專利名稱：一種動物用免疫增強(qiáng)劑的制備方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種動物用免疫增強(qiáng)劑的制備方法及應(yīng)用，屬于獸醫(yī)生物制品技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
畜禽養(yǎng)殖業(yè)的迅猛發(fā)展，尤其是集約化飼養(yǎng)規(guī)模的日益擴(kuò)大，使得疾病預(yù)防的問題愈加重要。疫苗接種是預(yù)防疾病的最基本、最有效的方法。但是由于各種原因，目前很多疫苗的免疫效果還不是十分理想，不能對動物提供完全的保護(hù)。為了提高疫苗的免疫效果，人們進(jìn)行了大量的工作，如通過濃縮抗原提高抗原含量、提高抗原的免疫原性、優(yōu)化制苗エ藝、采用優(yōu)質(zhì)佐劑、優(yōu)化免疫程序等等來提高疫苗的免疫質(zhì)量，通過使用免疫增效劑、減少各種有毒有害物質(zhì)對免疫系統(tǒng)的傷害、提供良好的飼養(yǎng)條件、采用合理的用藥程序來增強(qiáng)動物機(jī)體的免疫應(yīng)答能力。其中，研究開發(fā)新型高效動物用免疫增強(qiáng)劑(佐劑)是提高免 疫效果的主要方法之一。佐劑又稱免疫增強(qiáng)劑或免疫調(diào)節(jié)劑，是指先于抗原或與抗原同時注入動物體內(nèi)，能非特異性改變或增強(qiáng)機(jī)體對該抗原的免疫應(yīng)答的ー類物質(zhì)。目前佐劑的品種較多，按照來源可分為無機(jī)佐劑，如氫氧化鋁，明礬等；有機(jī)佐劑，微生物及其產(chǎn)物如短小桿菌、百日咳桿菌、內(nèi)毒素等；合成佐劑，如人工合成的雙鏈多聚核苷酸(雙鏈多聚腺苷酸、尿苷酸)、左旋咪唑、異丙肌苷等；油佐劑，如弗氏佐劑、礦物油佐劑等。上述佐劑中，有的雖然已經(jīng)研究成功應(yīng)用于人類如胸腺素和干擾素，但是價格較為昂貴，不可能用于動物。目前動物用疫苗所用佐劑主要還是以油佐劑、氫氧化鋁鋁膠佐劑為主，通過延長疫苗在注射部位的停留時間發(fā)揮佐劑效應(yīng)，還沒有直接通過增強(qiáng)動物機(jī)體自身的免疫應(yīng)答能力的佐劑來提高免疫效果。草分枝桿菌(Mycobacterium phlei)是分枝桿菌中的ー種，其中分枝桿菌胞壁酰ニ肽(MDP)具有很強(qiáng)的免疫治療作用，草分枝桿菌多糖MPS在免疫調(diào)節(jié)、抑制病毒復(fù)制方面有很好效果(周莉婷，趙晶晶等，分枝桿菌多糖免疫調(diào)節(jié)劑研究進(jìn)展，藥物生物技木，2011. 18(2) :176-179)。經(jīng)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)證明滅活的草分枝桿菌進(jìn)入人體后，T淋巴細(xì)胞受到刺激,釋放出多種淋巴因子,如IL-2、IL-4、TNF、IFN和MAF、MIF、MCF、MMF等，這些因子作用于單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)，使之向病灶部位聚集、活化，對病原菌進(jìn)行吞噬、殺傷和清除；同吋，自然殺傷(NK)細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞也活化、增多，IgM、IgG増加或趨于正常，持久地介入機(jī)體的免疫過程，不斷的調(diào)節(jié)細(xì)胞及體液免疫系統(tǒng)發(fā)揮免疫功能，從而增強(qiáng)機(jī)體免疫能力(陳孝治，烏體林斯注射液，中國新藥雜志，2000，9 (9) =644-645)。草分枝桿菌是一種非致病性微生物，単獨(dú)使用或與疫苗同時使用時沒有毒性，通過提高宿主自身的免疫應(yīng)答能力來提增強(qiáng)免疫力，安全可靠。草分枝桿菌發(fā)酵方便、成本低廉，便于臨床大面積推廣使用
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是制備一種動物用免疫增強(qiáng)劑，一方面可以非特異性的提高動物的免疫能力，另一方面用其作為疫苗的佐劑成分，可以使動物用疫苗的免疫效果更確實(shí)，將動物疫苗免疫水平提高到一個新的高度，減少疾病發(fā)生，具有直接的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。使用本發(fā)明涉及的免疫增強(qiáng)劑能夠1)增強(qiáng)動物免疫力，提高成活率和增重率；2)將動物用滅活疫苗的保護(hù)性抗體產(chǎn)生時間提前5 7天，使得動物免疫空白期更短，產(chǎn)生更好的免疫保護(hù)效果；本發(fā)明最關(guān)鍵的一點(diǎn)是，添加草分枝桿菌的禽流感滅活疫苗(H9亞型)，能使接種該疫苗的動物產(chǎn)生保護(hù)性抗體的時間提前5 7天。由于油乳劑滅活疫苗一般在免疫后10天開始產(chǎn)生抗體，14天血清中能檢測到抗體，21 28天達(dá)到保護(hù)性水平，而肉雞由于生長太快，免疫系統(tǒng)發(fā)育不完善，對抗原的免疫應(yīng)答能力差，產(chǎn)生抗體更慢，抗體水平更低(馬磊等，淺談影響肉雞免疫力下降的因素，家禽科學(xué)，2007，(11) :27-28)。草分枝桿菌動物用免疫增強(qiáng)劑使用后，肉雞免疫后14天即可產(chǎn)生保護(hù)性抗體，大大縮小了免疫空白期，降低了養(yǎng)殖中疾病發(fā)生的風(fēng)險。本發(fā)明中選用草分枝桿菌作為動物用疫苗佐劑，從調(diào)動機(jī)體免疫機(jī)能方面著手，增強(qiáng)了免疫效果，彌補(bǔ)了疫苗免疫中禽流感沒有活疫苗做基礎(chǔ)免疫的缺 憾，減少了整個養(yǎng)殖周期禽流感的發(fā)病率，具有直接的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。本發(fā)明主要技術(shù)方案在于本發(fā)明的一種動物用免疫增強(qiáng)劑，主要成分是草分枝桿菌(Mycobacteriumphlei)培養(yǎng)物的純化制品；該動物用免疫增強(qiáng)劑主要是將草分枝桿菌發(fā)酵培養(yǎng)，通過滅活、濃縮、純化、均質(zhì)等工序制備而成；該一種動物用免疫增強(qiáng)劑的應(yīng)用，可以單獨(dú)使用，用于非特異性的增強(qiáng)動物機(jī)體免疫能力，其使用劑量為按照動物體重計(jì)算，每公斤體重注射草分枝桿菌菌體I 20mg ;該免疫增強(qiáng)劑可按照每毫升疫苗中添加0. 032 0. 8mg草分枝桿菌菌體的量添加到動物用滅活疫苗中混合均勻，按照疫苗的常規(guī)劑量進(jìn)行免疫。
具體實(shí)施例方式I.菌株來源本發(fā)明涉及到的草分枝桿菌(Mycobacterium phlei)AS 4. 1180菌株購于北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學(xué)院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，編號CGMCC AS 4. 1180(中國微生物菌種保藏管理委員會，中國菌種目錄，1992版，機(jī)械工業(yè)出版社，1992，p285)。2.動物用免疫增強(qiáng)劑的制備方法動物用免疫增強(qiáng)劑的制備，是將編號為CGMCC AS 4. 1180草分枝桿菌(Mycobacterium phlei)發(fā)酵培養(yǎng),通過滅活、濃縮、純化等工序制成草分枝桿菌菌體。具體制備步驟(I)種子培養(yǎng)將草分枝桿菌(Mycobacterium phlei) CGMCC AS 4. 1180株置于種子罐中進(jìn)行培養(yǎng)，37°C通氣培養(yǎng)，pH值為7. 0，培養(yǎng)時間為3 4天，得到發(fā)酵用種子液；種子罐中的培養(yǎng)基配方酵母提取粉Ig 5g，濃縮麥芽汁(購自濟(jì)南雙麥啤酒物資有限公司)2ml IOml,葡萄糖5g 50g,磷酸氫二銨Ig 4g,磷酸氫二鉀0. 5g Ig,注射用水加至1000ml。(2)發(fā)酵培養(yǎng)為了得到活性最佳的草分枝桿菌，選擇在細(xì)菌生長的對數(shù)期終止發(fā)酵，進(jìn)行滅活，本發(fā)明對草分枝桿菌的培養(yǎng)時間進(jìn)行了篩選試驗(yàn)。草分枝桿菌在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)72h后，每隔24h用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，在顯微鏡下測定細(xì)菌濃度，結(jié)果見下表I :表I草分枝桿菌的培養(yǎng)時間篩選試驗(yàn)
權(quán)利要求
1.一種動物用免疫增強(qiáng)劑，其特征在于該免疫增強(qiáng)劑主要成分是編號為AS 4. 1180的草分枝桿菌(Mycobacterium phlei)培養(yǎng)物的純化制品,該草分枝桿菌購自北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學(xué)院微生物研究所中國普通微生物保藏管理中心，編號=CGMCCAS 4. 1180。
2.權(quán)利要求I所述一種動物用免疫增強(qiáng)劑的制備方法，其特征是將編號為CGMCCAS4.1180草分枝桿菌(Mycobacterium phlei)發(fā)酵培養(yǎng),通過滅活、濃縮、純化、均質(zhì)等工序制備而成。
3.權(quán)利要求I所述一種動物用免疫增強(qiáng)劑的應(yīng)用，其特征是可以單獨(dú)使用，用于非特異性的增強(qiáng)動物機(jī)體免疫能力，其使用劑量為按照動物體重計(jì)算，每公斤體重注射草分枝桿菌(Mycobacterium phlei)菌體 I 20mg。
4.權(quán)利要求I所述一種動物用免疫增強(qiáng)劑的應(yīng)用，其特征是該免疫增強(qiáng)劑可按照每毫升疫苗中添加0. 032 0. 8mg草分枝桿菌(Mycobacterium phlei)菌體的量添加到動物用滅活疫苗中混合均勻，按照疫苗的常規(guī)劑量進(jìn)行免疫。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種動物用免疫增強(qiáng)劑的制備方法及應(yīng)用。本發(fā)明的技術(shù)方案為將草分枝桿菌發(fā)酵培養(yǎng)，通過滅活、濃縮、提純、均質(zhì)等工序制備成一種動物用免疫增強(qiáng)劑?？梢詥为?dú)使用，用于非特異性的增強(qiáng)動物的機(jī)體免疫能力，也可以作為動物用疫苗的佐劑成分使用。本發(fā)明所提供的方法，既能增強(qiáng)動物的機(jī)體免疫能力，提高動物的生產(chǎn)性能；又使疫苗的免疫效果更確實(shí)，具有直接的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。
文檔編號A61P37/04GK102764434SQ201210057420
公開日2012年11月7日 申請日期2012年3月7日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月7日
發(fā)明者劉紅娟, 張廣, 徐龍濤, 李秀娟, 李金波, 王蕾, 鮑海忠 申請人:齊魯動物保健品有限公司