專利名稱：一種用于填充與修復(fù)受損組織的可注射溫敏凝膠的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于填充與修復(fù)受損組織的可注射溫敏凝膠的制備方法，屬于醫(yī)用材料制造方法技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
可注射的填充和修復(fù)材料是一種智能高分子材料，是近十年來發(fā)展起來的一個較新的研究領(lǐng)域，是智能高分子材料的一個非常熱門的研究課題。溫敏性可注射的材料與常規(guī)可注射的材料相比，是利用仿生學(xué)的原理，以自然界中的生物體為藍(lán)本，開發(fā)出在功能上接近甚至超過生物體組織的溫敏高分子材料，從而實現(xiàn)無生物活性的生物材料向有生物活性的生物材料的過渡；增大其響應(yīng)敏感度，改善其通一斷特性。材料的熱力學(xué)可逆性使材料在常溫下流動性增強(qiáng)，利于注射，而體內(nèi)溫度材料固化，其定型性和可塑性增強(qiáng)。此外可注射凝膠在體內(nèi)與修復(fù)組織之間嵌合性好，實現(xiàn)原位注射達(dá)到微創(chuàng)目的，成為軟組織修復(fù)、重建、填充的熱點。因此，溫敏性可注射的凝膠材料的應(yīng)用具有顯著的優(yōu)勢。近年來，面部皮膚充填劑的發(fā)展非常迅速，其產(chǎn)品市場的年增長率為16. 9%,2012 年則有望超過16億美金，其中透明質(zhì)酸產(chǎn)品所占比重最大。在已有的可注射填充物及其制備方法的技術(shù)中，常采用的注射填充物是交聯(lián)的透明質(zhì)酸和膠原蛋白為主的凝膠其鹽溶液。例如由瑞典Q-Med公司開發(fā)并生產(chǎn)的透明質(zhì)酸皮膚填充劑瑞藍(lán)(restvlane)。玻尿酸(透明質(zhì)酸)是一種廣泛存在于生物和組織類型的多聚糖。1934年哥倫比亞大學(xué)Karl Meyer首先發(fā)現(xiàn)了透明質(zhì)酸，是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分之一，化學(xué)結(jié)構(gòu)上各物種間無差異。在皮膚中透明質(zhì)酸是吸附和維持水分的主要結(jié)構(gòu)，在儲存水分及鎖水功能方面，能有效地吸收儲存多達(dá)3000倍水分體積，非一般保濕因子所能提供。透明質(zhì)酸除了可以使肌膚保持水分、還可以使眼睛保持潤滑、關(guān)節(jié)保持彈性。因此，透明質(zhì)酸在眼科手術(shù)、關(guān)節(jié)炎治療和整形手術(shù)等領(lǐng)域有著十分優(yōu)良的使用記錄。但是純HA易溶于水、吸收迅速和在組織中停留時間短等物理和生物特性，限制其作為功能成分載體的使用，需要使用化學(xué)交聯(lián)修飾，以增大其分子量、延長降解時間，提高穩(wěn)定性。但是透明質(zhì)酸的單純交聯(lián)并不能緩解其快速的降解。仍需多次填充達(dá)到修復(fù)效果，因此對患者造成一定的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。就構(gòu)建皮膚填充劑和組織修復(fù)的材料而言，材料的熱力學(xué)的可逆性是至關(guān)重要。透明質(zhì)酸雖是促進(jìn)組織生長的生物材料但是不具備熱力學(xué)的可逆性。本發(fā)明制備的一種可注射溫敏凝膠，此凝膠體系具有玻尿酸和殼聚糖的協(xié)同作用，不光延長了注射部位修復(fù)的時間，而且更易于注射，并具有抗菌、抗凝血，生物體內(nèi)成型性好等性質(zhì)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種溫敏凝膠的制備方法。本發(fā)明的顯著特征是殼聚糖經(jīng)過處理與化學(xué)反應(yīng)，引入溫敏官能團(tuán)，制備溫敏凝膠。透明質(zhì)酸不經(jīng)過交聯(lián)直接用高碘酸鈉處理， 得到活性醛基，通過化學(xué)反應(yīng)與殼聚糖上的氨基基團(tuán)進(jìn)行反應(yīng)，得到具有溫敏性能的復(fù)合凝膠。該制造方法中，復(fù)合凝膠不需交聯(lián)聚合，簡化了生產(chǎn)步驟，節(jié)約了生產(chǎn)成本。同時溫敏性質(zhì)使其在常溫下流動性好，易于注射；生物體內(nèi)成型性好，降解緩慢。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下本發(fā)明的目的是提供一種通過化學(xué)反應(yīng)制備溫敏復(fù)合凝膠的制備方法。發(fā)明人通過接枝上異丙基丙酰胺制備溫敏殼聚糖以及活性醛基透明質(zhì)酸的制備， 通過化學(xué)反應(yīng)制備具有溫敏性質(zhì)的凝膠，從而具有易注射與持久的性質(zhì)。易注射溫敏凝膠的制備方法包括以下步驟(1)活性醛基透明質(zhì)酸制備將原料透明質(zhì)酸(HA)及去離子水配成溶液。加入高碘酸鈉水溶液，在避光、室溫條件下攪拌反應(yīng)。加入乙二醇溶液終止未反應(yīng)的高碘酸鈉。上述原料透明質(zhì)酸(HA)及去離子水配成濃度為為0. 01 20g/100ml ；上述高碘酸鈉水溶液濃度為0. 1 10M，體積為1 IOOml(2)將步驟(1)制得的凝膠用無水乙醇浸泡、洗滌、抽提，除去未反應(yīng)單體及其它雜質(zhì)，然后溶液透析純化，冷凍干燥獲得純凈的凝膠產(chǎn)物。(3)溫敏殼聚糖制備將適量的殼聚糖溶于1 98%的乙酸溶液中，緩慢加入一定量N-異丙基丙酰胺 (NIPAAm)和引發(fā)劑，室溫攪拌溶解后，通入氮氣在一定溫度下攪拌反應(yīng)。將上述反應(yīng)物用丙酮沉淀，過濾。真空干燥，制得具有溫敏性質(zhì)的凝膠產(chǎn)物；上述添加劑N-異丙基丙酰胺(NIPAAm)與殼聚糖按質(zhì)量比為1 90 90 1。上述引發(fā)劑包括過硫酸鉀(KPQ、偶氮二異丁腈、過氧化二酰、過氧化苯甲酰、或過氧化二叔丁基的一種。上述引發(fā)劑與殼聚糖的質(zhì)量比為0.02% 10%。(4)復(fù)合凝膠的制備室溫下，將步驟( 和( 中二種凝膠按一定質(zhì)量比配成均勻水溶液，室溫下攪拌反應(yīng)制備復(fù)合凝膠。然后此凝膠溶液透析純化，冷凍干燥獲得純凈的凝膠產(chǎn)物。將上述二種凝膠于室溫下用緩沖液PBS充分溶脹，配成注射液，并通過針管，以恒定速度推動勻化， 得到可注射的水凝膠。上述復(fù)合凝膠中透明質(zhì)酸與殼聚糖的配比為1 9 9 1上述復(fù)合凝膠與緩沖液PBS的濃度為0. 01 30mg/ml(5)對上述共聚方法中的各因素(如不同單體、引發(fā)劑、溫度、反應(yīng)時間等)對產(chǎn)物性能的影響規(guī)律進(jìn)行研究，采用正交試驗法，對各因素進(jìn)行評價，在深入了解影響規(guī)律的基礎(chǔ)上，對合成過程進(jìn)行計算機(jī)模擬。有益效果1.本發(fā)明制備易注射溫敏凝膠是通過溫敏殼聚糖的制備以及活性醛基透明質(zhì)酸的制備，通過化學(xué)反應(yīng)作用下將殼聚糖與透明質(zhì)酸結(jié)合起來，制得具有溫敏性質(zhì)的凝膠，制得的凝膠為常溫下流動的液體，在體內(nèi)溫度下為凝膠態(tài)。具有溶脹性、溫敏性、易推動性、抗菌、持久性、生物相容性好等特點，是一種理想的填充與修復(fù)的材料。本發(fā)明制備的溫敏性凝膠減少了交聯(lián)劑對人體及注射部位的損害。該凝膠體系不僅能延長其在體內(nèi)的存留時間，而且可不斷刺激機(jī)體產(chǎn)生應(yīng)答，即促進(jìn)組織的原位再生修復(fù)，以提高充填質(zhì)量。同時由于殼聚糖的加入降低了細(xì)菌的侵入以及過敏反應(yīng)低等優(yōu)點?？蓮V泛應(yīng)用于各種受損器官的修復(fù)物、愈合用器材、假體、體內(nèi)植入物、藥物釋放體系和醫(yī)療與美容等方面。2.復(fù)合凝膠具有高純度、無毒害、無刺激性、化學(xué)穩(wěn)定性好、降解、不引起炎癥、無過敏反應(yīng)、生物相容性好、不致癌、重金屬含量低、PH值小，不引起溶血和凝血等性能。復(fù)合凝膠還應(yīng)該具有所需的物理、力學(xué)性能和加工性能、并能經(jīng)受高溫消毒處理。3.復(fù)合凝膠的協(xié)同作用，具有一定強(qiáng)度和抗彎剛度，能抵抗人體缺損體壓的組織修補(bǔ)能力。另外，單純交聯(lián)透明質(zhì)酸得到的凝膠，由于其半衰期短，快速降解。因此需要多次注射，需要較大的經(jīng)濟(jì)成本。但是復(fù)合凝膠由于殼聚糖的抗菌性，有利于受創(chuàng)部位的愈合而不易引起受創(chuàng)部位的感染。同時由于其具有溫敏性質(zhì)具有較好的可注射性和生物相容性。 而其較長的半衰期使其具有長久性，不需多次注射，降低患者的經(jīng)濟(jì)壓力與多次注射痛苦。 另外由于復(fù)合凝膠是可降解的，當(dāng)注射部位發(fā)生變形或不理想時，可用溶解酶溶化，不需經(jīng)手術(shù)去除，減少患者的痛苦。


圖1是本發(fā)明實施例2制備出的可注射的溫敏凝膠反應(yīng)示意圖。圖2是本發(fā)明實施例2制備出的可注射的溫敏凝膠的紅外光譜圖。圖3是本發(fā)明實施例2制備出的可注射的溫敏凝膠的相變分析圖。圖4是本發(fā)明實施例2制備出的可注射的溫敏凝膠的溶脹動力學(xué)曲線。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。實施例1(1)活性醛基透明質(zhì)酸的制備將原料透明質(zhì)酸及去離子水按配比O.Olg/lOOml混合，加入0. 1M，IOOmL的高碘酸鈉水溶液，在室溫下避光攪拌反應(yīng)后加入乙二醇溶液，在常溫下攪拌反應(yīng)，制得醛基透明質(zhì)酸；(2)將制得的凝膠用無水乙醇浸泡、洗滌、抽提，除去未反應(yīng)單體及其它雜質(zhì)，然后溶液透析純化，冷凍干燥獲得得到純凈的凝膠產(chǎn)物；(3)溫敏殼聚糖制備將0. 2g的CS溶于1 %的乙酸溶液中，緩慢加入0. 2g N-異丙基丙酰胺(NIPAAm) 和^ig過硫酸鉀(KPQ，室溫攪拌溶解后，通入氮氣攪拌反應(yīng)。將上述反應(yīng)物用丙酮沉淀，過濾。真空干燥，制得具有溫敏性質(zhì)的凝膠產(chǎn)物；(4)復(fù)合凝膠的制備(4. 1)室溫下，將步驟( 得到的透明質(zhì)酸凝膠和步驟C3)得到的溫敏殼聚糖凝膠，將上述二種凝膠透明質(zhì)酸與殼聚糖按質(zhì)量比1/9配成20mg/mL的水溶液，室溫下攪拌反應(yīng)，制備復(fù)合凝膠；
(4. 2)將上述步驟(4. 1)的凝膠溶液透析純化，冷凍干燥獲得純凈的凝膠產(chǎn)物。將上述二種凝膠于室溫下用緩沖液PBS配制成濃度為lmg/ml的溶液充分溶脹，并通過2. 5ml 的針管，以恒定速度推動勻化3遍。得到可注射的水凝膠。實施例2(1)活性醛基的透明質(zhì)酸的制備將原料透明質(zhì)酸及去離子水按配比lg/100ml混合，加入0. 5M, 5mL的高碘酸鈉水溶液，在室溫下避光攪拌反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后加入乙二醇溶液，在常溫下攪拌反應(yīng)。制得透明質(zhì)酸凝膠；(2)將制得的凝膠用無水乙醇浸泡、洗滌、抽提，除去未反應(yīng)單體及其它雜質(zhì)，然后溶液透析純化，冷凍干燥獲得得到純凈的凝膠產(chǎn)物；(3)溫敏殼聚糖制備將0. 2g的殼聚糖溶于5%的乙酸溶液中，緩慢加入2g N-異丙基丙酰胺(NIPAAm) 和^ig偶氮二異丁腈，室溫攪拌溶解后，通入氮氣攪拌反應(yīng)。將上述反應(yīng)物用丙酮沉淀，過濾。真空干燥，制得具有溫敏性質(zhì)的凝膠產(chǎn)物；(4)復(fù)合凝膠的制備(4. 1)室溫下，將步驟(2)得到的透明質(zhì)酸和步驟(3)得到的溫敏殼聚糖凝膠，將上述二種凝膠透明質(zhì)酸與殼聚糖按質(zhì)量比1/9配成20mg/ml的水溶液，室溫下反應(yīng)制備復(fù)合凝膠；(4. 2)將上述步驟(4. 1)的凝膠溶液透析純化，冷凍干燥獲得純凈的凝膠產(chǎn)物。將上述二種凝膠于室溫下用緩沖液PBS配制成濃度為20mg/ml的溶液充分溶脹，并通過2. 5ml 的針管，以恒定速度推動勻化3遍。得到可注射的水凝膠。實施例3(1)活性醛基的透明質(zhì)酸的制備
將原料透明質(zhì)酸及去離子水按配比20g/100ml混合，加入10M，IOOml的高碘酸鈉水溶液，在室溫下避光攪拌反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后加入乙二醇溶液，在常溫下攪拌反應(yīng)。制得透明質(zhì)酸凝膠；(2)將制得的凝膠用無水乙醇浸泡、洗滌、抽提，除去未反應(yīng)單體及其它雜質(zhì)，然后溶液透析純化，冷凍干燥獲得得到純凈的凝膠產(chǎn)物；(3)溫敏殼聚糖制備
將0. 2g的CS溶于98%乙酸溶液中，緩慢加入18g N-異丙基丙酰胺(NIPAAm)和 Img過硫酸鉀(KPQ，室溫攪拌溶解后，通入氮氣攪拌反應(yīng)。將上述反應(yīng)物用丙酮沉淀，過濾。真空干燥，制得具有溫敏性質(zhì)的凝膠產(chǎn)物；(4)復(fù)合凝膠的制備(4. 1)室溫下，將步驟(2)得到的透明質(zhì)酸和步驟⑶得到的溫敏殼聚糖凝膠，將上述二種凝膠透明質(zhì)酸與殼聚糖按質(zhì)量比5/5配成20mg/ml的水溶液，室溫下攪拌反應(yīng)，制備復(fù)合凝膠；(4. 2)將上述步驟(4. 1)的凝膠溶液透析純化，冷凍干燥獲得純凈的凝膠產(chǎn)物。將上述二種凝膠于室溫下用緩沖液PBS配制成濃度為50mg/ml的溶液充分溶脹，并通過2. 5ml 的針管，以恒定速度推動勻化3遍。得到可注射的水凝膠。
實施例4(1)活性醛基透明質(zhì)酸的制備將原料透明質(zhì)酸及去離子水按配比10 100混合，加入0.5M，50ml的高碘酸鈉水溶液，在室溫下避光攪拌反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后加入乙二醇溶液，在常溫下攪拌反應(yīng)。制得透明質(zhì)酸凝膠；(2)將制得的凝膠用無水乙醇浸泡、洗滌、抽提，除去未反應(yīng)單體及其它雜質(zhì)，然后溶液透析純化，冷凍干燥獲得得到純凈的凝膠產(chǎn)物；(3)溫敏殼聚糖制備將0. 2g的CS溶于20 %的乙酸溶液中，緩慢加入2g N-異丙基丙酰胺(NIPAAm)和 2g過氧化苯甲酰，室溫攪拌溶解后，通入氮氣攪拌反應(yīng)。將上述反應(yīng)物用丙酮沉淀，過濾。 真空干燥，制得具有溫敏性質(zhì)的凝膠產(chǎn)物；(4)復(fù)合凝膠的制備(4. 1)室溫下，將步驟(2)得到的透明質(zhì)酸和步驟⑶得到的溫敏殼聚糖凝膠，將上述二種凝膠透明質(zhì)酸與殼聚糖按質(zhì)量比5/5配成lmg/ml的水溶液，室溫下攪拌反應(yīng)，制備復(fù)合凝膠；(4. 2)將上述步驟(4. 1)的凝膠溶液透析純化，冷凍干燥獲得純凈的凝膠產(chǎn)物。 將上述二種凝膠于室溫下用緩沖液PBS配制成濃度為0. 0lmg/ml的溶液充分溶脹，并通過 2. 5ml的針管，以恒定速度推動勻化3遍。得到可注射的水凝膠。實施例5(1)活性醛基的透明質(zhì)酸的制備將原料透明質(zhì)酸及去離子水按配比1 100mg/ml混合，加入0. 5M，5mL的高碘酸鈉水溶液，在室溫下避光攪拌反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后加入乙二醇溶液，在常溫下攪拌反應(yīng)。制得透明質(zhì)酸凝膠；(2)將制得的凝膠用無水乙醇浸泡、洗滌、抽提，除去未反應(yīng)單體及其它雜質(zhì)，然后溶液透析純化，冷凍干燥獲得得到純凈的凝膠產(chǎn)物；(3)溫敏殼聚糖制備將0. 2g的CS溶于50 %的乙酸溶液中，緩慢加入2g N-異丙基丙酰胺(NIPAAm)和 ^ig過硫酸鉀(KPQ，室溫攪拌溶解后，通入氮氣攪拌反應(yīng)。將上述反應(yīng)物用丙酮沉淀，過濾。真空干燥，制得具有溫敏性質(zhì)的凝膠產(chǎn)物；(4)復(fù)合凝膠的制備(4. 1)室溫下，將步驟( 得到的透明質(zhì)酸和步驟C3)得到的溫敏殼聚糖凝膠，將上述二種凝膠透明質(zhì)酸與殼聚糖按質(zhì)量比5/5配成20mg/ml的水溶液，室溫下攪拌反應(yīng)，制備復(fù)合凝膠；(4. 2)將上述步驟(4. 1)的凝膠溶液透析純化，冷凍干燥獲得純凈的凝膠產(chǎn)物。將上述二種凝膠于室溫下用緩沖液PBS配制成濃度為50mg/ml的溶液充分溶脹，并通過2. 5ml 的針管，以恒定速度推動勻化3遍。得到可注射的水凝膠。
權(quán)利要求
1.一種用于填充與修復(fù)受損組織的可注射的溫敏凝膠的制備方法，其特征在于，該方法包括以下步驟(1)活性醛基透明質(zhì)酸制備將原料透明質(zhì)酸(HA)及去離子水配成一定濃度的溶液。 加入高碘酸鈉水溶液，在避光、室溫條件下攪拌反應(yīng)。加入乙二醇溶液終止未反應(yīng)的高碘酸鈉。(2)將步驟(1)制得的凝膠用無水乙醇浸泡、洗滌、抽提，除去未反應(yīng)單體及其它雜質(zhì)， 然后溶液透析純化，冷凍干燥獲得得到純凈的凝膠產(chǎn)物。(3)溫敏殼聚糖制備將適量的殼聚糖溶于1 98%的乙酸溶液中，緩慢加入一定量 N-異丙基丙酰胺(NIPAAm)和引發(fā)劑，室溫攪拌溶解后，通入氮氣在一定溫度下攪拌反應(yīng)。 將上述反應(yīng)物用丙酮沉淀，過濾。真空干燥，制得具有溫敏性質(zhì)的凝膠產(chǎn)物；(4)復(fù)合凝膠的制備室溫下，將步驟( 和(3)中二種凝膠按一定質(zhì)量比配成均勻水溶液，室溫下攪拌反應(yīng)制備復(fù)合凝膠。然后此凝膠溶液透析純化，冷凍干燥獲得純凈的凝膠產(chǎn)物。將上述二種凝膠于室溫下用緩沖液PBS充分溶脹，配成注射液，并通過針管，以恒定速度推動勻化。得到可注射的水凝膠。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，采用的透明質(zhì)酸原料為從微生物體中提取或通過發(fā)酵得到。分子質(zhì)量為2萬至300萬。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，原料透明質(zhì)酸(HA)及去離子水配成濃度為為 0.01 50 100mg/ml。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，高碘酸鈉水溶液濃度為0.1 10M，體積為 1 100ml。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，殼聚糖來自于甲殼素脫乙?；?，脫乙酰度為15 95%。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，添加劑N-異丙基丙酰胺(NIPAAm)與殼聚糖按質(zhì)量比為1 90 90 1添加。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，引發(fā)劑為過硫酸鉀(KPS)、偶氮二異丁腈、過氧化二酰、過氧化苯甲酰、或過氧化二叔丁基的一種；引發(fā)劑與殼聚糖的質(zhì)量比為 0. 02% 10%。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，復(fù)合凝膠中透明質(zhì)酸與殼聚糖的配比為 1 9 9 1
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，復(fù)合凝膠與緩沖液的濃度為0.01 30mg/ml 。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于填充與修復(fù)受損組織的可注射溫敏凝膠，其特征在于采用醫(yī)用級透明質(zhì)酸與殼聚糖作為凝膠原料，該凝膠溶脹比為2～500，溫敏溫度32～37℃。該注射溫敏凝膠除了具有普通凝膠的物理化學(xué)性質(zhì)外，還具有可注射和溫敏性，在常溫下流動性好，易于注射；生物體內(nèi)成型性好，降解緩慢，是普通凝膠無法比較的；并且所述凝膠未使用交聯(lián)劑，避免了交聯(lián)劑對人體的傷害；該凝膠體系不僅能延長其在體內(nèi)的存留時間，而且可不斷刺激機(jī)體產(chǎn)生應(yīng)答，促進(jìn)組織的原位再生修復(fù)，提高填充質(zhì)量。同時，具有降低細(xì)菌的侵入、抗凝血以及過敏反應(yīng)低等優(yōu)點。
文檔編號A61L27/50GK102321248SQ20111015485
公開日2012年1月18日 申請日期2011年6月10日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月10日
發(fā)明者馮淑芹 申請人:馮淑芹