專利名稱：生物人工肝用半乳糖化殼聚糖支架材料及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種殼聚糖支架生物材料技術，更具體地說，是涉及一種生物人工肝用半乳糖化殼聚糖支架材料及其制備方法。
背景技術：
肝臟是機體重要的解毒器官，不管什么原因一旦造成肝細胞的大量壞死，并出現(xiàn)肝功能衰竭必將導致機體代謝紊亂和毒性物質的大量堆積，二者的出現(xiàn)又進一步影響肝細胞功能，加劇肝細胞壞死，影響殘存肝細胞再生，從而加重肝功能衰竭，形成惡性循環(huán)。人工肝研究的出發(fā)點就是寄希望采用人工肝解毒、完成生物合成、生物轉化等肝臟功能，打破上述惡性循環(huán)，穩(wěn)定肝衰竭患者的內環(huán)境，為具有較強再生能力的肝細胞再生或為進一步肝移植而創(chuàng)造條件，爭取寶貴時間。自1956年Sorrentnin首次提出“人工肝”的概念并開始研究至今，歷經幾十年研究，人工肝研究取得了很多成果。這些成果大致可分為兩大類，一類為早期人工肝支持系統(tǒng)，該系統(tǒng)大多以解毒為主，部分兼有補充生物活性物質的作用；另一類為生物人工肝支持系統(tǒng)，由生物成分和合成材料組成，具有肝特異性解毒和生物合成及轉化功能。生物人工肝是80年代后期出現(xiàn)的新型人工肝支持系統(tǒng)，它將肝細胞懸液、培養(yǎng)的肝細胞等與生物合成材料相結合組裝成某種形式的系統(tǒng)，不僅具有肝特異性的解毒功能，而且還參與三大物質代謝、具有生物轉化功能、可清除毒性物質、能分泌具有促進肝細胞生長活性的物質等。因此以培養(yǎng)肝細胞為基礎的體外生物人工肝支持系統(tǒng)已成為目前研究的重點。理想的生物人工肝支架材料應具備以下功能(1)支架材料應為三維多孔網絡結構，孔的尺寸能夠為肝細胞提供黏附場所，且孔間相互貫通，以便于營養(yǎng)物質和代謝產物的傳遞；( 良好的生物相容性，有利于維持肝細胞正常分化、生長及增殖；C3)具有一定的生物力學性能，利于加工成所需的形狀和結構，易于重復制備；(4)重要的一點是需要支架材料與細胞之間存在特異性反應，發(fā)揮特有的生物合成及轉化功能?，F(xiàn)有的生物人工肝系統(tǒng)一般為傳統(tǒng)的中空纖維人工肝，其存在一定的缺陷，因為肝細胞是貼壁型的細胞，一般貼壁生長才能有效的發(fā)揮其生理功能。而傳統(tǒng)的中空纖維不利于管外腔的培養(yǎng)肝細胞生長，上述缺陷是目前生物人工肝治療不能提高肝功能療效的原因所在。殼聚糖分子結構類似于葡胺聚糖，其葡胺聚糖是肝臟細胞外基質的組成成分，肝細胞是一種依賴貼壁性細胞，其表面存在著ASGPRs受體，而半乳糖則是肝細胞表面ASGPRs 的特異性受體，是肝細胞識別的相應位點并能產生特異性相互作用，半乳糖化殼聚糖支架材料有望成為一種具有良好應用前景的生物人工肝支架材料。

發(fā)明內容
針對現(xiàn)有技術的生物人工肝支架材料現(xiàn)狀與不足，本發(fā)明的目的旨在提供一種具有高的孔隙率結構，適合肝細胞生長的尺寸，良好的溶脹率，可控降解及出色的細胞相容性的生物人工肝用半乳糖化殼聚糖支架材料及其制備方法。
可實現(xiàn)上述目的的生物人工肝支架材料，為經氧化海藻酸鈉生物交聯(lián)劑交聯(lián)處理的半乳糖化殼聚糖生物材料，是在殼聚糖上接枝半乳糖，在細胞基質外引入肝細胞特異性相互作用位點的半乳糖化殼聚糖生物材料。該半乳糖化殼聚糖支架材料具有空間三維多孔結構，且孔道之間相互連通。作為生物人工肝用半乳糖化殼聚糖支架材料，即用氧化海藻酸鈉生物交聯(lián)劑交聯(lián)處理的半乳糖化殼聚糖生物材料，其制備方法主要包括以下加工工序1)將殼聚糖和乳糖酸按等摩爾比溶于pH 4. 5 4. 8四甲基乙二胺/鹽酸混合溶液中，加入活性中間體在5 35°C下活化反應48 96小時制備半乳糖化殼聚糖，反應后用堿溶液調和至pH 7. 0 7. 2，過濾透析，冷凍干燥得到半乳糖化殼聚糖；2)將半乳糖化殼聚糖溶解于體積濃度 3%的乙酸溶液中，配制質量濃度為 10mg/ml 30mg/ml的半乳糖化殼聚糖的乙酸溶液；3)將制得的氧化海藻酸鈉溶解于超純水中，制備質量濃度為10mg/ml 30mg/ml 的氧化海藻酸鈉水溶液；4)將步驟幻和幻中配制的溶液按半乳糖化殼聚糖與氧化海藻酸鈉質量比為 5 1 2 1的比例混合，交聯(lián)反應10 240分鐘，將其倒入模具中進行凝膠，冷凍干燥得到支架材料；5)將步驟4)制得的支架材料浸沒在pH 8. O 9. O的氫氧化鈉-乙醇水溶液12 M小時，除去殘留的乙酸，再將其用乙醇水溶液洗滌至中性，二次凍干即獲得氧化海藻酸鈉交聯(lián)的半乳糖化殼聚糖支架材料。在上述制備方案中，制備半乳糖化殼聚糖用活性中間體為1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)_碳二亞胺鹽酸鹽與N-羥基琥珀酸活性酯的混合溶液，兩者的摩爾比為O 1) (1:2)。活性中間體的加入量為足以使殼聚糖溶液與乳糖酸溶液的反應能夠順利進行為準。在上述制備方案中，半乳糖化殼聚糖溶液與氧化海藻酸鈉水溶液的交聯(lián)反應，最好是在攪拌條件下進行交聯(lián)反應，攪拌可以是磁力攪拌，也可以是機械攪拌。磁力攪拌比較溫和，優(yōu)先采用磁力攪拌。在上述制備方案中，殼聚糖和乳糖酸溶于四甲基乙二胺/鹽酸混合溶液，可采取分別溶于四甲基乙二胺/鹽酸混合溶液，然后再混合，也可采取先后溶于四甲基乙二胺/鹽酸混合溶液；用于調和的堿溶液可采用mol濃度在0. 05 0. 2mol/L范圍的NaOH、氨水、KOH 等溶液。優(yōu)先選用NaOH溶液。冷凍干燥溫度一般在-80 O°C下進行。在上述制備方案中，活化反應溫度為能使殼聚糖與乳糖酸在不變性的情況下進行反應為準。反應溫度過高會使殼聚糖與乳糖酸變性，過低會使反應進行得過于緩慢。活化反應一般是在室溫下進行，即反應溫度在5 35°C范圍內都可。在上述制備方案中，所述超純水為用醫(yī)用超純水機按制備操作規(guī)程制備的超純水。在上述制備方案中，用乙醇水溶液進行洗滌方式可以是沖洗、浸泡或沖洗加浸泡。 任何將支架材料洗滌至中性的方式都可以。在上述制備方案中，生物人工肝用半乳糖化殼聚糖支架材料在使用或者進行活體實驗或進行體外細胞相關實驗時，還需進行Y射線輻照消毒。
在制備人工肝用半乳糖化殼聚糖支架材料的研究完成過程中，發(fā)明人經反復多次試驗和對氧化海藻酸鈉的深刻理解，選用生物相容性良好的氧化海藻酸鈉交聯(lián)劑作為半乳糖化支架材料的交聯(lián)劑。氧化海藻酸鈉是海藻酸鈉的氧化產物，海藻酸鈉是一種從褐藻中分離出來的天然多糖，具有可降解性和良好的生物相容性、無任何的免疫原性，并不誘導任何持續(xù)性的炎癥反應，同時由于其價格相對低廉，被廣泛地應用在組織工程和醫(yī)藥等領域。用高碘酸鈉對海藻酸鈉進行氧化改性，氧化海藻酸鈉不但保留了良好的生物相容性，增加了其生物相容性，還引入了活性基團(-CH0-)，能夠與氨基發(fā)生反應。氧化海藻酸鈉作為一種天然生物改性得到的交聯(lián)劑，具有細胞毒性低、細胞親和力強及增加支架材料的力學性能等優(yōu)勢。用氧化海藻酸鈉處理的支架材料，孔徑大小適合細胞生長，抗壓縮強度提高，降解速率減慢，細胞相容性良好。本發(fā)明以生物交聯(lián)劑氧化海藻酸鈉為交聯(lián)劑，以半乳糖化殼聚糖為基體所制備的生物人工肝用支架材料，具有一定的抗壓縮性能，又有適于肝細胞生長的孔徑結構，還有良好的溶脹率和熱穩(wěn)定性，最重要的一點，此支架材料促使肝細胞在其表面及三維空間上粘附生長及分化的特點，很適合作為生物人工肝用支架材料。且其制備過程簡單，技術要求不高，易于重復以實現(xiàn)產業(yè)化。


附圖1為支架材料的掃描電鏡圖(放大100倍)。其中圖1-1 1-3為條件1 條件3支架材料表面形貌；圖1-4 1-6為條件1 條件3支架材料的橫斷面形貌。附圖2為支架材料的體外降解曲線圖(60天)。附圖3為支架材料的肝細胞表面粘附圖。其中圖3-1 3-3為條件1的粘附情況； 圖3-4 3-6為條件2的粘附情況；圖3-7 3_9為條件3的粘附情況；圖3_10 3_12條件 4 的粘附情況(圖 3-1，3-4，3-7，3-10 放大 500 倍；圖 3-2，3-5，3-8，3-11 放大 2000 倍； 圖 3-3，3-6，3-9，3-12 放大 5000 倍)。附圖4為支架材料上肝細胞三維空間的生長情況(HE染色，放大100倍)。其中圖 4-1 4-3為條件1的生長情況；圖4-4 4-6為條件2的生長情況；圖4_7 4_8為條件 3的生長情況。其中條件1為半乳糖化殼聚糖與氧化海藻酸鈉質量比為2 1制備的支架材料； 條件2為半乳糖化殼聚糖與氧化海藻酸鈉質量比為3 1制備的支架材料；條件3為半乳糖化殼聚糖與氧化海藻酸鈉質量比為4 1制備的支架材料；條件4為半乳糖化殼聚糖與氧化海藻酸鈉質量比為5 1制備的支架材料。
具體實施例方式1、生物人工肝用半乳糖化殼聚糖支架材料制備實施例以下通過實施例描述本發(fā)明的具體實施方式
，對本發(fā)明的內容再作進一步的詳細說明。但需要特別說明的是，不應將此理解為本發(fā)明的保護范圍僅限于實例，相反的是，凡基于本發(fā)明的內容所實現(xiàn)的技術應均屬于本發(fā)明的保護范圍。在以下各實施例中，除特別說明外，所涉及的百分比均為質量百分比，所涉及的份數均為質量份數。
實施例1將3. 24g殼聚糖溶于MOml pH4. 5的四甲基乙二胺/鹽酸緩沖溶液中，7. 16g乳糖酸溶于80ml pH4. 5的四甲基乙二胺/鹽酸緩沖溶液，兩溶液合并加入2.5ml的1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)-碳二亞胺鹽酸鹽/N-羥基琥珀酸混合溶液(兩者摩爾比為1 1) 活性中間體，在25°C左右下活化反應72小時制備半乳糖化殼聚糖，反應后用0. 1M/L的 NaOH溶液調和至接近中性(pH7. 0左右)，反復過濾透析，冷凍干燥得到純化的半乳糖化殼聚糖；將半乳糖化殼聚糖和氧化海藻酸鈉分別配制成2. 5%的溶液，按半乳糖化殼聚糖和氧化海藻酸鈉干重比例為2 1將兩種溶液混合，25°C下攪拌反應約lOmin，倒入模具中室溫進行凝膠，于冰箱中在-20°C預凍過夜，經冷凍干燥后得到支架材料。將制得的支架材料浸沒在氫氧化鈉-乙醇水溶液(pH8. 5)中約M小時，除去殘留的乙酸，以有利于khiff堿反應，再將其用大量的乙醇水溶液反復沖洗浸泡至中性，二次凍干獲得氧化海藻酸鈉交聯(lián)的半乳糖化殼聚糖支架材料。實施例2將1.62g殼聚糖溶于120ml pH4. 7的四甲基乙二胺/鹽酸緩沖溶液中，3. 58g乳糖酸溶于40ml pH4. 7的四甲基乙二胺/鹽酸緩沖溶液，兩溶液合并加入1.0ml的1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)-碳二亞胺鹽酸鹽/N-羥基琥珀酸混合溶液(兩者摩爾比為1 2) 活性中間體，在20°C左右下活化反應96小時制備半乳糖化殼聚糖，反應后用0. 15M/L的氨水溶液調和至接近中性(PH7. 2左右)，反復過濾透析，冷凍干燥得到純化的半乳糖化殼聚糖；將半乳糖化殼聚糖和氧化海藻酸鈉分別配制成2. 5%的溶液，按半乳糖化殼聚糖和氧化海藻酸鈉干重比例為3 1將兩種溶液混合，20°C左右下攪拌反應約20min，倒入模具中室溫進行凝膠，于冰箱中在-20°C左右預凍過夜，經冷凍干燥后得到支架材料。將制得的支架材料浸沒在氫氧化鈉-乙醇水溶液(ρΗ8. 0)中約M小時，除去殘留的乙酸，有利于khiff堿反應，再將其用大量的乙醇水溶液反復沖洗浸泡至中性，二次凍干獲得氧化海藻酸鈉交聯(lián)的半乳糖化殼聚糖支架材料。實施例3將1.62g殼聚糖溶于120ml pH4. 8的四甲基乙二胺/鹽酸緩沖溶液中，3. 58g乳糖酸溶于40ml pH4. 8的四甲基乙二胺/鹽酸緩沖溶液，兩溶液合并加入1.2ml的1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)-碳二亞胺鹽酸鹽/N-羥基琥珀酸混合溶液(兩者摩爾比為2 1) 活性中間體，在30°C左右下活化反應約60小時制備半乳糖化殼聚糖，反應后用0. 15M/L的 KOH溶液調和至接近中性(pH7. 1左右)，反復過濾透析，冷凍干燥得到純化的半乳糖化殼聚糖；將半乳糖化殼聚糖和氧化海藻酸鈉分別配制成2. 5%的溶液，按半乳糖化殼聚糖和氧化海藻酸鈉干重比例為4 1將兩種溶液混合，30°C左右下攪拌約8min，倒入模具中室溫進行凝膠，在-20°C左右于冰箱中預凍過夜，經冷凍干燥后得到支架材料。將制得的支架材料浸沒在氫氧化鈉-乙醇水溶液(ρΗ9. 0)中約M小時，除去殘留的乙酸，有利于khiff堿反應，再將其用大量的乙醇水溶液反復沖洗浸泡至中性，二次凍干獲得氧化海藻酸鈉交聯(lián)的半乳糖化殼聚糖支架材料。
實施例4先將4. 86g殼聚糖溶于480ml pH4. 6的四甲基乙二胺/鹽酸緩沖溶液中，再將 10. 74g乳糖酸溶于其中，加入4. Oml的1-乙基_3_ (3- 二甲氨丙基)-碳二亞胺鹽酸鹽/ N-羥基琥珀酸(兩者等摩爾比)活性中間體，在20°C左右下活化反應約96小時制備半乳糖化殼聚糖，反應后用0. 1M/L的NaOH溶液調和至接近中性，反復過濾透析，冷凍干燥得到純化的半乳糖化殼聚糖；將半乳糖化殼聚糖和氧化海藻酸鈉分別配制成2. 5%的溶液，按半乳糖化殼聚糖和氧化海藻酸鈉干重比例為5 1將兩種溶液混合，室溫下攪拌20min，倒入模具中室溫進行凝膠，于冰箱中在_20°C左右預凍過夜，經冷凍干燥后得到支架材料。將制得的支架材料浸沒在氫氧化鈉-乙醇水溶液(pH8. 7)中約M小時，除去殘留的乙酸，有利于khiff堿反應，再將其用大量的乙醇水溶液反復沖洗浸泡至中性，二次凍干獲得氧化海藻酸鈉交聯(lián)的半乳糖化殼聚糖支架材料。2、生物人工肝用半乳糖化殼聚糖支架材料性能指標測試實施例(1)形貌和孔隙率測試實施例用掃描電鏡觀察上述實施例制備的生物人工肝用半乳糖化殼聚糖支架材料的微觀結構，其微觀形貌如附圖1所示。其中，條件4的支架材料的微觀形態(tài)與前三種相似。從掃描電鏡圖上可以看出，支架材料的斷面呈現(xiàn)較均勻連續(xù)的多孔結構，且有許多通孔，這種微觀結構主要是支架材料內部的冰晶通過冷凍干燥法進行升華而得到，類似于其它天然大分子形成的支架體系結構，其平均孔徑尺寸在100-250um。另一方面，隨著交聯(lián)劑氧化海藻酸鈉含量的增加，支架材料之間的微觀結構并沒有出現(xiàn)明顯的不同。另外，支架材料的孔隙率通過排液法測得空隙率大約為70%，已有研究表明在此孔隙率的支架材料上培養(yǎng)肝細胞，肝細胞聚集形成多層球形聚集體和具有較高的生命力。因此，基于對支架材的SEM觀察和孔隙率的測定，AGC支架材料將可能有利于肝細胞的侵入、增殖和功能性表達。(2)溶脹率測試實施例支架材料的保水率對于生物人工肝用支架材料來說是一個非常重要的性能。支架材料的這種特征直接影響細胞的黏附、分布和營養(yǎng)代謝廢物的傳輸。對于支架材料來說，交聯(lián)劑的含量越高，越有利于形成較小的網絡空間和較為密實的結構，當與PBS緩沖溶液接觸時，支架材料會有更小的溶脹率；如果分子結構中存在大量的親水基團(如羥基、氨基和羧基等)，交聯(lián)劑含量較低時，會有較多的分子鏈暴露于水分子中與水分子結合，增強了吸水性。表1-不同條件下半乳糖化殼聚糖支架材料的溶脹率
權利要求
1.一種生物人工肝用半乳糖化殼聚糖支架材料，其特征在于支架材料為經氧化海藻酸鈉生物交聯(lián)劑交聯(lián)處理的半乳糖化殼聚糖生物材料。
2.根據權利要求1所述的生物人工肝用半乳糖化殼聚糖支架材料，其特征在于，半乳糖化殼聚糖支架材料具有空間三維多孔結構。
3.權利要求1或2所述生物人工肝用半乳糖化殼聚糖支架材料的制備方法，其特征在于包括以下工序1)將殼聚糖和乳糖酸按等摩爾比溶于PH4. 5 4. 8的四甲基乙二胺與鹽酸的混合溶液中，加入活性中間體在5 35°C下活化反應48 96小時制備半乳糖化殼聚糖，反應后用堿溶液調和至pH 7. 0 7. 2，過濾透析，冷凍干燥得到半乳糖化殼聚糖；2)將半乳糖化殼聚糖溶解于體積濃度為 3%的乙酸溶液中，配制質量濃度為 10mg/ml 30mg/ml的半乳糖化殼聚糖的乙酸溶液；3)將氧化海藻酸鈉溶解于超純水中，制備質量濃度為10mg/ml 30mg/ml的氧化海藻酸鈉水溶液；4)將步驟幻和幻中配制的溶液按半乳糖化殼聚糖與氧化海藻酸鈉質量比(5 1) (2 1)的比例混合，交聯(lián)反應10 240分鐘，將其倒入模具中進行凝膠，冷凍干燥得到支架材料；5)將步驟4)制得的支架材料浸沒在pH8 9的氫氧化鈉-乙醇水溶液12 24小時，除去殘留的乙酸，再將其用乙醇水溶液洗滌至中性，二次凍干即獲得氧化海藻酸鈉交聯(lián)的半乳糖化殼聚糖支架材料。
4.根據權利要求3所述的生物人工肝用半乳糖化殼聚糖支架材料的制備方法，其特征在于活性中間體為1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)-碳二亞胺鹽酸鹽與N-羥基琥珀酸活性酯的混合溶液，兩者的摩爾比為O 1) (1 2)。
5.根據權利要求3或4所述的生物人工肝用半乳糖化殼聚糖支架材料的制備方法，其特征在于堿溶液為mol濃度在0. 05 0. 2mol/L范圍的NaOH、氨水或KOH溶液。
6.根據權利要求3或4所述的生物人工肝用半乳糖化殼聚糖支架材料的制備方法，其特征在于半乳糖化殼聚糖溶液與氧化海藻酸鈉水溶液在有攪拌的條件下進行交聯(lián)反應。
7.根據權利要求5所述的生物人工肝用半乳糖化殼聚糖支架材料的制備方法，其特征在于半乳糖化殼聚糖溶液與氧化海藻酸鈉水溶液的交聯(lián)反應是在磁力攪拌條件下進行交聯(lián)反應。
8.根據權利要求3或4所述的生物人工肝用半乳糖化殼聚糖支架材料的制備方法，其特征在于氧化海藻酸鈉與半乳糖化殼聚糖膠聯(lián)反應形成的凝膠在-80 0°C下冷凍干燥。
9.根據權利要求6所述的生物人工肝用半乳糖化殼聚糖支架材料的制備方法，其特征在于氧化海藻酸鈉與半乳糖化殼聚糖膠聯(lián)反應形成的凝膠在-80 0°C下冷凍干燥。
10.根據權利要求7所述的生物人工肝用半乳糖化殼聚糖支架材料的制備方法，其特征在于氧化海藻酸鈉與半乳糖化殼聚糖膠聯(lián)反應形成的凝膠在-80 0°C下冷凍干燥。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種生物人工肝用半乳糖化殼聚糖支架材料，為經氧化海藻酸鈉生物交聯(lián)劑交聯(lián)處理的、具有空間三維多孔結構的半乳糖化殼聚糖生物材料。其主要制備工序殼聚糖和乳糖酸按等摩爾比溶于四甲基乙二胺/鹽酸混合溶液，加入活性中間體活化反應制備半乳糖化殼聚糖；半乳糖化殼聚糖溶解于乙酸溶液，氧化海藻酸鈉溶解于超純水，將該兩種溶液按一定比例混合進行交聯(lián)反應，反應結束倒入模具成型，經冷凍干燥得到支架材料，再將其浸沒在氫氧化鈉-乙醇水溶液除去殘留的乙酸，再經乙醇水溶液洗滌、二次凍干即制得經氧化海藻酸鈉交聯(lián)處理的半乳糖化殼聚糖支架材料。本發(fā)明的半乳糖化殼聚糖支架材料，具有適合肝細胞生長的孔徑，良好的生物相容性。
文檔編號A61L27/20GK102274545SQ201110194729
公開日2011年12月14日 申請日期2011年7月12日 優(yōu)先權日2011年7月12日
發(fā)明者萬昌秀, 余喜訊, 張小華, 張旭, 彭紅, 徐源廷, 陳 峰, 顧志鵬 申請人:四川大學