專利名稱：一種豬用免疫增強(qiáng)劑il-12b(p40)及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因重組技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種豬用免疫增強(qiáng)劑IL-12B(P40)及其制備方法。
背景技術(shù)：
白介素12 (IL-12),又名細(xì)胞毒淋巴細(xì)胞成熟因子(cytotoxic lymphocytematuration factor, CLMF),或稱細(xì)胞刺激因子(natural killer cell stimulationfactor, NKSF)。它是一種由分子量為40kDa和35kDa的兩個(gè)亞基組成的異源二聚體的細(xì)胞因子，主要由樹突狀細(xì)胞(DC)、巨噬細(xì)胞(ΜΦ)、B淋巴細(xì)胞以及其他一些抗原提呈細(xì)胞(APC)產(chǎn)生，它能促進(jìn)分化的CD4+T輔助細(xì)胞I (Thl)的增殖，誘導(dǎo)NK細(xì)胞和T細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)·胞因子(主要是Y干擾素)，提高NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性，促進(jìn)細(xì)胞毒性T細(xì)胞的形成等等。IL-12在機(jī)體早期的非特異性免疫和隨后的抗原特異性的適應(yīng)性免疫過程均扮演了極重要的角色。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種豬用免疫增強(qiáng)劑IL_12B(P40)及其制備方法，應(yīng)用于豬病原體(如豬瘟病毒、豬藍(lán)耳病病毒等)感染的預(yù)防及治療。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)一種豬用免疫增強(qiáng)劑IL_12B(P40)，是一種基因重組蛋白，該蛋白含有豬IL-12的P40亞基[IL-12B(P40)]的主要氨基酸序列。一種豬用免疫增強(qiáng)劑IL_12B(P40)的制備方法，包括以下步驟I)以IL_12B(P40)特異性的上下游引物，通過RT-PCR合成包含EcoRI和XhoI兩個(gè)酶切位點(diǎn)的IL-12B(P40)cDNA，經(jīng)過純化酶切，重組至原核表達(dá)載體pGEX-6p-l ；2)該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)菌株BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的表達(dá)產(chǎn)物為GST-IL-12B(P40)融合蛋白；3)將純化的GST-IL-12B(P40)融合蛋白與化學(xué)合成的豬瘟病毒T細(xì)胞表位E290多肽(KHKVRNEVMVHWFDD)混勻，免疫豬后，通過淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測機(jī)體的T細(xì)胞免疫反
應(yīng)。O本發(fā)明的有益效果為重組融合蛋白可作為一種免疫增強(qiáng)劑，與豬病原體(如豬瘟病毒、豬藍(lán)耳病病毒等)的一些T細(xì)胞表位(如豬瘟病毒T細(xì)胞表位E290多肽KHKVRNEVMVHWFDD)聯(lián)合免疫動(dòng)物，增強(qiáng)機(jī)體的細(xì)胞免疫水平，應(yīng)用于豬病的預(yù)防及治療。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明實(shí)施例所述的一種豬用免疫增強(qiáng)劑IL-12B (P40)，是一種基因重組蛋白，該蛋白含有豬IL-12的P40亞基[IL-12B(P40)]的主要氨基酸序列。實(shí)施例I :IL_12B(P40)基因克隆到原核表達(dá)載體pGEX_6p_l
I、設(shè)計(jì) IL_12B(P40)基因引物參考豬源IL-12B(P40)基因序列(GenBank 號(hào)NM_214013)設(shè)計(jì)擴(kuò)增 IL_12B(P40)基因引物如下，引入酶切位點(diǎn)為EcoRI和Xho I (用斜體表示)F-E GC GAATTC ATGCACCTTCAGCAGCTG,R-X GC CTCGAG CTAATTGCAGGACACAGATGO2、提取豬外周血單核淋巴細(xì)胞(PBMC)的總RNA根據(jù)invitrogen公司的RNA提取試劑盒,從豬PBMC中提取總RNA。3、IL_12B(P40)基因的反轉(zhuǎn)錄及 PCR根據(jù)invitrogen公司的RT-PCR試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得IL-12B (P40) -mRNA的cDNA。然后根據(jù)上述引物為PCR擴(kuò)增IL-12B(P40)基因。PCR反應(yīng)條件如下94°C 4分鐘；94°C 40秒，55°C 40秒，72°C 75秒；共30循環(huán)；720C 10分鐘。結(jié)果得PCR產(chǎn)物約為975bp的目的片段。4、陽性重組質(zhì)粒 pGEX-6p-l-IL_12B (P40)的獲取I %瓊脂糖凝膠電泳后，回收目的條帶，按下列體系用EcoR I和Xho I雙酶切回收PCR產(chǎn)物及載體pGEX-6p-l質(zhì)粒
權(quán)利要求
1.一種豬用免疫增強(qiáng)劑IL-12B(P40)，其特征在于，其含有豬IL-12的P40亞基的主要氨基酸序列，該氨基酸序列為MHLQQLVVSWFSLVWLASPIVAIWELEKNVYVVELDWYPNAPGEMVVLTCNTPEEDGITWTSDQSSEVLGTGKTLTIHVKEFGDAGQYTCRKGGAVLSQSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKSFLKCEAKNYSGRFTCWWLTAISTDLKFSVKSSRGSTDPRGVTCGTATLSEDLGEYKKYRVECQEGSACPAAEESLPIEVVLEAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLNPLKNSRHVEISWEYPDTWSTPHSYFSLMFGVQVQGKNKREKKDKLFTDQISAKVTCHKDANIRVQARDRYYSSSWSEWASVSCN。
2.權(quán)利要求I所述的豬用免疫增強(qiáng)劑IL-12B(P40)的制備方法，其特征在于，包括以下步驟 1)以IL-12B(P40)特異性的上下游引物，通過RT-PCR合成包含EcoRI和XhoI兩個(gè)酶切位點(diǎn)的IL-12B(P40)cDNA，經(jīng)過純化酶切，重組至原核表達(dá)載體pGEX-6p-l ； 2)該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)菌株BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的表達(dá)產(chǎn)物為GST-IL-12B(P40)融合蛋白； 3)將純化的GST-IL-12B(P40)融合蛋白與化學(xué)合成的豬瘟病毒T細(xì)胞表位E290多肽(KHKVRNEVMVHWFDD)混勻。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種豬用免疫增強(qiáng)劑IL-12B(P40)及其制備方法，豬用免疫增強(qiáng)劑IL-12B(P40)是一種含有豬IL-12的P40亞基(IL-12B(P40)的主要氨基酸序列的基因重組蛋白，通過RT-PCR合成IL-12B(P40)的cDNA，經(jīng)過純化、酶切，將該基因克隆進(jìn)原核表達(dá)載體pGEX-6p-1，該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)菌株BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的表達(dá)產(chǎn)物為GST-IL-12B(P40)融合蛋白，該融合蛋白經(jīng)純化后，純度較高，將純化的GST-IL-12B(P40)融合蛋白與化學(xué)合成的豬瘟病毒T細(xì)胞表位E290多肽(KHKVRNEVMVHWFDD)混勻，免疫豬后，能誘發(fā)機(jī)體顯著的T細(xì)胞免疫反應(yīng)。本發(fā)明的有益效果為重組GST-IL-12B(P40)融合蛋白可作為一種免疫增強(qiáng)劑應(yīng)用于豬病原體(如豬瘟病毒、豬藍(lán)耳病病毒等)感染的預(yù)防及治療。
文檔編號(hào)A61K39/187GK102908613SQ20111022329
公開日2013年2月6日 申請日期2011年8月4日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月4日
發(fā)明者李帥偉, 于賓賓 申請人:廣州格拉姆生物科技有限公司