專利名稱：神經(jīng)纖毛蛋白拮抗劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一般而言，本發(fā)明涉及與神經(jīng)纖毛蛋白/神經(jīng)菌毛素(neUr0pilin，NRP)活性有關(guān)的組合物和方法。更具體的說，本發(fā)明關(guān)于調(diào)控神經(jīng)纖毛蛋白-I(NRPl)受體介導的血管形成和維持的組合物和方法。本發(fā)明進一步涉及篩選治療上可用于預防或治療與血管發(fā)生有關(guān)的疾患和疾病的物質(zhì)的方法。
背景技術(shù)：
血管系統(tǒng)的發(fā)育是許多生理性和病理性過程的基本要求?；钴S生長中的組織諸如胚胎和腫瘤要求充足的血液供應。它們通過生成促血管發(fā)生因子來滿足這一需要，所述促血管發(fā)生因子經(jīng)由一般稱為血管發(fā)生(angiogenesis)的過程促進新血管形成和維持。血管形成是復雜但有序的生物學事件，牽涉所有或許多以下步驟a)自已有的內(nèi)皮細胞(EC) 增殖出EC或自祖細胞分化出EC ；b)EC遷移并接合以形成索樣結(jié)構(gòu)；c)血管索然后發(fā)生管發(fā)生(tubulogenesis)以形成具有中央內(nèi)腔的血管；d)已有的索或血管伸出芽以形成次生血管；e)初級血管叢發(fā)生進一步重塑(remodeling)和整形(reshaping)；及 )內(nèi)皮周細胞(peri-endothelial cell)被募集來包圍內(nèi)皮管，為血管提供維持和調(diào)節(jié)功能，此類細胞包括用于小毛細血管的周細胞、用于大血管的平滑肌細胞、和心臟中的心肌細胞。Hanahan， D. Science 277:48-50(1997) ；Hogan,B. L. &Kolodziej,P. A. Nature Reviews Genetics. 3 513-23(2002) ；Lubarsky, B. &Krasnow, Μ.A. Cell. 112 :19-28(2003)?，F(xiàn)在完全確立了血管發(fā)生牽涉多種病癥的發(fā)病機理。這些包括實體瘤和轉(zhuǎn)移、 動脈粥樣硬化、晶狀體后纖維組織增生、血管瘤、慢性炎癥、眼內(nèi)新血管疾病諸如增殖性視網(wǎng)膜病變例如糖尿病性視網(wǎng)膜病、年齡相關(guān)黃斑變性(AMD)、新生血管性青光眼、移植角膜組織和其它組織的免疫排斥、類風濕性關(guān)節(jié)炎、和銀屑病。Folkman等，J. Biol. Chem., 267 :10931-10934(1992) ；Klagsbrun 等，Annu. Rev.Physiol. 53 :217-239(1991) ；Garner Α. , " Vascular diseases“,在Garner A禾口Klintworth GK編的《Pathobiology of Ocular Disease. A Dynamic Approach》H 2 片反(Marcel Dekker, NY,1994)中，pp 1625—1710。在腫瘤生長的情況中，血管發(fā)生對于自增生至瘤形成的轉(zhuǎn)換，及為腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移提供營養(yǎng)似乎是至關(guān)重要的。Folkman等，Nature 339:58(1989)。新血管形成 (neovascularization)讓腫瘤細胞獲得了與正常細胞相比的生長優(yōu)勢和增殖自治。腫瘤通常開始于單個異常細胞，由于與可利用毛細管床的距離，該細胞只能增殖至幾立方毫米的尺寸，而且它能在較長的一段時間里保持“休眠”狀態(tài)而不進一步生長和傳播。有些腫瘤細胞然后轉(zhuǎn)向血管發(fā)生表型以激活內(nèi)皮細胞，所述內(nèi)皮細胞增殖并成熟成新的毛細血管。這些新形成的血管不僅讓原發(fā)性腫瘤繼續(xù)生長，而且讓轉(zhuǎn)移性腫瘤細胞傳播并再建群(recolonization)。因而，在腫瘤切片中的微血管密度與乳腺癌及數(shù)種其它腫瘤的患者存活之間觀察到了相關(guān)性。Weidner 等，N. Engl. J. Med 324 :1-6(1991) ；Horak 等，Lancet 340 :1120-1124(1992) ；Macchiarini 等，Lancet340 145-146 (1992)。尚未完全了解控制血管發(fā)生轉(zhuǎn)換的精確機制，但是認為腫瘤塊的新血管形成源自眾多血管發(fā)生刺激物與抑制物的凈平衡(Folkman, Nat Med 1 (1) :27-31 (1995))。血管發(fā)育的過程受到緊密調(diào)節(jié)。迄今為止，多種分子，多為由周圍細胞生成的分泌性因子，已顯示出調(diào)節(jié)EC分化、增殖、遷移和接合成索樣結(jié)構(gòu)。例如，血管內(nèi)皮生長因子 (VEGF)已鑒定為牽涉刺激血管發(fā)生和誘導血管通透性的關(guān)鍵因子。！^errara等，Endocr. Rev. 18 :4-25(1997)。甚至單個VEGF等位基因的遺失導致胚胎致死的發(fā)現(xiàn)指向此因子在血管系統(tǒng)的發(fā)育和分化中所發(fā)揮的不可代替的作用。此外，VEGF已顯示為與腫瘤和眼內(nèi)病癥有關(guān)的新血管形成的關(guān)鍵介導物。！^errara等，Endocr. Rev.見上文。VEGF mRNA在多數(shù)所檢查的人腫瘤中過表達。Berkman 等，J. Clin, hvest. 91 :153-159(1993) ；Brown 等，Human Pathol. 26 :86-91 (1995) ；Brown 等，Cancer Res. 53 :4727-4735 (1993) ；Mattern 等，Brit. J. Cancer 73 :931-934 (1996) ；Dvorak 等，Am. J. Pathol. 146 1029-1039 (1995)。同樣，眼部液體中VEGF的濃度水平與糖尿病性和其它缺血相關(guān)視網(wǎng)膜病患者中的活潑血管增殖的存在高度相關(guān)。Aiello等，N.Engl. J.Med. 331 1480-1487 (1994)。此外，研究證明了 VEGF在AMD患者脈絡(luò)膜新血管膜中的定位。Lopez等，Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 37 :855-868(1996)。抗VEGF中和性抗體在裸鼠中遏制多種人腫瘤細胞系的生長(Kim等，Nature 362 841-844(1993) ；Warren等，J. Clin. Invest. 95 1789-1797 (1995) ； Borgstr0m等，Cancer Res. 56 :4032-4039 (1996) ；Melnyk 等，Cancer Res. 56 :921-924 (1996))，而且在缺血性視網(wǎng)膜病癥模型中還抑制眼內(nèi)血管發(fā)生。Adamis等，Arch. Ophthalmol. 114 :66-71 (1996)。因此，抗VEGF單克隆抗體或其它VEGF作用抑制劑是有希望用于治療腫瘤和多種眼內(nèi)新血管病癥的候選物。此類抗體記載于例如1998年1月14日公開的EP 817，648和1998年10 月15日公開的W098/45331和W098/45332。抗VEGF抗體之一，貝伐單抗已獲FDA批準與化療方案聯(lián)合用于治療轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌(CRC)和非小細胞肺癌(NSCLC)。而且，貝伐單抗正在許多進行中的治療各種癌癥適應證的臨床試驗中進行調(diào)查。在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過程中，神經(jīng)元伸出纜樣軸突，所述軸突遷移長距離以到達它們的靴點。見綜述 Carmeliet and Tessier-Lavigne (2005)Nature 436:193-200。生長中的軸突的領(lǐng)先尖端是高度能動的感覺結(jié)構(gòu)，稱為生長錐。通過絲足伸展(filopodial extension)的伸展和收縮的動態(tài)循環(huán)，生長錐不斷感覺和評估其空間環(huán)境中的眾多提示， 并精確選擇正確航跡來延伸向其最終靶點。在過去的十年里，在了解軸突導向機制方面取得了可觀的進展。見綜述 Dickson (2002) Science 298 1959-64。導向提示來自四種引誘物和驅(qū)除物；可以作用于近程(即細胞或基質(zhì)相關(guān)的)或遠程(即可擴散的)。迄今為止，已鑒定了四大族軸突導向分子netrins(神經(jīng)生長因子)、semaphorins(信號素)、印hrins和slits。見綜述Huber et al (2003)Annu Rev Neurosci 26:509-63。信號素(kma)，也稱作腦衰蛋白(collapsin)，屬于一大族在系統(tǒng)發(fā)生上保守的分泌性和膜結(jié)合性蛋白質(zhì)。信號素家族的成員能夠在神經(jīng)發(fā)育過程中介導驅(qū)除性和引誘性軸突導向事件。RapeH2000)Curr Opin Neurobiol 10:88-94。迄今為止鑒定的超過三十種信號素都享有大約500個氨基酸的保守化末端義！!^結(jié)構(gòu)域。信號素成員根據(jù)它們的結(jié)構(gòu)相似性和物種起源歸入八個亞家族。關(guān)于信號素統(tǒng)一命名法的更多詳情見kmaphorin NomenclatureCommittee(1999)Cell 97 :551_552。神經(jīng)纖毛蛋白/神經(jīng)菌毛素(neuropilin，NRP)家族由兩種同源蛋白質(zhì)構(gòu)成，神經(jīng)纖毛蛋白-I(NRPl)和神經(jīng)纖毛蛋白-2(NRP》。NRPl首先鑒定為在生長中的軸突的生長錐中表達的I型130kDa跨膜糖蛋白。NRP2隨后通過表達克隆得到鑒定。Fujisawa and Kitsukawa (1998) Curr Opin Neurobiol8 :587_592。發(fā)現(xiàn) NRP 是信號素的一個子集(即 3 類信號素)的受體。有人提出NRP與另一個信號素受體家族(即神經(jīng)叢素(plexin)) —起發(fā)揮非信號傳導性共同受體的功能。盡管最初描述為軸突導向的介導物，已發(fā)現(xiàn)NRP在血管發(fā)育中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。Carmeliet and Tessier-Lavigne (2005) 它被鑒定為在腫瘤和內(nèi)皮細胞上表達的同等型特異性VEGF受體，大大促進了對NRP在血管和腫瘤生物學中的作用的了解。Soker et al (1998)Cell 92 :735-745 ；Klagsbrun et al (2002)Adv Exp Med Biol 515:33-48。 遺傳研究提供了有力的證據(jù)來證明Nrpl是血管形態(tài)發(fā)生所要求的。Nrpl功能的喪失導致血管重塑和分支缺陷，這種表型可以因Nrp2功能喪失而進一步增強。Kawasaki等 (1999) Developmentl26 :4895-4902 ;Takashima 等 U002)Proc Natl Acad Sci USA 99: 3657-3662。這些結(jié)果說明在發(fā)育早期Nrpl和Nrp2可能具有重疊的功能。然而，每一種 Nrp的表達在發(fā)育晚期隔開，Nrpl主要在動脈中表達，而Nrp2主要在靜脈和淋巴管中表達。Yuan et al (2002)Development 129 :4797-4806 ；Herzog φ (2001)Mech Dev 109 115-119。注意，僅僅Nrp2功能的喪失特異性的削弱淋巴發(fā)育。因為Nrpl在發(fā)育過程中在許多其它細胞類型中表達，所以通過生成EC特異性敲除(其導致與無效等位基因中所看到的類似的血管缺陷)得出了血管Nrpl的作用。Gu等 (2003)Dev Cell 5 :45_57。有趣的是，此研究還顯示出kma3A與NRPl結(jié)合不是血管發(fā)育所要求的。在另一項研究中，在Nrpl敲除胚胎的發(fā)育中的后腦的內(nèi)皮頂端細胞的導向中觀察到缺陷。Gerhardt 等(2004)Dev Dyn 231 :503_509。盡管對NRPl在血管發(fā)育中的作用進行了廣泛研究，仍然不清楚NRPl是否是專門通過VEGF-VEGF受體2 (VEGFR2)途徑(作為VEGF結(jié)合VEGFR2的增強劑并由此作為VEGFR2 信號傳導的增強劑)或通過不依賴VEGFR2的信號傳導途徑或二者的組合來發(fā)揮其血管功能的。單克隆抗體可以使用重組DNA技術(shù)來制備。單克隆抗體得到了廣泛使用，特別是那些衍生自嚙齒類的單克隆抗體，然而非人抗體在人體中常常是抗原性的。本領(lǐng)域試圖通過構(gòu)建“嵌合”抗體來克服這個問題，在嵌合抗體中非人抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域與人恒定域偶聯(lián) (Cabilly等，美國專利No. 4，816，567)。人恒定域的同種型可以選擇成適合嵌合抗體參與抗體依賴性細胞的細胞毒性(ADCC)和補體依賴性細胞毒性的。在試圖解決抗體的抗原結(jié)合功能和將人抗體中異源序列的使用最小化的另一項努力中，對多種抗原生成了人源化抗體，其中基本上小于整個人可變域被來自非人物種的相應序列替代。例如，將嚙齒類殘基用于替代人抗體的相應區(qū)段。在實踐中，人源化抗體通常是這樣的人抗體，其中一些互補決定區(qū)(CDR)殘基及可能的一些框架區(qū)(FR)殘基用嚙齒類抗體中類似位點的殘基替代。Jones 等(1986)Nature 321 :522-525 ；Riechmann 等(1988)Nature 332 :323-327 ；Verhoeyen 等 (1988)Science239 :1534_1536。在對人施用治療性抗體之前，一般需要在非人哺乳動物中進行臨床前研究以評估抗體的療效和/或毒性。理想的是，進行這些研究的抗體能夠識別靶抗原并以高效力與靶抗原起作用，其中所述靶抗原對于宿主動物諸如小鼠或非人靈長類是內(nèi)源的。噬菌體展示技術(shù)提供了用于生成和選擇能與配體諸如抗原結(jié)合的新蛋白質(zhì)的有力工具。使用噬菌體展示技術(shù)，可以生成蛋白質(zhì)變體的大型文庫并快速分揀那些能以高親和力與靶抗原結(jié)合的序列。將編碼變異多肽的核酸與編碼病毒外殼蛋白諸如基因III蛋白或基因VIII蛋白的核酸序列融合。已經(jīng)開發(fā)了單價噬菌體展示系統(tǒng)，其中將編碼蛋白質(zhì)或多肽的核酸序列與編碼基因III蛋白一部分的核酸序列融合。(Bass，S. (1990)Proteins 8 309 ；Lowmanand Wells(1991)Methods :A Companion to Methods in Enzymology 3: 205)。在單價噬菌體展示系統(tǒng)中，基因融合物以低水平表達，而野生型基因III蛋白也表達，使得(病毒)顆粒的感染性得到保留。生成肽文庫和篩選那些文庫的方法已經(jīng)公開于許多專利(例如美國專利No. 5，723，286、美國專利No. 5，432，018、美國專利No. 5，580，717、 美國專利No. 5，427，908和美國專利No. 5，498，530)。證明肽在絲狀噬菌體表面上表達和功能性抗體片段在大腸桿菌周質(zhì)中表達對于開發(fā)噬菌體展示抗體文庫是重要的。(Smith等(1985):1315 ;Skerra and Pluckthun (1988) Science 240:1038)。已經(jīng)以多種方式制備了抗體或抗原結(jié)合多肽的文庫，包括通過插入隨機DNA序列來改變單一基因或者通過克隆一族相關(guān)基因。使用噬菌體展示來展示抗體或抗原結(jié)合片段的方法已經(jīng)記載于美國專利No. 5，750，373,5, 733，743、 5，837，242,5, 969，108,6, 172，197,5, 580，717 和 5，658，727。然后對文庫篩選具有期望特征的抗體或抗原結(jié)合蛋白的表達。噬菌體展示技術(shù)在制備具有期望特征的抗體方面相對于常規(guī)雜交瘤和重組方法具有數(shù)項優(yōu)勢。此技術(shù)容許以較少的時間、無需使用動物就開發(fā)出具有多樣序列的大型抗體文庫。雜交瘤的制備或人源化抗體的制備動則就需要數(shù)月制備。另外，由于不需要進行免疫，可以對有毒的或具有低抗原性的抗原生成噬菌體抗體文庫(Hogenboom(1988) Immunotechniques 4:1_20)。噬菌體抗體文庫還可用于生成和鑒定新的治療性抗體。噬菌體展示文庫已經(jīng)用于自經(jīng)免疫的、未免疫的人、種系序列、或未接觸抗原的 B 細胞 Ig 全集生成人抗體(Barbas&Burton(1996)Trends Biotechl4 :230 ；Griffiths 等 (1994)EMBO J. 13 :3245 ；Vaughan等(1996)Nat. Biotech. 14 :309 ；Winter EP 0368684B1)。 已經(jīng)使用多種淋巴樣組織生成了未接觸抗原的或非免疫性抗原結(jié)合文庫。這些文庫中的一些可以通過商業(yè)途徑購買，諸如那些由Cambridge Antibody ^Technology和Morphosys 開發(fā)的文庫(Vaughan 等(1996) Nature Biotech 14 :309 ;Knappik 等(1999) J. Mol. Biol. 296 57)。然而，這些文庫中的許多具有有限的多樣性。自噬菌體展示文庫中鑒定和分離高親和力抗體的能力在分離用于治療用途的新抗體中是重要的。自文庫中分離高親和力抗體依賴于文庫的容量、細菌細胞的生產(chǎn)效率、和文庫的多樣性。參見例如Knappik等(1999) J. Mol. Biol. 296 :57。由于抗體或抗原結(jié)合蛋白的不正確折疊和終止密碼子的存在，文庫的容量會因低效生產(chǎn)而縮小。如果抗體或抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域沒有得到正確折疊，那么在細菌細胞中的表達會受到抑制?？梢酝ㄟ^突變可變 /恒定界面的表面轉(zhuǎn)角中的殘基或選定的CDR殘基來提高表達。(Deng等(1994) J.Biol. Chem. 269 9533 ；Ulrich 等(1995)PNAS,92 :11907-11911 ；Forsberg 等(1997)J. Biol. Chem. 272:12430).在細菌細胞中生成噬菌體抗體文庫時，框架區(qū)的序列是提供正確折疊的一個因素。生成抗體或抗原結(jié)合蛋白的多樣性文庫對于分離高親和力抗體也是重要的。已經(jīng)使用多種方法生成了在有限CDR中具有多樣性的文庫。參見例如Tomlinson(2000)Nature Biotech. 18:989-994。⑶R3區(qū)是受關(guān)注的，部分因為常常發(fā)現(xiàn)它們參與抗原結(jié)合。重鏈上的CDR3區(qū)的長度、序列和結(jié)構(gòu)構(gòu)象變化極大。其他人也已經(jīng)通過在每個位置使用所有20種氨基酸來隨機化重鏈和輕鏈可變域 CDR區(qū)而產(chǎn)生了多樣性。認為使用所有20種氨基酸會產(chǎn)生變異抗體序列的大大多樣性并增加鑒定到新抗體的機會。(Barbas (1994) PNAS91 :3809 ；Yelton, DE (1995) J. Immunology 155 :1994 Jackson, J. R. (1995) J. Immunology 154 :3310 ；Hawkins, RE (1992) J. Mol. Biology 226 :889)。發(fā)明_既述本發(fā)明提供了新的抗NRPl抗體，其能夠調(diào)控至少一種神經(jīng)纖毛蛋白介導的生物學活性。優(yōu)選的是，所述抗NRPl抗體是能夠抑制至少一種神經(jīng)纖毛蛋白介導的生物學活性的拮抗性抗體。更具體的說，本發(fā)明提供了自設(shè)計的人合成抗體噬菌體文庫生成抗NRPl抗體的方法，及阻斷其所生成的抗NRPl抗體的新功能。本發(fā)明的抗NRPl抗體根據(jù)它們所結(jié)合的NRPl上的部位分成兩類抗NRPIa抗體(包括YW64. 3及其變體)，它們結(jié)合NRPl的CUB 結(jié)構(gòu)域(ala2)；和抗NRPIb抗體(包括YW107. 4及其變體)，它們結(jié)合NRPl的凝結(jié)因子V/ VIII 結(jié)構(gòu)域(blb2)。一方面，本發(fā)明的抗NRPIa抗體可選自表III所示“YW64”抗體克隆，它們具有經(jīng)鑒定的部分CDR序列和對鼠和人NRPl的結(jié)合親和力。本發(fā)明的抗NRPIa抗體優(yōu)選包含下述輕鏈可變域，所述輕鏈可變域包含以下⑶R氨基酸序列⑶RLl (RASQSISSYLA ；SEQ ID NO 123)、CDRL2 (GASSRAS ；SEQ ID NO :124)和 CDRL3 (QQYMSVPIT ；SEQ ID NO :125)。例如，抗 NRPIa抗體包含SEQ ID NO :3的輕鏈可變域序列。本發(fā)明的抗NRPIa抗體優(yōu)選包含下述重鏈可變域，所述重鏈可變域包含以下CDR氨基酸序列CDRH1 (GFSFSSEPIS ；SEQ ID NO :126)、 CDRH2 (SSITGKNGYTYYADSVKG ；SEQ ID NO :127)和 CDRH3 (WGKKVYGMDV ； SEQ ID NO :128)。例如，抗NRPIa抗體包含SEQ ID NO :4的重鏈可變域序列。更優(yōu)選的是，本發(fā)明的抗NRPIa抗體是包含SEQ ID NO 3的輕鏈可變域序列和SEQ ID NO 4的重鏈可變域序列的YW64. 3抗體。另一方面，本發(fā)明的抗NRPIb抗體可選自表IV所示“YW107. 4”抗體克隆，它們具有經(jīng)鑒定的部分⑶R序列和對鼠和人NRPl的結(jié)合親和力。本發(fā)明的抗NRPIb抗體優(yōu)選包含下述輕鏈可變域，所述輕鏈可變域包含以下⑶R氨基酸序列⑶RLl (RASQYFSSYLA ；SEQ ID NO :129)、CDRL2(GASSRAS ； SEQ ID NO :130)和 CDRL3 ^jQYLGSPPT ； SEQ ID NO :131)。例如，抗NRPIb抗體包含SEQ ID NO :5的輕鏈可變域序列。本發(fā)明的抗NRPIb抗體優(yōu)選包含下述重鏈可變域，所述重鏈可變域包含以下⑶R氨基酸序列⑶RHl (GFTFSSYAMS ； SEQ ID N0: 132)、CDRH2(SQISPAGGYTNYADSVKG ； SEQ ID NO :133)和 CDRH3 (ELPYYRMSKVMDV ； SEQ ID NO 134)。例如，抗NRPIb抗體包含SEQ ID NO :6的重鏈可變域序列。更優(yōu)選的是，本發(fā)明的抗NRPIb抗體是包含SEQ ID NO 5的輕鏈可變域序列和SEQ ID NO 6的重鏈可變域序列的 YW107. 4. 87 抗體。本發(fā)明還提供了抗NRPl抗體用于治療血管發(fā)生相關(guān)病癥諸如癌癥的用途。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的抗NRPl抗體與抗VEGF抗體聯(lián)合使用。優(yōu)選的是，所述抗VEGF抗體能夠與抗體A4. 6. 1結(jié)合相同的VEGF表位。更優(yōu)選的是，所述抗VEGF抗體是 bevacizumab (貝伐單抗)或ranibizumab (蘭尼單抗)。本發(fā)明涉及下述各項。1. 一種抗神經(jīng)纖毛蛋白-1 (NRPl)抗體，其能夠抑制至少一種神經(jīng)纖毛蛋白(NRP) 介導的生物學活性。2.項1的抗體，其能夠抑制NRPl與信號素的相互作用。3.項1的抗體，其能夠抑制NRPl與血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)的相互作用。4.項1的抗體，其在NRPl的ala2結(jié)構(gòu)域內(nèi)與NRPl結(jié)合，并阻斷NRPl與信號素的結(jié)合，但不阻斷NRPl與VEGF的結(jié)合。5.項4的抗體，其能夠抑制NRPl介導的血管發(fā)生。6.項4的抗體，其包含輕鏈可變域，該輕鏈可變域包含以下互補決定區(qū)(OTR)氨基酸序列CDRLl (RASQSISSYLA ;SEQ ID NO 123)、CDRL2 (GASSRAS ；SEQ ID NO :1 )禾口 CDRL3 (QQYMSVPIT ； SEQ ID NO :125)。7.項6的抗體，其包含SEQ ID NO 3的輕鏈可變域序列。8.項4的抗體，其包含重鏈可變域，該重鏈可變域包含以下⑶R氨基酸序列 CDRHl (GFSFSSEPIS ；SEQ ID NO 126)、CDRH2 (SSITGKNGYTYYADSVKG ;SEQ ID NO :127)和 CDRH3 (WGKKVYGMDV ； SEQ ID NO :128)。9.項8的抗體，其包含SEQ ID NO 4的重鏈可變域序列。10.項4的抗體，其是包含SEQ ID NO 3的輕鏈可變域序列和SEQ ID NO 4的重鏈可變域序列的YW64. 3抗體。11.項1的抗體，其在NRPl的blM結(jié)構(gòu)域內(nèi)結(jié)合NRP1，并阻斷NRPl與VEGF的結(jié)合，但不阻斷NRPl與信號素的結(jié)合。12.項11的抗體，其包含輕鏈可變域，該輕鏈可變域包含以下⑶R氨基酸序列CDRLl (RASQYFSSYLA ；SEQ ID NO 129)、CDRL2 (GASSRAS ;SEQ ID NO :130)禾口 CDRL3 ^jQYLGSPPT ； SEQ ID NO :131)。13.項12的抗體，其包含SEQ ID NO 5的輕鏈可變域序列。14.項11的抗體，其包含重鏈可變域，該重鏈可變域包含以下⑶R氨基酸序列 CDRHl (GFTFSSYAMS ；SEQ ID NO 132)、CDRH2 (SQISPAGGYTNYADSVKG ;SEQ ID NO :133)和 CDRH3 (ELPYYRMSKVMDV ； SEQ ID NO :134)。15.項14的抗體，其包含SEQ ID NO 6的重鏈可變域序列。16.項11的抗體，其是包含SEQ ID NO 5的輕鏈可變域序列和SEQ ID NO 6的重鏈可變域序列的YW107. 4. 87抗體。17.依照項1的抗體，其中所述抗體既能夠與鼠NRPl結(jié)合又能夠與人NRPl結(jié)合。18.依照項1的抗體，其中所述抗體是單克隆抗體。
19.依照項1的抗體，其中所述抗體是雙特異性抗體。20.依照項1的抗體，其中所述抗體是合成抗體。21.項1的抗NRPl抗體在制備用于在哺乳動物中治療或預防與病理性血管發(fā)生有關(guān)的病癥的藥物中的用途。22.項21的用途，其中所述病癥是癌癥。23.項22的用途，其中所述癌癥選自乳腺癌、結(jié)腸直腸癌、非小細胞肺癌、非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、腎癌、前列腺癌、肝癌、頭頸癌、黑素瘤、卵巢癌、間皮瘤、和多發(fā)性骨髓瘤。24.項23的用途，其中所述治療進一步包含第二治療劑。25.項M的用途，其中所述第二治療劑是選自下組的藥劑抗血管發(fā)生劑、抗腫瘤組合物、化療劑和細胞毒劑。26.項25的方法，其中所述抗血管發(fā)生劑是VEGF拮抗劑。27.項沈的方法，其中所述VEGF拮抗劑是抗hVEGF抗體。28.項27的方法，其中所述抗hVEGF抗體能夠與抗體A4. 6. 1結(jié)合相同的VEGF表位。29.項 28 的方法,其中所述抗 hVEGF 抗體是 bevacizumab 或 ranibizumab。30.項M的方法，其中所述第二治療劑是選自下組的受體酪氨酸激酶抑制劑 vatalanib (PTK787)、erlotinib (TARCEVA )、0SI-7904、ZD6474 (ZACTIMA )、 ZD6126 (ANG453)、ZD1839、sunitinib (SUTENT )、semaxanib (SU5416)、AMG706、 AG013736、Imatinib (GLEEVEC ). MLN-518,CEP-701,PKC-412,Lapatinib (GSK572016)、
VELCADE , AZD217U sorafenib (NEXAVAR ), XL880 和 CHIR165。附圖簡述

圖1圖示了抗NRPl抗體的結(jié)合特異性。(IA)抗NRPl抗體特異性結(jié)合人和鼠NRPl。 通過測試與hNRPl、mNRPl、hNRP2、mNRP2、ErbB2-ECD、或BSA包被的孔的結(jié)合來評估抗NRPl 抗體YW64. 3和YW107. 4IgG (10ug/ml)的結(jié)合特異性，并通過抗人IgG HRP偶聯(lián)物來檢測所結(jié)合的IgG。(IB)抗NRPl抗體YW64. 3和YW107. 4IgG的FACS分析，顯示了抗體對細胞表面NRPl蛋白(HUVEC)的結(jié)合能力。圖2圖示了抗NRPl抗體YW107. 4及其親和力成熟變體YW107. 4. 87 (抗NRPIb)的結(jié)合特性。(2A)親和力成熟的YW107. 4. 87變體的BIAcore動力學分析。(2B) Yff 107. 4 ^P YW107. 4. 87IgG的FACS分析，顯示了親和力成熟變體YW107. 4. 87對細胞表面NRPl蛋白 (HUVEC)改進的結(jié)合。圖 3A 和圖;3B 顯示了 YW 64. 3 (抗 NRPIa)和 YW107. 4. 87 (抗 NRPIb)的可變區(qū)序列，列出了 h4D5的序列作為參照。編號方式基于Kabat數(shù)據(jù)庫。CDR序列在框區(qū)中。(3A) h4D5 (SEQ ID N0:1)、YW 64. 3 (SEQ ID NO :3)和 YW107. 4. 87 (SEQ ID NO :5)的輕鏈可變區(qū)序列。(3B)h4D5(SEQ ID NO :2)、YW 64. 3 (SEQ ID NO :4)和 YW107. 4. 87 (SEQ ID NO :6)的
重鏈可變區(qū)序列。圖4描繪了抗NRPl抗體對VEGF165結(jié)合NRPl的阻斷。圖5描繪了 kma3A誘導的DRG塌陷(5A)和kma3F誘導的海馬塌陷測定法(5B)的定量?？筃RPIa顯示出特異性阻斷kma3A誘導的DRG神經(jīng)元生長錐塌陷，而非kma3F誘導的海馬神經(jīng)元生長錐塌陷。圖6圖示了抗NRPl抗體能夠在體外抑制VEGF誘導的HUVEC遷移和發(fā)芽。(6A)遷移測定法的定量(每種條件的η = 6)。*p = 0. 00003 ；**ρ = 9. 9xl(T" ；Student氏t檢驗。(6B)珠發(fā)芽測定法的定量，每種條件η = 12-14粒珠。圖7圖示了抗NRPl抗體對發(fā)育中小鼠視網(wǎng)膜中的血管重塑的體內(nèi)抑制效果。(7Α) 出生后第5天(PQ至Ρ8的血管發(fā)育的圖示。血管以同中心模式向視網(wǎng)膜邊緣延伸。視神經(jīng)乳頭(ONH)位于視網(wǎng)膜的中央；(7Β) ONH附近的血管重塑發(fā)生于Ρ5與Ρ8之間；(7C)進入視網(wǎng)膜更深層的血管發(fā)芽的圖示。血管向外網(wǎng)層(OPL)發(fā)芽延伸并形成叢。稍晚的發(fā)芽發(fā)生在NFL和OPL之間，最終產(chǎn)生內(nèi)網(wǎng)層(IPL) ； (7D)血管密度的定量；每種條件4個受處理視網(wǎng)膜的12幅代表性圖像的總像素計數(shù)。*p = 0. 006 ；< 0. 0001 ；Student氏t檢驗； (7E)血管延伸的定量，通過自O(shè)NH至血管系統(tǒng)邊緣的距離相對于自O(shè)NH至視盤凹陷的距離的比率來測量。自4只受處理視網(wǎng)膜采集12次代表性測量。圖8描繪了抗NRPl抗體對VEGF誘導的血管通透性、HUVEC增殖、VEGFR2磷酸化和VEGFR2下游信號傳導的影響。(8A)小鼠皮膚血管通透性測定法的定量。所示數(shù)值是6 次獨立實驗的平均值(抗NRPIa為ρ = 0. 69，抗NRPIb為ρ = 0. 989) ； (8B)有或無VEGF時 HUVEC增殖的定量(每種條件為η = 5) ； (SC)HUVEC中使用識別總VEGFR2或酪氨酸磷酸化VEGFR2的抗體通過ELISA測定法檢測出的VEGFR2磷酸化水平。抗NRPIa處理細胞中的 VEGFR2磷酸化水平與對照組沒有顯著差異(ρ = 0. 133)。*p = 0. 00017 ；Student氏t檢驗；(SD)HUVEC溶胞物的免疫印跡分析。將細胞用指定抗體處理，接著與VEGF—起溫育。圖9圖示了抗NRPl抗體(單獨的或聯(lián)合抗VEGF的)在多種異種移植物腫瘤模型中的腫瘤生長抑制效果。(9A-C)分別為SK-MES-1、H1299和Fo5腫瘤模型的平均腫瘤體積圖。(9D) SK-MES-I 腫瘤模型的 Kaplan-Meier 圖。圖10顯示了抗NRPl抗體(單獨的或聯(lián)合抗VEGF的)在Fo5腫瘤模型中的血管效應。(IOA)平均血管密度(通過凝集素灌注來測量)；每種條件3-4個受處理腫瘤的總像素計數(shù)。(IOB)平均周細胞密度(通過PDGFRii染色來測量)。(IOC)周細胞/血管比率， 測量相對周細胞覆蓋。圖11圖示了 NRPl和VEGF抑制對血管重塑的疊加效應。IlA呈現(xiàn)了這樣一種模型，其中在新形成的血管中阻斷NRPl功能抑制血管發(fā)生重塑和后續(xù)成熟，使得血管的存活依賴于VEGF。IlB顯示了存在抗NRP1B、抗VEGF或其組合時新生小鼠視網(wǎng)膜中的平均血管密度變化。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及用于調(diào)控NRP介導的生物學活性的新組合物和方法。定義“神經(jīng)纖毛蛋白/神經(jīng)菌毛素(neuropilin) ”或NRP指神經(jīng)纖毛蛋白_1 (NRPl)、神經(jīng)纖毛蛋白_2(NRP2)及其同等型(isoform)和變體全體，如Rossignol等Q000)Genomics 70 :211-222中所述。神經(jīng)纖毛蛋白是120-130kDa非酪氨酸激酶受體。有多種NRP-I和 NRP-2剪接變體和可溶性同等型。神經(jīng)纖毛蛋白的基本結(jié)構(gòu)包含五個結(jié)構(gòu)域三個胞外結(jié)構(gòu)域(ala2、blb2和c)、一個跨膜結(jié)構(gòu)域、和一個胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。ala2結(jié)構(gòu)域與補體成分
10Clr和Cls(CUB)同源，其一般包含四個半胱氨酸殘基，形成兩個二硫鍵。blM結(jié)構(gòu)域與凝結(jié)因子V和VIII同源。c結(jié)構(gòu)域的中央部分稱為MAM，因為它與跨膜肽酶(meprin)、A5和受體酪氨酸磷酸酶μ蛋白同源。ala2和bll32結(jié)構(gòu)域負責配體結(jié)合，而c結(jié)構(gòu)域?qū)τ谕投刍虍愋投刍侵陵P(guān)重要的。Gu等(2002) J. Biol. Chem. 277 :18069-76 ；He and Tessier-Lavigne(1997)Cell90 :739-51。“神經(jīng)纖毛蛋白介導的生物學活性” 一般指其中神經(jīng)纖毛蛋白-1和/或神經(jīng)纖毛蛋白-2發(fā)揮重大作用的生理性或病理性事件。此類活性的非限制性例子有胚胎神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育或神經(jīng)元再生、血管發(fā)生(包括血管造型)、腫瘤發(fā)生和腫瘤轉(zhuǎn)移過程中的軸突導向。術(shù)語“抗體”以最廣義使用，明確覆蓋單克隆抗體(包括全長單克隆抗體)、多克隆抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、及抗體片段，只要它們展現(xiàn)出期望的生物學活性。術(shù)語“單克隆抗體”在用于本文時指從一群基本上同質(zhì)的抗體獲得的抗體，即構(gòu)成群體的各抗體個體是相同的，除了可以以極小量存在的可能的天然存在突變形式外。單克隆抗體是高度特異性的，針對單一抗原性位點。此外，與典型的包含針對不同決定簇(表位)的不同抗體的常規(guī)(多克隆)抗體制備物不同，每種單克隆抗體針對抗原上的單一決定簇。修飾語“單克隆”指示抗體從基本上同質(zhì)的抗體群獲得的特征，不應解釋為要求通過任何特定方法來生成抗體。例如，將依照本發(fā)明使用的單克隆抗體可通過最初由Kohler 等(197 Nature 256 :495記載的雜交瘤方法來制備，或者可通過重組DNA方法來制備(參見例如美國專利No. 4，816，567)?！皢慰寺】贵w”還可使用例如Clackson等(1991) Nature 352 :6M-628和Marks等(1991) J. Mol. Biol. 222 :581-597中記載的技術(shù)從噬菌體抗體庫分離。 單克隆抗體在本文中明確包括“嵌合”抗體(免疫球蛋白)，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與衍生自特定物種或?qū)儆谔囟贵w類別或亞類的抗體中的相應序列相同或同源，而鏈的剩余部分與衍生自另一物種或?qū)儆诹硪豢贵w類別或亞類的抗體中的相應序列相同或同源，以及此類抗體的片段，只要它們展現(xiàn)出期望的生物學活性(美國專利No. 4，816，567 ； Morrison 等(1984)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 :6851-6855)。非人(例如鼠)抗體的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗體。在極大程度上，人源化抗體指人免疫球蛋白(受體抗體)中的高變區(qū)殘基用具有期望特異性、親和力和能力的非人物種(供體抗體)諸如小鼠、大鼠、兔或非人靈長類動物的高變區(qū)殘基替換的免疫球蛋白。在有些情況中，將人免疫球蛋白的Fv框架區(qū) (FR)殘基用相應的非人殘基替換。此外，人源化抗體可包含在受體抗體中或在供體抗體中沒有找到的殘基。進行這些修飾是為了進一步改進抗體的性能。一般而言，人源化抗體將包含至少一個、通常兩個基本上整個如下的可變域，其中所有或基本上所有高變環(huán)對應于非人免疫球蛋白的高變環(huán)，且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗體任選還將包含至少部分免疫球蛋白恒定區(qū)(Fe)，通常是人免疫球蛋白的恒定區(qū)。更多細節(jié)參見 Jones 等(1986)Nature321 :522-525 ；Riechmann 等(1988)Nature 332 :323-329 ； Presta (1992) Curr. Op. Struct. Biol. 2 :593_596?！拔锓N依賴性抗體”指對來自第一哺乳動物物種的抗原的結(jié)合親和力強于對來自第二哺乳動物物種的該抗原同系物的親和力的抗體。通常，物種依賴性抗體“特異性結(jié)合”人抗原(即結(jié)合親和力(Kd)數(shù)值不超過大約1x10_7M，優(yōu)選不超過大約Ix 10_8M，且最優(yōu)選不超過大約Ix 10_9M)，但是對來自第二非人哺乳動物物種的該抗原同系物的結(jié)合親和力比對人抗原的結(jié)合親和力弱至少大約50倍、或至少大約500倍、或至少大約1000倍。物種依賴性抗體可以是上文所定義的各種類型抗體中的任一種，但是優(yōu)選人源化抗體或人抗體。在用于本文時，“抗體突變體”或“抗體變體”指物種依賴性抗體的氨基酸序列變體，其中物種依賴性抗體的一個或多個氨基酸殘基發(fā)生了修飾。此類突變體與物種依賴性抗體必然具有小于100 %的序列同一性或相似性。在一個優(yōu)選的實施方案中，抗體突變體所具有的氨基酸序列與物種依賴性抗體的重鏈或輕鏈可變域的氨基酸序列具有至少75%、更優(yōu)選至少80%、更優(yōu)選至少85%、更優(yōu)選至少90%、最優(yōu)選至少95%的氨基酸序列同一性或相似性。關(guān)于此序列的同一性或相似性在本文中定義為在比對序列并在必要時引入缺口以實現(xiàn)最大百分比序列同一性后，候選序列中與物種依賴性抗體殘基相同(即相同殘基) 或相似(即根據(jù)共同側(cè)鏈特性來自同一組的氨基酸殘基，見下文)的氨基酸殘基的百分比。 N-末端、C-末端、或內(nèi)部的延伸、刪除、或插入可變域以外的抗體序列都不應視為影響序列同一性或相似性?！胺蛛x的”抗體指已經(jīng)鑒定且自其天然環(huán)境的一種成分分開和/或回收的抗體。其天然環(huán)境的污染性成分指將會干擾該抗體的診斷或治療用途的物質(zhì)，可包括酶、激素、和其它蛋白質(zhì)性質(zhì)或非蛋白質(zhì)性質(zhì)的溶質(zhì)。在優(yōu)選的實施方案中，將抗體純化至(1)根據(jù)Lowry 法的測定，抗體重量超過95%，最優(yōu)選重量超過99%，(2)足以通過使用轉(zhuǎn)杯式測序儀獲得至少15個殘基的N-末端或內(nèi)部氨基酸序列的程度，或C3)根據(jù)還原性或非還原性條件下的SDS-PAGE及使用考馬斯藍或優(yōu)選的銀染色，達到同質(zhì)。既然抗體天然環(huán)境的至少一種成分不會存在，那么分離的抗體包括重組細胞內(nèi)的原位抗體。然而，分離的抗體通常將通過至少一個純化步驟來制備。在用于本文時，“抗體可變域”指抗體分子的輕鏈和重鏈中包含互補決定區(qū)(CDR ； 即⑶R1、⑶R2、和⑶舊)和框架區(qū)(FR)氨基酸序列的那部分。V1^g重鏈可變域。\指輕鏈可變域。依照本發(fā)明所使用的方法，歸為⑶R和FR的氨基酸位置可以依照Kabat (Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health，Bethesda， Md.，1987和1991))來限定。。抗體或抗原結(jié)合片段的氨基酸編號方式也依照Kabat。在用于本文時，術(shù)語“互補決定區(qū)(⑶R ；即⑶R1、⑶R2、和⑶R3)指抗體可變域中其存在是抗原結(jié)合所必需的氨基酸殘基。每個可變域通常具有三個CDR，鑒定為CDRl、 ⑶R2和⑶R3。每個互補決定區(qū)可以包含來自如Kabat定義的“互補決定區(qū)”的氨基酸殘基(即大約是輕鏈可變域的殘基對-34仏1)、50-56(1^)和89-97 (U)及重鏈可變域的殘基 31-35(HI)、50_65(H2)和 95-102(H3) ；Kabat 等，Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))和/或來自“高變環(huán)”的殘基(即大約是輕鏈可變域的殘基洸-32 (Li)、50-52 (L2)和 91-96 (L3)及重鏈可變域的殘基洸_32 (Hl)、53-55 (H2)和 96-101 (H3) ；Chothia and Lesk(1987) J. Mol. Biol. 196 :901-917)。在有些情況中，互補決定區(qū)可以包含來自Kabat定義的⑶R和高變環(huán)二者的氨基酸。例如，抗體4D5重鏈的⑶RHl 包含氨基酸26-35。“框架區(qū)”(以下的FR)指可變域中CDR殘基以外的殘基。每個可變域通常具有四個FR，鑒定為FR1、FR2、FR3和FR4。如果CDR是依照Kabat定義的，那么輕鏈FR殘基位于大約輕鏈殘基 1-23 (LCFRl)、35-49 (LCFR2)、57-88 (LCFR3)、和 98-107 (LCFR4)，而重鏈 FR 殘基位于大約重鏈殘基 1-30 (HCFRl) ,36-49 (HCFR2)、66_94 (HCFR3)、和 103-113 (HCFR4)。如果⑶R包含來自高變環(huán)的氨基酸殘基，那么輕鏈FR殘基位于大約輕鏈殘基1-25 (LCFRl)、 33-49 (LCFR2)、53-90 (LCFR3)、和97-107 (LCFR4)，而重鏈FR殘基位于大約重鏈殘基 1-25 (HCFRl)、33-52 (HCFR2)、56-95 (HCFR3)、和 102-113 (HCFR4)。在有些情況中，在 CDR 包含來自Kabat定義的⑶R和高變環(huán)二者的氨基酸時，F(xiàn)R殘基將做相應的調(diào)整。例如，當 CDRHl包含氨基酸! 6-Η35時，重鏈FRl殘基位于1_25位，而FR2殘基位于36-49位。在用于本文時，“密碼子集”指用于編碼期望變異氨基酸的一套不同核苷酸三聯(lián)體序列?？梢酝ㄟ^例如固相合成來合成一套寡核苷酸，其包括呈現(xiàn)密碼子集所提供的核苷酸三聯(lián)體的所有可能組合并編碼期望氨基酸組的序列。一種標準形式的密碼子命名是ira 代碼，其是本領(lǐng)域已知的且在本文中有記載。密碼子集通常以3個斜體大寫字母表示，例如 NNK、NNS、XYZ、DVK等等。如此，“非隨機密碼子集”在用于本文時指編碼部分、優(yōu)選完全滿足本文所述氨基酸選擇標準的選定氨基酸的密碼子集。在某些位置具有選定核苷酸“簡并性” 的寡核苷酸的合成是本領(lǐng)域眾所周知的，例如TRIM法(Knappek等(1999) J. Mol. Biol. 296 57-86) ；Garrard&Henner (1993)Gene 1 :103)。此類具有某些密碼子集的寡核苷酸集可以使用商品化核酸合成儀來合成(可購自例如Applied Biosystems,Foster City，CA)，或者可以通過商業(yè)途徑獲得(例如購自Life Technologies, Rockville, MD)。因此，一套具有特定密碼子集的合成寡核苷酸通常包括具有不同序列(在整個序列中由密碼子集所建立的差異)的多種寡核苷酸。寡核苷酸，在依照本發(fā)明使用時，具有容許與可變域核酸模板雜交的序列，而且還可以但非必須包含可用于例如克隆目的的限制酶位點?！癋v”片段是包含完整抗原識別和結(jié)合位點的抗體片段。此區(qū)由緊密結(jié)合(該結(jié)合的本質(zhì)可以是共價的，例如在scFv中)的一個重鏈可變域和一個輕鏈可變域的二聚體組成。正是在這種構(gòu)造中，每個可變域的三個⑶R相互作用而在二聚體表面上確定了一個抗原結(jié)合位點。六個CDR或其子集共同賦予抗體以抗原結(jié)合特異性。然而，即使是單個可變域(或只包含對抗原特異性的三個CDR的半個Fv)也具有識別和結(jié)合抗原的能力，只是通常親和力低于完整結(jié)合位點?！癋ab”片段包含輕鏈的可變域和恒定域及重鏈的可變域和第一恒定域(CHl)。 F(ab' )2抗體片段包含一對Fab片段，這對Fab片段一般通過它們之間的鉸鏈半胱氨酸在它們羧基末端附近共價連接。本領(lǐng)域還知道抗體片段的其它化學偶聯(lián)形式?！皢捂淔v”或“scFv”抗體片段包含抗體的Vh和\結(jié)構(gòu)域，其中這些結(jié)構(gòu)域存在于一條多肽鏈上。一般而言，F(xiàn)v多肽在Vh與\結(jié)構(gòu)域之間還包含多肽接頭，使得scFv能夠形成結(jié)合抗原所需的結(jié)構(gòu)。關(guān)于scFv的綜述參見Pluckthun，在Rosenburg and Moore編的《The Pharmacology of Monoclonal Antibodies》第 113 卷中，Springer-Verlag, New York,pp.269-315(1994)。術(shù)語“雙抗體”指具有兩個抗原結(jié)合位點的小型抗體片段，該片段在同一條多肽鏈(Vh及VJ中包含相連的重鏈可變域(Vh)和輕鏈可變域(\)。通過使用過短的接頭使得同一條鏈上的兩個結(jié)構(gòu)域之間不能配對，迫使這些結(jié)構(gòu)域與另一條鏈的互補結(jié)構(gòu)域配對，從而產(chǎn)生兩個抗原結(jié)合位點。雙抗體更完整的記載于例如EP 404, 097 ；WO 93/11161 ；Hollinger 等(1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :6444-6448 表述“線性抗體”指^ipata 等(1995) Protein Eng, 8 (10) :1057-1062 中所描述的抗體。簡言之，這些抗體包含一對串聯(lián)的Fd區(qū)段(Vh-ChI-Vh-ChI),該區(qū)段與互補的輕鏈多肽一起形成一對抗原結(jié)合區(qū)。線性抗體可以是雙特異性的，或者是單特異性的。在用于本文時，“文庫”或“庫”指眾多抗體或抗體片段序列(例如本發(fā)明的多肽)， 或者編碼這些序列的核酸，這些序列在根據(jù)本發(fā)明方法導入這些序列的變異氨基酸組合方面是不同的?！笆删w展示”是一種將變異多肽作為與外殼蛋白至少一部分的融合蛋白展示在噬菌體(例如絲狀噬菌體)顆粒表面上的技術(shù)。噬菌體展示的效用在于能夠?qū)﹄S機化蛋白質(zhì)變體的大型文庫快速且高效分選那些能以高親和力與靶抗原結(jié)合的序列的實情。肽和蛋白質(zhì)文庫在噬菌體上的展示已經(jīng)用于對數(shù)以百萬計的多肽篩選那些具有特異性結(jié)合特性的多肽。多價噬菌體展示法已經(jīng)用于展示小隨機肽和小蛋白，其通過與絲狀噬菌體的基因 III 或基因 VIII 融合來實現(xiàn)。Wells and Lowman(1992)Curr. Opin. Struct. Biol. 3 355-362，及其中引用的參考文獻。在單價噬菌體展示中，將蛋白質(zhì)或肽文庫與基因III或其一部分融合，并在存在野生型基因III蛋白時以低水平表達，使得噬菌體顆粒展示一個拷貝的融合蛋白或者不展示融合蛋白。親合效應(avidity effect)相對于多價噬菌體得到了降低，使得分選基于內(nèi)在的配體親和力，而且使用噬菌粒載體，這簡化了 DNA操作。Lowman and Wells(1991)Methods :A companion to Methods in Enzymology 3 :205_0216o“噬菌?！笔蔷哂屑毦鷱椭破瘘c(例如ColEl)和一個拷貝的噬菌體基因區(qū)間的質(zhì)粒載體。噬菌?？衫萌魏我阎删w，包括絲狀噬菌體和λ類噬菌體。質(zhì)粒一般也包含抗生素抗性的可選擇標志物?？寺∪脒@些載體的DNA區(qū)段可以像質(zhì)粒一起而擴增。在給容納這些載體的細胞提供生成噬菌體顆粒所必需的所有基因時，質(zhì)粒的復制模式變成滾環(huán)復制，以生成質(zhì)粒DNA的一條鏈的拷貝，并包裝噬菌體顆粒。噬菌粒可形成感染性或非感染性噬菌體顆粒。此術(shù)語包括這樣的噬菌粒，它們包含與異源多肽基因連接成基因融合物的噬菌體外殼蛋白基因或其片段，使得異源多肽展示在噬菌體顆粒的表面上。術(shù)語“噬菌體載體”指包含異源基因且能夠復制的雙鏈復制型噬菌體。噬菌體載體具有容許噬菌體復制和噬菌體顆粒形成的噬菌體復制起點。噬菌體優(yōu)選是絲狀噬菌體，諸如M13、fl、fd、Pf3噬菌體或其衍生物，或者是λ類噬菌體，諸如λ、21、φ80、φ81、82、 似4、4；34等或其衍生物。在用于本文時，“溶劑可及位置”指源抗體或抗原結(jié)合片段重鏈和輕鏈可變區(qū)中根據(jù)抗體或抗原結(jié)合片段的結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)系綜(ensemble)和/或建模結(jié)構(gòu)確定為潛在觸及溶劑和/或接觸分子(諸如抗體特異性抗原)的氨基酸殘基位置。這些位置通常發(fā)現(xiàn)于CDR 中和蛋白質(zhì)外部上。如本文所定義的抗體或抗原結(jié)合片段的溶劑可及位置可使用本領(lǐng)域已知的多種算法來確定。優(yōu)選的是，溶劑可及位置是使用來自抗體三維模型的坐標而確定的， 優(yōu)選使用計算法程序，諸如hsightll程序(Accelrys，San Diego, CA)。溶劑可及位置還可以使用本領(lǐng)域已知的算法來確定(例如Lee and Richards (1971) J. Mol. Biol. 55，379和 Connolly (1983) J. App 1. Cryst. 16,548)。溶劑可及位置的確定可使用適于蛋白質(zhì)建模的軟件和自抗體得到的三維結(jié)構(gòu)信息來進行?？捎糜谶@些目的的軟件包括STOl Biopolymer Module軟件(Tripos Associates)。一般和優(yōu)選的是，若算法(程序)要求用戶輸入大小參數(shù)，計算中所使用的探針的“大小”設(shè)為半徑大約1.4?；蚋　Ａ硗?，Pacios (1994) Comput. Chem. 18(4) :377-386記載了使用供個人計算機用的軟件確定溶劑可及區(qū)域和面積的方法?！把馨l(fā)生因子”或“血管發(fā)生劑”指刺激血管發(fā)育，例如促進血管發(fā)生 (angiogenesis)、內(nèi)皮細胞生長、血管穩(wěn)定性和/或血管生成(vasculogenesis)等的生長因子。例如，血管發(fā)生因子包括但不限于例如VEGF和VEGF家族的成員、P1GF、PDGF 家族、成纖維細胞生長因子家族(FGF)、TIE配體(血管生成素)、印hrin、Del-l、酸性 (aFGF)和堿性(bFGF)成纖維細胞生長因子、卵泡抑素(Follistatin)、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、肝細胞生長因子(HGF)/散射因子(SF)、白介素-8(IL-8)、L印tiruMidkine、 神經(jīng)纖毛蛋白、胎盤生長因子、血小板衍生內(nèi)皮細胞生長因子(PD-ECGF)、血小板衍生生長因子尤其是 PDGF-BB 或 PDGFR-β、Pleiotrophin (PTN)、Progranulin, Proliferin、轉(zhuǎn)化生長因子-α (TGF-α)、轉(zhuǎn)化生長因子-β (TGF-β)、腫瘤壞死因子-α (TNF-α)等。它還包括加速傷口愈合的因子，諸如生長激素、胰島素樣生長因子-I (IGF-I)、VIGF、表皮生長因子(EGF)、CTGF及其家族的成員、及TGF-α和TGF-β。參見例如Klagsbrun and D’ Amore (1991)Annu. Rev. Physiol. 53 :217-39 ；Streit and Detmar (2003)Oncogene 22 3172-3179 ;Ferrara&Alitalo(1999)Nature Medicine 5(12) :1359-1364 ；Tonini 等 (2003) Oncogene 22 :6549-6556 (例如列舉已知血管發(fā)生因子的表 1) ；Sato (2003) Int. J. Clin. Oncol. 8 :200_206?！翱寡馨l(fā)生劑”或“血管發(fā)生抑制劑”指或直接或間接抑制血管發(fā)生 (angiogenesis)、血管生成(vasculogenesis)、或不想要的血管通透性的小分子量物質(zhì)、 多核苷酸、多肽、分離的蛋白質(zhì)、重組蛋白、抗體、或其偶聯(lián)物或融合蛋白。應當理解，抗血管發(fā)生劑包括那些結(jié)合并阻斷血管發(fā)生因子或其受體的血管發(fā)生活性的藥劑。例如，抗血管發(fā)生劑是上文定義的血管發(fā)生劑的抗體或其它拮抗劑，例如VEGF-A的抗體、VEGF-A 受體(例如KDR受體或Flt-I受體)的抗體、抗PDGFR抑制劑諸如Gleevec (Imatinib Mesylate)。抗血管發(fā)生劑還包括天然血管發(fā)生抑制劑，例如血管他丁(angiostatin)、內(nèi)皮他丁 (endostatin)等。參見例如 Klagsbrun and D' Amore (1991) Annu. Rev. Physiol. 53 217-39 ；Streit and Detmar (2003) 0ncogene22 :3172-3179 (例如列舉惡性黑素瘤中抗血管發(fā)生療法的表 3) ；Ferrara&Alitalo (1999) Nature Medicine 5(12) 1359-1364 ;Tonini 等 (2003) 0ncogene22 :6549-6556 (例如列舉已知抗血管發(fā)生因子的表2) ；Sato (2003) Int. J Clin. Oncol. 8 :200-206 (例如列舉臨床試驗中所使用的抗血管發(fā)生劑的表1)。術(shù)語“VEGF”和“VEGF-A”在用于本文時指165個氨基酸的人血管內(nèi)皮細胞生長因子及相關(guān)的121個、189個和206個氨基酸的人血管內(nèi)皮細胞生長因子，如Leung等(1989) Science 246 :1306 和 Houck 等(1991)Mol. Endocrin，5 :1806 所述，及其天然存在等位基因形式和加工形式。術(shù)語“VEGF”還指來自非人物種諸如小鼠、大鼠或靈長類動物的VEGF。 有時，來自特定物種的VEGF表示如下，hVEGF表示人VEGF，mVEGF表示鼠VEGF，等等。術(shù)語“VEGF”還用于指包含165個氨基酸的人血管內(nèi)皮細胞生長因子的氨基酸第8-109位或第1-109位的截短形式多肽。本申請中可能通過例如“VEGF(8-109) "VEGF(1-109)，，或 "VEGF165”來鑒別任何此類形式VEGF。“截短的”天然VEGF的氨基酸位置如天然VEGF序列中所示編號。例如，截短的天然VEGF中的第17位氨基酸(甲硫氨酸)也是天然VEGF中的第17位(甲硫氨酸)。截短的天然VEGF具有與天然VEGF相當?shù)膶DR和Flt-I受體的結(jié)合親和力?！癡EGF抗體”指以足夠親和力和特異性結(jié)合VEGF的抗體。優(yōu)選的是，本發(fā)明的抗 VEGF抗體可在靶向和干預其中牽涉VEGF活性的疾病或疾患時用作治療劑?？筕EGF抗體通常不會結(jié)合其它VEGF同系物，諸如VEGF-B或VEGF-C，也不會結(jié)合其它生長因子，諸如 P1GF、PDGF或bFGF。一種優(yōu)選的抗VEGF抗體是與雜交瘤ATCC HB 10709所生成的單克隆抗VEGF抗體A4. 6. 1結(jié)合相同表位的單克隆抗體。更優(yōu)選的是，抗VEGF抗體是依照I^resta 等，Cancer Res. 57 :4593-4599 (1997)生成的重組人源化抗VEGF單克隆抗體，包括但不限于稱為bevacizumab (貝伐單抗；BV ；Avastin )的抗體?？筕EGF 抗體 “Bevacizumab (貝伐單抗，BV) ”，也稱為 “rhuMAb VEGF” 或 “Avastin ’’,是依照 I^resta 等，Cancer Res. 57 :4593-4599(1997)生成的重組人源化抗 VEGF單克隆抗體。它包含突變的人IgGl框架區(qū)和來自阻斷人VEGF結(jié)合其受體的鼠抗 hVEGF單克隆抗體A4. 6. 1的抗原結(jié)合互補決定區(qū)。貝伐單抗(Bevacizumab)大約93%的氨基酸序列，包括大部分框架區(qū)，衍生自人IgGl，而大約7 %的序列衍生自鼠抗體A4. 6. 1。 貝伐單抗(Bevacizumab)具有約149，000道爾頓的分子量且是糖基化的?！癡EGF拮抗劑”指能夠中和、阻斷、抑制、消除、降低或干擾VEGF活性，包括其與一種或多種VEGF受體的結(jié)合的分子。VEGF拮抗劑包括抗VEGF抗體及其抗原結(jié)合片段、特異性結(jié)合VEGF由此使其隔絕與一種或多種受體結(jié)合的受體分子及衍生物、抗VEGF受體抗體和VEGF受體拮抗劑諸如VEGFR酪氨酸激酶的小分子抑制劑。“治療”指治療性處理和預防性或防范性措施二者。需要治療的受試者包括早就患有病癥的受試者以及要預防病癥的受試者?！安“Y”指任何會受益于抗體治療的疾患。例如，患有或需要預防異常血管發(fā)生(過度的、不當?shù)幕蚴Э氐难馨l(fā)生)或血管通透性的哺乳動物。這包括慢性和急性病癥或疾病，包括那些使哺乳動物傾向于所討論病癥的病理狀況。本文中待治療的病癥的非限制性例子包括惡性和良性腫瘤；非白血病和淋巴樣惡性腫瘤；神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)、星細胞、下丘腦和其它腺體、巨噬細胞、上皮、基質(zhì)和囊胚腔病癥；及炎性、血管發(fā)生性和免疫學病癥。異常血管發(fā)生發(fā)生于病情中的或引起病情的新血管生長過度、不足或不當(例如從醫(yī)學觀點看不良的血管發(fā)生位置、時間或啟動)時。過度的、不當?shù)幕蚴Э氐难馨l(fā)生發(fā)生于有促成病情惡化或引起病情的新血管生長時，諸如癌癥尤其是血管化實體瘤和轉(zhuǎn)移瘤(包括結(jié)腸癌、肺癌(尤其是小細胞肺癌、或前列腺癌)，由眼部新血管形成引起的疾病尤其是糖尿病性失明、視網(wǎng)膜病變、原發(fā)性糖尿病性視網(wǎng)膜病變(primarily diabetic retinopathy)或年齡相關(guān)黃斑變性(AMD)，銀屑病、銀屑病關(guān)節(jié)炎、成血管細胞瘤諸如血管瘤；炎性腎病，諸如腎小球腎炎，尤其是膜增生性腎小球腎炎、溶血性尿毒綜合征(haemolytic uremic syndrome)、糖尿病腎病或高血壓腎硬化；各種炎性疾病，諸如關(guān)節(jié)炎，尤其是類風濕性關(guān)節(jié)炎、炎性腸病、銀屑病、結(jié)節(jié)病、動脈硬化和移植后發(fā)生的疾病、 子宮內(nèi)膜異位癥或慢性哮喘，及超過70種其它疾患。新血管可供應患病組織，破壞正常組織，而且，在癌癥的情況中，新血管可容許腫瘤細胞逃入循環(huán)并停留在其它器官中(腫瘤轉(zhuǎn)移)。不足的血管發(fā)生發(fā)生于有不當血管生長促成病情惡化時，例如在諸如冠狀動脈疾病、 中風和傷口愈合遲緩的疾病中。此外，潰瘍、中風和心臟病發(fā)作可源自沒有自然愈合通常要求的血管發(fā)生。本發(fā)明設(shè)想了治療那些有風險發(fā)生上述疾病的患者。作為接受本發(fā)明抗體或多肽的候選者的其他患者具有或者有風險發(fā)生維管組織異常增殖、酒渣鼻(紅斑痤瘡)、獲得性免疫缺陷綜合征、動脈阻塞、特應性角膜炎、細菌性潰瘍、貝切特氏病(Bechets disease)、血液傳播的腫瘤(blood borne tumor)、頸動脈阻塞性疾病、脈絡(luò)膜新血管形成、慢性炎癥、慢性視網(wǎng)膜剝離、慢性葡萄膜炎、慢性玻璃體炎、接觸鏡佩戴過度、角膜移植物排斥、角膜新血管形成、角膜移植物新血管形成、克羅恩氏病(Crohn' sdisease)、伊爾斯病(Eales disease)、流行性角膜結(jié)膜炎、真菌性潰瘍、 單純皰疹感染、帶狀皰疹感染、高粘滯綜合征、卡波西氏肉瘤(Kaposi' s sarcoma)、白血病、脂質(zhì)變性、萊姆氏病(Lyme' s disease)、邊緣角質(zhì)層分離(marginal keratolysis)、 莫倫潰瘍(Mooren ulcer)、除麻風以外的分枝桿菌感染、近視、眼部新血管疾病、眼窩、 奧-韋二氏綜合征(Osier-Weber syndrome)(奧斯勒-韋伯-朗迪(Osler-Weber-Rendu) 病)、骨關(guān)節(jié)炎、佩吉特氏病(Pagets disease)、扁平部睫狀體炎(pars planitis)、類天
phylectenulosis> ^ ]] ^^ ^^E (post-laser complication) > J^ ^ 動物感染、彈性假黃色瘤、翼狀胬肉(Pterygium)、干燥性角膜炎、放射狀角膜切開術(shù)、視網(wǎng)膜新血管形成、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病、晶狀體后纖維組織增生、類肉瘤/結(jié)節(jié)病(sarcoid)、 鞏膜炎、鐮狀細胞貧血、斯耶格倫氏綜合征(Sogrens syndrome)、實體瘤、斯塔加特病 (Stargarts disease)、約—斯病(Steven' s Johnson disease)、上緣角月莫炎(superior limbic keratitis)、梅毒、全身性狼瘡、特里昂氏邊緣變性(Terrien' s marginal degeneration)、弓形蟲病、外傷、尤因肉瘤(Ewing sarcoma)的腫瘤、成神經(jīng)細胞瘤的腫瘤、 骨肉瘤的腫瘤、視網(wǎng)膜母細胞瘤的腫瘤、橫紋肌肉瘤的腫瘤、潰瘍性結(jié)腸炎、靜脈阻塞、維生素A缺乏和韋格納結(jié)節(jié)病(Wegeners sarcoidosis)、與糖尿病有關(guān)的不良血管發(fā)生、寄生蟲病、異常傷口愈合、外傷、損傷或手術(shù)后肥大、毛發(fā)生長抑制、排卵和黃體形成抑制、子宮中胚胎發(fā)育抑制和植入抑制?？寡馨l(fā)生療法可用于以下各項的一般治療移植物排斥、肺部炎癥、腎病綜合征、先兆子癇、心包積液(諸如與心包炎有關(guān)的)和胸腔積液、特征為不良血管通透性的疾病和病癥，例如與腦瘤有關(guān)的水腫、與惡性腫瘤有關(guān)的腹水、梅格斯氏(MeigS)綜合征、肺部炎癥、腎病綜合征、心包積液、胸腔積液、與心血管疾病有關(guān)的通透性，諸如心肌梗死和中風后的疾患，諸如此類。依照本發(fā)明的其它血管發(fā)生依賴性疾病包括血管纖維瘤(傾向于出血的異常血管)、新生血管性青光眼(眼中的血管生長)、動靜脈畸形(動脈與靜脈之間的異常聯(lián)絡(luò))、 不連接的骨折(不會愈合的骨折)、動脈粥樣硬化斑塊(動脈的硬化)、膿性肉芽腫(由血管構(gòu)成的普通皮膚損傷)、硬皮病(結(jié)締組織疾病的一種形式)、血管瘤(由血管構(gòu)成的腫瘤)、沙眼(第三世界失明的第一位原因)、血友病性關(guān)節(jié)、血管粘連和肥厚性瘢痕(異常瘢痕形成)。術(shù)語“癌癥”和“癌性”指或描述哺乳動物中特征通常為細胞生長不受調(diào)控的生理疾患。癌癥的例子包括但不限于癌、淋巴瘤、母細胞瘤、肉瘤、和白血病。此類癌癥的更具體例子包括鱗狀細胞癌、肺癌(包括小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺的腺癌、和肺的鱗癌)、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌(gastric or stomach cancer)(包括胃腸癌)、胰腺癌、成膠質(zhì)細胞瘤、宮頸癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer or hepatic carcinoma)、膀胱癌、肝瘤(h印atoma)、乳腺癌、結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜癌或子宮癌、唾液腺癌、腎癌(kidney or renal cancer)、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、及各種類型的頭和頸癌，以及B細胞淋巴瘤(包括低級/濾泡性非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、小淋巴細胞性(SL)NHL、中級/濾泡性 NHL、中級彌漫性NHL、高級成免疫細胞性NHL、高級成淋巴細胞性NHL、高級小無核裂細胞性NHL、貯積病(bulky disease)NHL、套細胞淋巴瘤、AIDS相關(guān)淋巴瘤、和瓦爾登斯特倫氏 (Waldenstrom)巨球蛋白血癥)、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、急性成淋巴細胞性白血病 (ALL)、毛細胞性白血病、慢性成髓細胞性白血病、和移植后淋巴增殖性病癥(PTLD)、以及與瘢痣病(Phakomatoses)JKW (諸如與腦瘤有關(guān)的)和梅格斯氏(Meigs)綜合征有關(guān)的異常血管增殖。術(shù)語“抗腫瘤組合物”指可用于治療癌癥的組合物，其包含至少一種活性治療劑， 例如“抗癌劑”。治療劑(抗癌劑)的例子包括但不限于例如化療劑、生長抑制劑、細胞毒齊U、放射療法中所使用的藥劑、抗血管發(fā)生劑、凋亡劑、抗微管蛋白劑、和其它用于治療癌癥的藥劑諸如抗HER-2抗體、抗CD20抗體、表皮生長因子受體(EGFR)拮抗劑(例如酪氨酸激酶抑制劑)、HER1/EGFR抑制劑(例如erlotinib (Tarceva )、血小板衍生生長因子抑制劑 (例如 Gleevec (Imatinib Mesylate))、C0X_2 抑制劑(例如塞來考昔(celecoxib))、干擾素、細胞因子、能與 ErbB2、ErbB3、ErbB4、PDGFR- β、BlyS、APRIL、BCMA 或 VEGF 受體中的一種或多種靶物結(jié)合的拮抗劑(例如中和性抗體)、TRAIL/Apo2、及其它生物活性和有機化學劑等。本發(fā)明還包括它們的組合。術(shù)語“細胞毒劑”在用于本文時指抑制或阻止細胞功能和/或引起細胞破壞的物質(zhì)。該術(shù)語意圖包括放射性同位素(例如I131、I125、Y90和Re186)、化療劑、和毒素諸如細菌、 真菌、植物或動物起源的酶活毒素或其片段?！盎焺敝缚捎糜谥委煱┌Y的化學化合物?；焺┑睦影捎糜谥委煱┌Y的化學化合物。化療劑的例子包括烷化劑類(alkylating agents)，諸如塞替派(thiotepa) 和 CYTOXAN 環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide)；磺酸烷基酯類(alkyl sulfonates), 諸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶類 (aziridines)，i者如苯佐替派(benzodepa)、卡波酉昆(carboquone)、美妥替派(meturedepa) 和烏瑞替派(ured印a)；乙撐亞胺類(ethylenimines)和甲基蜜胺類(methylamelamines)， 包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撐蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撐磷酰胺 (triethylenephosphoramide)、三乙撐硫代憐酉先胺(triethylenethiophosphoramide) 和三羥甲蜜胺(trimethylolomelamine)；番荔枝內(nèi)酯類(acetogenins)(尤其是布拉他辛(bullatacin)禾口布拉他辛麗(bullatacinone))；喜積才喊(camptothecin)(包括合成類似物托泊替康(topotecan))；苔蘚抑素(bryostatin) ；callystatin ;CC_1065 (包括其阿多來新(adozelesin)、卡折來新(carzelesin)和比折來新(bizelesin)合成類似物)；隱藻素類(cryptophycinsM特別是隱藻素1和隱藻素8)；多拉司他汀(dolastatin) ；duocarmycin (包括合成類似物，KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素 (eleutherobin) ；pancratistatin ；sarcodictyin ；海綿才屯素(spongistatin)；氣芥類 (nitrogen mustards)，諸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、膽磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、異環(huán)磷酰胺(ifosfamide)、雙氯乙基甲胺(mechlorethamine)、鹽酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride) >美法侖(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥膽甾醇(phenesterine)、潑尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿啼唆氮芥(uracil mustard)；亞硝脲類(nitrosoureas),諸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、 福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(Iomustine)、尼莫司汀(nimustine)禾口雷莫司汀(ranimustine)；抗生素類，諸如烯二炔類抗生素(enediyne)(例如加利車霉素 (cal icheamicin)，尤其是加利車霉素γ 11和加利車霉素ω 11 (參見例如Agnew (1994) Chem. Intl. Ed. Engl. 33 :183-186)；蒽環(huán)類抗生素(dynemicin)，包括 dynemicin A ；二膦酸鹽類(bisphosphonates)，諸如氯膦酸鹽(clodronate)；埃斯波霉素(esperamicin)； 以及新制癌素(neocarzinostatin)發(fā)色團和相關(guān)色蛋白烯二炔類抗生素發(fā)色團)、阿克拉霉素(aclacinomycin)、方文線菌素(actinomycin)、氨茴霉素(anthramycin)、偶氮絲氨酸(azaserine)、博來霉素(bleomycin)、放線菌素 C (cactinomycin)、carabicin、 洋紅霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、方文線菌素 D (dactinomycin)、柔紅霄素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6_ 二氮-5-氧-L-正亮氨酸、ADRIAMYCIN 多柔比星(doxorubicin)(包括嗎啉代多柔比星、氰基嗎啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星和脫氧多柔比星)、表柔比星(印irubicin)、 依索比星(esorubicin)、伊達比星(idarubicin)、麻西羅霉素(marcellomycin)、絲裂霉素類(mitomycins)諸如絲裂霉素C、霉酚酸(mycophenolic acid)、諾拉霉素(nogalamycin)、 橄欖霉素(olivomycin)、培洛霉素(ρ印lomycin)、potfiromycin、口票呤霉素(puromycin)、 三鐵阿霉素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑菌素(streptonigrin)、 鏈佐星(str印tozocin)、殺結(jié)核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、凈司他丁 (zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代謝物類，諸如甲氨蝶呤(methotrexate)和5_氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物，諸如二甲葉酸(denopterin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、蝶羅呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤類似物，諸如氟達拉濱(fludarabine)、 6-巰基嘌呤(mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鳥嘌呤(thioguanine)；嘧啶類似物，諸如安西他濱(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6_氮尿苷(azauridine)、 卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、雙脫氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxif luridine)、依諾他濱(enocitabine)、氟尿苷(f loxuridine)；雄激素類，諸如卡魯睪酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、表硫雄醇 (印itiostanol)、美雄烷(m印itiostane)、睪內(nèi)酯(testolactone)；抗腎上腺類，諸如氨魯米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；葉酸補充劑，諸如亞葉酸(folinic acid)；醋葡醛內(nèi)酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酉先丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿啼唆(eniluracil)；安口丫唆(amsacrine) ；bestrabucil ；比生群(bisantrene)；依達曲沙(edatraxate)；地磷酉先月安(defosfamide)；地美可辛(demecolcine)；地口丫酉昆(diaziquone) ；elfornithine ； Hc 利醋銨(elliptinium acetate)；埃坡霉素(印othilone)；依托格魯(etoglucid)；硝酸鎵；羥脲(hydroxyurea)；香菇多糖(Ientinan)；氯尼達明(Ionidamine)；美登木素生物喊類(maytansinoids),諸如美登素(maytansine)禾口安絲菌素(ansamitocin)； 米ft月瓜月宗(mitoguazone)；米托惠酉昆(mitoxantrone)；莫口；！達酉享(mopidamol) ； 二月安硝吖啶(nitracrine)；噴司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星
19(pirarubicin)；洛索惠酉昆(Iosoxantrone) ； ^ 1=3 Sl (podophyllinic acid) ；2_ 乙基酉先胼(ethylhydrazide)；丙卡巴胼(procarbazine) ； PSK 多糖復合物(JHS Natural Products, Eugene, OR)；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西佐口南(sizofiran)；螺方 錯(spirogermanium)；細交鏈 包菌麗酸(tenuazonic acid)；三亞月安酉昆(triaziquone)； 2,2'，2〃 -三氯三乙胺；單端孢菌素類(trichothecenes)(尤其是T-2毒素、疣孢菌素 (verrucarin)A、桿抱菌素(roridin)A 禾口蛇 亍菌素(anguidin))；烏拉坦(urethan)；長春地辛(vindesine)；達卡巴嗪 (dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine) ；二溴甘露酉享(mitobronitol) ；二漠衛(wèi)矛酉享(mitolactol)；喊泊漠燒(pipobroman) ；gacytosine ；阿糖胞苷(arabinoside) ( “Ara-C")；環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide)；塞替派(thiotepa)； 類紫杉醇類(taxoids)，例如 TAXOL 帕利他塞(paclitaxel) (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N. J.)、ABRAXANE 不含克列莫佛(Cremophor)、清蛋白改造納米顆半立齊Ll 型中白禾1H也塞(American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois)禾口 TAXOTERE 多西他塞(doxetaxel) ( Rhone -Poulenc Rorer, Antony, France)； 苯丁酸氮芥(chlorambucil) ； GEMZAR 吉西他濱(gemcitabine) ；6-硫鳥嘌呤 (thioguanine)；巰基嘌呤(mercaptopurine)；甲氨蝶呤(methotrexate)；鉬類似物，諸如順怕(cisplatin)禾口卡怕(carboplatin)；長春喊(vinblastine)；怕(platinum)；依托泊苷(etoposide) (VP-16)；異環(huán)磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；長春新堿(vincristine) ； NAVELBINE 長春瑞濱(vinorelbine)；能滅瘤(novantrone)； 替尼泊苷(teniposide)；依達曲沙(edatrexate)；道諾霉素(daunomycin)；氨基蝶呤 (aminopterin)；希羅達(xeloda)；伊本膦酸鹽(ibandronate)；伊立替康(irinotecan) (Camptosar, CPT-11)(包括伊立替康及5-FU和亞葉酸的治療方案)；拓撲異構(gòu)酶抑制劑RFS 2000;二氟甲基鳥氨酸(DMFO)；類視黃酸類(retinoids)，諸如視黃酸(retinoic acid)；卡培他濱(capecitabine)；考布他汀(combretastatin)；亞葉酸(Ieucovorin) (LV)；奧沙利鉬(oxaliplatin)，包括奧沙利鉬治療方案(FOLFOX) ；PKC- α , Raf, H-Ras, EGFR(例如erlotinibCTarceva ))和VEGF-A的、降低細胞增殖的抑制劑；及任何上述物質(zhì)的藥劑學可接受的鹽、酸或衍生物。 該定義還包括作用于調(diào)節(jié)或抑制激素對腫瘤作用的抗激素劑諸如抗雌激素類和選擇性雌激素受體調(diào)控物類(SERM)，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括 NOLVADEX 他莫昔芬)、雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、4_ 羥基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奧那司酮 (onapristone)和FARESTON 托瑞米芬(toremifene)；抑制在腎上腺中調(diào)節(jié)雌激素生成的芳香酶的芳香酶抑制劑，諸如例如4(5)-咪唑、氨魯米特(aminoglutethimide)、 MEGASE 醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)、AROMASIN 依西美坦 (exemestane)、福美坦(formestane)、法倔唑(fadrozole)、 RIVISOR 伏羅唑(vorozole)、FEMARA 來曲唑(Ietrozole)和 ARIMIDEX 阿那曲唑 (anastrozole)；抗雄激素類，諸如氟他米特(flutamide)、尼魯米特(nilutamide)、比卡米特(bicalutamide)、亮丙瑞林(Ieuprolide)、和戈舍瑞林(goserelin)；以及曲沙他濱 (troxacitabine) (1，3_ 二氧戊環(huán)核苷胞嘧啶類似物)；反義寡核苷酸，特別是抑制牽涉異常(abherant)細胞增殖的信號途經(jīng)中的基因表達的反義寡核苷酸，諸如例如I3KC-α、Raf和H-Ras ；核酶，諸如VEGF表達抑制劑(例如ANGIOZYME 核酸)和HER2表達抑制劑；疫苗，諸如基因療法疫苗，例如ALLOVECTIN 疫苗、LEUVECTIN 疫苗和 VAXID 疫苗；PROLEUKIN rIL-2 ； LURTOTECAN 拓撲異構(gòu)酶 1 抑制劑； ABARELIX rmRH ；長春瑞濱(Vinorelbine)和埃斯波霉素(Esperamicins)(見美國專利No. 4，675，187)；及任何上述物質(zhì)的藥劑學可接受的鹽、酸或衍生物。術(shù)語“前體藥物”在用于本申請時指與母藥(parent drug)相比對腫瘤細胞的細胞毒性較小并能夠酶促活化或轉(zhuǎn)變?yōu)楦呋钚阅杆幮问降乃幱没钚晕镔|(zhì)的前體或衍生物形式。參見例如 Wilman(1986)“Prodrugs in Cancer Chemotherapy，，,Biochemical Society Transactions,14,pp. 375—382，615th Meeting Belfast 禾口 Stella 等(1985) "Prodrugs :A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery", Directed Drug Delivery, Borchardt 等，編，pp. M7j67，Humana Press.本發(fā)明的前體藥物包括但不限于含磷酸鹽/酯前體藥物、含硫代磷酸鹽/酯前體藥物、含硫酸鹽/酯前體藥物、含肽前體藥物、D-氨基酸修飾前體藥物、糖基化前體藥物、含內(nèi)酰胺前體藥物、含任選取代苯氧基乙酰胺的前體藥物或含任選取代苯乙酰胺的前體藥物、可轉(zhuǎn)化為更具活性而無細胞毒性的藥物的5-氟胞嘧啶和其它5-氟尿苷前體藥物?？裳苌鸀楸景l(fā)明使用的前體藥物形式的細胞毒性藥物的例子包括但不限于上文描述的那些化療劑。“分離的”核酸分子指已經(jīng)鑒定且與抗體核酸的天然來源中通常與之關(guān)聯(lián)的至少一種污染性核酸分子分開的核酸分子。分離的核酸分子不同于在自然界中發(fā)現(xiàn)它時的形式或背景。分離的核酸分子因此與存在于天然細胞中時的核酸分子有區(qū)別。然而，分離的核酸分子包括通常表達該抗體的細胞中所包含的核酸分子，例如當所述核酸分子在所述細胞中的染色體定位不同于它在天然細胞中的染色體定位時。表述“控制序列”指在特定宿主生物體中表達可操作連接的編碼序列所必需的DNA 序列。例如，適于原核生物的控制序列包括啟動子、任選的操縱基因序列、和核糖體結(jié)合位點。已知真核細胞利用啟動子、多腺苷酸化信號、和增強子。若一段核酸與另一段核酸序列處于功能性相互關(guān)系中，則它是“可操作連接的”。 例如，若前序列(presequence)或分泌前導(secretory leader)的DNA表達成參與多肽分泌的前蛋白質(zhì)(preprotein)，則它與該多肽的DNA可操作連接；若啟動子或增強子影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄，則它與該序列可操作連接；或者，若核糖體結(jié)合位點的位置促進翻譯，則它與編碼序列可操作連接。一般而言，“可操作連接的”意味著相連的DNA序列是相鄰的，而且在分泌前導的情況中意味著相鄰且處于閱讀狀態(tài)。然而，增強子不必相鄰。連接可以通過在方便的限制性位點處的連接來實現(xiàn)。若沒有此類位點，則依照常規(guī)實踐使用合成的寡核苷酸銜接頭或接頭。在用于本文時，表述“細胞”、“細胞系”和“細胞培養(yǎng)物”可互換使用，而且所有此類名稱包括后代。如此，詞語“轉(zhuǎn)化子”和“(經(jīng))轉(zhuǎn)化細胞”包括原代受試細胞及由其衍生的培養(yǎng)物，不管傳代的次數(shù)。還應理解，所有后代在DNA內(nèi)容上可能不是精確相同的，這是由于有意或無意的突變。包括與最初對轉(zhuǎn)化細胞所篩選的具有相同功能或生物學活性的突變后代。在意指不同的名稱時，上下文會有清楚表述。本發(fā)明的實施方式抗NRPl抗體的生成
本發(fā)明在此提供新的抗NRPl抗體。產(chǎn)生抗體的示例性方法在以下章節(jié)中有更詳細的描述。用衍生自哺乳動物物種的NRPl抗原選出新的抗NRPl抗體?？乖瓋?yōu)選是人 NRPl(hNRPl)。然而，來自其它物種的NRP，諸如鼠NRPl (mNRPl)，也可用作靶抗原。來自各種哺乳動物物種的NRP抗原可分離自天然來源。在其它實施方案中，抗原是重組生產(chǎn)的或者是利用本領(lǐng)域已知的其它合成方法而制備的。所選的抗體通常將具有足夠強的針對NRPl抗原的結(jié)合親和力。例如，抗體結(jié)合 hNRPl的Kd值可不超過約5nM，優(yōu)選不超過約2nM，而更優(yōu)選不超過約500pM。例如，抗體親和力可由基于表面等離振子共振的測定法(如實施例所述的BIAcore測定法)；酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)；和競爭測定法(如RIA的)來測定。而且，抗體可進行其它生物學活性測定法，如，用以評估其作為治療劑的有效性。 此類測定法是本領(lǐng)域已知的，而且依賴于靶抗原并意圖用于抗體。實例包括HUVEC抑制測定法(如下文實施例所述的)；腫瘤細胞生長抑制測定法(如例如W089/06692所述的)；抗體依賴性細胞的細胞毒性(ADCC)和補體介導的細胞毒性(CDC)測定法(美國專利 5，500, 362)；和激動劑活性或造血作用測定法(參見W095/27062)。為了篩選能結(jié)合感興趣的抗原上的特定表位的抗體，可進行常規(guī)的交叉阻斷測試，如 Antibodis, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow 禾口 David Lane (1988)所述的。另外，可進行表位作圖，如 Champe 等(1995) J. Biol. Chem. 270 1388-1394所述的，來確定抗體是否結(jié)合感興趣的表位。從合成的抗體噬菌體文庫中產(chǎn)生新的抗NRPl抗體在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供利用獨特的噬菌體展示法來產(chǎn)生和挑選新的抗NRPl抗體的方法。該方法包括產(chǎn)生基于單個框架模板的合成抗體噬菌體文庫，設(shè)計可變域內(nèi)的足夠的多樣性，展示具有多樣化可變域的多肽，選擇對靶NRPl抗原具有高親和力的候選抗體，和分離所選的抗體。噬菌體展示方法的詳情可在例如2003年12月11日公開的W003/102157中找到。在一個方面，本發(fā)明中所用的抗體文庫可通過在抗體可變域的至少一個⑶R中突變?nèi)軇┛杉暗暮?或高度多變的位置來產(chǎn)生。一些或全部CDR可用本文提供的方法來突變。在一些實施方案中，優(yōu)選突變⑶RH1、⑶RH2和⑶RH3中的位置以形成單個文庫或突變 ⑶RL3和⑶RH3中的位置以形成單個文庫或突變⑶RL3和⑶RH1、⑶RH2和⑶RH3中的位置以形成單個文庫，由此產(chǎn)生多樣的抗體文庫。例如，可產(chǎn)生這樣的抗體可變域文庫，其在⑶RH1、⑶RH2和⑶RH3中溶劑可及的和 /或高度多變的位置上有突變。產(chǎn)生的另一種文庫在⑶RL1、⑶RL2和⑶RL3中有突變。這些文庫也可互相結(jié)合使用以產(chǎn)生具有期望親和力的結(jié)合物。例如，在一或多輪選擇對靶抗原結(jié)合的重鏈文庫后，在其它輪次的選擇中可將輕鏈文庫替換入重鏈結(jié)合物群中以提供結(jié)合物的親和力。文庫優(yōu)選通過用重鏈序列可變區(qū)⑶RH3區(qū)中的變異氨基酸替代原始氨基酸來產(chǎn)生。所得文庫可包含多種抗體序列，其中序列多樣性主要位于重鏈序列的⑶RH3區(qū)中。在一個方面，文庫在人源化抗體4D5序列、或人源化抗體4D5序列的框架氨基酸序列的背景中產(chǎn)生。文庫優(yōu)選通過用DVK密碼子集編碼的氨基酸至少替代重鏈殘基95-lOOa來產(chǎn)生，其中DVK密碼子集用于編碼這些位置中每個位置的變異氨基酸集?？捎糜诋a(chǎn)生這些替代的寡核苷酸集的例子包括序列(DVK)7。在一些實施方案中，文庫通過用DVK和NNK 兩個密碼子集編碼的氨基酸替代殘基95-lOOa來產(chǎn)生?？捎糜诋a(chǎn)生這些替代的寡核苷酸集的例子包括序列(DVK) 6 (NNK)。在另一個實施方案中，文庫通過用DVK和NNK兩個密碼子集編碼的氨基酸替代殘基95-lOOa來產(chǎn)生?？捎糜诋a(chǎn)生這些替代的寡核苷酸集的例子包括序列(DVK)5(NNK)15可用于產(chǎn)生這些替代的寡核苷酸集的另一個例子包括序列(NNK)6。根據(jù)本文所述標準，本領(lǐng)域技術(shù)人員可確定合適寡核苷酸序列的其它例子。在另一個實施方案中，利用不同的CDRH3設(shè)計來分離高親和力結(jié)合物和分離針對各種表位的結(jié)合物。該文庫中產(chǎn)生的CDRH3的長度范圍是11至13個氨基酸，盡管也可產(chǎn)生不同于此的長度。通過用NNK、DVK和NVK密碼子集也可拓展H3多樣性，以及在N和/或 C-末端處的更有限的多樣性。⑶RHl和⑶RH2中也可產(chǎn)生多樣性。⑶R-Hl和H2多樣性的設(shè)計遵循目標為模擬所述帶有如下修飾的天然抗體全集的策略，所述修飾使多樣性較前述設(shè)計更緊密地與天然多樣性相匹配。對于CDRH3中的樣性，可分開構(gòu)建多個文庫，它們具有不同長度的H3，然后組合起來以選擇針對靶抗原的結(jié)合物。合并多個文庫并用前述和本文下述的固體支持物選擇和溶液分選法來選擇?？刹捎枚喾N選擇策略。例如，一種變化涉及在結(jié)合至固相的靶物上選擇， 然后分選可能在融合多肽上存在的標簽(如抗gD標簽)，然后再一次在結(jié)合至固相的靶物上分選。或者，文庫可首先在結(jié)合至固相表面的靶物上選擇，然后用靶抗原濃度逐漸減低的溶液相結(jié)合來分選所洗脫的結(jié)合物。利用不同分選方法的組合來最低限度地只選擇高度表達的序列并選擇許多不同的高親和力克隆。針對靶NRPl抗原的高親和力結(jié)合物可由文庫分離。H1/H2區(qū)中的有限多樣性可降低簡并性約IO4至IO5倍并允許為更多高親和力結(jié)合物提供更大的H3多樣性。利用在 CDRH3中具有不同類型多樣性的文庫(如利用DVK或NVT)可分離能與靶抗原的不同表位結(jié)合的結(jié)合物。對于如上所述合并的文庫中分離的結(jié)合物，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)親和力可通過提供輕鏈中的有限多樣性來進一步提高。在該實施方案中，輕鏈多樣性如下產(chǎn)生，在CDRLl中氨基酸第 28位由RDT編碼；氨基酸第四位由RKT編碼；氨基酸第30位由RVW編碼；氨基酸第31位由ANW編碼；氨基酸第32位由THT編碼；任選的，氨基酸第33位由CTG編碼；在CDRL2中 氨基酸第50位由KBG編碼；氨基酸第53位由AVC編碼；任選的，氨基酸第55位由GMA編碼；在CDRL3中氨基酸第91位由TMT或SRT或這兩者編碼；氨基酸第92位由DMC編碼； 氨基酸第93位由RVT編碼；氨基酸第94位由NHT編碼；和氨基酸第96位由TWT或YKG或這兩者編碼。在另一個實施方案中，產(chǎn)生在⑶RH1、⑶RH2和⑶RH3區(qū)中具有多樣性的一個或多個文庫。在該實施方案中，用各種長度的H3區(qū)并主要用密碼子集XYZ和NNK或NNS來產(chǎn)生 CDRH3中的多樣性。用各寡核苷酸形成文庫并合并，或者合并寡核苷酸來形成文庫子集。該實施方案的文庫可針對結(jié)合至固相的靶物進行分選。分離自多次分選的克隆可利用ELISA 測定法來篩選特異性和親和力。對于特異性，克隆可以針對期望靶抗原以及其它非靶抗原進行篩選。然后，在溶液結(jié)合競爭ELISA測定法或點競爭測定法中對那些針對靶NRPl抗原的結(jié)合物篩選親和力。可以用如上所述制備的XYZ密碼子集由文庫分離高親和力結(jié)合物。 可方便地在細胞培養(yǎng)中以高產(chǎn)率將這些結(jié)合物制備成抗體或抗原結(jié)合片段。在一些實施方案中，可能希望產(chǎn)生在⑶RH3區(qū)長度方面具有更大多樣性的文庫。 例如，可能希望產(chǎn)生⑶RH3區(qū)的長度范圍為約7至19個氨基酸的文庫。由這些實施方案中的文庫分離的高親和力結(jié)合物可方便地在細菌和真核細胞培養(yǎng)中以高產(chǎn)率產(chǎn)生?？稍O(shè)計載體以方便地去除如下序列如gD標簽、病毒外殼蛋白成分序列，和/或增加恒定區(qū)序列來高產(chǎn)率地產(chǎn)生全長抗體或抗原結(jié)合片段?？梢詫ⅱ荝H3中有突變的文庫與包含不同型式的其它⑶R(例如⑶RL1、⑶RL2、 ⑶RL3、⑶RHl和/或⑶Rffi)的文庫組合。因此，例如，在一個實施方案中，將⑶RH3文庫與 ⑶RL3文庫組合，所述CDRL3文庫用預先確定的密碼子集在第觀、29、30、31、和/或32位有變異氨基酸的人源化4D5抗體序列的背景中產(chǎn)生。在另一個實施方案中，將CDRH3有突變的文庫與包含變異⑶RHl和/或⑶RH2重鏈可變域的文庫組合。在一個實施方案中，⑶RHl 文庫用第觀、30、31、32和33位有變異氨基酸的人源化抗體4D5序列產(chǎn)生。⑶RH2文庫可用預先確定的密碼子集用第50、52、53、54、56和58位有變異氨基酸的人源化抗體4D5序列產(chǎn)生?？筃RPl抗體突變體可進一步修飾噬菌體文庫產(chǎn)生的新抗NRPl抗體以產(chǎn)生抗體突變體，所述突變體具有比親本抗體改善了的物理、化學和/或生物學性質(zhì)。當所用的測定法是生物學活性測定法時，優(yōu)選抗體突變體在所選測定法中的生物學活性比親本抗體在該測定法中的生物學活性好至少約10倍，優(yōu)選好至少約20倍，更優(yōu)選好至少約50倍，有時好至少約100倍或 200倍。例如，優(yōu)選抗NRPl抗體突變體針對NRPl的結(jié)合親和力比親本抗NRPl抗體的結(jié)合親和力強至少約10倍，優(yōu)選強至少約20倍，更優(yōu)選強至少約50倍，有時強至少約100倍或 200 倍。為了產(chǎn)生抗體突變體，將一處或多處氨基酸改變(如替代)導入親本抗體的一個或多個高變區(qū)?；蛘?另外，可將框架區(qū)殘基的一處或多處改變(如替代)導入親本抗體， 這些改變導致抗體突變體針對來自第二哺乳動物物種的抗原的結(jié)合親和力有所改善。要修飾的框架區(qū)殘基的實例包括那些直接非共價結(jié)合抗原的(Amit等(1986)kience 233 747-753)；相互作用于 / 影響 CDR 構(gòu)象的(Chothia 等(1987) J. Mol. Biol. 196 :901-917)； 和/或參與VL-VH界面的(EP 239400B1)的殘基。在某些實施方案中，一個或多個這類框架區(qū)殘基的修飾導致抗體針對來自第二哺乳動物物種的抗原的結(jié)合親和力有所增強。例如， 在本發(fā)明的該實施方案中，可改變約1個至約5個框架殘基。有時，這可足以產(chǎn)生適用于臨床前試驗中的抗體突變體，甚至其中沒有高變區(qū)殘基被改變。可是通常，抗體突變體將包含別的高變區(qū)改變。改變的高變區(qū)殘基可以是隨機改變的，尤其是在其中親本抗體的起始結(jié)合親和力使得這類隨機產(chǎn)生的抗體突變體可方便地被篩選出來?？捎糜谏纱祟惪贵w突變體的一種方法稱作“丙氨酸掃描誘變”(Cunningham and Wells (1989) Science 244:1081-1085)。這里，一個或多個高變區(qū)殘基用丙氨酸或多丙氨酸殘基替代，以影響氨基酸與來自第二哺乳動物物種的抗原的相互作用。然后通過在或?qū)μ娲稽c引入更多或其它突變，推敲那些對替代展現(xiàn)出功能敏感性的高變區(qū)殘基。如此，雖然引入氨基酸序列變異的位點是預先決定的，但是突變本身的性質(zhì)不需要預先決定。如本文所述對如此生成的丙氨酸突變體篩選它們的生物學活性。通常，從保守替代諸如下文顯示在標題“優(yōu)選替代”下的那些開始。如果此類替代導致生物學活性(例如結(jié)合親和力)的改變，那么可以引入下表中稱為“例示替代”的更實質(zhì)性改變，或如下文中關(guān)于氨基酸種類的進一步描述，并篩選產(chǎn)物。優(yōu)詵替代
權(quán)利要求
1.一種抗神經(jīng)纖毛蛋白-I(NRPl)抗體，其能夠抑制至少一種神經(jīng)纖毛蛋白(NRP)介導的生物學活性。
2.權(quán)利要求1的抗體，其能夠抑制NRPl與信號素的相互作用。
3.權(quán)利要求1的抗體，其能夠抑制NRPl與血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)的相互作用。
4.權(quán)利要求1的抗體，其在NRPl的ala2結(jié)構(gòu)域內(nèi)與NRPl結(jié)合，并阻斷NRPl與信號素的結(jié)合，但不阻斷NRPl與VEGF的結(jié)合。
5.權(quán)利要求1的抗體，其在NRPl的blb2結(jié)構(gòu)域內(nèi)結(jié)合NRP1，并阻斷NRPl與VEGF的結(jié)合，但不阻斷NRPl與信號素的結(jié)合。
6.依照權(quán)利要求1的抗體，其中所述抗體既能夠與鼠NRPl結(jié)合又能夠與人NRPl結(jié)合。
7.權(quán)利要求1的抗NRPl抗體在制備用于在哺乳動物中治療或預防與病理性血管發(fā)生有關(guān)的病癥的藥物中的用途。
全文摘要
本申請涉及神經(jīng)纖毛蛋白拮抗劑。本發(fā)明披露了具有獨特結(jié)構(gòu)和功能特征的新的抗NRP1抗體及其變體。本發(fā)明還提供了所述抗體在研究、診斷和治療應用中的用途。
文檔編號A61K39/395GK102304184SQ20111020686
公開日2012年1月4日 申請日期2006年11月8日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月8日
發(fā)明者吳雁, 瑞安.J.沃茨 申請人:健泰科生物技術(shù)公司