能。
文檔編號A61P9/10GK102302592SQ20111026919
公開日2012年1月4日 申請日期2011年9月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月13日
發(fā)明者張春椿, 徐春根, 熊耀康, 蔣劍平 申請人:浙江中醫(yī)藥大學