專利名稱：一種用于眼內(nèi)填充的原位交聯(lián)水凝膠及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于眼內(nèi)填充的原位交聯(lián)水凝膠及其制備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
玻璃體切除術(shù)是臨床上常用的治療視網(wǎng)膜脫離、玻璃體出血、眼后段外傷等眼底疾患的手術(shù)方法。玻璃體被切除后，需要注入眼內(nèi)填充物來進行視網(wǎng)膜的頂壓復(fù)位和維持眼球外形。常用的眼內(nèi)填充物有硅油和惰性氣體(如SF6、C2F6和C3F8等)。但硅油填充存在硅油乳化、繼發(fā)性青光眼、角膜帶狀變性及并發(fā)性白內(nèi)障等并發(fā)癥，必須二次手術(shù)取出。對于那些硅油依賴眼，硅油取出后即眼球萎縮者，則無能為力。而氣體眼內(nèi)填充的時間比較短暫，因為氣體會不斷被眼內(nèi)組織吸收，所以在眼內(nèi)的容積逐漸縮小，不超過2個月的時間內(nèi)，氣體會完全吸收。因此，迄今為止，臨床上缺乏比較理想的長期眼內(nèi)填充物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用于眼內(nèi)填充的原位交聯(lián)水凝膠及其制備方法與應(yīng)用。本發(fā)明提供的一種原位交聯(lián)水凝膠的制備方法，包括如下步驟式(I)所示多臂端巰基聚乙二醇與式(II)所示聚合物(α-PEG-MA)經(jīng)原位交聯(lián)反應(yīng)即得；
I H2\
C-^-C 葉O—CH2——CH2-1~SHj
(I)OO(II)式⑴中，m可為大于I的整數(shù)；式(II)中η可為大于I的整數(shù)。上述的制備方法中，式(I)中，m可為25-75之間的整數(shù)；式(II)中η為30-60之間的整數(shù)。上述的制備方法中，式⑴中m具體可為55，式(II)中η具體可為30或60。上述的制備方法中，所述原位交聯(lián)反應(yīng)的溶劑可為水、質(zhì)量百分濃度為O. 9%的氯化鈉水溶液和PH值為7. 0-8. O的磷酸鹽緩沖液中任一種。上述的制備方法中，所述式(I)所示多臂端巰基聚乙二醇與式(II)所示聚合物的摩爾份數(shù)比可為(1-10) (1-10)，I I或I : 10。本發(fā)明還提供了上述方法制備的原位交聯(lián)水凝膠在制備人工玻璃體中的應(yīng)用。本發(fā)明所提供的人工玻璃體替代材料與傳統(tǒng)的人工玻璃體替代材料相比，具有在眼內(nèi)可長期填充，無明顯毒性反應(yīng)的優(yōu)點，并且在結(jié)構(gòu)上模擬原始的天然玻璃體結(jié)構(gòu)，為親水性。


圖I為本發(fā)明所制備的a -PEG-MA的核磁共振氫譜譜圖。圖2為實施例3中使用實施例I制備的水凝膠進行流式細胞儀檢測凋亡細胞比率(早期凋亡細胞，即分析數(shù)據(jù)中的“LR” ；晚期凋亡細胞和壞死細胞，即分析數(shù)據(jù)中的“UR” ；正常細胞，即分析數(shù)據(jù)中的“LL” ；細胞碎片，即分析數(shù)據(jù)中的“UL”)。圖3為實施例4中使用實 施例I制備的水凝膠填充兔眼玻璃體腔I年后的眼底照相。圖4為實施例4中使用實施例I制備的水凝膠填充兔眼玻璃體腔I年后的雙眼視網(wǎng)膜電圖。圖5為實施例4中使用實施例I制備的水凝膠填充兔眼玻璃體腔I年后的玻璃體腔凝膠離體照相。圖6為實施例4中使用實施例I制備的水凝膠填充兔眼玻璃體腔I年后的視網(wǎng)膜蘇木素-伊紅染色。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。 下述實施例中所用的四臂端巰基聚乙二醇(4ARM-PEG-SH)，數(shù)均分子量約為10000(其中，式(I)中，m 為 55)，購于 JenChem，貨號為 4ARM-SH-10K。下述實施例中所用的PEG-O-EMA是按照下述方法制備得到的以羥端基PEG (數(shù)均分子量約為2000，Alfa-Aesar提供，貨號B22181)為原料，制備式(II)所示化合物，其中η為30或60。具體制備方法如下(I)將9. Og羥甲基丙烯酸乙酯(TCI提供，貨號Η0916)溶于75mL無水乙醚中，冰浴下滴入2. 3mL三溴化磷，冰浴下反應(yīng)3小時后于室溫繼續(xù)反應(yīng)24小時，得到溴甲基丙烯
酸乙酯。(2)將20. Og端羥基PEG溶于300mL 二氯甲烷中，加入2. 4g氫化鈉，攪拌I小時。在冰浴下滴入8mL上述制備的溴甲基丙烯酸乙酯，室溫下反應(yīng)24小時，即得式(II)所示化合物。所得化合物的結(jié)構(gòu)可以從圖I的核磁氫譜得到確認。實施例I、原位交聯(lián)水凝膠的制備將4ARM-PEG-SH和PEG_0_EMA (η為30)分別溶于水中，配制成濃度均為200mg/mL的溶液，將兩者的溶液以體積比為I : I在體外混合(該體系中，4ARM-PEG-SH與PEG-O-EMA的質(zhì)量份數(shù)比為I : I)，在室溫下進行原位交聯(lián)反應(yīng)3h得到原位交聯(lián)水凝膠。實施例2、原位交聯(lián)水凝膠的制備將4ARM-PEG-SH和PEG-O-EMA (η為60)分別溶于質(zhì)量百分含量為0.9%的氯化鈉水溶液中，配制成濃度均為50mg/mL的溶液，將兩者的溶液以體積比為I : 10在體外混合(該體系中，4ARM-PEG-SH與PEG-O-EMA的質(zhì)量份數(shù)比為I : 10)，在下進行原位交聯(lián)反應(yīng)3h得到原位交聯(lián)水凝膠。實施例3、原位交聯(lián)水凝膠的制備及其細胞安全性試驗(I)將 4ARM-PEG-SH 和 PEG-O-EMA 分別溶于 pH = 7. 4 濃度為 O. lmol/L 的磷酸鹽緩沖液中，配制成濃度均為50mg/mL的溶液，將兩者的溶液以體積比為I : I在體外混合，室溫下進行原位交聯(lián)反應(yīng)3h得到凝膠塊，用于細胞實驗。(2)細胞系(大鼠視網(wǎng)膜色素上皮細胞D407細胞系)常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)液為DMEM/F12 = I I (購于美國Hyclone公司)，加入胎牛血清(終濃度為10% )，取傳至3-6代的細胞用于實驗。(3)0. 25%的胰酶消化細胞，混勻，制成細胞懸液，消化制成細胞懸液后按5X106/ml接種于無菌6孔培養(yǎng)板。放入37度5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，至細胞融合到70%孔
底面積，給予無血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)12h。(4)棄掉培養(yǎng)液，每孔重新加入新鮮的無血清培養(yǎng)液1ml，同時加入制備的原位交聯(lián)水凝膠塊，對照組不加，培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24h。(4)冷PBS洗滌2次。O. 25%胰酶消化至細胞開始脫落，20%胎牛血清終止消化。冷PBS洗滌2次。IOOOrpm離心5分鐘；棄上清，用IOOul凋亡結(jié)合緩沖液重懸浮細胞；細胞懸液轉(zhuǎn)移至流式管，加5ul Annexin V和IOul PI ;室溫避光作用15分鐘。(5)加入400ul結(jié)合緩沖液，上機(流式細胞儀；BD FACS Calibur)檢測。結(jié)果顯示在凝膠組，早期凋亡細胞比率6. 3 %，晚期凋亡細胞比率為3. 32% (圖2);在正常對照組，早期凋亡細胞比率為4. 55%，晚期凋亡細胞比率為4. 2%。上述結(jié)果表明，本發(fā)明提供的新材料原位交聯(lián)凝膠沒有明顯的細胞毒性反應(yīng)。實施例4、實施例I制備的原位交聯(lián)水凝膠的動物眼內(nèi)填充安全性試驗試驗選取青紫蘭兔。動物實驗步驟如下(I)麻醉青紫蘭兔。(2)沿角膜緣剪開半側(cè)球結(jié)膜，19G鞏膜穿刺刀造灌注孔和玻切孔。(3)插入灌注頭，打開灌注，灌注液的配方如下500ml乳酸林格氏液中加入50%葡萄糖4ml,地塞米松(5mg/lml) I. 6ml,鹽酸腎上腺素(lmg/lml)0. Sml,妥布霉素(8萬U/lml)0. 2ml。(4)玻璃體切割頭伸入玻璃體腔，切除全部玻璃體。(5)將實施例I制備的原位交聯(lián)水凝膠注入玻璃體腔。(6)縫合鞏膜口和球結(jié)膜。(7)結(jié)膜囊涂抹泰利必妥眼膏。手術(shù)I年后，進行眼底照相檢查，可見視網(wǎng)膜及脈絡(luò)膜表現(xiàn)正常，無出血、滲出等病理性改變(如圖3所示)；視網(wǎng)膜電圖檢查顯示雙眼a/b波振幅和潛伏期相近，原位交聯(lián)凝膠眼(左眼)無明顯視網(wǎng)膜毒性功能損害(如圖4所示)；處死兔子，剖開眼球，可見玻璃體腔內(nèi)存在符合玻璃體透明/不定型的特點，表面無滲出膜、出血覆蓋(如圖5所示)；對兔眼視網(wǎng)膜用蘇木素-伊紅染色(如圖6所示)，可見視網(wǎng)膜各層次結(jié)構(gòu)正常，細胞排列緊密，未見水腫、出血等改變。綜上，細胞試驗證實本發(fā)明提供的原位交聯(lián)水凝膠的細胞毒性輕微；動物試驗顯示，長達一年的時間，本發(fā)明提供的原位交聯(lián)水凝膠在玻璃體切除后的兔眼內(nèi)仍保持凝膠形式存在，并且保持透明；視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜的各層組織結(jié)構(gòu)存在，未見出血、水腫等病理改變，尤為重要的是， 視網(wǎng)膜的功能也大致正常；動物體內(nèi)試驗也證實本材料在眼內(nèi)填充是安全的。
權(quán)利要求
1.一種原位交聯(lián)水凝膠的制備方法，包括如下步驟式(I)所示多臂端巰基聚乙二醇與式(II)所示聚合物經(jīng)原位交聯(lián)反應(yīng)即得；
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于式(I)中，m為25-75之間的整數(shù)；式(II)中η為30-60之間的整數(shù)。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在于所述原位交聯(lián)反應(yīng)的溶劑為水、質(zhì)量百分濃度為O. 9%的氯化鈉水溶液和pH值為7. 0-8. O的磷酸鹽緩沖液中任一種。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于所述式(I)所示多臂端巰基聚乙二醇與式(II)所示聚合物的摩爾份數(shù)比為(1-10) (1-10)。
5.權(quán)利要求1-4中任一所述方法制備的原位交聯(lián)水凝膠。
6.權(quán)利要求5所述的原位交聯(lián)水凝膠在制備人工玻璃體中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于眼內(nèi)填充的原位交聯(lián)水凝膠及其制備方法與應(yīng)用。該制備方法包括如下步驟式(I)所示四臂端巰基聚乙二醇與式(II)所示聚合物經(jīng)原位交聯(lián)反應(yīng)即得。本發(fā)明還提供了上述方法制備的原位交聯(lián)水凝膠在制備人工玻璃體中的應(yīng)用。本發(fā)明所提供的人工玻璃體替代材料與傳統(tǒng)的人工玻璃體替代材料相比，具有在眼內(nèi)可長期填充，無明顯毒性反應(yīng)的優(yōu)點，并且在結(jié)構(gòu)上模擬原始的天然玻璃體結(jié)構(gòu)，為親水性。
文檔編號A61L27/18GK102952278SQ201110243230
公開日2013年3月6日 申請日期2011年8月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月23日
發(fā)明者姜燕榮, 陶勇, 張燕, 郭寶華, 黃延賓, 童新明 申請人:北京大學(xué)人民醫(yī)院