專利名稱：一種用于藥物載體的多孔微球、制備方法及藥物負(fù)載方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及多孔微球的制備領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種用于藥物載體的多孔微球、制備方法及藥物負(fù)載方法。
背景技術(shù)：
隨著新興生物技術(shù)和基因工程發(fā)展，蛋白質(zhì)和多肽類大分子生化醫(yī)藥(如生長激素、胰島素、肝素、干擾素、白細(xì)胞介素等)由于在侏儒癥、糖尿病、肝硬化以及癌癥等難以治愈疾病的治療過程中表現(xiàn)出藥理作用強(qiáng)、副作用少且很少引起過敏反應(yīng)的特點(diǎn)而倍受重視。由于多肽和蛋白質(zhì)類藥物穩(wěn)定性差，在腸胃中易被降解，且存在生物利用度低的問題， 故多采用注射劑。但是由于此類藥物的體內(nèi)半衰期短，臨床應(yīng)用時(shí)常常需要多次注射給藥。 針對這些問題，研究者們基本遵循兩種解決途徑，第一是尋找一條蛋白質(zhì)藥物高生物利用率的給藥途徑；第二是通過化學(xué)修飾來優(yōu)化蛋白質(zhì)的代謝動力學(xué)特性，以延長其半衰期，達(dá)到長效穩(wěn)定的目的。其中，利用生物可降型聚合物為骨架材料制備微球給藥系統(tǒng)，可以達(dá)到長效緩釋，減少給藥次數(shù)和藥物刺激，降低毒副作用，提高療效的目的。通常包埋藥物采用復(fù)乳法，在制備過程中蛋白與有機(jī)溶劑和油水界面的接觸，都可能影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)；且攪拌，超聲處理這些外界因素的干擾，易使其發(fā)生聚集、吸附、沉淀、氧化、脫酰胺、水解等一系列物理或化學(xué)變化。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)一旦遭到破壞，不但藥效下降，而且可能在體內(nèi)產(chǎn)生免疫原性和其他不良反應(yīng)。為了增加蛋白藥物在微球化過程中的穩(wěn)定性，一般需要將其與一些保護(hù)劑溶液混合后進(jìn)行凍干處理，常用的保護(hù)劑主要有兩類聚乙二醇類和糖類，但對殘留的測定和去除帶來困難，不利于大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。為了克服包埋過程中蛋白質(zhì)及其他藥物活性易被破壞的問題，可用有多孔結(jié)構(gòu)的微球吸附藥物來達(dá)到載藥目的。因?yàn)榫哂卸嗫捉Y(jié)構(gòu)的微球相比同等粒徑大小的常規(guī)微球， 能提供更多的比表面積，在以吸附法制備載藥微球制劑時(shí)，能顯著提高藥物的裝載量。粒徑的均一性是微球應(yīng)用的關(guān)鍵問題，因?yàn)榱讲痪粍荼卦斐芍苽渲貜?fù)性和治療重復(fù)性差的問題，難以報(bào)批臨床。中國專利(公開號CN101361716A)中使用攪拌法制備的聚乳酸多孔微球粒徑和孔徑分布不均一，難以提高載藥率和準(zhǔn)確調(diào)控藥物釋放及實(shí)驗(yàn)批次間的重復(fù)性。裝載藥物的可完全釋放也是限制載藥聚合物微球進(jìn)入臨床應(yīng)用的主要問題，疏水性的聚合物材料與所裝載的蛋白藥物之間易發(fā)生非特異性吸附，導(dǎo)致藥物的不完全釋放， 造成藥物的浪費(fèi)和生物利用度降低。中國專利(授權(quán)公告號CN100388970C)中使用的吸附藥物的微球材料是疏水性的聚乳酸(PLA)共聚物，這種疏水性材料在蛋白類藥物的后期釋放中，容易造成藥物的不完全釋放。而且膜材與蛋白之間的非特異性吸附作用易使蛋白發(fā)生聚集，降低藥物的活性。針對不同的疾病，所需的釋藥速度不同，例如，用于治療抗癌的藥物需要及時(shí)的大量釋放，以達(dá)到有效的藥物濃度；而用于治療糖尿病的胰島素等藥物，需要緩慢釋放來保證穩(wěn)定的藥物濃度，減少注射次數(shù)減輕病人的痛苦。因此，制備釋放速度可控的載藥微球十分必要。中國專利(公開號CN193i^81A)中使用乙基纖維素為膜材制備粒徑可控的多孔微球，但沒有對微球的降解速度進(jìn)行調(diào)控和研究，不利于藥物使用的普遍性?？偟膩碚f，在制備多孔載藥微球時(shí)，需要添加制孔劑，造成后期殘留測定困難，并且降低生物安全性；且現(xiàn)有的技術(shù)制備得到的微球粒徑和孔徑不均一，載藥率低，重復(fù)性差；釋放過程中蛋白藥物容易與微球骨架發(fā)生非特異性吸附，導(dǎo)致藥物不完全釋放并產(chǎn)生聚集體，從而產(chǎn)生免疫原性，導(dǎo)致失去活性；微球降解過程不可控，不利于擴(kuò)展應(yīng)用于多種疾病的治療。本發(fā)明針對多孔微球粒徑和孔徑分布不均一，載藥率低、不能控制釋放和藥物活性低等問題，提出采用一種兩嵌段的兩親性聚合物為材料，制備多孔微球作為藥物載體解決上述難題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種用于藥物載體的多孔微球。本發(fā)明的再一目的在于提供一種用于藥物載體的多孔微球的制備方法。本發(fā)明的還一目的在于提供一種用于藥物載體的多孔微球的藥物負(fù)載方法。根據(jù)本發(fā)明的用于藥物載體的多孔微球，所述微球的制備方法包括以下步驟1)將可降解兩嵌段兩親性聚合物材料溶于有機(jī)溶劑中，形成油相0 ；2)將油相0加入到含有穩(wěn)定劑的水相中W，形成0/W的預(yù)乳；3)將步驟2)所得的0/W預(yù)乳通過微孔膜，得到0/W乳液；4)將步驟幻所得到的乳液中的有機(jī)溶劑去除、固化，再經(jīng)離心洗滌和冷凍干燥， 得到多孔載藥微球；所述步驟1)中有機(jī)溶劑至少含有一種在水中溶解度低于2%的溶劑，所述有機(jī)溶劑包括二氯甲烷、三氯甲烷、二硫化碳和二甲苯中的一種或多種；所述步驟2)中油相0和水相W的體積比1 5 20。根據(jù)本發(fā)明的用于藥物載體的多孔微球，所述的預(yù)乳液的粒徑大小最好大于膜孔徑，預(yù)乳液的制備方法，可通過普通的乳化方式如均質(zhì)、超聲、機(jī)械攪拌等方法制備，所述的乳液中的有機(jī)溶劑的去除可采用減壓蒸發(fā)、常溫常壓攪拌揮發(fā)或溶劑萃取等方法中的一種或者幾種。根據(jù)本發(fā)明的用于藥物載體的多孔微球，所述的壓力可在l-20001tfa之間調(diào)節(jié)， 這主要由制備過程中使用的微孔膜孔徑的大小及目標(biāo)微球大小的制備要求所決定。根據(jù)本發(fā)明的用于藥物載體的多孔微球，所述的微孔膜包括疏水和親水的膜，優(yōu)選親水的膜，如采用親水性的SPG膜，該SPG膜為商品化產(chǎn)品，在制備過程中，可通過選擇不同膜孔徑的SPG膜來控制產(chǎn)品的粒徑大小，常用的微孔膜孔徑為0. 5-200μπι，優(yōu)選的為 1. 4-50 μ m,更優(yōu)選的為 2. 8-18 μ m。根據(jù)本發(fā)明的用于藥物載體的多孔微球，所述的聚合物材料的選擇面很廣，不僅可以選擇兩親性材料，如聚乳酸、聚乳酸-聚羥基乙酸共聚物、聚己內(nèi)酯、聚原酸酯、聚酸酐、聚磷腈分別與聚乙二醇共聚所得的聚合物材料中的任意一種，也可以將其不同種類不同分子量的聚合物復(fù)配混合使用。根據(jù)本發(fā)明的用于藥物載體的多孔微球，所述的有機(jī)溶劑可選自水中的溶解度低于2% (不包括2%)的有機(jī)溶劑，如二氯甲烷、三氯甲烷、二硫化碳和二甲苯等有機(jī)溶劑中的任意一種或多種，具體種類或體積需視所用膜材等制備參數(shù)而定。
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根據(jù)本發(fā)明的用于藥物載體的多孔微球，所述的步驟幻可重復(fù)多次，即將步驟3) 所得的乳液作為預(yù)乳用壓力再次通過微孔膜，直至得到的乳液的粒徑大小與均一性滿足要求。根據(jù)本發(fā)明的用于藥物載體的多孔微球，所述的外水相穩(wěn)定劑可選自聚乙烯醇、 聚甘油脂肪酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐單油酸酯(TweenSO)、聚氧乙烯山梨糖醇酐月桂酸酯 (Tween20)、十二烷基磺酸鈉(SDQ等一種或幾種，穩(wěn)定劑使用濃度優(yōu)選為0. IOwt %。本發(fā)明還提供了采用所述多孔微球進(jìn)行藥物負(fù)載的方法，該方法包括以下步驟按1 2 100的質(zhì)量比將藥物與多孔微球混合，振蕩使多孔微球?qū)λ幬镂?，離心收集微球，洗去未吸附的藥物，冷凍干燥，得到吸附有藥物的多孔載藥微球；所述藥物為選自多肽、蛋白類、多糖、核酸、疫苗中的一種，本發(fā)明制備得到的載藥微球?qū)τ谒幬锞哂泻芨叩尼尫怕室约氨３至己玫纳锘钚?，尤其對于多肽、蛋白類物質(zhì)效果更加明顯，很好的解決了上述難題。由于多糖、核酸和疫苗類藥物在超聲、攪拌等強(qiáng)烈的制備條件下及與有機(jī)溶劑接觸時(shí)結(jié)構(gòu)和多肽、蛋白類物質(zhì)一樣，極易破壞而導(dǎo)致失活，因此，在本發(fā)明中通過多孔微球?qū)@類藥物進(jìn)行吸附制備載藥微球，能很好的保持藥物活性， 同樣具有良好的效果。本發(fā)明還提供了一種用于藥物載體的多孔微球的制備方法，所述方法包括以下步驟1)將可降解兩嵌段兩親性聚合物材料溶于溶劑中，形成油相0 ；2)將油相0加入到含有穩(wěn)定劑的水相中W，形成0/W的預(yù)乳；3)將步驟2)所得的0/W預(yù)乳通過微孔膜，得到0/W乳液；4)將步驟幻所得到的乳液中的有機(jī)溶劑去除、固化，再經(jīng)離心洗滌和冷凍干燥， 得到多孔載藥微球；所述步驟1)中溶劑至少含有一種在水中溶解度低于2%的有機(jī)溶劑，所述有機(jī)溶劑包括二氯甲烷、三氯甲烷、二硫化碳和二甲苯中的一種或多種；所述步驟2)中油相0和水相W的體積比1 5 20。本發(fā)明提供的尺寸均一的多孔微球，該微球尺寸均一、可控、直徑分布系數(shù)(CV)
值在20 %以內(nèi)，更優(yōu)選的在15 %以內(nèi)。藥物裝載率最高可達(dá)50 %，釋放過程中蛋白多
肽類藥物活性保持率在90%以上，能瞬間釋放或持續(xù)釋放1周至12周。粒徑分布系數(shù)
(Coefficient of Variation, CV)采用數(shù)球法測定，測定300個粒子的粒徑，按下面的公式
計(jì)算粒子的粒徑分布系數(shù)(CV)。
— 1CF= T\ /d
N
ν!=1J其中Cli為單個粒子的粒徑，J為粒子的數(shù)均粒徑，N為粒子的總數(shù)，N > 300個。根據(jù)本發(fā)明的用于藥物載體的多孔微球，所述微球的平均粒徑范圍在 500nm-100 μ m，所述的聚合物微球在制備過程中至少采用了一種兩嵌段的兩親性聚合物材料并且至少采用了一種在水中的溶解度低于2% (不包括2%)的有機(jī)溶劑，更有利于提高藥物的裝載率、保持生物活性和可持續(xù)釋放。本發(fā)明中采用快速膜乳化方法制備出粒徑和孔徑均一可控，載藥率高，能控制釋
6放，且藥物活性高的多孔微球。其中，膜乳化技術(shù)保證了載藥微球粒徑均一可控，制備乳液時(shí)首先選用普通的乳化方式如均質(zhì)、超聲、機(jī)械攪拌等方法制備，通過這些常規(guī)的方法制得的乳液粒徑大于膜孔徑，然后在壓力的作用下將這些粒徑大于膜孔徑的預(yù)復(fù)乳通過微孔膜后，便可以得到粒徑和微孔膜一致的復(fù)乳液，可以多次重復(fù)的操作直至得到的乳液的粒徑大小與均一性滿足要求。其次，采用的兩嵌段共聚物含有親水性鏈段，在固化過程中，由于有機(jī)溶劑在微球表面產(chǎn)生快速爆沸而成孔，因?yàn)橛H水性鏈段在微球表面均一分布，因此爆沸速度相同，產(chǎn)生的孔道孔徑均一；同時(shí)，通過采用不同親水性鏈段所占比例的膜材和控制油水比例，能控制微球的孔徑。再次，因?yàn)槎嗫孜⑶虻谋缺砻娣e相對于光滑的微球明顯提高，因而吸附的位點(diǎn)增加，能獲得較高的載藥率。通過控制膜材的分子量和在有機(jī)溶劑中的濃度能控制微球的降解速率，膜材分子量、聚合物中親水嵌段所占比例、油水比以及聚合物在有機(jī)溶劑中的濃度都會影響微球的降解速率，從而可以通過調(diào)節(jié)以上參數(shù)來控制藥物的釋放速率。聚合物分子量越低，聚合物在有機(jī)溶劑中的濃度越低，微球骨架越疏松，利于微球的降解，從而藥物釋放速率較快；反之，提高聚合物分子量和聚合物在有機(jī)溶劑中的濃度，微球骨架緊實(shí)，微球降解慢，釋藥速率也慢。聚合物中其中親水嵌段所占的比例越高，微球與周圍水環(huán)境接觸的機(jī)會越多，親水鏈降解的速率越快，而且微球孔徑也隨著親水嵌段的比例增加而增加，從而提高釋藥速度；反之降低聚合物中其中親水嵌段所占的比例，釋藥速率隨之降低。外水相體積越大，微球孔徑越大，突釋越大；反之，外水相體積減小，孔徑越小，突釋降低，因此可以根據(jù)病情需要，制備不同的多孔載藥微球，從而達(dá)到控制藥物釋放速率的目的；同時(shí)，親水性鏈段分布在微球表面，避免了疏水性微球與蛋白的非特異性吸附而導(dǎo)致的不完全釋放。 吸附法制備載藥微球避免了超聲、攪拌等制備條件以及有機(jī)溶劑和油水界面對藥物活性的影響，很好的保持藥物活性。本發(fā)明中利于制備多孔微球的條件是使用在水中溶解度低于2%的有機(jī)溶劑， 油相與水相比小于1 5，兩親性聚合材料中親水嵌段所占比例為4 20%。若使用的有機(jī)溶劑在水中溶解度高于2%，油水比大于1 5，兩親性聚合材料中親水嵌段所占比例低于4%，不利于制備多孔微球。若油水比小于1 20，兩親性聚合材料中親水嵌段所占比例高于20%，不利于制備規(guī)則球形的微球。因?yàn)閮汕抖蔚膬捎H性聚合物(由疏水性的鏈段和親水性的鏈段交替聚合而成的線性共聚物，該聚合物同時(shí)具備親水性和疏水性)，可以很好的解決蛋白類藥物與微球膜材之間的非特異性吸附，保證藥物的完全釋放；另外，以兩親型聚合物為微球材料還可以穩(wěn)定制備孔徑均一的微球，從而可以獲得較高的載藥率。由于兩親性材料中的親水性部分本身具有類似于制孔劑的性質(zhì)，在制備過程中不需要額外添加制孔劑，降低了生產(chǎn)成本，解決了殘留測定的困難，利于提高生物安全性。采用快速膜乳化法可實(shí)現(xiàn)制備出粒徑均一，大小可控的多孔微球，因?yàn)榱酱笮∨c藥物釋放有緊密聯(lián)系，從而可以通過調(diào)節(jié)微球粒徑大小達(dá)到控制釋放周期的目的。本發(fā)明公開的制備方法與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明方法制備效率很高，乳液過膜時(shí)的流速大小高達(dá)lOmls—1，因而制備過程大多瞬間完成。本發(fā)明提供了一種多孔載藥微球，其特征在于，所述微球的直徑分布系數(shù)在20%以內(nèi)，藥物載藥率最高達(dá)50 %，釋放過程中蛋白多肽類藥物活性保持率在90 %以上，能瞬間釋放或者持續(xù)釋放1周至12周。本發(fā)明提供了一種快速制備尺寸均一的多孔載藥微球的方法，并可通過控制制備過程中的微孔膜孔徑大小和操作壓力來控制產(chǎn)品的粒徑大小。本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)無法制備粒徑均一的多孔載藥微球的問題，保證了實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性，利于藥物療效的穩(wěn)定性和工業(yè)化放大生產(chǎn)。本發(fā)明不需要在油相額外添加制孔劑，即可達(dá)到制備多孔微球的效果，免去了后期測殘留帶來的困難，同時(shí)利于降低成本。本發(fā)明克服了傳統(tǒng)緩釋多孔微球在后期不能完全釋放的問題，并且在裝載藥物， 釋放和儲存過程中都能有效保持藥物活性。本發(fā)明方法操作簡單、條件溫和并且易于工業(yè)化放大生產(chǎn)。


圖1為本發(fā)明的載藥微球的制備流程示意圖；圖2為實(shí)施例1制備的微球的電鏡圖；圖3為實(shí)施例1制備的微球的粒徑分布圖；圖4為實(shí)施例2制備的微球的電鏡圖；圖5為實(shí)施例3制備的微球的電鏡圖；圖6為實(shí)施例4制備的微球的電鏡圖；圖7為實(shí)施例5制備的微球的電鏡圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的描述，但本發(fā)明不僅僅限制于該實(shí)施例中。實(shí)施例1將孔徑為2. 8 μ m的親水性微孔膜置于水中浸潤，使孔膜充分濕潤。將0. 4g的分子量為1萬的聚乳酸-聚乙二醇共聚物(PELA)(親水嵌段所占的比例為4% )溶于8ml 二氯甲烷中，作為油相，將該油相加入到80ml的wt的聚乙二醇(PVA)水溶液中，油相和水相的比例為1 10，磁力攪拌300rpm攪拌Imin制備預(yù)乳，再將該預(yù)乳液在400kPa的操作壓力下壓過微孔膜裝置(如圖1)，得到乳液，乳液過膜時(shí)間小于10s，再將乳液在室溫下攪拌Mh以除去有機(jī)溶劑二氯甲烷，再經(jīng)離心洗滌即得到載藥微球。將所得的微球真空干燥4 得到成品微球。干燥后的微球重新分散在水中，利用場發(fā)射掃描電鏡(JEOL SEM Company, Japan)觀察微球的表面形貌(如圖幻。微球的體積平均粒徑及其分布用激光粒度儀(Malvern Company,USA)測定(如圖3)，經(jīng)測定微球的平均粒徑為627nm，粒度分布系數(shù) CV值為12. 53%。將0. 2g微球置于小離心管中，加入5mL胰高血糖素樣肽-I(GLP-I)溶液， 在一定溫度下吸附Mh，然后將未吸附的GLP-I溶液在5000rpm下離心分離，測定未吸附的 GLP-I質(zhì)量，通過計(jì)算定量得到微球?qū)τ贕PL-I的載藥率為37.8%。準(zhǔn)確稱量30mg凍干微球，加入 IOml ρΗ7· 4 的 PBS 緩沖液(8g NaCl,0. 2g KC1，0. 24g KH2PO4,1. 8IgNa2HPO4 · H2O, 0. 5g NaN3,0. Ig Tween20和1000ml蒸餾水)。樣品管置于37 °C水浴恒溫振蕩器振搖 (120rpm)。定期離心分離，取出1. Oml上清液，同時(shí)補(bǔ)入1. Oml新鮮PBS緩沖液。上清液中蛋白含量以BCA試劑和micro-BCA試劑盒則定。經(jīng)測定，6周內(nèi)微球持續(xù)釋放GLP-I累積達(dá)到97.2%,且釋放出的GLP-I活性保持率為96. 5%0實(shí)施例2將孔徑為7. 2 μ m的親水性膜置于水中浸潤，使孔膜充分濕潤。將0. 7g的分子量為5萬的聚乳酸-聚羥基乙酸和聚乙二醇共聚物(親水嵌段所占的比例為10%)溶于IOml 三氯甲烷中，作為油相，將該油相加入到50ml的1. 2% wt的PVA水溶液中，油相和水相的比例為1 5，磁力攪拌300rpm攪拌Imin制備預(yù)乳，再將該預(yù)乳液在2001tfa的操作壓力下壓過微孔膜裝置，得到乳液，乳液過膜時(shí)間小于10s，再將乳液在室溫下攪拌Mh以除去有機(jī)溶劑三氯甲烷，再經(jīng)離心洗滌即得到載藥微球。將所得的微球真空干燥4 得到成品微球。 干燥后的微球重新分散在水中，利用場發(fā)射掃描電鏡(JEOL SEM Company, Japan)觀察微球的表面形貌(如圖4)。微球的體積平均粒徑及其分布用激光粒度儀(Malvern Company, USA)測定，經(jīng)測定，微球的平均粒徑為4. 12 μ m,粒度分布系數(shù)CV值為12. 67%。將0. 2g微球置于小離心管中，加入5mL胰島素溶液，在一定溫度下吸附46h，然后將未吸附的胰島素溶液在5000rpm下離心分離，測定未吸附的胰島素質(zhì)量，通過計(jì)算定量得到微球?qū)τ谝葝u素的載藥率為36. 9%。準(zhǔn)確稱量30mg凍干微球，加入IOml pH7. 4的PBS緩沖液(8g NaCl, 0. 2gKCl，0. 24g KH2PO4,1. 81g Na2HPO4 · H20,0. 5g NaN3,0. Ig Tween20 禾口 1000ml 蒸餾水)。 樣品管置于37°C水浴恒溫振蕩器振搖(120rpm)。定期離心分離，取出1. Oml上清液，同時(shí)補(bǔ)入1. Oml新鮮PBS緩沖液。上清液中蛋白含量以BCA試劑和micro-BCA試劑盒則定。經(jīng)測定，5周內(nèi)微球持續(xù)釋放胰島素累積達(dá)到95. 8%，且釋放出的胰島素活性保持率為94. 7%0實(shí)施例3將孔徑為9 μ m的親水性膜置于水中浸潤，使孔膜充分濕潤。將0. Sg的分子量為 2萬的聚乳酸-聚乙二醇共聚物(親水嵌段所占的比例為20%)溶于15ml 二硫化碳中，作為油相，將該油相加入到300ml的1. 4% wt的PVA水溶液中，油相和水相的比例為1 20， 磁力攪拌300rpm攪拌Imin制備預(yù)乳，再將該預(yù)乳液在150kPa的操作壓力下壓過微孔膜裝置，得到乳液，乳液過膜時(shí)間小于10s，再將乳液在室溫下攪拌Mh以除去有機(jī)溶劑三氯甲烷，再經(jīng)離心洗滌即得到載藥微球。將所得的微球真空干燥4 得到成品微球。干燥后的微球重新分散在水中，利用場發(fā)射掃描電鏡(JEOL SEM Company, Japan)觀察微球的表面形貌(如圖5)。微球的體積平均粒徑及其分布用激光粒度儀(Malvern Company, USA)測定，經(jīng)測定，微球的平均粒徑為4. 17 μ m,粒度分布系數(shù)CV值為13. 74 %。將0. 2g微球置于小離心管中，加入5mL重組生長激素溶液，在一定溫度下吸附36h，然后將未吸附的重組人生長激素溶液在5000rpm下離心分離，測定未吸附的重組人生長激素質(zhì)量，通過計(jì)算定量得到微球?qū)τ谥亟M人生長激素的載藥率為22. 8%。準(zhǔn)確稱量30mg凍干微球，加入IOml ρΗ7· 4 的PBS緩沖液(8g NaCl, 0. 2g KCl，0. 24g KH2PO4,1. 81g Na2HPO4 ·Η20，0· 5g NaN3,0. Ig Tween20和1000ml蒸餾水)。樣品管置于37°C水浴恒溫振蕩器振搖(120rpm)。定期離心分離，取出1.0ml上清液，同時(shí)補(bǔ)入1.0ml新鮮PBS緩沖液。上清液中蛋白含量以BCA試劑和micro-BCA試劑盒則定。經(jīng)測定，7周內(nèi)微球持續(xù)釋放生長激素累積達(dá)到94. 8%，且釋放出的生長激素活性保持率為95. 4%。實(shí)施例4將孔徑為18 μ m的親水性膜置于水中浸潤，使孔膜充分濕潤。將Ig的分子量為3萬的聚己內(nèi)酯-聚乙二醇共聚物(親水嵌段所占的比例為15% )溶于20ml 二甲苯中，作為油相，將該油相加入到160ml的1. 5% wt的PVA水溶液中，油相和水相的比例為1 8， 磁力攪拌300rpm攪拌Imin制備預(yù)乳，再將該預(yù)乳液在IOOkPa的操作壓力下壓過微孔膜裝置，得到乳液，乳液過膜時(shí)間小于10s，再將乳液在室溫下攪拌24h以除去有機(jī)溶劑三氯甲烷，再經(jīng)離心洗滌即得到載藥微球。將所得的微球真空干燥4 得到成品微球。干燥后的微球重新分散在水中，利用場發(fā)射掃描電鏡(JEOL SEM Company，Japan)觀察微球的表面形貌(如圖6)。微球的體積平均粒徑及其分布用激光粒度儀(Malvern Company,USA)測定， 經(jīng)測定，微球的平均粒徑為7. 62 μ m，粒度分布系數(shù)CV值為14. 65%。將0. 2g微球置于小離心管中，加入5mL亮丙瑞林溶液，在一定溫度下吸附Mh，然后將未吸附的亮丙瑞林溶液在 5000rpm下離心分離，測定未吸附的亮丙瑞林質(zhì)量，通過計(jì)算定量得到微球?qū)τ诹帘鹆值妮d藥率為47. 8%0準(zhǔn)確稱量30mg凍干微球，加入IOml ρΗ7· 4的PBS緩沖液(8g NaCl, 0. 2g KCl，0. 24gKH2P04,1. 81g Na2HPO4 · H20,0. 5g NaN3,0. Ig Tween20 和 1000ml 蒸餾水)。樣品管置于37°C水浴恒溫振蕩器振搖(120rpm)。定期離心分離，取出1. Oml上清液，同時(shí)補(bǔ)入 1.0ml新鮮PBS緩沖液。上清液中亮丙瑞林含量用液相則定。經(jīng)測定，8周內(nèi)微球持續(xù)釋放亮丙瑞林累積達(dá)到98. 2%，且釋放出的亮丙瑞林活性保持率為97. 9%。實(shí)施例5將孔徑為50. 2 μ m的親水性膜置于水中浸潤，使孔膜充分濕潤。將1. 2g的分子量為4萬的聚乳酸-聚乙二醇共聚物(親水嵌段所占的比例為6 % )溶于30ml 二氯甲烷與三氯甲烷復(fù)配的溶劑(體積被為1 1)中作為油相，將該油相加入到300ml的2wt%的PVA 水溶液中，油相和水相的比例為1 10，磁力攪拌300rpm攪拌Imin制備預(yù)乳，再將該預(yù)乳液在70kPa的操作壓力下壓過微孔膜裝置，得到乳液，乳液過膜時(shí)間小于10s，再將乳液在室溫下攪拌Mh以除去有機(jī)溶劑二氯甲烷，再經(jīng)離心洗滌即得到載藥微球。將所得的微球真空干燥4 得到成品微球。干燥后的微球重新分散在水中，利用場發(fā)射掃描電鏡(JE0L SEM Company，Japan)觀察微球的表面形貌(如圖7)。微球的體積平均粒徑及其分布用激光粒度儀(Malvern Company, USA)測定，經(jīng)測定，微球的平均粒徑為20. 72 μ m，粒度分布系數(shù) CV值為14. 16%。將0. 2g微球置于小離心管中，加入5mL乙肝疫苗溶液，在一定溫度下超聲吸附20h，然后將未吸附的促黃體激素(LHRH)溶液在5000rpm下離心分離，測定未吸附的 LHRH質(zhì)量，通過計(jì)算定量得到微球?qū)τ贚HRH的載藥率為39. 2%。準(zhǔn)確稱量30mg凍干微球， 加入 IOml ρΗ7· 4 的PBS緩沖液(8g NaCl, 0. 2g KCl，0.24g KH2PO4,1. 81g Na2HPO4 ·Η20,0. 5g NaN3,0. Ig Tween20和1000ml蒸餾水)。樣品管置于37°C水浴恒溫振蕩器振搖(120rpm)。 定期離心分離，取出1.0ml上清液，同時(shí)補(bǔ)入1.0ml新鮮PBS緩沖液。上清液中LHRH用BCA 試劑和micro-BCA試劑盒則定。經(jīng)測定，4周內(nèi)微球持續(xù)釋放LHRH累積達(dá)到99. 0%，且釋放出的LHRH活性保持率為96. 3%。
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權(quán)利要求
1.一種用于藥物載體的多孔微球，其特征在于，所述微球的制備方法包括以下步驟1)將可降解兩嵌段兩親性聚合物材料溶于有機(jī)溶劑中，形成油相0；2)將油相0加入到含有穩(wěn)定劑的水相中W，形成0/W的預(yù)乳；3)將步驟2、所得的0/W預(yù)乳通過微孔膜，得到0/W乳液；4)將步驟幻所得到的乳液中的有機(jī)溶劑去除、固化，再經(jīng)離心洗滌和冷凍干燥，得到多孔載藥微球；所述步驟1)中有機(jī)溶劑至少含有一種在水中溶解度低于2%的溶劑；所述步驟2)中油相0和水相W的體積比1 5 20。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于藥物載體的多孔微球，其特征在于，所述步驟1)中，所述有機(jī)溶劑包括二氯甲烷、三氯甲烷、二硫化碳和二甲苯中的一種或多種；所述步驟1)兩嵌段兩親性聚合物材料包括聚乳酸、聚乳酸-聚羥基乙酸共聚物、聚己內(nèi)酯、聚原酸酯、聚酸酐、聚磷腈中的一種或多種與聚乙二醇共聚所得的兩親性聚合材料， 其分子量為1萬 10萬，該兩親性聚合材料中親水嵌段所占比例為4 20% ；所述步驟2、水相中的穩(wěn)定劑包括聚乙烯醇、聚甘油脂肪酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐單油酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐月桂酸酯和十二烷基磺酸鈉中的一種或幾種，穩(wěn)定劑濃度為 0. Iwt % IOwt %。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于藥物載體的多孔微球，其特征在于，所述有機(jī)溶劑包括二氯甲烷和三氯甲烷中的一種或兩種，所述兩嵌段兩親性聚合物材料包括聚乳酸、聚乳酸-聚羥基乙酸共聚物或聚己內(nèi)酯與聚乙二醇共聚所得的兩親性聚合材料。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于藥物載體的多孔微球，其特征在于，所述步驟3)中微孔膜的孔徑為0. 5 200 μ m，通過微孔膜的壓力為1 2000kPa。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于藥物載體的多孔微球，其特征在于，所述藥物為選自多肽、蛋白類、多糖、核酸和疫苗類中的一種。
6.一種用于藥物載體的多孔微球的制備方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟1)將可降解兩嵌段兩親性聚合物材料溶于有機(jī)溶劑中，形成油相0；2)將油相0加入到含有穩(wěn)定劑的水相中W，形成0/W的預(yù)乳；3)將步驟2、所得的0/W預(yù)乳通過微孔膜，得到0/W乳液；4)將步驟幻所得到的乳液中的有機(jī)溶劑去除、固化，再經(jīng)離心洗滌和冷凍干燥，得到多孔載藥微球；所述步驟1)中有機(jī)溶劑至少含有一種在水中溶解度低于2%的溶劑；所述步驟2)中油相0和水相W的體積比1 5 20。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的用于藥物載體的多孔微球的制備方法，其特征在于，所述步驟1)中，所述有機(jī)溶劑包括二氯甲烷、三氯甲烷、二硫化碳和二甲苯中的一種或多種；所述步驟1)兩嵌段兩親性聚合物材料包括聚乳酸、聚乳酸-聚羥基乙酸共聚物、聚己內(nèi)酯、聚原酸酯、聚酸酐、聚磷腈中的一種或多種與聚乙二醇共聚所得的兩親性聚合材料， 其分子量為1萬 10萬，該兩親性聚合材料中親水嵌段所占比例為4 20% ；所述步驟幻水相中的穩(wěn)定劑包括聚乙烯醇、聚甘油脂肪酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐單油酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐月桂酸酯和十二烷基磺酸鈉中的一種或幾種，穩(wěn)定劑濃度為 0. Iwt % IOwt %。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的用于藥物載體的多孔微球的制備方法，其特征在于，所述有機(jī)溶劑包括二氯甲烷和三氯甲烷中的一種或兩種，所述兩嵌段兩親性聚合物材料包括聚乳酸、聚乳酸-聚羥基乙酸共聚物或聚己內(nèi)酯與聚乙二醇共聚所得的兩親性聚合材料。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的用于藥物載體的多孔微球的制備方法，其特征在于，所述步驟3)中微孔膜的孔徑為0. 5 200 μ m,通過微孔膜的壓力為1 2000kPa。
10.一種利用權(quán)利要求1所述用于藥物載體的多孔微球負(fù)載藥物的方法，其特征在于， 按1 2 100的質(zhì)量比將藥物與多孔微球混合。
全文摘要
本發(fā)明涉及多孔微球的制備領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種用于藥物載體的多孔微球、制備方法及藥物負(fù)載方法。所述方法包括以下步驟1)將可降解兩嵌段兩親性聚合物材料溶于有機(jī)溶劑中，形成油相O；2)將油相O加入到含有穩(wěn)定劑的水相中W，形成O/W的預(yù)乳；3)將步驟2)所得的O/W預(yù)乳通過微孔膜，得到O/W乳液；4)將步驟3)所得到的乳液中的有機(jī)溶劑去除、固化，再經(jīng)離心洗滌和冷凍干燥，得到多孔載藥微球；所述步驟1)中有機(jī)溶劑至少含有一種在水中溶解度低于2％的溶劑；所述油相O和水相W的體積比1∶5～20。本發(fā)明克服了傳統(tǒng)緩釋多孔微球在后期不能完全釋放的問題，并且在裝載藥物，釋放和儲存過程中都能有效保持藥物活性。
文檔編號A61K47/34GK102258786SQ20111016434
公開日2011年11月30日 申請日期2011年6月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月17日
發(fā)明者周煒清, 王玉霞, 蘇志國, 韋祎, 馬光輝 申請人:中國科學(xué)院過程工程研究所