專利名稱：一種伊立替康脂質(zhì)體制劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于藥物制劑領(lǐng)域，具體涉及一種抗腫瘤藥物伊立替康的脂質(zhì)體制劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
伊立替康( IrinotecanHydrochloride,CPT-11)是日本Daiichi Seiyaku 公司和Yakult Honsha公司聯(lián)合開發(fā)的半合成水溶性喜樹堿類衍生物，1994年在日本首次上市，作為轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌的有效藥物引起全世界廣泛關(guān)注。其抗癌活性強(qiáng)，以鹽酸鹽三水合物的形式存在，水溶性較好。在臨床作為一線藥物與氟尿嘧啶、亞葉酸聯(lián)合用于治療代謝性結(jié)腸或直腸癌，也可用于經(jīng)氟尿嘧啶治療后無效、復(fù)發(fā)的代謝性結(jié)腸或直腸癌。除以上適應(yīng)證夕卜，該藥對(duì)不同類型的腫瘤均具有抑制作用。目前，該藥已獲得美國FDA和歐盟的共同批準(zhǔn)，在全球100多個(gè)國家上市，它是美國FDA 40多年來繼氟尿嘧啶(5-FU)以后再次批準(zhǔn)用于轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌一線治療的化療藥物?，F(xiàn)已上市的劑型主要有注射液和凍干粉針。但該藥在劑量較大時(shí)，可引起嚴(yán)重的腹瀉和骨髓抑制，這兩種不良反應(yīng)被認(rèn)為是與劑型相關(guān)的毒性。另外，因其結(jié)構(gòu)中的內(nèi)酯環(huán)具有PH依賴性，在堿性、中性甚至弱酸性(如pH大于6時(shí))溶液中會(huì)形成無活性的羧酸鹽形式，因此在藥物進(jìn)入體內(nèi)后會(huì)有相當(dāng)一部分藥物轉(zhuǎn)化為無活性的羧酸鹽形式，從而降低了藥效。由此看來，目前上市劑型在安全性、有效性及患者順應(yīng)性方面均存在較大的改進(jìn)空間，這無疑限制了其在臨床上更為廣泛地應(yīng)用。對(duì)伊立替康現(xiàn)有上市劑型進(jìn)行改進(jìn)，提高藥物的安全性及有效性研究已經(jīng)取得了較多進(jìn)展。其中，脂質(zhì)體制劑的研發(fā)進(jìn)展最快，如日本Yakult Honsha公司開發(fā)的伊立替康脂質(zhì)體制劑IHL305目前已經(jīng)進(jìn)入臨床研究，伊立替康的活性代謝產(chǎn)物SN-38的脂質(zhì)體制劑也已經(jīng)在美國開展相關(guān)臨床研究，Celator公司開發(fā)的伊立替康與氟脲苷的復(fù)方脂質(zhì)體制劑正在美國開展I期臨床研究。脂質(zhì)體具有類似于細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，構(gòu)成雙分子層的類脂親水性的頭部形成膜的內(nèi)表面，而親脂性的尾部則處于膜的中間。正由于脂質(zhì)體的這種類膜結(jié)構(gòu)使其能夠攜帶各種親水的、疏水的和兩親的物質(zhì)，它們被包入脂質(zhì)體內(nèi)部水相、插入類脂雙分子層或吸附連接在脂質(zhì)體的表面。脂質(zhì)體作為藥物載體，既起到了對(duì)藥物的保護(hù)作用，又提高了藥物對(duì)機(jī)體特定部位的靶向性，因此在提高藥效方面具有很多優(yōu)越的特性。普通脂質(zhì)體進(jìn)入體內(nèi)后很快被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬，而主要靶向在肝、脾、骨髓等網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)較為豐富的器官中，對(duì)其他部位的靶向性較差。而且其在體內(nèi)易受蛋白、酶等的作用而發(fā)生滲漏，影響療效并使毒性增大。通過在脂質(zhì)體中加入兩親性的PEG的二硬脂酸磷脂酰胺的衍生物-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(PEG-DSPE)等大分子能減少脂質(zhì)體與血漿中調(diào)理素的結(jié)合，增加其血液穩(wěn)定性，延長半衰期和藥物在血液中的時(shí)間。常用的脂質(zhì)體制備方法有薄膜分散法、注入法、跨膜梯度主動(dòng)載藥法、超聲波分散法、冷凍干燥法、逆向蒸發(fā)法等。國際申請(qǐng)W02005117878公開了一種伊立替康脂質(zhì)體的處方和制備方法，該制劑通過離子梯度的方法主動(dòng)將伊立替康藥物以較高的濃度載入由磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、卵磷脂、心磷脂、膽固醇等構(gòu)成的脂質(zhì)體中。顯著提高了藥物在血液中的滯留性，提高了藥物制劑的穩(wěn)定性。但制備工藝較為復(fù)雜，首先需要制備具有脂質(zhì)體內(nèi)外離子梯度的空白脂質(zhì)體，然后才能進(jìn)行藥物裝載。從工藝的復(fù)雜程度及工業(yè)化放大的角度來看均不利于產(chǎn)品的批量制備，且工藝中需要控制的質(zhì)量指標(biāo)較多，任何指標(biāo)的變化都可能會(huì)導(dǎo)致藥物包封率的降低或脂質(zhì)體穩(wěn)定性下降。另外，按照此發(fā)明的描述，藥物能否以較高的包封率包入脂質(zhì)體內(nèi)部不得而知，如果包封率較低，則還需要采用必要的純化手段將未包封的藥物去除，進(jìn)一步增加了工藝的復(fù)雜程度。國際申請(qǐng)W02011066684公開了一種伊立替康或鹽酸伊立替康脂質(zhì)體的制劑處方及其制備方法， 該制劑限定了中性磷脂與膽固醇的比例，通過現(xiàn)有技術(shù)硫酸銨梯度法將藥物載入脂質(zhì)體內(nèi)。此申請(qǐng)同樣采用了離子梯度的方法制備伊立替康脂質(zhì)體，除工藝復(fù)雜、難以工業(yè)化生產(chǎn)外，此申請(qǐng)還對(duì)磷脂與膽固醇的比例進(jìn)行了限定。認(rèn)為膽固醇的用量對(duì)脂質(zhì)體的粒徑和穩(wěn)定性有一定影響，當(dāng)膽固醇與中性磷脂的重量比例控制在I : 3-5時(shí)脂質(zhì)體的穩(wěn)定性等指標(biāo)明顯提高。但從現(xiàn)有的公開文件中并沒有獲得足夠的證據(jù)支持此申請(qǐng)的論點(diǎn)，包括目前已經(jīng)上市銷售的多個(gè)脂質(zhì)體產(chǎn)品，其膽固醇的重量比例均超過了此申請(qǐng)的限定值，而粒徑及穩(wěn)定性均較好。本發(fā)明人也開展過相關(guān)研究，并未得出此結(jié)論。CN1994279A也公開了一種伊立替康脂質(zhì)體的制劑處方及制備工藝，該制劑處方由磷脂酰膽堿、鞘磷脂、心磷脂、膽固醇和聚乙二醇衍生物組成，通過PH梯度法將藥物包封于脂質(zhì)體內(nèi)部。此申請(qǐng)?zhí)幏街泻星柿字托牧字硕N磷脂價(jià)格較高，難以獲得，造成制劑成本較高。工藝方面，通過pH梯度法載藥，需要通過超濾法去除有機(jī)溶劑，制備工藝較為復(fù)雜，難以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化。此申請(qǐng)中使用了濃度較高的檸檬酸鈉緩沖液及其他多種緩沖鹽來調(diào)節(jié)PH值，這些緩沖鹽的臨床使用安全性存在較大隱患。另外，pH梯度法載藥會(huì)隨著放置時(shí)間的增長而導(dǎo)致藥物泄露，難以保證制劑的體內(nèi)外穩(wěn)定性。雖然上述專利文獻(xiàn)中述及的脂質(zhì)體處方與現(xiàn)有上市注射液相比已經(jīng)具有了一定優(yōu)勢，但是在處方的經(jīng)濟(jì)性、合理性，制劑的穩(wěn)定性，工藝的可放大性、操作簡便性，以及藥物的安全性及有效性方面仍然存在較多問題。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的經(jīng)濟(jì)性、穩(wěn)定性、工藝可放大性及藥物的安全性有效性等方面存在的問題，本發(fā)明提供一種伊立替康脂質(zhì)體制劑及其制備方法。發(fā)明概述首先，本發(fā)明提供一種包封率高、藥物穩(wěn)定性好、體內(nèi)半衰期長、療效顯著的抗腫瘤藥物長循環(huán)脂質(zhì)體制劑，該制劑中最終在體內(nèi)發(fā)揮腫瘤治療作用的藥物是伊立替康。該制劑在體內(nèi)能夠逃避網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)的吞噬作用，明顯延長伊立替康藥物的體內(nèi)半衰期，是一種可注射制劑，此制劑具有腫瘤被動(dòng)靶向作用，與普通注射液相比能夠顯著提高腫瘤治療效果，同時(shí)在安全性方面也具有優(yōu)勢。本發(fā)明還提供上述制劑的制備方法，包括伊立替康藥物本身的修飾方法及長循環(huán)脂質(zhì)體制劑的制備方法。與現(xiàn)有的制備方法相比，本發(fā)明所提供的制備方法具有工藝簡單、藥物包封率高、脂質(zhì)體穩(wěn)定性好、藥物體內(nèi)半衰期長等優(yōu)點(diǎn)，有利于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。術(shù)語說明
脂質(zhì)體本發(fā)明所述脂質(zhì)體具有藥劑學(xué)上的一股含義，系指將藥物包封于類脂質(zhì)雙分子層內(nèi)而形成的微型泡囊體；以磷脂為主要膜材。多室脂質(zhì)體和小單室脂質(zhì)體脂質(zhì)體按照所包含的類脂質(zhì)雙分子層的層數(shù)不同，分為單室脂質(zhì)體和多室脂質(zhì)體。 多層雙分子層的泡囊稱為多室脂質(zhì)體。單一雙分子層的泡囊稱為單室脂質(zhì)體。小單室脂質(zhì)體是指粒徑小于200nm的單室脂質(zhì)體。mPEG-COOH :分子兩個(gè)末端分別為甲氧基和羧基的聚乙二醇，mPEG2000_C00H、mPEG5000-C00H中2000、5000的含義是修飾物中連接的聚乙二醇(PEG)的分子量為2000道爾頓、5000道爾頓。這是本領(lǐng)域的通用表示。各種PEG分子量的mPEG-COOH均可市場購得。聚乙二醇的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(PEG-DSPE):也稱PEG化的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺，是一種長循環(huán)膜材；mPEG2000-DSPE 甲氧基聚乙二醇分子量為2000道爾頓的PEG化的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺；可市場購得，也可按現(xiàn)有技術(shù)自行制備。發(fā)明詳述本發(fā)明的技術(shù)方案如下一種伊立替康長循環(huán)脂質(zhì)體制劑，主要包含mPEG-COOH修飾的伊立替康藥物、氫化大豆磷脂酰膽堿(HSPC)、膽固醇和長循環(huán)膜材，其中所述mPEG-COOH修飾的伊立替康為伊立替康與mPEG-COOH按摩爾比I : I的交聯(lián)產(chǎn)物；所述長循環(huán)膜材為聚乙二醇化的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(PEG-DSPE)或單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂(GM-I)。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，上述的伊立替康長循環(huán)脂質(zhì)體中，所述的mPEG-COOH修飾的伊立替康中聚乙二醇(PEG)的分子量介于500 50000道爾頓之間，進(jìn)一步優(yōu)選聚乙二醇分子量為2000 5000道爾頓。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，上述的伊立替康長循環(huán)脂質(zhì)體中，以伊立替康計(jì)，mPEG-COOH修飾的伊立替康與氫化大豆磷脂酰膽堿(HSPC)的質(zhì)量比為I : 3 10，進(jìn)一步優(yōu)選I 4 6。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，上述的伊立替康長循環(huán)脂質(zhì)體中，膽固醇與氫化大豆磷脂酰膽堿(HSPC)的質(zhì)量比為I : 3 10，進(jìn)一步優(yōu)選I : 5 7。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，上述的伊立替康長循環(huán)脂質(zhì)體中，聚乙二醇化的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(PEG-DSPE)或單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷酯(GM-I)與氫化大豆磷脂酰膽堿(HSPC)的質(zhì)量比為I : 5 20，進(jìn)一步優(yōu)選I : 10 15。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述mPEG-COOH修飾的伊立替康是聚乙二醇(mPEG-COOH)和伊立替康按現(xiàn)有技術(shù)交聯(lián)制得，例如采用CN1852740B中描述的方法；或者直接將伊立替康分子與mPEG-COOH通過酯化反應(yīng)交聯(lián)在一起。進(jìn)一步優(yōu)選的，mPEG-COOH修飾的伊立替康按以下方法I或方法2制備方法I:按摩爾比I : I的比例將伊立替康與叔丁氧羰基甘氨酸(t-boc-glycine)進(jìn)行交聯(lián)，得到叔丁氧羰基甘氨酸-伊立替康；通過加入三氟乙酸將叔丁氧羰基甘氨酸-伊立替康轉(zhuǎn)化為甘氨酸-伊立替康；按摩爾比I : I的比例將甘氨酸-伊立替康與分子量為500 5000道爾頓的mPEG-COOH通過現(xiàn)有公知的方法進(jìn)行交聯(lián)，即可得到mPEG-COOH修飾的伊立替康藥物。方法2 :按摩爾比為I : I的比例將伊立替康與分子量為500 5000道爾頓的mPEG-COOH溶解于適量冰的無水二氯甲烷中，稱取適量二甲基氨基吡啶(DMAP)和二異丙基碳二酰亞胺(DCC)加入后，置于室溫條件下攪拌反應(yīng)12-24h。通過砂芯漏斗過濾去除固體，所得溶液于分液漏斗中用O. IN的鹽酸洗2-3次。無水硫酸鎂干燥后旋蒸去除溶劑，產(chǎn)物進(jìn)一步真空干燥。加入少量無水二氯甲烷復(fù)溶后，冰浴條件下加入無水乙醚進(jìn)行結(jié)晶。將得到的固體進(jìn)行過濾，干燥后即得到mPEG-COOH修飾的伊立替康藥物。本發(fā)明制劑進(jìn)入人體后最終發(fā)揮抗腫瘤作用的為伊立替康，上述的伊立替康長循環(huán)脂質(zhì)體，其中所述的mPEG-COOH修飾的伊立替康是伊立替康分子與mPEG-COOH分子之間通過化學(xué)鍵連接而提高了伊立替康的體內(nèi)穩(wěn)定性及循環(huán)半衰期，其中伊立替康分子中的羥基與mPEG-COOH分子中的末端羧基通過酯鍵直接連接或者通過交聯(lián)劑如叔丁氧基羰基甘氨酸(t-boc-glycine)而連接在一起。進(jìn)入體內(nèi)后，在體內(nèi)廣泛存在的酯酶等蛋白酶的作 用下此連接鍵被破壞而釋放出伊立替康。膽固醇作為脂質(zhì)體制劑中的一種重要組成物質(zhì)具有調(diào)節(jié)磷脂雙分子層流動(dòng)性的作用，不同的膽固醇含量具有不同的體內(nèi)藥物釋放特性。膽固醇含量高則磷脂雙分子層流動(dòng)性強(qiáng)，小分子藥物容易泄漏，膽固醇含量低則磷脂雙分子層的剛性強(qiáng)，藥物不宜泄漏，但脂質(zhì)體穩(wěn)定性會(huì)稍差。 由于藥物被包封于由磷脂雙分子層組成的脂質(zhì)體內(nèi)部及磷脂雙分子層中，因此載有藥物的脂質(zhì)體制劑進(jìn)入人體后能夠有效避免網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬作用，延長了藥物的體內(nèi)半衰期。當(dāng)藥物從脂質(zhì)體中釋放出來之后，由于修飾劑mPEG-COOH的作用保護(hù)了藥物分子不被破壞，延長了藥物與腫瘤部位的作用時(shí)間，因此藥物半衰期被進(jìn)一步延長，從而起到了長效作用。加上腫瘤部位的血管滲透性較高,能夠使更多的伊立替康集中于腫瘤部位,達(dá)到被動(dòng)靶向作用，提高腫瘤治療效果。根據(jù)本發(fā)明，修飾后的伊立替康可通過被動(dòng)方式或主動(dòng)方式載入脂質(zhì)體內(nèi)部。以被動(dòng)方式載藥時(shí)，將藥物和磷脂溶于有機(jī)溶劑中，之后進(jìn)行水化、擠壓并去除游離藥物后即可得到脂質(zhì)體制劑。以主動(dòng)方式載藥時(shí)，首先按照現(xiàn)有公開技術(shù)制備含有硫酸銨內(nèi)水相的空白脂質(zhì)體，去除外水相中的硫酸銨后，加入藥物溶液，加熱載藥后即可得到脂質(zhì)體制劑；硫酸銨的濃度范圍為50-500mM。根據(jù)本發(fā)明，硫酸銨在脂質(zhì)體的制備時(shí)加入，但在制備過程中大部分被去除，因此只有很少量保存到最終制劑中。硫酸銨以硫酸根和銨根的形式存在于空白脂質(zhì)體內(nèi)部，當(dāng)載藥后銨根變成氨氣揮發(fā)掉而硫酸根與藥物結(jié)合。根據(jù)不同的制備工藝，以上所述的脂質(zhì)體制劑中還含有少量緩沖鹽及滲透壓調(diào)節(jié)齊U。常用的緩沖鹽包括枸櫞酸鹽緩沖液、磷酸鹽緩沖液、組氨酸緩沖液等；滲透壓調(diào)節(jié)劑可以選擇蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、氯化鈉中的一種或多種；所述緩沖鹽溶液的PH介于4. 0-6. 5之間，滲透壓調(diào)節(jié)劑的濃度范圍為10-100mM。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選的方案之一，所述的伊立替康長循環(huán)脂質(zhì)體制劑為注射液制劑，其中每1000ml制劑中含有mPEG-COOH修飾的伊立替康I 10g，氫化大豆磷脂酰膽堿3 50g, PEG-DSPE 0. I 5g，膽固醇 0. 6 IOgo本發(fā)明所述的伊立替康長循環(huán)脂質(zhì)體制劑的制備方法，采用被動(dòng)載藥的方式制備伊立替康脂質(zhì)體，步驟如下(I)將聚乙二醇(mPEG-COOH)和伊立替康交聯(lián)，得到mPEG-COOH修飾的伊立替康；(2)將mPEG-COOH修飾的伊立替康、HSPC、膽固醇、PEG-DSPE或GM-I溶解于有機(jī)溶劑中 ，充分溶解；(3)配制pH為4. 0-6. 5的緩沖液，并將其加入至步驟(2)中制備的溶液中，充分水化，得到多室脂質(zhì)體；(4)采用高壓均質(zhì)、擠出、超聲或凍融的方法將步驟(3)得到的多室脂質(zhì)體的平均粒徑降低至50-200納米；(5)去除未包封的游離藥物，即可得到伊立替康長循環(huán)脂質(zhì)體制劑。本發(fā)明所述的伊立替康長循環(huán)脂質(zhì)體制劑的制備方法，采用主動(dòng)載藥的方式制備伊立替康脂質(zhì)體，步驟如下(I)將聚乙二醇(mPEG-COOH)和伊立替康交聯(lián)，得到mPEG-COOH修飾的伊立替康；(2)按配方稱取HSPC、膽固醇、PEG-DSPE或GM-I溶于適量有機(jī)溶劑中，充分溶解；(3)配制含有50_500mM濃度的硫酸銨的水溶液，并將其加入至步驟(2)中制備的溶液中，在40-70°C溫度條件下攪拌反應(yīng)10-60分鐘，得到多室脂質(zhì)體；(4)采用高壓均質(zhì)、擠出、超聲或凍融的方法將步驟(3)得到的多室脂質(zhì)體的平均粒徑降低至20-200納米；通過超濾方式去除脂質(zhì)體外水相中的硫酸銨，得到具有脂質(zhì)體內(nèi)外銨離子梯度的空白脂質(zhì)體；(5)將步驟⑴制備的mPEG-COOH修飾的伊立替康溶解于pH4. 0-6. 5的緩沖液中，與步驟(4)得到的空白脂質(zhì)體共同加熱，去除未包封的游離藥物，即可得到伊立替康長循環(huán)脂質(zhì)體制劑。以上所述的伊立替康長循環(huán)脂質(zhì)體的制備方法，所述聚乙二醇(mPEG-COOH)和伊立替康的交聯(lián)可以通過現(xiàn)有技術(shù)來實(shí)現(xiàn)，如可以采用CN1852740B中描述的方法，首先將伊立替康與叔丁氧羰基甘氨酸(t-boc-glycine)進(jìn)行酯化反應(yīng)，三氟乙酸水解去除叔丁氧羰基后，將分子量為500 5000道爾頓道爾頓的mPEG-COOH與之進(jìn)行交聯(lián)，即可得到mPEG-COOH修飾的伊立替康。也可以不使用叔丁氧羰基甘氨酸(t-boc-glycine),而直接將伊立替康分子與mPEG-COOH通過酯化反應(yīng)交聯(lián)在一起。以上所述的伊立替康長循環(huán)脂質(zhì)體的制備方法，所述有機(jī)溶劑可以選自乙醇、甲醇、氯仿或二氯甲烷；所述PH4. 0-6. 5的緩沖液選自枸櫞酸鹽緩沖液、磷酸鹽緩沖液或組氨酸緩沖液。上述方法制備的伊立替康長循環(huán)脂質(zhì)體注射液制劑不可避免的還含有在制備過程中加入的少量殘留的枸櫞酸鹽緩沖液、磷酸鹽緩沖液、組氨酸緩沖液、乙醇、甲醇等。根據(jù)本發(fā)明所述的伊立替康長循環(huán)脂質(zhì)體的制備方法，優(yōu)選方案之一(l)mPEG-COOH修飾的伊立替康的制備按照摩爾比為I : I的比例將伊立替康與叔丁氧羰基甘氨酸(t-boc-glycine)進(jìn)行交聯(lián)，得到叔丁氧羰基甘氨酸-伊立替康；使用三氟乙酸將上步中得到的叔丁氧羰基甘氨酸-伊立替康中的叔丁氧羰基水解并去除，得到甘氨酸-伊立替康；按照摩爾比I : I的比例稱取甘氨酸-伊立替康和分子量為500 5000道爾頓的mPEG-C00H，酯化反應(yīng)后得到mPEG-COOH修飾的伊立替康藥物。(2)稱取上步中制備的mPEG-COOH修飾的伊立替康藥物溶于無水乙醇中，加熱溶解后，加入HSPC、膽固醇和PEG-DSPE，伊立替康與HSPC的質(zhì)量比為I : 4 I : 6 ;溶解后，通過旋蒸方式去除大部分乙醇。
(3)配制含5-10% (w/v)蔗糖的pH為4· 0-6. 5的組氨酸緩沖液(組氨酸濃度為IO-IOOmM)，將組氨酸溶液預(yù)熱至40-60°C后加入至膜材及藥物混合物中，40_60°C條件下攪拌反應(yīng)10-40min，得到多室脂質(zhì)體。(4)分別通過孔徑為200nm和SOnm的聚碳酸酯濾膜擠出多次后，得到平均粒徑為50-200nm的小單室脂質(zhì)體。以現(xiàn)有公知的方法檢測包封率大于80%。(5)通過切向流超濾器對(duì)此脂質(zhì)體進(jìn)行超濾后去除大部分游離藥物，得到包封率大于95%的脂質(zhì)體制劑。以O(shè). 22um的除菌濾膜過濾除菌后分裝，即得到伊立替康長循環(huán)脂質(zhì)體注射液。優(yōu)選方案二 (l)mPEG-COOH修飾的伊立替康的制備按照摩爾比為I : I的比例將伊立替康與分子量為500 5000道爾頓的·mPEG-COOH溶解于適量冰的無水二氯甲烷中，稱取適量二甲基氨基吡啶(DMAP)和二異丙基碳二酰亞胺(DCC)加入后，置于室溫條件下攪拌反應(yīng)過夜。固體通過砂芯漏斗過濾去除。溶液與分液漏斗中用O. IN的鹽酸洗2-3次。無水硫酸鎂干燥后旋蒸去除溶劑，產(chǎn)物進(jìn)一步真空干燥。加入少量無水二氯甲烷復(fù)溶后，冰浴條件下加入無水乙醚進(jìn)行結(jié)晶。將得到的固體進(jìn)行過濾，干燥后即得到修飾后的伊立替康藥物。(2)稱取HSPC、膽固醇及GM-1，質(zhì)量比為5 7 I O. 3 O. 7，以適量乙醇加
熱溶解。(3)配制濃度為50-500mM的硫酸銨溶液并加入至(2)步的乙醇溶液中，50_70°C水浴水化30-60分鐘，得到多室脂質(zhì)體。(4)高壓均質(zhì)降低平均粒徑至50-200納米。切向流超濾法除去外水相硫酸銨，得硫酸銨梯度空白脂質(zhì)體。(5)將(I)步修飾后得到的藥物溶解于O. 9%的氯化鈉溶液中并與脂質(zhì)體混合，其中伊立替康重量為氫化大豆磷脂1/6-1/4 ;30-60°C水浴保溫載藥20-40分鐘，得到藥物包封率大于80%的脂質(zhì)體。通過切向流超濾器去除外水相中游離藥物并置換外水相為PH4. 0-6. 5的組氨酸蔗糖溶液(蔗糖含量5-10%，w/v,組氨酸濃度IO-IOOmM)。除菌過濾后分裝，即得伊立替康長循環(huán)脂質(zhì)體注射液。測定包封率為95%以上。伊立替康為水溶性抗腫瘤藥物，而水溶性藥物采用被動(dòng)載藥的方法制備的脂質(zhì)體其包封率和載藥量均比較低。本發(fā)明采用將伊立替康進(jìn)行修飾的方法，將聚乙二醇大分子與藥物交聯(lián)。交聯(lián)后的藥物不僅水溶性較好，而且在乙醇等有機(jī)溶劑中也能溶解。因此可以使用被動(dòng)載藥的方式將藥物與磷脂一起溶解之后進(jìn)行水化。令人意想不到的是，由此得到的脂質(zhì)體包封率非常高，大于80%，藥物不但能夠包入脂質(zhì)體內(nèi)部，而且部分藥物還可以嵌插在磷脂雙分子層上。與主動(dòng)載藥方式相比，此工藝簡單且容易放大，因此非常適合于工業(yè)化生產(chǎn)。同時(shí)，本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)，修飾后的伊立替康藥物同樣可以用目前公知的離子梯度法以主動(dòng)載藥的方式進(jìn)行藥物包封。與被動(dòng)載藥方式相比，兩種載藥工藝得到的脂質(zhì)體的藥物包封率、粒徑及分布、載藥量、放置穩(wěn)定性以及藥物體內(nèi)半衰期均無明顯差異。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)包括(I)脂質(zhì)體膜材中膽固醇及PEG-DSPE的含量較低，有利于藥物的包封及體內(nèi)釋放。(2)藥物通過聚乙二醇修飾后，一方面能夠通過被動(dòng)方式載入脂質(zhì)體內(nèi)部，同時(shí)修飾后的藥物在體內(nèi)不容易被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬、藥物分子本身也更加穩(wěn)定，能夠大大延長體內(nèi)半衰期。使得脂質(zhì)體制劑能夠更有效的靶向至腫瘤部位，從而更好的發(fā)揮抗腫瘤作用。(3)藥物經(jīng)大分子聚乙二醇修飾后體內(nèi)穩(wěn)定性得到明顯改善。由于伊立替康藥物穩(wěn)定性較差，在接近中性PH條件下內(nèi)酯環(huán)很容易發(fā)生破壞而形成開環(huán)產(chǎn)物，此開環(huán)產(chǎn)物不具有抗腫瘤活性。伊立替康藥物進(jìn)入正常人體血液循環(huán)系統(tǒng)中后會(huì)有很大一部分藥物以開環(huán)形式存在，導(dǎo)致藥效學(xué)下降。經(jīng)修飾后的藥物穩(wěn)定性大為提高，在中性pH條件下藥物分子不會(huì)被破壞，不產(chǎn)生開環(huán)產(chǎn)物。(4)經(jīng)修飾后的藥物制成脂質(zhì)體制劑，通過動(dòng)物藥效學(xué)評(píng)價(jià)可以發(fā)現(xiàn)，抗腫瘤效果顯著提高。與普通伊立替康注射液相比抑瘤率可以提高3倍以上，抑瘤率也明 顯高于未經(jīng)修飾的伊立替康藥物制成的脂質(zhì)體制劑。(5)藥物毒副作用降低由于藥物經(jīng)修飾后被包入脂質(zhì)體內(nèi)部，給藥后與普通注射液相比改變了藥物的組織分布和藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，因此降低了普通注射液臨床使用中常見的血液學(xué)毒性及胃腸道毒性等毒副作用。


圖I伊立替康長循環(huán)脂質(zhì)體對(duì)人結(jié)腸癌HT-29裸鼠移植瘤的抑制效果，橫坐標(biāo)表示時(shí)間(單位為天)，縱坐標(biāo)表示相對(duì)腫瘤體積。六條曲線分別對(duì)應(yīng)六組:A陰性對(duì)照組、B鹽酸伊立替康注射液組、C伊立替康修飾產(chǎn)物組(按照實(shí)施例I方法I制備)、D伊立替康脂質(zhì)體組I (通過硫酸銨梯度法直接將伊立替康包入脂質(zhì)體內(nèi)部，按照實(shí)施例2方法制備)、E伊立替康脂質(zhì)體組2 (通過直接水化法將修飾后的伊立替康藥物包入脂質(zhì)體內(nèi)部，按照實(shí)施例3方法制備)和F伊立替康脂質(zhì)體組3 (通過離子梯度法將mPEG-COOH修飾的伊立替康包入脂質(zhì)體中，按照實(shí)施例4方法制備)。圖2伊立替康長循環(huán)脂質(zhì)體對(duì)裸鼠體重的影響。橫坐標(biāo)表示時(shí)間(單位為天)，縱坐標(biāo)表示動(dòng)物體重(單位為克)。六條曲線分別對(duì)應(yīng)六組:A陰性對(duì)照組、B鹽酸伊立替康注射液組、C伊立替康修飾產(chǎn)物組(按照實(shí)施例I方法I制備)、D伊立替康脂質(zhì)體組I (通過硫酸銨梯度法直接將伊立替康包入脂質(zhì)體內(nèi)部，按照實(shí)施例2方法制備)、E伊立替康脂質(zhì)體組2 (通過直接水化法將修飾后的伊立替康藥物包入脂質(zhì)體內(nèi)部，按照實(shí)施例3方法制備)和F伊立替康脂質(zhì)體組3 (通過離子梯度法將mPEG-COOH修飾的伊立替康包入脂質(zhì)體中，按照實(shí)施例4方法制備)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但不限于實(shí)施范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的基本思想，可以做出各種修改或改進(jìn)，但是只要不脫離本發(fā)明的基本思想，均在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。包封率的計(jì)算包封率=[脂質(zhì)體中包封的藥物/(脂質(zhì)體中包封的藥物+脂質(zhì)體外部游離的藥物)]X 100%，常采用葡聚糖凝膠、超速離心法、透析法等分離方法將溶液中游離藥物和脂質(zhì)體分離，分別測定，計(jì)算包封率。
多分散指數(shù)(PDI):反應(yīng)了脂質(zhì)體粒徑的分布情況，數(shù)值越小表明粒徑分布越集中。實(shí)施例I、伊立替康分子的修飾(I)方法 I稱取100毫克鹽酸伊立替康及59毫克叔丁氧羰基甘氨酸(t-boc-glycine)溶解于30毫升無水二氯甲烷中，充分溶解。稱取21毫克二甲基氨基吡啶(DMAP)和7毫克二異丙基碳二酰亞胺(DCC)加入后，置于室溫條件下攪拌反應(yīng)過夜。固體通過砂芯漏斗過濾去除。溶液與分液漏斗中用O. IN的鹽酸洗2-3次。硫酸鈉干燥后旋蒸去除溶劑,產(chǎn)物進(jìn)一步真空干燥，得到叔丁氧羰基甘氨酸-伊立替康。稱取上步反應(yīng)產(chǎn)物IOOmg溶于7ml無水二氯甲烷中，加入O. 53ml三氟乙酸，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)lh，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑。粗產(chǎn)物溶于O. Iml甲醇中，加入25ml乙醚沉淀?；鞈乙涸诒≈袛嚢?0min。產(chǎn)物過濾收集，真空干燥，得到甘氨酸-伊立替康。稱取甘氨酸-伊立替康516mg和分子量為2000道爾頓的mPEG-COOH約2g溶解于IOOml無水二氯甲烷中。稱取60mg DMAP溶于無水二氯甲烷中，加入282mg DCC，混合后，室溫條件下攪拌反應(yīng)過夜?；旌衔锿ㄟ^砂芯漏斗過濾，溶劑通過旋蒸方式去除。加入500ml異丙醇，冰浴中沉淀。固體過濾，真空干燥，得到mPEG2000-C00H修飾的伊立替康藥物。(2)方法 2稱取677mg伊立替康與分子量為5000道爾頓的mPEG-COOH約5g，溶解于IOOml冰的無水二氯甲烷中，稱取50mg 二甲基氨基吡啶(DMAP))，量取40ul 二異丙基碳二酰亞胺(DCC)加入上述二氯甲烷中后，置于室溫條件下攪拌反應(yīng)過夜。固體通過砂芯漏斗過濾去除。溶液與分液漏斗中用0. IN的鹽酸洗2-3次。無水硫酸鎂干燥后旋蒸去除溶劑，產(chǎn)物進(jìn)一步真空干燥。加入5ml無水二氯甲烷復(fù)溶后，冰浴條件下加入500ml無水乙醚進(jìn)行結(jié)晶。將得到的固體進(jìn)行過濾，干燥后即得到mPEG5000-C00H修飾的伊立替康藥物。實(shí)施例2、硫酸銨梯度法制備伊立替康脂質(zhì)體空白脂質(zhì)體的制備稱取氫化大豆卵磷脂1000克，mPEG2000-DSPE 100克，膽固醇300克溶于800ml無水乙醇中，60°C加熱充分溶解。配制250mM的硫酸銨水溶液10L，加入上述膜材中，并于70°C水化20分鐘。之后，將其加入微射流儀器中，以18000psi的壓力循環(huán)5次，得到粒徑IOOnm左右的空白脂質(zhì)體。通過切向流超濾方法將脂質(zhì)體外水相中的硫酸銨去除，并置換為PH6. O的蔗糖-組氨酸緩沖液。載藥過程配制10mg/ml的鹽酸伊立替康水溶液。取上述空白脂質(zhì)體10ml，加入鹽酸伊立替康水溶液20ml加入上述脂質(zhì)體中，于50°C孵育30分鐘后即可得到載藥的鹽酸伊立替康長循環(huán)脂質(zhì)體。通過切向流超濾方法將脂質(zhì)體外水相中未包封的游離藥物去除，并置換為PH6. O的蔗糖-組氨酸緩沖液。檢測脂質(zhì)體包封率為99 %，平均粒徑為110nm。 實(shí)施例3mPEG_C00H修飾的伊立替康長循環(huán)脂質(zhì)體的制備稱取按照實(shí)施例I之方法I中制備的mPEG2000-C00H修飾的伊立替康lOOmg，溶解于IOml無水乙醇中。稱取HSPC 2000mg、膽固醇200mg及mPEG2000-DSPE IOOmg加入至上述乙醇溶液中，65°C條件下加熱充分溶解。配制pH為5. O的蔗糖-組氨酸溶液20ml，65°C條件下加入至乙醇溶液中，充分?jǐn)嚢杷?0分鐘。依次通過孔徑為200nm和IOOnm的聚碳酸酯膜，高壓擠出5次后得到脂質(zhì)體。進(jìn)一步通過切向流超濾的方法將脂質(zhì)體外水相中游離的藥物去除。檢測藥物包封率為98. 5%，平均粒徑為125nm。上述脂質(zhì)體通過O. 22um的除菌濾膜過濾后，無菌分裝，即得到伊立替康長循環(huán)脂質(zhì)體注射液。藥物濃度為5mg/ml。實(shí)施例4硫酸銨梯度法制備mPEG-COOH修飾的伊立替康長循環(huán)脂質(zhì)體空白脂質(zhì)體的制備稱取氫化大豆卵磷脂1000克，mPEG2000-DSPE 50克，膽固醇150克溶于IOOOml無水乙醇中，60°C加熱充分溶解。配制250mMM的硫酸銨水溶液10L，加入上述膜材中，并于 70°C水化20分鐘。之后，將其加入微射流儀器中，以18000psi的壓力循環(huán)5次，得到粒徑IOOnm左右的空白脂質(zhì)體。通過切向流超濾方法將脂質(zhì)體外水相中的硫酸銨去除，并置換為PH6. O的蔗糖-組氨酸緩沖液。載藥過程配制含伊立替康藥物10mg/ml的mPEG2000-C00H修飾的伊立替康水溶液。取上述空白脂質(zhì)體10ml，加入鹽酸伊立替康水溶液20ml加入上述脂質(zhì)體中，于60°C孵育30分鐘后即可得到載藥的鹽酸伊立替康長循環(huán)脂質(zhì)體。通過切向流超濾方法將脂質(zhì)體外水相中未包封的游離藥物去除，并置換為pH6. O的蔗糖-組氨酸緩沖液。檢測脂質(zhì)體包封率為97. 5%，平均粒徑為lOOnm。實(shí)施例5mPEG_C00H修飾的伊立替康長循環(huán)脂質(zhì)體的制備稱取按照實(shí)施例I的方法2中制備的mPEG5000-C00H修飾的伊立替康lOOmg，溶解于IOml無水乙醇中。稱取HSPC 2000mg、膽固醇500mg及單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂IOOmg加入至上述乙醇溶液中，65°C條件下加熱充分溶解。配制pH為5. 5的蔗糖-組氨酸溶液20ml，65°C條件下加入至乙醇溶液中，充分?jǐn)嚢杷?0分鐘。依次通過孔徑為200nm和IOOnm的聚碳酸酯膜，高壓擠出5次后得到脂質(zhì)體。進(jìn)一步通過切向流超濾的方法將脂質(zhì)體外水相中游離的藥物去除。檢測藥物包封率為97. 9%，平均粒徑為115nm。上述脂質(zhì)體通過0. 22um的除菌濾膜過濾后，無菌分裝，即得到伊立替康長循環(huán)脂質(zhì)體注射液。以伊立替康計(jì)，藥物濃度為5mg/ml。實(shí)施例6伊立替康脂質(zhì)體的穩(wěn)定性考察將按照實(shí)施例2(樣品I)、實(shí)施例3(樣品2)和實(shí)施例4(樣品3)方法制備的脂質(zhì)體分別置于2-8°C條件和25°C條件下進(jìn)行穩(wěn)定性考察，結(jié)果如下表所示。表I伊立替康脂質(zhì)體在2-8°C下的穩(wěn)定性考察
權(quán)利要求
1.一種伊立替康長循環(huán)脂質(zhì)體制劑，，其特征在于主要包含mPEG-COOH修飾的伊立替康藥物、氫化大豆磷脂酰膽堿(HSPC)、膽固醇和長循環(huán)膜材，所述mPEG-COOH修飾的伊立替康為伊立替康與mPEG-COOH按摩爾比I : I的交聯(lián)產(chǎn)物；所述長循環(huán)膜材為聚乙二醇化的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(PEG-DSPE)或單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂(GM-I)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的伊立替康長循環(huán)脂質(zhì)體制劑，其特征在于所述的mPEG-COOH修飾的伊立替康中聚乙二醇(PEG)的分子量介于500 50000道爾頓之間，進(jìn)一步優(yōu)選聚乙二醇分子量為2000 5000道爾頓。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的伊立替康長循環(huán)脂質(zhì)體制劑，其特征在于以伊立替康計(jì)，mPEG-COOH修飾的伊立替康與氫化大豆磷脂酰膽堿(HSPC)的質(zhì)量比為I : 3 10，進(jìn)一步優(yōu)選I : 4 6。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的伊立替康長循環(huán)脂質(zhì)體制劑，其特征在于膽固醇與氫化大豆磷脂酰膽堿(HSPC)的質(zhì)量比為I : 3 10，進(jìn)一步優(yōu)選I : 5 7。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的伊立替康長循環(huán)脂質(zhì)體制劑，其特征在于聚乙二醇化的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(PEG-DSPE)或單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷酯(GM-I)與氫化大豆磷脂酰膽堿(HSPC)的質(zhì)量比為I : 5 20，進(jìn)一步優(yōu)選I : 10 15。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的伊立替康長循環(huán)脂質(zhì)體制劑，其特征在于mPEG-COOH修飾的伊立替康是按以下方法I或方法2制得 方法I :按摩爾比I : I的比例將伊立替康與叔丁氧羰基甘氨酸(t-boc-glycine)進(jìn)行交聯(lián)，得到叔丁氧羰基甘氨酸-伊立替康；通過加入三氟乙酸將叔丁氧羰基甘氨酸-伊立替康轉(zhuǎn)化為甘氨酸-伊立替康；按摩爾比I : I的比例將甘氨酸-伊立替康和分子量為500 5000道爾頓的mPEG-COOH通過現(xiàn)有公知的方法進(jìn)行交聯(lián)，即可得到mPEG-COOH修飾的伊立替康藥物； 方法2:按照摩爾比為I : I的比例將伊立替康與分子量為500 5000道爾頓的mPEG-COOH溶解于適量冰的無水二氯甲烷中，稱取適量二甲基氨基吡啶(DMAP)和二異丙基碳二酰亞胺(DCC)加入后，置于室溫條件下攪拌反應(yīng)過夜。所得固體通過砂芯漏斗過濾去除，溶液與分液漏斗中用0. IN的鹽酸洗2-3次。無水硫酸鎂干燥后旋蒸去除溶劑，產(chǎn)物進(jìn)一步真空干燥。加入少量無水二氯甲烷復(fù)溶后，冰浴條件下加入無水乙醚進(jìn)行結(jié)晶。將得到的固體進(jìn)行過濾，干燥后即得到mPEG-COOH修飾的伊立替康藥物。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的伊立替康長循環(huán)脂質(zhì)體制劑，其特征在于所述的脂質(zhì)體制劑為注射液制劑，其中每1000ml制劑中含有mPEG-COOH修飾的伊立替康I 10g，氫化大豆磷脂酰膽堿3 50g, PEG-DSPE 0. I 5g，膽固醇0. 6 IOgo
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述的伊立替康長循環(huán)脂質(zhì)體制劑的制備方法，采用被動(dòng)載藥的方式制備伊立替康脂質(zhì)體，步驟為 (1)將聚乙二醇(mPEG-COOH)和伊立替康交聯(lián)在一起，形成mPEG-COOH修飾的伊立替康； (2)將mPEG-COOH修飾的伊立替康、HSPC、膽固醇、PEG-DSPE或GM-I溶解于有機(jī)溶劑中，充分溶解； (3)配制pH為4.0-6. 5的緩沖液，并將其加入至步驟(2)中制備的溶液中，充分水化，得到多室脂質(zhì)體；(4)采用高壓均質(zhì)、擠出、超聲或凍融的方法將步驟(3)得到的多室脂質(zhì)體的平均粒徑降低至50-200納米； (5)去除未包封的游離藥物，即可得到伊立替康長循環(huán)脂質(zhì)體制劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的伊立替康長循環(huán)脂質(zhì)體制劑的制備方法，采用主動(dòng)載藥的方式制備伊立替康脂質(zhì)體，步驟為 (1)將聚乙二醇(mPEG-COOH)和伊立替康交聯(lián)在一起，形成mPEG-COOH修飾的伊立替康； (2)按配方稱取HSPC、膽固醇、PEG-DSPE或GM-I溶于適量有機(jī)溶劑中，充分溶解； (3)配制含有50-500mM濃度的硫酸銨的水溶液，并將其加入至步驟(2)中制備的溶液中，在40-70°C溫度條件下攪拌反應(yīng)10-60分鐘，得到多室脂質(zhì)體； (4)采用高壓均質(zhì)、擠出、超聲或凍融的方法將步驟(3)得到的多室脂質(zhì)體的平均粒徑降低至20-200納米；通過超濾方式去除脂質(zhì)體外水相中的硫酸銨，得到具有脂質(zhì)體內(nèi)外銨離子梯度的空白脂質(zhì)體； (5)將步驟(I)制備的mPEG-COOH修飾的伊立替康溶解于pH4.0-6. 5的緩沖液中，與步驟(4)得到的空白脂質(zhì)體共同加熱，去除未包封的游離藥物，即可得到伊立替康長循環(huán)脂質(zhì)體制劑。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的伊立替康長循環(huán)脂質(zhì)體的制備方法，其特征在于所述有機(jī)溶劑可以選自乙醇、甲醇、氯仿、二氯甲烷；所述PH4. 0-6.5的緩沖液選自枸櫞酸鹽緩沖液、磷酸鹽緩沖液、組氨酸緩沖液。
全文摘要
本發(fā)明提供一種伊立替康長循環(huán)脂質(zhì)體及其制備方法，采用伊立替康與mPEG-COOH化學(xué)交聯(lián)后的修飾物作為主藥，與氫化大豆磷脂酰膽堿、膽固醇、PEG-DSPE通過主動(dòng)載藥或被動(dòng)載藥的方式制備而成。本發(fā)明的伊立替康長循環(huán)脂質(zhì)體具有藥物包封率高、脂質(zhì)體穩(wěn)定性好、藥物體內(nèi)半衰期長等優(yōu)點(diǎn)，有利于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)A61K9/127GK102935066SQ20111023400
公開日2013年2月20日 申請(qǐng)日期2011年8月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月16日
發(fā)明者王晶翼, 楊清敏, 王棟海, 嚴(yán)守升, 張明會(huì), 楊光麗, 張勇 申請(qǐng)人:齊魯制藥有限公司