專利名稱：一種治療豬呼吸道綜合癥的卵黃抗體注射液的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于獸醫(yī)生物制品技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種治療豬呼吸道疾病的卵黃抗體的制備方法。
背景技術(shù)：
豬呼吸道疾病綜合征(PRDC)以生長(zhǎng)速度降低、飼料利用率降低、食欲減退、咳嗽、呼吸困難為特征的疾病，雖然總體死亡率不高，但可嚴(yán)重影響豬場(chǎng)的經(jīng)濟(jì)效益。臨床上引起豬呼吸道綜合癥的主要病原有豬肺炎支原體、繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、2型圓環(huán)病毒(PCV-2)和豬流感病毒，以及繼發(fā)感染的其它細(xì)菌性病原，如巴氏桿菌、鏈球菌和胸膜肺炎放線桿菌等病原。斷奶后各個(gè)階段的豬均可發(fā)病，即從斷奶后2周開(kāi)始，一直到育肥期都可能發(fā)生呼吸道疾病綜合癥。 PRRSV是一種免疫抑制性病毒，感染后可以產(chǎn)生病毒血癥，除引起繁殖障礙外，尚可以引起全身淋巴系統(tǒng)，特別是肺臟巨噬細(xì)胞的破壞，導(dǎo)致嚴(yán)重的免疫抑制，從而促進(jìn)了包括肺炎支原體、鏈球菌、胸膜肺炎放線桿菌在內(nèi)的等多種病原體感染。最近幾年的PCV-2與PRRSV也有顯著的協(xié)同作用。肺炎支原體一方面可以破壞呼吸道的局部清除病原體的能力，使得細(xì)菌性病原體嚴(yán)重繼發(fā)感染；另一方面，通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，肺炎支原體可以調(diào)制肺臟局部的免疫應(yīng)答，使肺泡巨噬細(xì)胞的的功能發(fā)生改變，從而促進(jìn)了 PRRSV的感染，延長(zhǎng)了 PRRSV感染的時(shí)間，加重了 PRRSV造成的損失。最近的研究表明，肺炎支原體還可以促進(jìn)PCV-2的感染。美國(guó)學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，在呼吸道疾病綜合癥(PRDC)的臨床病例中，經(jīng)常發(fā)現(xiàn)肺炎支原體與PCV-2混合感染，而不一定有PRRSV或流感病毒的存在。PCV-2的抗原經(jīng)常發(fā)現(xiàn)于有肺炎支原體感染誘導(dǎo)增生的支氣管周圍淋巴組織區(qū)域。PCV-2/肺炎支原體的混合感染模型本身表明，PCV-2或肺炎支原體單獨(dú)感染只能引起輕微的一過(guò)性呼吸道疾病和病變，但如果二者混合感染，可導(dǎo)致嚴(yán)重的與PRDC和PMWS —致的呼吸道疾病癥狀和病變。因?yàn)镻RDC的發(fā)生既有感染的因素，又有營(yíng)養(yǎng)、飼養(yǎng)管理以及豬舍環(huán)境的因素，因此豬場(chǎng)通常采用綜合性措施加以控制，如疫苗免疫，藥物預(yù)防以及加強(qiáng)飼養(yǎng)管理等。通過(guò)綜合性的預(yù)防措施雖然可以起到一定的效果，但是由于PRRSV、PCV2等疾病的免疫抑制作用，通常在帶毒豬場(chǎng)免疫效果并不理想，并且PRRSV對(duì)不同來(lái)源的毒株的保護(hù)力較低，在帶毒豬場(chǎng)免疫PRRSV可能導(dǎo)致PRRSV的爆發(fā)，給豬場(chǎng)造成巨大的損失。肺炎支原體免疫可以減輕PRRSV的感染，預(yù)防PRDC ;但PRRSV感染又可干擾肺炎支原體的免疫。如果在肺炎支原體免疫前感染了 PRRSV或PCV2，則肺炎支原體的免疫效果明顯降低。另外由于PRDC的發(fā)生是病毒/細(xì)菌以及支原體混合感染的結(jié)果，通?？梢允褂脧V譜抗生素對(duì)細(xì)菌性病原進(jìn)行清除，如使用金霉素、阿莫西林和氟苯尼考等抗生素，這些藥物通常可以控制大多數(shù)呼吸道細(xì)菌性病原體的感染。但抗生素的大量運(yùn)用一方面將導(dǎo)致更多耐藥菌株的出現(xiàn)，增加疾病防控成本，另一方面也給食品安全帶來(lái)了隱患。目前，卵黃抗體已經(jīng)廣泛運(yùn)用于雞、鴨、鵝、犢牛、仔豬和羔羊等動(dòng)物疾病的緊急治療和預(yù)防中，如雞傳染性法氏囊、雞新城疫、雞白痢、鴨病毒性肝炎、小鵝瘟、豬輪狀病毒、犬瘟熱、犬細(xì)小病毒病、羔羊輪狀病毒腹瀉、仔豬輪狀病毒腹瀉等。卵黃抗體是一種高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的多克隆抗體，制備簡(jiǎn)單，容易提取，可以高效特異的對(duì)病毒性/細(xì)菌性疾病進(jìn)行治療；而且雞大規(guī)模工業(yè)化飼養(yǎng)成本低，經(jīng)濟(jì)方便。同時(shí)使用卵黃抗體進(jìn)行疾病治療可以減少抗生素的使用，減少耐藥株的出現(xiàn)，從而降低疫病控制成本。因此，卵黃抗體在生物制品的開(kāi)發(fā)和疾病的防治方面具有廣闊的前景。且迄今為止，運(yùn)用卵黃抗體治療豬呼吸道綜合癥的研究尚未有報(bào)到。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種治療豬呼吸綜合癥的卵黃抗體注射液的制備方法，用于防治豬呼吸道綜合癥，克服已有技術(shù)中的缺點(diǎn)，在降低防疫成本和耐藥性菌株產(chǎn)生的前提下，有效的提高動(dòng)物的生產(chǎn)性能和疫病防治效果，且不會(huì)對(duì)人產(chǎn)生食源性污染和藥物殘留。本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)·一種治療豬呼吸綜合癥的卵黃抗體注射液的制備方法，包括以下步驟I)分離當(dāng)前流行的PRRSV、PCV-2和豬肺炎支原體，分別用MARC-145細(xì)胞培養(yǎng)PRRSV,用PK15細(xì)胞培養(yǎng)PCV-2和支原體培養(yǎng)基培養(yǎng)豬肺炎支原體，測(cè)定病毒和支原體滴度后制備成三聯(lián)滅活疫苗。制備的疫苗中PRRSV的TCID5tl不低于108/ml，PCV-2的TCID5tl不低于10%1，豬肺炎支原體數(shù)量不低于IOltVml ；2)利用制備的PRRSV/PCV2/豬肺炎支原體三聯(lián)滅活疫苗免疫非免疫產(chǎn)蛋母雞，免疫程序如下與產(chǎn)蛋前30天首次免疫,免疫劑量為2ml/羽，首次免疫后2、4分別進(jìn)行兩次加強(qiáng)免疫，免疫劑量為3ml/羽。此后每隔2月全群免疫一次，免疫劑量為2ml/羽，以誘導(dǎo)母雞持續(xù)性的產(chǎn)生抗PRRSV、PCV-2和豬肺炎支原體的抗體；3)第三次免疫后14天收集雞蛋，運(yùn)用75%乙醇消毒蛋殼，在無(wú)菌條件下收集卵黃，運(yùn)用等量磷酸鹽緩沖液(O. IM PBS,PH7. 2)后置組織勻漿器中，5000轉(zhuǎn)/分勻漿I分鐘，加入乳酸至PH為4. 0，2 8°C攪拌過(guò)夜，置-80°C冷凍后解凍，并重復(fù)冷凍一次，然后8000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，收集上清，按照I : I的比例加入飽和硫酸銨，2 8°C攪拌2消失，后2 8°C靜置過(guò)夜，8000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘收集沉淀，加入O. IM PBS溶解后除去硫酸銨；4)運(yùn)用微量中和實(shí)驗(yàn)測(cè)定PRRSV、PCV_2的中和抗體效價(jià)，運(yùn)用ELISA測(cè)定豬肺炎支原體抗體效價(jià)；5)將效價(jià)測(cè)定好的卵黃抗體進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)，合格后無(wú)菌分裝，使PRRSV、PCV-2和豬肺炎支原體抗體效價(jià)不低于I : 64。本發(fā)明的有益效果為本發(fā)明中制備的卵黃抗體注射液為免疫球蛋白制劑，能夠特異性的中和PRRSV、PCV2，同時(shí)對(duì)豬肺炎支原體亦具有作用，可用于臨床上由PRRSV、PCV-2和豬肺炎支原體混合感染導(dǎo)致的豬呼吸道綜合癥；使用本發(fā)明中制備的注射液不僅可以治愈易感染上述病原的豬，同時(shí)對(duì)同群未感染上述病原的豬使用可以使其獲得被動(dòng)免疫；臨床實(shí)驗(yàn)表明，使用本發(fā)明制備的產(chǎn)品后可以顯著提高豬群生產(chǎn)性能；本發(fā)明制備成本低，見(jiàn)效快，本制品無(wú)毒副作用，使用后無(wú)藥物殘留，生產(chǎn)使用過(guò)程中對(duì)人畜無(wú)危害，同時(shí)使用本發(fā)明中制備的產(chǎn)品不會(huì)導(dǎo)致耐藥菌毒株的出現(xiàn)，對(duì)食品安全無(wú)潛在的危害，適宜大規(guī)模推廣。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I :PRRSV流行毒株的分離鑒定以及病毒TCID5tl測(cè)定I、PRRSV流行毒株的分離鑒定I)采集疑似PRRSV發(fā)病豬血清，接種MARC-145細(xì)胞，37°C，5% C02培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞病變情況，如培養(yǎng)至96小時(shí)后無(wú)細(xì)胞病變出現(xiàn)則將細(xì)胞培養(yǎng)物置_40°C反復(fù)凍融三次，12000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，取上清接種MARC-145細(xì)胞繼續(xù)傳代。以此類推連續(xù)進(jìn)行傳代。該分離毒株傳代至第2代時(shí)在接種72小時(shí) 后出現(xiàn)細(xì)胞病變。2)根據(jù)GENBANK中登錄的PRRSV的序列(AY150564)設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物P1、P2。其中 Pl CCGACTGCTAGGGCTTCT,P2 :TATCTGCCACCCAACACG 擴(kuò)增片段大小為 363bp。將出現(xiàn)細(xì)胞病變的病毒液上清提取RNA，運(yùn)用RT-PCR進(jìn)行進(jìn)行PCR鑒定。如擴(kuò)增出特異性的片段則判定為PRRSV陽(yáng)性。2、PRRSV分離毒株的TCID5tl測(cè)定將生長(zhǎng)良好的MARC-145細(xì)胞運(yùn)用胰酶消化后按照I : 4的比例傳代到96孔板中，每孔O. Iml，然后置37°C，5% CO2培養(yǎng)。96孔板中細(xì)胞長(zhǎng)滿單層后，將培養(yǎng)液吸出，加入病毒稀釋液，每個(gè)梯度8孔，每孔O. Iml0病毒液稀釋按照10倍倍比稀釋，選取IO1 IO9等9個(gè)稀釋度進(jìn)行病毒接種。加入病毒液后置37°C，5% CO2吸附2小時(shí)，然后去除病毒液，加入細(xì)胞維持液繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)4天后觀察并記錄細(xì)胞病變孔數(shù),運(yùn)用Reed-Muench氏法計(jì)算TCID50。實(shí)施例2滅活疫苗的制備及免疫I、菌毒滅活分別將測(cè)定好菌毒滴度的菌毒液混合，混合后制備的疫苗中PRRSV的TCID5tl不低于108/ml，PCV-2的TCID5tl不低于106/ml，豬肺炎支原體數(shù)量不低于IOltVmL混合后加入
O.2%的甲醛37°C滅活24小時(shí)。滅活檢驗(yàn)合格后備用。2、滅活疫苗制備油相制備由注射用白油94體積份，加司本_80°C 6體積份，混合后，然后加硬脂酸鋁(每100毫升混合液加入2克硬脂酸鋁)，逐漸攪拌至透明為止，高壓滅菌備用。水相制備取滅菌吐溫-80°C 4體積份，加入滅活病毒液96體積份，充分振搖，使吐溫-80°C完全溶解。乳化取油相I體積份放于乳化缸內(nèi)，開(kāi)動(dòng)電機(jī)慢速轉(zhuǎn)動(dòng)攪拌，同時(shí)緩慢加入水相I體積份，加完后再以10000r/min攪拌2 5分鐘，在終止攪拌前加入I %硫柳汞水溶液，使其終濃度為O. 01%，得到制備卵黃抗體用滅活疫苗。3、疫苗免疫非免疫母雞產(chǎn)蛋前30天首次免疫,免疫劑量為2ml/羽，首次免疫后2、4分別進(jìn)行兩次加強(qiáng)免疫，免疫劑量為3ml/羽。此后每隔2月全群免疫一次，免疫劑量為2ml/羽，以誘導(dǎo)母雞持續(xù)性的產(chǎn)生抗PRRSV，PCV-2和豬肺炎支原體的抗體。實(shí)施例3卵黃抗體的制備和效價(jià)測(cè)定I、卵黃抗體的制備第三次免疫后14天收集雞蛋，運(yùn)用75%乙醇消毒蛋殼，在無(wú)菌條件下收集卵黃，運(yùn)用等量磷酸鹽緩沖液(O. IM PBS, PH7. 2)后置組織勻漿器中，5000轉(zhuǎn)/分勻漿I分鐘，力口入乳酸至PH為4. O, 2 8°C攪拌過(guò)夜，置-80°C冷凍后解凍，并重復(fù)冷凍一次，然后8000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，收集上清，按照I : I的比例加入飽和硫酸銨,2 8°C攪拌2消失，后2 8°C靜置過(guò)夜，8000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘收集沉淀，加入O. IM PBS溶解后除去硫酸銨。2、PRRSV抗體的效價(jià)測(cè)定I)細(xì)胞制備取生長(zhǎng)良好的MARK-145細(xì)胞，運(yùn)用胰酶消化后按照I : 4的比例傳代至96孔板中，每孔O. 1ml，加入至96孔板后輕微前后左右搖晃，混勻細(xì)胞使其能夠均勻貼壁。2)體外中和實(shí)驗(yàn)將PRRSV病毒液進(jìn)行稀釋，稀釋至2000TCID5Q/ml。取制備的卵黃抗體進(jìn)行2倍倍比稀釋，取21 21°等10個(gè)稀釋度。每個(gè)稀釋度取O. 4ml卵黃抗體稀釋液加入等量的稀釋病毒液，37°C水浴I小時(shí)使卵黃抗體與PRRSV病毒進(jìn)行中和反應(yīng)。
3)細(xì)胞接種以及中和效價(jià)測(cè)定中和反應(yīng)完畢后，將96孔板中細(xì)胞培養(yǎng)液去除，力口入中和反應(yīng)后的混合液，每孔O. lml，37°C吸附I小時(shí)，然后去除吸附混合液，加入細(xì)胞維持液繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)4天后觀察細(xì)胞病變孔數(shù)并記錄,然后按照Reed-Muench氏法計(jì)算中和抗體效價(jià)。3、將效價(jià)測(cè)定好的卵黃抗體進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)，合格后無(wú)菌分裝，使PRRSV，PCV-2和豬肺炎支原體抗體效價(jià)不低于I : 64。實(shí)施例42010年11月河北某豬場(chǎng)40日齡斷奶仔豬982頭，出現(xiàn)呼吸道癥狀，主要表現(xiàn)為食欲減退、咳嗽、呼吸困難，喘氣，呈腹氏呼吸，喜堆臥在一起，生長(zhǎng)緩慢，消瘦，死亡率升高。少數(shù)豬出現(xiàn)拉稀，皮膚發(fā)紅等癥狀，且該豬場(chǎng)常規(guī)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)有PRRSV和PCV-2的感染。此次出現(xiàn)呼吸道癥狀后使用本發(fā)明制備的卵黃抗體進(jìn)行治療(卵黃抗體治療組493頭豬)，同時(shí)設(shè)計(jì)對(duì)照組(395頭)。對(duì)照組在飲水中加入復(fù)合維生素和黃芪多糖粉劑，同時(shí)在飼料中加入枝原凈lOOppm、金霉素300ppm、阿莫西林400ppm進(jìn)行飼料投藥。對(duì)照組和卵黃抗體治療組均加強(qiáng)飼養(yǎng)管理和消毒。經(jīng)上述處理后兩組豬群效果均有好轉(zhuǎn)，呼吸癥狀逐漸消失，動(dòng)物食欲逐漸增加。至育肥期時(shí)，卵黃抗體組淘汰率為I. 8%，對(duì)照組淘汰率為2. 6%，卵黃抗體治療組效果優(yōu)于對(duì)照組。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明制備的卵黃抗體具有較好的療效，能夠提高仔豬存活率。
權(quán)利要求
1.一種治療豬呼吸綜合癥的卵黃抗體注射液的制備方法，其特征在于，包括以下步驟 1)分離當(dāng)前流行的PRRSV、PCV-2和豬肺炎支原體，分別用MARC-145細(xì)胞培養(yǎng)PRRSV，用PK15細(xì)胞培養(yǎng)PCV-2和支原體培養(yǎng)基培養(yǎng)豬肺炎支原體，測(cè)定病毒和支原體滴度后制備成三聯(lián)滅活疫苗； 2)利用制備的PRRSV/PCV2/豬肺炎支原體三聯(lián)滅活疫苗免疫非免疫產(chǎn)蛋母雞； 3)在無(wú)菌條件下收集卵黃，運(yùn)用等量的PH7.2的O. IM PBS后置組織勻漿器中，5000轉(zhuǎn)/分勻漿I分鐘，加入乳酸至PH為4. 0，2 8°C攪拌過(guò)夜，置_80°C冷凍后解凍，并重復(fù)冷凍一次，然后8000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，收集上清，按照I : I的比例加入飽和硫酸銨，2 8°C攪拌2消失，后2 8°C靜置過(guò)夜，8000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘收集沉淀，加入O. IM PBS溶解后除去硫酸銨； 4)運(yùn)用微量中和實(shí)驗(yàn)測(cè)定PRRSV、PCV-2的中和抗體效價(jià)，運(yùn)用ELISA測(cè)定豬肺炎支原體抗體效價(jià)； 5)將效價(jià)測(cè)定好的卵黃抗體進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)，合格后無(wú)菌分裝，使PRRSV、PCV-2和豬肺炎支原體抗體效價(jià)不低于I : 64。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的治療豬呼吸綜合癥的卵黃抗體注射液的制備方法，其特征在于，步驟I)中所述制備的疫苗中PRRSV的TCID50不低于108/ml, PCV-2的TCID50不低于106/ml，豬肺炎支原體數(shù)量不低于IOltVmL
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的治療豬呼吸綜合癥的卵黃抗體注射液的制備方法，其特征在于，步驟2)中的所述免疫程序如下與產(chǎn)蛋前30天首次免疫，免疫劑量為2ml/羽，首次免疫后2、4分別進(jìn)行兩次加強(qiáng)免疫，免疫劑量為3ml/羽，此后每隔2月全群免疫一次，免疫劑量為2ml/羽，以誘導(dǎo)母雞持續(xù)性的產(chǎn)生抗PRRSV、PCV-2和豬肺炎支原體的抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的治療豬呼吸綜合癥的卵黃抗體注射液的制備方法，其特征在于，步驟3)中在第三次免疫后14天收集雞蛋，運(yùn)用75%乙醇消毒蛋殼，在無(wú)菌條件下收集卵黃。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種治療豬呼吸綜合癥的卵黃抗體注射液的制備方法，包括以下步驟1)分離當(dāng)前流行的PRRSV、PCV-2和豬肺炎支原體，分別用MARC-145細(xì)胞培養(yǎng)PRRSV，用PK15細(xì)胞培養(yǎng)PCV-2和支原體培養(yǎng)基培養(yǎng)豬肺炎支原體，測(cè)定病毒和支原體滴度后制備成三聯(lián)滅活疫苗；2)利用制備的PRRSV/PCV2/豬肺炎支原體三聯(lián)滅活疫苗免疫非免疫產(chǎn)蛋母雞；3)在無(wú)菌條件下收集卵黃；4)運(yùn)用微量中和實(shí)驗(yàn)測(cè)定PRRSV、PCV-2的中和抗體效價(jià)，運(yùn)用ELISA測(cè)定豬肺炎支原體抗體效價(jià)；5)將效價(jià)測(cè)定好的卵黃抗體進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)，合格后無(wú)菌分裝。本發(fā)明的有益效果卵黃抗體注射液能有針對(duì)性的對(duì)PRRSV、PCV2和豬肺炎支原體單獨(dú)感染或混合感染病豬進(jìn)行有效的治療。
文檔編號(hào)A61P31/04GK102908619SQ20111022325
公開(kāi)日2013年2月6日 申請(qǐng)日期2011年8月4日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月4日
發(fā)明者李帥偉, 龐程 申請(qǐng)人:廣州格拉姆生物科技有限公司