專利名稱：黃花菜及黃花菜總黃酮的新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種中藥及其有效部位的新用途，特別涉及黃花菜及黃花菜總黃酮新用途及其制備方法。
背景技術(shù)：
黃花菜又名“金針菜”、“一日百合”，俗稱忘憂草。屬百合科萱草屬植物，具有豐富的營養(yǎng)成份。其主要化學(xué)成分有蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物，還有多種維生素、生物堿、苷、黃酮類、胡蘿卜素、揮發(fā)油、鞣質(zhì)以及無機(jī)礦物鈣、磷。據(jù)《中藥大辭典》記載黃花菜含有生物堿0.7%，苷1.8%，黃酮類0.75%，β-胡蘿卜素0.36%。明代李時珍在《本草綱目》中稱其有安神醒腦、增智寬胸、美容養(yǎng)血、解熱消毒、除煩通乳之功效?，F(xiàn)代研究黃花菜具有補(bǔ)腦健智、化瘀止血、通絡(luò)止痛、抗菌消炎等功效。其中黃花菜總黃酮是其重要有效成分之一，它具有增強(qiáng)免疫力、活血化瘀、保肝抗炎、抗菌抗病毒、抑制腫瘤、清除氧自由基和抑菌作用等多種功能。目前對黃花菜總黃酮的提取研究很少，而對其應(yīng)用研究未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明第一個目的在于公開了黃花菜的新用途。本發(fā)明第二個目的在于公開黃花菜總黃酮的新用途。本發(fā)明第三個目的在于公開黃花菜總黃酮的制備方法。本發(fā)明目的是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的黃花菜在制備抗抑郁藥物中的應(yīng)用。黃花菜在制備升高腦皮質(zhì)中的5-羥色胺藥物中的應(yīng)用。
黃花菜在制備升高腦皮質(zhì)中的去甲腎上腺素藥物中的應(yīng)用。黃花菜在制備升高腦皮質(zhì)中的多巴胺藥物中的應(yīng)用。黃花菜在制備升高腦皮質(zhì)中的5-羥基吲哚乙酸藥物中的應(yīng)用。黃花菜在制備拮抗利血平藥物中的應(yīng)用。黃花菜總黃酮在制備抗抑郁藥物中的應(yīng)用。黃花菜總黃酮在制備升高腦皮質(zhì)中的5-羥色胺藥物中的應(yīng)用。黃花菜總黃酮在制備升高腦皮質(zhì)中的去甲腎上腺素藥物中的應(yīng)用。黃花菜總黃酮在制備升高腦皮質(zhì)中的多巴胺藥物中的應(yīng)用。黃花菜總黃酮在制備升高腦皮質(zhì)中的5-羥基吲哚乙酸藥物中的應(yīng)用。黃花菜總黃酮在制備拮抗利血平藥物中的應(yīng)用。黃花菜總黃酮可以按照現(xiàn)有技術(shù)的方法制備，本發(fā)明同時提供了一種制備黃花菜總黃酮的方法步驟1 將黃花菜60-95%乙醇加熱回流提取1_4次，每次0.5_1小時，過濾，合并濾液，回收乙醇，得浸膏A，殘渣I ；步驟2 殘渣I用20-80%乙醇加熱提取1_4次，每次20-60min，過濾，合并濾液， 回收乙醇，得浸膏B;步驟3 將浸膏A用蒸餾水稀釋后過濾，通過大孔樹脂柱，蒸餾水洗至流出液透明， 用20% -95%乙醇洗脫2-6倍柱體積，分別回收乙醇，得到樣品1 ；步驟4 將浸膏B用蒸餾水稀釋后過濾，通過大孔樹脂柱，蒸餾水洗至流出液透明， 先后用20% -95%乙醇洗脫2-6倍柱體積，分別回收乙醇，得到樣品2。步驟5 混合步驟3、步驟4的樣品制得黃花菜總黃酮。所述制備黃花菜總黃酮的方法優(yōu)選為步驟1 將黃花菜95%乙醇浸泡過夜，95%乙醇加熱提取3次，每次0.5-1小時，過濾，合并濾液，回收乙醇，得浸膏A，殘渣I ；步驟2 殘渣I用60%乙醇加熱提取2次，每次40min，過濾，合并濾液，回收乙醇，
得浸膏B ；步驟3 將浸膏A用蒸餾水稀釋后過濾，通過已處理好的AB-8大孔樹脂柱，蒸餾水洗至流出液透明，用60%乙醇洗脫3倍柱體積，回收乙醇，得到樣1 ；步驟4 將浸膏B用蒸餾水稀釋后過濾，通過已處理好的AB-8大孔樹脂柱，蒸餾水洗至流出液透明，用60 %乙醇洗脫3倍柱體積，回收乙醇，得到樣2 ；本發(fā)明黃花菜總黃酮還可以按常規(guī)的制劑工藝制成藥劑學(xué)可接受的任意常規(guī)劑型，例如膠囊劑、片劑、顆粒劑、散劑、口服液、丸劑等制劑。為使上述劑型能夠?qū)崿F(xiàn)，需在制備這些劑型時加入藥學(xué)可接受的輔料，例如填充劑、崩解劑、潤滑劑、助懸劑、粘合劑、甜味齊U、矯味劑、防腐劑、基質(zhì)等。填充劑包括淀粉、預(yù)膠化淀粉、乳糖、甘露醇、甲殼素、微晶纖維素、蔗糖等；崩解劑包括淀粉、預(yù)膠化淀粉、微晶纖維素、羧甲基淀粉鈉、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、低取代羥丙纖維素、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉等；潤滑劑包括硬脂酸鎂、十二烷基硫酸鈉、滑石粉、二氧化硅等；助懸劑包括聚乙烯吡咯烷酮、微晶纖維素、蔗糖、瓊脂、羥丙基甲基纖維素等；粘合劑包括，淀粉漿、聚乙烯吡咯烷酮、羥丙基甲基纖維素等；甜味劑包括 糖精鈉、阿斯帕坦、蔗糖、甜蜜素、甘草次酸等；矯味劑包括甜味劑及各種香精；防腐劑包括尼泊金類、苯甲酸、苯甲酸鈉、山梨酸及其鹽類、苯扎溴銨、醋酸氯乙定、桉葉油等；基質(zhì)包括PEG6000，PEG4000，蟲蠟等。經(jīng)藥理試驗證明本發(fā)明黃花菜及黃花菜總黃酮具有抗抑郁作用，能顯著提高大鼠腦皮質(zhì)的5-HT、NE、DA含量和海馬的5-HT、NE含量，與模型組比較有顯著差異(P < 0. 05-0. 01)，給藥28天后，與正常組相比，模型組大鼠的Open-Field法水平穿越格數(shù)、 豎立次數(shù)明顯減少，差異具有顯著性(P <0.01)，與模型組相比，黃花菜或黃花菜總黃酮膠囊劑大、中、小劑量組和鹽酸氟西汀組大鼠的Open-Field法水平穿越格數(shù)、豎立次數(shù)均有增加，具有顯著性差異(P<0. 05-0.01)；給藥觀天后，與模型組相比，黃花菜或黃花菜總黃酮膠囊劑大、中、小劑量組大鼠蔗糖溶液消耗量增加，差異具有顯著性(P <0.05-0. 01)； 與模型組相比，黃花菜或黃花菜總黃酮膠囊劑大、中、小劑量組大鼠的強(qiáng)迫性游泳期間的不動時間顯著減小，具有顯著性差異(P <0.01)。黃花菜或黃花菜總黃酮膠囊劑大、中、小劑量能顯著拮抗利血平所致的體溫下降作用和小鼠眼瞼下垂及運動不能的作用(P < 0. 05-0. 01)。下述實驗例通過黃花菜按照實施例1的方法制備的寧心解郁膠囊藥理試驗進(jìn)一步說明本發(fā)明。實驗例1寧心解郁膠囊對大鼠慢性應(yīng)激抑郁癥的治療作用試驗?zāi)康牟捎寐跃C合應(yīng)激法建立抑郁大鼠模型，觀察中藥寧心解郁膠囊的抗抑郁作用。受試藥物寧心解郁膠囊干粉，批號，北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院提供。鹽酸氟西汀，產(chǎn)品批號AU6471，分裝批號:051020，生產(chǎn)廠美國 Eli Lilly and Company Limited，分裝廠禮來蘇洲制藥有限公司。去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)、5-羥色胺(5-HT)、3，4-二羥基苯乙酸(DOPAC)、高香草酸(HVA)、5_羥基吲哚乙酸(5-HIAA) ,3,4- 二羥基卞胺(DHBA)，以上為SIGMA公司產(chǎn)品。二正丁胺(上?；瘜W(xué)試劑采購站進(jìn)口分裝)，B-8離子對試劑(天津化學(xué)試劑二廠)，甲醇(優(yōu)級純，北京化工廠)，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。數(shù)據(jù)處理所有實驗數(shù)據(jù)以x±s表示。計量數(shù)據(jù)由SPSS10. 0統(tǒng)計軟件進(jìn)行方差分析及組間檢驗。實驗動物SPF級Sprague-Dawley(SD)大鼠，體重250_300g，雌雄各半，動物許可證編號 SCXK (京)2002-0003，北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供。飼養(yǎng)條件動物進(jìn)入動物實驗室后，大鼠每籠放養(yǎng)5只，飼養(yǎng)3天后啟用；正常組大鼠每籠放養(yǎng)5只，模型組、寧心解郁膠囊高劑量組、寧心解郁膠囊中劑量組、寧心解郁膠囊低劑量組、鹽酸氟西汀組的大鼠均單籠飼養(yǎng)。動物室光照充足，通風(fēng)和空調(diào)設(shè)備良好，室溫控制在 23-25°C，相對濕度為40-70%。實驗室按常規(guī)定期消毒。慢性應(yīng)激抑郁模型的建立將大鼠置于晝夜節(jié)律光照條件下，自由進(jìn)食進(jìn)水，飼養(yǎng)3天以適應(yīng)環(huán)境，每日觸摸動物以適應(yīng)實驗人員的操作。大鼠適應(yīng)環(huán)境后隨機(jī)分為空白對照組(以下簡稱空白組)、 抑郁模型組(以下簡稱模型組)。模型組根據(jù)文獻(xiàn)均單籠飼養(yǎng)，以慢性不可預(yù)見性的刺激，配合孤養(yǎng)，各種刺激因子按隨機(jī)方法在^d內(nèi)應(yīng)用，包括冰水游泳G°C，5min)，熱刺激 (450C，5min)，搖晃(頻率160次/分，3min)，夾尾(Imin)，禁水(24h)，禁食(24h)，晝夜顛倒，每日給予一種刺激，每種刺激累計使用4次，順序隨機(jī)，使動物不能預(yù)料刺激的發(fā)生，給予觀天刺激后，進(jìn)行OpenField行為學(xué)測定、大鼠強(qiáng)迫游泳實驗和糖水消耗實驗，以評價模型組大鼠的慢性應(yīng)激抑郁模型是否成功，造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組、寧心解郁膠囊高劑量組、寧心解郁膠囊中劑量組、寧心解郁膠囊低劑量組、鹽酸氟西汀組。使各組大鼠的Open Field行為學(xué)、大鼠強(qiáng)迫游泳實驗和糖水消耗實驗的實驗結(jié)果盡量大致一致， 做為給藥前的指標(biāo)。開始給藥后，每隔2天再接受一次不同應(yīng)激刺激，刺激方式及程度與造模時相同，直至實驗結(jié)束。給藥方法給予28天刺激后，隨機(jī)分為模型組、寧心解郁膠囊高劑量組、寧心解郁膠囊中劑量組、寧心解郁膠囊低劑量組、鹽酸氟西汀組。依“實驗動物與人按體表面積比等效量換算比率”可算出各動物的等效劑量，作為中劑量。寧心解郁膠囊的大劑量為122.31mg/kg體重，中劑量為40. 77mg/kg體重，低劑量劑量為13. 59mg/kg體重；西藥組給予鹽酸氟西汀，劑量為3. 6mg/kg體重，均按lml/100g體重的濃度灌胃給藥，模型組給予生理鹽水lml/100g 體重。共灌胃觀天。實驗指標(biāo)觀察1、Open-Field 行為學(xué)測定在給予28天刺激后及給藥后28天用Open-field法觀察各組大鼠行為的變化。根據(jù)文獻(xiàn)自制Open Field觀察箱，直徑90cm，高40cm，周壁為黑色，將底面按扇形分成面積相等的25格。以大鼠穿越底面格子數(shù)為水平得分，動物穿越1格(3爪以上跨入)為1分；以大鼠雙足離開地面次數(shù)為垂直得分，動物雙足離開底面為標(biāo)志，無論動物站立多長時間直至放下雙足為1分。每只動物每次進(jìn)行一次測定，時間為5min。利用攝像裝置記錄其行為的變化，分析結(jié)果。2、大鼠強(qiáng)迫游泳實驗在給予28天刺激后及給藥后28天后，據(jù)文獻(xiàn)將大鼠放入內(nèi)徑20cm，高40cm的玻璃圓缸內(nèi)，每缸1只，缸內(nèi)水深Mcm，水溫，(每缸水僅用1次)，連續(xù)觀察5min，累計大鼠在水中停止掙扎，呈漂浮直立狀態(tài)，僅有偶爾的肢體運動以保持頭部浮在水面的持續(xù)時間即不動時間。(此實驗前一天每只大鼠預(yù)游15min，隨后取出放于燈下擦干放入籠中。)3、糖水消耗實驗在給予觀天刺激后及給藥后觀天后，進(jìn)行糖水消耗實驗。在進(jìn)行糖水消耗實驗時每只大鼠加蔗糖溶液100ml，同時所有大鼠進(jìn)行禁食，計算大鼠Ih飲用蔗糖溶液的量。4、皮質(zhì)和海馬單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的測定取材方法斷頭處死動物后，剝離出全腦，在冰上迅速分離出前額皮質(zhì)和海馬，稱質(zhì)量后置1. 5ml的凍存管中用液氮快速冷凍后，放入_80°C冰箱保存至測定。樣品的處理根據(jù)腦組織質(zhì)量不同加入不同體積的溶液每IOOmg腦組織加入Iml 組織處理液(0. 15mmol/L HC104和2ng/l·! 1的DHBA 25 μ 1，冰浴條件下超聲勻漿30s，然后在15000轉(zhuǎn)/分，4°C離心20min，上清液用于神經(jīng)遞質(zhì)測定。神經(jīng)遞質(zhì)檢測采用高效液相色譜系統(tǒng)(HPLC)-電化學(xué)檢測器(ECD)檢測單胺類神經(jīng)遞質(zhì)及其主要代謝產(chǎn)物的濃度，包括NE，D0PAC，DA，5-HIAA，HVA，5_HT。取上清液 10 μ 1進(jìn)樣測定，各神經(jīng)遞質(zhì)含量以ng/g組織濕質(zhì)量計算。色譜條件色譜條件N0Va-pak C18色譜柱GmmX 150mm, 5 μ m)；流動相50mmol · L—1檸檬酸-醋酸鈉緩沖液pH 3. 5 (內(nèi)含 1. (toimol · I^B-8 離子對試劑，1. Snmol · Γ1 二正丁胺，0. 3讓ol · L^1EDTA 二鈉，4% 甲醇)，流速1. OmL ^irT1,玻璃碳工作電極，檢測池電壓為+0. 75V ；3，4- 二羥芐胺DHBA為內(nèi)標(biāo)物，樣品中各主要組分用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量。實驗結(jié)果1.寧心解郁膠囊對大鼠腦皮質(zhì)的5-HT、NE、DA、5_HIAA、HVA和DOPAC含量的影響模型組大鼠腦皮質(zhì)的5-HT、NE、DA、5_HIAA和DOPAC含量與正常組比較顯著降低(P < 0. 01)；寧心解郁膠囊大劑量組大鼠腦皮質(zhì)的5-HT、NE、DA和5-HI從與模型組比較含量顯著升高(P < 0. 05-0. 01)，寧心解郁膠囊大劑量組大鼠腦皮質(zhì)的DOPAC含量與模型組比較有升高趨勢，但差異無顯著性(P > 0. 05)，寧心解郁膠囊中劑量組大鼠腦皮質(zhì)的5-HT和 NE與模型組比較含量顯著升高(P < 0. 01)，寧心解郁膠囊中劑量組大鼠腦皮質(zhì)的DA、D0PAC 和5-HIAA含量與模型組比較有升高趨勢，但差異無顯著性(P > 0. 05)，寧心解郁膠囊小劑量組大鼠腦皮質(zhì)的5-HT、NE和5-HIAA含量與模型組比較有升高趨勢，但差異無顯著性(P > 0.05)，見表 1-3。表1寧心解郁膠囊對抑郁大鼠腦皮質(zhì)5-HT和5-HIAA含量的影響(ng/g，； ±s)
組別η5-HT5-HIAA
正常組16 2903.26±177.67*1525.07土129.91*模型組14 1608.96土94.75896.89土50.56寧心解郁股囊大劑量組15 2487.57土240.58*1071.81土100.18*寧心解郁股嚢中劑量組16 2413.89土243.42*908.10士62.43寧心解郁膠囊小劑量組16 2058.93土221.561057.70土103.58鹽酸氟西汀組13 2646.28土242.93*1305.27土111.21*注與模型組比較*P < 0. 01 ；**P < 0. 05表2寧心解郁膠囊對抑郁大鼠腦皮質(zhì)DA和DOPAC含量的影響(ng/g，[土 s )
組別ηDADOPAC
正常組16 3085.22±277.78*299.79土21.40*模型組14 1841.11士162.20166.50土12.35寧心解郁股囊大劑量組15 2582.42土237.69**202.25土16.67寧心解郁膠囊中劑量組16 2157.86土223.86207.33土19.17寧心解郁股囊小劑量組16 1831.37土157.79167.21土13.56鹽酸氟西汀組13 1782.78土265.28204.81±21.92注與模型組比較*Ρ < 0. 01 ；**Ρ < 0. 05表3寧心解郁膠囊對抑郁大鼠腦皮質(zhì)NE和HVA含量的影響(ng/g，； ±s)
組別ηNEHVA
正常組16 1965.09土108.09*213.88土17.66模型組14 1251.35土73.55263.86土47.42寧心解郁膠囊大劑量組15 1552.82土107.85**491.57土49.43*寧心解郁膠嚢中劑量組16 1619.99土77.37*234.14土59.48寧心解郁股嚢小劑量組16 1432.50土84.95123.53土8.92鹽酸氟西汀組13 1397.65土132.90414.16土121.79注與模型組比較*Ρ < 0. 01 ；**Ρ < 0. 052.寧心解郁膠囊對大鼠海馬的5-HT、NE、DA、5_HIAA、HVA和DOPAC含量的影響
模型組大鼠海馬的5_HT、NE和DA含量與正常組比較顯著降低(P < 0. 01)，其5_HI 從、DOPAC和HVA含量與正常組比較有降低趨勢，但差異無顯著性(P >0.05)；寧心解郁膠囊大、中劑量組大鼠海馬的5-HT和NE與模型組比較含量顯著升高(P < 0. 05-0. 01)，寧心解郁膠囊小劑量組大鼠海馬的5-HT和NE含量與模型組比較有升高趨勢，但差異無顯著性 (P > 0. 05)，見表 4-6。表4寧心解郁膠囊對抑郁大鼠海馬5-HT和5-HIAA含量的影響(ng/g，；土s)
權(quán)利要求
1.黃花菜在制備拮抗利血平藥物中的應(yīng)用。
2.黃花菜總黃酮在制備抗抑郁藥物中的應(yīng)用。
3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于黃花菜總黃酮在制備升高腦皮質(zhì)中的5-羥色胺藥物中的應(yīng)用。
4.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于黃花菜總黃酮在制備升高腦皮質(zhì)中的去甲腎上腺素藥物中的應(yīng)用。
5.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于黃花菜總黃酮在制備升高腦皮質(zhì)中的多巴胺藥物中的應(yīng)用。
6.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于黃花菜總黃酮在制備升高腦皮質(zhì)中的5-羥基吲哚乙酸藥物中的應(yīng)用。
7.黃花菜總黃酮在制備拮抗利血平藥物中的應(yīng)用。
8.一種具有抗抑郁作用的黃花菜總黃酮，其特征在于總黃酮的制備方法包括如下步驟步驟1 將黃花菜60-95%乙醇加熱回流提取1-4次，每次0. 5-1小時，過濾，合并濾液， 回收乙醇，得浸膏A，殘渣I ；步驟2 殘渣I用20-80%乙醇加熱提取1-4次，每次20-60min，過濾，合并濾液，回收乙醇，得浸膏B;步驟3 將浸膏A用蒸餾水稀釋后過濾，通過大孔樹脂柱，蒸餾水洗至流出液透明，用 20%-95%乙醇洗脫2-6倍柱體積，分別回收乙醇，得到樣品1 ；步驟4 將浸膏B用蒸餾水稀釋后過濾，通過大孔樹脂柱，蒸餾水洗至流出液透明，先后用20% -95%乙醇洗脫2-6倍柱體積，分別回收乙醇，得到樣品2 ； 步驟5 混合步驟3的樣品1、步驟4的樣品2制得黃花菜總黃酮。
9.如權(quán)利要求8所述的黃花菜總黃酮，其特征在于該總黃酮的制備方法包括如下步驟步驟1 將黃花菜95%乙醇浸泡過夜，95%乙醇加熱提取3次，每次0. 5-1小時，過濾， 合并濾液，回收乙醇，得浸膏A，殘渣I ；步驟2 殘渣I用60%乙醇加熱提取2次，每次40min，過濾，合并濾液，回收乙醇，得浸膏B，殘渣II ；步驟3 將浸膏A用蒸餾水稀釋后過濾，通過已處理好的AB-8大孔樹脂柱，蒸餾水洗至流出液透明，用60%洗脫3倍柱體積，回收乙醇，得到樣1 ；步驟4 將浸膏B用蒸餾水稀釋后過濾，通過已處理好的AB-8大孔樹脂柱，蒸餾水洗至流出液透明，用60 %洗脫3倍柱體積，回收乙醇，得到樣2。
10.一種制備黃花菜總黃酮的方法，包括如下步驟步驟1 將黃花菜60-95%乙醇加熱回流提取1-4次，每次0. 5-1小時，過濾，合并濾液， 回收乙醇，得浸膏A，殘渣I ；步驟2 殘渣I用20-80 %乙醇加熱提取1-4次，每次20-60min，過濾，合并濾液，回收乙醇，得浸膏B;步驟3 將浸膏A用蒸餾水稀釋后過濾，通過大孔樹脂柱，蒸餾水洗至流出液透明，用 20%-95%乙醇洗脫2-6倍柱體積，分別回收乙醇，得到樣品1 ；步驟4 將浸膏B用蒸餾水稀釋后過濾，通過大孔樹脂柱，蒸餾水洗至流出液透明，先后用20% -95%乙醇洗脫2-6倍柱體積，分別回收乙醇，得到樣品2 ； 步驟5 混合步驟3的樣品1、步驟4的樣品2制得黃花菜總黃酮。
全文摘要
本發(fā)明涉及黃花菜及黃花菜總黃酮的新用途，公開了黃花菜及其總黃酮在制備抗抑郁藥物中的應(yīng)用，具體公開了黃花菜及其總黃酮在制備升高腦皮質(zhì)中的5-羥色胺、去甲腎上腺素、多巴胺、5-羥基吲哚乙酸藥物中的應(yīng)用，并公開了黃花菜及其總黃酮在制備拮抗利血平藥物中的應(yīng)用；通過藥理實驗證實上述應(yīng)用。
文檔編號A61P43/00GK102210800SQ20111013757
公開日2011年10月12日 申請日期2008年7月31日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月31日
發(fā)明者倪健, 朱陵群, 鄒憶懷 申請人:倪健