專利名稱：一種具有連續(xù)梯度性能的多糖基神經(jīng)修復(fù)支架材料及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到生物醫(yī)學(xué)材料領(lǐng)域，具體涉及到一種具有連續(xù)梯度性能的多糖基神經(jīng)修復(fù)支架材料及其制備方法。
背景技術(shù)：
越來越多的天然材料如肝素、甲殼素、殼聚糖、透明質(zhì)酸等被用于制備神經(jīng)損傷的修復(fù)支架材料。例如，殼聚糖是甲殼素經(jīng)脫乙?；玫降囊环N天然陽離子多糖，是自然界中唯一的帶正電的多糖，因此可以和細(xì)胞表面帶負(fù)電的基團(tuán)相互作用，與細(xì)胞膜發(fā)生非特異性吸附；同時(shí)殼聚糖又具有較高的親水性，能促進(jìn)細(xì)胞在材料表面的吸附和鋪展，因此， 殼聚糖材料有利于神經(jīng)細(xì)胞在其表面的黏附和細(xì)胞骨架的形成。另外，殼聚糖分子與細(xì)胞基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)中的糖氨聚糖分子結(jié)構(gòu)相似，這可能有利于其與細(xì)胞外黏附分子(如層粘連蛋白、纖維連接蛋白、肝素蛋白等)的結(jié)合，進(jìn)一步促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的貼壁和生長。此外，殼聚糖還能促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長，從而有利于神經(jīng)再生中血管的再生，為再生神經(jīng)提供營養(yǎng)，促進(jìn)軸突生長和髓鞘的形成。透明質(zhì)酸和硫酸軟骨素等天然多糖都是來自于細(xì)胞外基質(zhì)，具有天然的細(xì)胞親和性，逐漸的被用于神經(jīng)修復(fù)支架材料的制備。在周圍神經(jīng)自然修復(fù)過程中，周圍神經(jīng)的再生是從近端向遠(yuǎn)端逐漸生長的，所以， 越來越多的定向孔支架材料被用于神經(jīng)的修復(fù)，所制備的定向多孔支架可以引導(dǎo)軸突從一端向另外一端伸展，最終達(dá)到修復(fù)的目的。但是現(xiàn)有的這些修復(fù)支架材料都是均相的，從材料的一端到另外一端，無論從結(jié)構(gòu)還是成分上都是均勻的，最終也導(dǎo)致了功能上的均一性。 這些特點(diǎn)和神經(jīng)自身的修復(fù)生長是不相匹配的，使得支架材料在神經(jīng)修復(fù)過程中的降解速度不能與神經(jīng)本身的生長的速度同步，同時(shí)復(fù)合的神經(jīng)生長因子的釋放速度在整個(gè)支架體系中保持恒定，也不能滿足神經(jīng)生長的需要。在此基礎(chǔ)上，有人提出了半連續(xù)的梯度材料用于神經(jīng)的修復(fù)，在這類材料中雖然提出了梯度的概念，但是與神經(jīng)生長的連續(xù)梯度性也沒有完全匹配?；谏鲜鲅芯楷F(xiàn)狀和背景，我們提出了連續(xù)梯度神經(jīng)修復(fù)的概念，并且通過梯度混合的方法成功的制備了多糖基的連續(xù)梯度神經(jīng)修復(fù)材料。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)和不足，提供一種具有連續(xù)梯度性能的多糖基神經(jīng)修復(fù)支架材料。該支架材料沿著一個(gè)方向顯示出各種性質(zhì)的變化，這些性質(zhì)包括成分、結(jié)構(gòu)和功能。該修復(fù)支架適合外周神經(jīng)和脊柱神經(jīng)的修復(fù)。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供上述支架材料的制備方法。本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)—種具有連續(xù)梯度性能的多糖基神經(jīng)修復(fù)支架材料，所述支架材料是由一種以上的多糖構(gòu)成，并且沿一個(gè)方向具有連續(xù)的梯度性；所述連續(xù)的梯度性為成分的連續(xù)梯度性、結(jié)構(gòu)的連續(xù)梯度性和功能的連續(xù)梯度性中的一種或多種；成分的連續(xù)梯度性是指其構(gòu)成神經(jīng)修復(fù)支架材料的多糖成分為兩種以上，其中一種多糖成分從支架材料的一端到另一端逐漸減少或增加，另一種或多種多糖成分從支架材料的一端到另一端逐漸增加或減少；結(jié)構(gòu)的連續(xù)梯度性是指神經(jīng)修復(fù)支架材料中的多孔結(jié)構(gòu)的尺寸和孔隙率從支架材料的一端到另一端逐漸增加或減少；性能的連續(xù)梯度性是指支架材料的力學(xué)性能、降解速率從支架材料的一端到另一端逐漸減小或增加；或該支架材料的所負(fù)載的神經(jīng)營養(yǎng)因子或神經(jīng)生長因子的釋放量或釋放速率從支架材料的一端到另一端逐漸減小或增加。所述多糖為甲殼素、殼聚糖、透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、肝素、海藻酸鈉和葡聚糖中的一種或多種。上述一種具有連續(xù)梯度性能的多糖基神經(jīng)修復(fù)支架材料的制備方法，其特征在于包括以下步驟將多糖溶液A與多糖溶液B在梯度混合儀中等體積混合，然后低溫冷凍干燥，得到具有梯度性的神經(jīng)修復(fù)支架材料；所述兩種多糖溶液A與多糖溶液B的成分與濃度中至少有一個(gè)不同；所述多糖溶液A選自甲殼素溶液、殼聚糖溶液、透明質(zhì)酸溶液、硫酸軟骨素溶液、 肝素溶液、海藻酸鈉溶液和葡聚糖溶液中的一種以上；多糖溶液B選自甲殼素溶液、殼聚糖溶液、透明質(zhì)酸溶液、硫酸軟骨素溶液、肝素溶液、海藻酸鈉溶液和葡聚糖溶液中的一種以上。所述多糖溶液A為殼聚糖溶液，多糖溶液B為透明質(zhì)酸的水溶液；所述殼聚糖溶液的制備方法如下將殼聚糖鹽酸溶液倒入飽和的NH4HCO3溶液中， 在20°C靜置5天，形成殼聚糖氨基甲酸鹽溶液。所述多糖溶液A或多糖溶液B的質(zhì)量濃度為1 3 %。
所述多糖溶液A或多糖溶液B在SOmTorr的真空下脫氣。所述多糖溶液A或多糖溶液B中加入重量體積百分比0. 05 的交聯(lián)劑或神經(jīng)生長因子或神經(jīng)營養(yǎng)因子。所述低溫冷凍溫度為-20 _80°C。當(dāng)多糖溶液A的濃度與多糖溶液B的濃度相同，成分不同，得到具有成分梯度性的神經(jīng)修復(fù)支架材料。當(dāng)多糖溶液A的成分與多糖溶液B的成分相同，濃度不同，然后在凍干機(jī)中冷凍干燥，得到具有結(jié)構(gòu)梯度性的神經(jīng)修復(fù)支架材料。當(dāng)多糖溶液A與多糖溶液B的成分與濃度都不相同，然后在凍干機(jī)中冷凍干燥，得到成分與結(jié)構(gòu)都具有梯度性的神經(jīng)修復(fù)支架材料。當(dāng)多糖溶液A與多糖溶液B的成分與濃度至少一個(gè)不相同，在多糖溶液A或多糖溶液B中加入交聯(lián)劑或神經(jīng)生長因子或神經(jīng)營養(yǎng)因子，得到具有連續(xù)梯度功能化的多糖基神經(jīng)修復(fù)支架材料。本發(fā)明通過調(diào)節(jié)梯度混合儀兩容器中的多糖的成分、濃度和負(fù)載神經(jīng)生長因子或神經(jīng)營養(yǎng)因子的載體體系的含量和種類，得到具有連續(xù)梯度功能化的多糖基神經(jīng)修復(fù)支架
4材料，使得該材料的性能適合神經(jīng)修復(fù)的自身生長規(guī)律。


圖1為梯度混合儀示意2為染色后成分梯度材料圖片圖3為結(jié)構(gòu)梯度材料的大孔端冷凍干燥后的SEM圖片圖4為結(jié)構(gòu)梯度材料的小孔端冷凍干燥后的SEM圖片圖5為梯度材料中蛋白絕對(duì)釋放量曲線圖6為梯度材料中蛋白相對(duì)釋放量曲線
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。實(shí)施例1殼聚糖/肝素連續(xù)梯度神經(jīng)修復(fù)支架材料的制備分別配制2W/v%表示重量體積百分比，下同)的殼聚糖醋酸溶液，(溶劑為重量體積比為醋酸水溶液)和2W/v%的肝素醋酸溶液(溶劑為重量體積比為Iw/
醋酸水溶液)，兩者在4°C攪拌過夜，然后分別在SOmTorr的真空下脫氣。在梯度混合儀(如圖1所示)中，在活塞1和活塞2關(guān)閉的條件下，A容器中加入IOml的殼聚糖溶液，加入0. 5W/V%甲苯胺藍(lán)藍(lán)色染料，B中加入IOml的肝素溶液，加入 0. 5w/v%甲基橙黃色染料，在B中加入磁力攪拌子4，在活塞2的末端連接蠕動(dòng)泵3，在攪拌的條件下，打開兩個(gè)活塞，開啟蠕動(dòng)泵，將混合溶液緩慢的引入到管狀的接受器中，-80°C低溫冷凍干燥，然后在0. 05W/v%的戊二醛水溶液中進(jìn)行交聯(lián)處理2min，然后在的氨水溶液中浸泡脫酸20min，然后用蒸餾水洗至中性，得到具有成分連續(xù)梯度性的神經(jīng)修復(fù)支架材料，染色后成分梯度材料圖片如圖2所示。由圖2可以看出，從左到右，黃色染料的濃度逐漸降低，藍(lán)色染料的濃度逐漸升高，同時(shí)濃度的變化顯示出具有連續(xù)的梯度性。實(shí)施例2殼聚糖/透明質(zhì)酸連續(xù)梯度性神經(jīng)修復(fù)支架材料的制備堿化殼聚糖溶液的制備將IOg的的殼聚糖鹽酸溶液(lw/v^i )倒入40ml 飽和的NH4HCO3溶液中，在20°C靜置5天，形成殼聚糖氨基甲酸鹽(ChitoSan-NHC02_NH4+) 溶液(因?yàn)闅ぞ厶鞘蔷坳栯x子，堿化處理后才能不和透明質(zhì)酸形成聚電解質(zhì))，然后在 80mTorr的真空下脫氣。配制lw/v%的透明質(zhì)酸的水溶液，4°C攪拌過夜，然后在80mTorr 的真空下脫氣。在梯度混合儀(如圖1所示)中，在活塞1和活塞2關(guān)閉的條件下，A容器中加入 IOml的堿化殼聚糖溶液，B中加入IOml的透明質(zhì)酸水溶液，在B中加入磁力攪拌子4，在活塞2的末端連接蠕動(dòng)泵3，在攪拌的條件下，打開兩個(gè)活塞，開啟蠕動(dòng)泵，將混合溶液緩慢的引入到管狀的接受器中，-20°C低溫冷凍干燥，然后在120度真空處理30分鐘，在0. 05w/v% 的戊二醛溶液中進(jìn)行交聯(lián)處理anin，然后在的鹽酸溶液中浸泡20min，然后用蒸餾水洗至中性，得到具有成分連續(xù)梯度性的神經(jīng)修復(fù)支架材料。實(shí)施例3殼聚糖結(jié)構(gòu)連續(xù)梯度神經(jīng)修復(fù)支架材料的制備分別配制和3W/v%的殼聚糖醋酸溶液(溶劑為重量體積比為醋酸水溶液)，兩者在4°C攪拌過夜，然后分別在SOmTorr的真空下脫氣。在梯度混合儀(如圖1所示)中，在活塞1和活塞2關(guān)閉的條件下，A容器中加入 IOml的殼聚糖醋酸溶液，B中加入IOml的3W/V%的殼聚糖醋酸溶液，在B中加入磁力攪拌子4，在活塞2的末端連接蠕動(dòng)泵3，在攪拌的條件下，打開兩個(gè)活塞，開啟蠕動(dòng)泵，將混合溶液緩慢的引入到管狀的接受器中，-80°C低溫冷凍干燥，然后在0. 05w/V%的戊二醛溶液中進(jìn)行交聯(lián)處理anin，然后在的氨水溶液中浸泡脫酸20min，然后用蒸餾水洗至中性，得到具有結(jié)構(gòu)連續(xù)梯度性的神經(jīng)修復(fù)支架材料。從支架材料的一端到另一端材料的尺寸從2mm到50um，孔隙率從75%到95%逐漸變化。材料兩端的多孔結(jié)構(gòu)如圖3、圖4 所示。實(shí)施例4殼聚糖力學(xué)性能連續(xù)梯度神經(jīng)修復(fù)支架材料的制備分別配制2W/v%殼聚糖醋酸溶液(溶劑為重量體積比為醋酸水溶液)和加入0. 05W/v%的戊二醛的2W/v%的殼聚糖醋酸溶液(溶劑為重量體積比為醋酸水溶液)，兩者在4°C攪拌過夜，然后分別在SOmTorr的真空下脫氣。在梯度混合儀(如圖1所示)中，在活塞1和活塞2關(guān)閉的條件下，A容器中加入 IOml的殼聚糖醋酸溶液，B中加入IOml的含戊二醛的殼聚糖醋酸溶液，在B中加入磁力攪拌子4，在活塞2的末端連接蠕動(dòng)泵3，在攪拌的條件下，打開兩個(gè)活塞，開啟蠕動(dòng)泵，將混合溶液緩慢的引入到管狀的接受器中，-80°C低溫冷凍干燥，然后在的氨水溶液中浸泡脫酸20min，然后用蒸餾水洗至中性，得到具有交聯(lián)密度連續(xù)梯度性的神經(jīng)修復(fù)支架材料， 該材料具有力學(xué)性能隨著交聯(lián)度的減小，壓縮模量逐漸減小，顯示出力學(xué)性能的梯度性。結(jié)果如下將12cm支架材料均勻切割成8段(直徑1. 5cm，高度1. 5cm)，依次編號(hào)，在力學(xué)試驗(yàn)機(jī)上測量(傳感器為50N，壓縮速率為2mm/min)，所測得的力學(xué)性能如下
Samples12345678壓縮模量/Kpa85. 279. 163. 259. 355. 453. 849. 245. 6 實(shí)施5負(fù)載蛋白的殼聚糖連續(xù)梯度神經(jīng)修復(fù)支架材料的制備分別配制2W/v%殼聚糖醋酸溶液(溶劑為重量體積比為醋酸水溶液)和含牛血清白蛋白的2W/v%殼聚糖醋酸溶液(溶劑為重量體積比為醋酸水溶液)，兩者在4°C攪拌過夜，然后分別在SOmTorr的真空下脫氣。在梯度混合儀(如圖1所示)中，在活塞1和活塞2關(guān)閉的條件下，A容器中加入IOml的殼聚糖醋酸溶液，B中加入IOml的含牛血清白蛋白(sigma)(作為神經(jīng)生長因子的模板蛋白)的殼聚糖醋酸溶液，在B中加入磁力攪拌子4，在活塞2的末端連接蠕動(dòng)泵3，在攪拌的條件下，打開兩個(gè)活塞，開啟蠕動(dòng)泵，將混合溶液緩慢的引入到管狀的接受器中，-80°C低溫冷凍干燥，然后在的氨水溶液中浸泡脫酸20min，然后用蒸餾水洗至中性，得到負(fù)載牛血清白蛋白連續(xù)梯度性的神經(jīng)修復(fù)支架材料。牛血清白蛋白負(fù)載率(單位質(zhì)量支架負(fù)載蛋白的質(zhì)量)的測定將12cm支架材料均勻切割成8段，(直徑1. 5cm,高度1. 5cm)，按蛋白濃度的大小排序，將所得的8段支架重
6新用的醋酸溶解，用BCA法(該方法是測量蛋白濃度的經(jīng)典方法)測得蛋白的負(fù)載
率如下
權(quán)利要求
1.一種具有連續(xù)梯度性能的多糖基神經(jīng)修復(fù)支架材料，其特征在于所述支架材料是由一種以上的多糖構(gòu)成，并且沿一個(gè)方向具有連續(xù)的梯度性；所述連續(xù)的梯度性為成分的連續(xù)梯度性、結(jié)構(gòu)的連續(xù)梯度性和功能的連續(xù)梯度性中的一種或多種；成分的連續(xù)梯度性是指其構(gòu)成神經(jīng)修復(fù)支架材料的多糖成分為兩種以上，其中一種多糖成分從支架材料的一端到另一端逐漸減少或增加，另一種或多種多糖成分從支架材料的一端到另一端逐漸增加或減少；結(jié)構(gòu)的連續(xù)梯度性是指神經(jīng)修復(fù)支架材料中的多孔結(jié)構(gòu)的尺寸和孔隙率從支架材料的一端到另一端逐漸增加或減少；性能的連續(xù)梯度性是指支架材料的力學(xué)性能、降解速率從支架材料的一端到另一端逐漸減小或增加；或該支架材料的所負(fù)載的神經(jīng)營養(yǎng)因子或神經(jīng)生長因子的釋放量或釋放速率從支架材料的一端到另一端逐漸減小或增加。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種具有連續(xù)梯度性能的多糖基神經(jīng)修復(fù)支架材料，其特征在于所述多糖為甲殼素、殼聚糖、透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、肝素、海藻酸鈉和葡聚糖中的一種或多種。
3.權(quán)利要求1所述一種具有連續(xù)梯度性能的多糖基神經(jīng)修復(fù)支架材料的制備方法，其特征在于包括以下步驟將多糖溶液A與多糖溶液B在梯度混合儀中等體積混合，然后低溫冷凍干燥，得到具有梯度性的神經(jīng)修復(fù)支架材料；所述兩種多糖溶液A與多糖溶液B的成分與濃度中至少有一個(gè)不同；所述多糖溶液A選自甲殼素溶液、殼聚糖溶液、透明質(zhì)酸溶液、硫酸軟骨素溶液、肝素溶液、海藻酸鈉溶液和葡聚糖溶液中的一種以上；多糖溶液B選自甲殼素溶液、殼聚糖溶液、透明質(zhì)酸溶液、硫酸軟骨素溶液、肝素溶液、 海藻酸鈉溶液和葡聚糖溶液中的一種以上。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述一種具有連續(xù)梯度性能的多糖基神經(jīng)修復(fù)支架材料的制備方法，其特征在于所述多糖溶液A為殼聚糖溶液，多糖溶液B為透明質(zhì)酸的水溶液；所述殼聚糖溶液的制備方法如下將殼聚糖鹽酸溶液倒入飽和的NH4HCO3溶液中，在 20°C靜置5天，形成殼聚糖氨基甲酸鹽溶液。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述一種具有連續(xù)梯度性能的多糖基神經(jīng)修復(fù)支架材料的制備方法，其特征在于所述多糖溶液A或多糖溶液B的質(zhì)量濃度為1 3%。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述一種具有連續(xù)梯度性能的多糖基神經(jīng)修復(fù)支架材料的制備方法，其特征在于所述多糖溶液A或多糖溶液B在SOmTorr的真空下脫氣。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述一種具有連續(xù)梯度性能的多糖基神經(jīng)修復(fù)支架材料的制備方法，其特征在于所述多糖溶液A或多糖溶液B中加入重量體積百分比0. 05 1 %的交聯(lián)劑或神經(jīng)生長因子或神經(jīng)營養(yǎng)因子。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述一種具有連續(xù)梯度性能的多糖基神經(jīng)修復(fù)支架材料的制備方法，其特征在于所述低溫冷凍溫度為-20 -80°C。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種具有連續(xù)梯度性能的多糖基神經(jīng)修復(fù)支架材料，是由一種以上的多糖構(gòu)成，并且沿一個(gè)方向具有連續(xù)的梯度性。所述支架材料的制備方法為將多糖溶液A及多糖溶液B在梯度混合儀中等體積混合，然后低溫冷凍干燥，得到具有梯度性的神經(jīng)修復(fù)支架材料。兩多糖溶液的成分與濃度中至少有一個(gè)不同，或者在多糖溶液A或多糖溶液B中加入重量體積百分比0.05～1％的交聯(lián)劑或神經(jīng)生長因子或神經(jīng)營養(yǎng)因子。本發(fā)明通過調(diào)節(jié)梯度混合儀兩容器中的多糖的成分、濃度和負(fù)載神經(jīng)生長因子或神經(jīng)營養(yǎng)因子的載體體系的含量和種類，得到具有連續(xù)梯度功能化的多糖基神經(jīng)修復(fù)支架材料，使得該材料的性能適合神經(jīng)修復(fù)的自身生長規(guī)律。
文檔編號(hào)A61L27/20GK102198291SQ20111012565
公開日2011年9月28日 申請(qǐng)日期2011年5月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月16日
發(fā)明者周長忍, 焦延鵬, 王玲芬 申請(qǐng)人:暨南大學(xué)