專利名稱：一種白樺樹皮取物及其制備方法和醫(yī)療用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明公開一種白樺樹皮取物及提取方法，同時還提供了其在醫(yī)療用途，涉及中 醫(yī)藥學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
目前臨床上常將糖尿病分為胰島素依賴型(IDDM，I型糖尿病)和非胰島素依賴型 (NIDDM，II型糖尿病)兩類，其中II型糖尿病在糖尿病中占90%。WHO預(yù)計，由于人口老齡化、 肥胖、不健康的飲食以及缺乏運動的生活方式，到2025年，糖尿病患者的數(shù)目將由1995年 的1. 35億上升為3億。II型糖尿病的特征是胰島素敏感組織如骨骼肌、肝、脂肪組織對胰島素作用的抵 抗。雖然其具體機制尚不清楚，但胰島素信號在其傳導(dǎo)通路中的減弱甚至阻斷必定是直接 關(guān)系。PTPases在胰島素信號通路中多個環(huán)節(jié)起作用，如將自身磷酸活化的頂去磷酸化，從 而降低受體激酶活性；或?qū)RS-l、IRS_2、Shc等胰島素受體的底物中蛋白酪氨酸殘基至去 磷酸化，從而負調(diào)控胰島素作用受體后通路。特定Pleases和胰島素通路中的酪氨酸激酶 間的酶活性不平衡可能是引起II型糖尿病胰島素抵抗的原因。因此，通過尋找選擇性作用 于該通路中PTPases的抑制劑抑制其活性，加強和延長胰島素信號，成為越來越受重視的 治療II型糖尿病的新途徑。PTPlB選擇性抑制劑的研究取得了一定的進展，但大多研究局限于肽類和類 肽化合物，例比如根據(jù)PTPIB去磷酸化的底物序列設(shè)計的抑制劑EEDE (F2PMP ) M、 G1U-F2PMP-F2PMP,雖然這些肽類化合物具有較強高的選擇性和較強的抑制活性，但它們的 不易穿透細胞膜和其肽類磷酸結(jié)構(gòu)使很難成為藥物候選化合物。最近，在非肽類PTPlB抑 制劑的報道中2-羧甲氧基苯甲酸類化合物對PTPlB有很強的抑制作用，更重要的事，其中 (2S) -2- [4' - (2-芐基-苯并呋喃)-3-聯(lián)苯-4-氧]-3-苯基-丙酸化合物不僅對PTPlB有 很強的選擇抑制性，還對降低ob/ob小鼠血漿中的葡萄糖和胰島素水平有顯著作用。這是 第一例從藥理學(xué)上直接證明PTPlB抑制劑具有抗糖尿病活性的證據(jù)[Malamas，Μ. S. et al. J. Med. Chem. 2000, 43，1293-1310]。這為我們從天然資源里尋找高效、高選擇性 的小分子非肽類PTPlB抑制劑提供了機遇。白樺樹⑵etoh platyphylla Suk)為樺木科喬木植物，對土壤適應(yīng)性強，喜酸性 土，沼澤地、干燥陽坡及濕潤陰坡都能生長。本發(fā)明是首次從白樺樹皮中分離得到抑制蛋白酪氨酸磷酸酯酶IB活性組分，經(jīng) 多次藥理實驗研究表明，該組分具有顯著抑制蛋白酪氨酸磷酸酯酶IB的活性及降血糖作 用，經(jīng)文獻檢索，未見該類植物具有此方面的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種白樺樹皮提取物，為一種新的組合物，具有抑制蛋白酪氨酸磷酸 酯酶IB的活性，可以降低血糖。
本發(fā)明還進一步提供白樺樹皮提取物的制備方法，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明的另一個目的是提供了白樺樹皮提取物及其從中分離的活性組分的醫(yī)療 用途，作為抑制蛋白酪氨酸磷酸酯酶IB (PTPlB)的抑制劑和胰島素增敏劑，可用于治療各 種糖尿病、肥胖癥及其它由此引發(fā)的并發(fā)癥。本發(fā)明提供的白樺樹皮提取物是通過以下方法得到的
1)將干燥切碎的白樺樹、BetuleiρlatyphyIla Suk)樹皮，用5_10倍量有機醇(80%或 以上濃度)，加熱回流提取2-4次，每次30min-60min，合并提取液；
2)提取液減壓濃縮回收有機醇，至濃縮，合并濃縮液，放涼，加入1倍量水，析出沉淀， 過濾或離心取沉淀，得提取濃縮物；
3)提取濃縮物用1-2倍量水調(diào)節(jié)混懸液后，分別用1-2倍量二氯甲烷萃取3次，合并萃 取液；
4 )萃取液減壓濃縮回收二氯甲烷，至濃縮，合并濃縮液，放涼，干燥； 5)干燥品研磨后經(jīng)過200-300目硅膠柱層析，先用1-2倍量正己烷為流動相進行洗脫； 之后用3-5倍量二氯甲烷與甲醇按10 1比例的洗脫液洗脫，收集該洗脫液，將洗脫液常溫 減壓濃縮，干燥，得本發(fā)明提取物。上述的有機醇包括甲醇、乙醇。用HPLC法測定發(fā)明提取物中羽扇豆醇的含量不低于20%。對所得本發(fā)明提取物進行了蛋白酪氨酸磷酸酯酶IB抑制活性試驗，表明其具有 明顯的抑制活性。測試原理利用分子生物學(xué)手段在大腸桿菌系統(tǒng)表達人源蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酯酶 IB (hPTPlB)催化結(jié)構(gòu)域，經(jīng)純化后的hPTPlB重組蛋白能水解底物/7NPP的磷脂鍵，得到的 產(chǎn)物在410 nm處有很強的光吸收，因此可以通過直接檢測410 nm處光吸收的變化以觀察 酶的活性變化以及化合物對酶活性的抑制情況。標(biāo)準(zhǔn)的測活體系如下10 mM ,Tris. Cl， PH 7.6,10 mM pNPP，2% DMSO，100 nM hPTPlB。觀察指標(biāo)動態(tài)測定波長為410nm處的光吸收，時間為3分鐘，其動力學(xué)曲線一級 反應(yīng)的斜率作為酶活性指標(biāo)。抑制率 試驗例1
本發(fā)明提取物的抑制PTPlB活性試驗
實驗方法用于篩選的蛋白酪氨酸磷酸酯酶PTPlB是從大腸桿菌中表達并純化的GST 融合蛋白。采用紫外底物PNPP，觀察不同濃度對重組酶的活性抑制，以初步評價化合物的 藥用效果。PTPlB水解底物/7NPP的磷脂得到的產(chǎn)物在410nm處有很強的光吸收。因此可以 直接檢測410nm處光吸收的變化以觀察酶的活性變化以及化合物對其的抑制情況。陽性對 照正釩酸鈉的IC5tl為2. 0 uM。實驗結(jié)果如下
權(quán)利要求
1.一種白樺樹皮取物，是通過以下方法得到的1)將干燥切碎的白樺樹樹皮，用5-10倍量有機醇，加熱回流提取2-4次，每次 30min-60min，合并提取液；2)提取液減壓濃縮回收有機醇，至濃縮，合并濃縮液，放涼，加入1倍量水，析出沉淀， 過濾或離心取沉淀，得提取濃縮物；3)提取濃縮物用1-2倍量水調(diào)節(jié)混懸液后，分別用1-2倍量二氯甲烷萃取3次，合并萃 取液；4 )萃取液減壓濃縮回收二氯甲烷，至濃縮，合并濃縮液，放涼，干燥； 5)干燥品研磨后經(jīng)過200-300目硅膠柱層析，先用1-2倍量正己烷為流動相進行洗脫； 之后用3-5倍量二氯甲烷與甲醇按10 1比例的洗脫液洗脫，收集該洗脫液，將洗脫液常溫 減壓濃縮，干燥，得本發(fā)明提取物；上述的有機醇包括甲醇、乙醇等有機物醇。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于白樺樹樹皮回流提取所用得有機醇濃度大于或 等于80%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述白樺樹皮提取物在治療各種糖尿病、肥胖癥及其并發(fā)癥藥物中應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的活性組分在制備胰島素增敏劑中的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開一種白樺樹皮取物及提取方法，同時還提供了其在醫(yī)療用途，從白樺樹樹皮中提取、分離獲得的具有抑制蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B活性的組份。經(jīng)多次體外蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B抑制實驗表明，該組份具有明顯的PTP1B抑制活性，可在制備糖尿病、肥胖癥及并發(fā)癥藥物應(yīng)用。
文檔編號A61K36/185GK102138946SQ20111008818
公開日2011年8月3日 申請日期2011年4月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月9日
發(fā)明者吳學(xué), 孫亞楠, 崔龍, 李東浩, 苑廣信 申請人:北華大學(xué)