專利名稱：乙酰膽堿酯酶基因啟動子用于抗肝癌藥物的篩選的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及腫瘤學(xué)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及將乙酰膽堿酯酶基因啟動子用于抗肝癌藥物的篩選。
背景技術(shù)：
膽堿能系統(tǒng)(the cholinergic system)是一種主要的興奮型神經(jīng)信號系統(tǒng),包括乙酰膽堿(acetylcholine，Ach)的合成、效應(yīng)和降解的完整體系。膽堿能神經(jīng)元首先由膽堿乙?；D(zhuǎn)移酶(choline acetyltransferase, CHAT)催化膽堿和乙酰輔酶A形成Ach,然后被囊泡乙酰膽堿運載蛋白(Vesicular acetylcholine transporter,VAChT)運輸?shù)酵挥|囊泡并釋放，隨后作用于效應(yīng)細胞細胞膜表面的乙酰膽堿受體(acetylcholine receptor,AChR)，傳遞神經(jīng)沖動。
AChR 分為毒章喊型膽喊受體(muscarinic-acetylcholine receptor, mAChR)和煙喊型膽喊受體(nicotinyl-acetylcholine receptor, nAChR)。mAChR是一類與毒蕈堿高度親和的G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)家族成員，迄今已發(fā)現(xiàn)5種類型。nAChR是一種配體門控的離子通道，目前已發(fā)現(xiàn)16種不同亞單位。nAChRci7受體是目前發(fā)現(xiàn)的唯一可形成同源五聚體的亞單位，具有最高的ACh結(jié)合活性。最后，Ach由效應(yīng)細胞外乙酰膽堿酯酶(Acetylcholinesterase, ACHE)降解,神經(jīng)沖動終止。研究已表明，ACHE和AChR廣泛存在于多種組織中，提示膽堿能系統(tǒng)參與多種細胞生物學(xué)行為。例如，在退行性神經(jīng)疾病(如Alzheimer氏癡呆病)中存在ACHE基因的過表達，導(dǎo)致乙酰膽堿水平降低，神經(jīng)沖動無法順利完成。本申請的發(fā)明人曾采用real-time PCR方法得到原發(fā)肝癌的癌組織樣本和癌旁組織樣本的乙酰膽堿酯酶ACHE (acetylcholinesterase)基因表達譜,通過比較兩種組織的表達譜，得到癌與癌旁組織間表達差異性。結(jié)果表明，該基因在癌組織中的mRNA表達明顯低于癌旁組織及正常組織(P < 0. 001)。為了研究和應(yīng)用，需要篩選和獲得ACHE蛋白的激動劑和拮抗劑。目前，以ACHE蛋白為靶標，通過篩選使該蛋白活性下降的篩選方法，已經(jīng)獲得了一些拮抗劑。然而，以該蛋白為靶標，直接篩選促進該蛋白活性上調(diào)的方法，卻一直未篩選獲得令人滿意的激動劑。迄今為止，本領(lǐng)域缺乏以該蛋白作為靶標來有效篩選其激動劑的方法，也尚未公開過ACHE蛋白的有效激動劑。因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)新的有效篩選ACHE蛋白激動劑的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種新的有效篩選ACHE蛋白激動劑的方法。在本發(fā)明的第一方面，提供了一種ACHE基因啟動子的用途，它被用于篩選抑制肝癌的候選藥物。 在另一優(yōu)選例中，所述的ACHE基因啟動子是完整的ACHE基因啟動子，其序列如SEQ ID NO. :1 所示。在另一優(yōu)選例中，所述的ACHE基因啟動子是含有了 SEQ ID NO. :1中至少90%，較佳地至少95%，更佳地至少98%的啟動子區(qū)域，并且保留啟動功能。在本發(fā)明的第二方面，提供了一種表達盒，所述的表達盒包括或由以下元件構(gòu)成ACHE啟動子以及與該啟動子操作性相連的報告基因。在另一優(yōu)選例中，所述的報告基因包括熒光素酶、GFP和抗性基因。在另一優(yōu)選例中，所述的ACHE啟動子是完整的ACHE基因啟動子。在本發(fā)明的第四方面，提供了一種表達載體，所述的表達載體中含有本發(fā)明第二 方面中所述的表達盒。在本發(fā)明的第四方面，提供了一種宿主細胞，所述的宿主細胞攜帶本發(fā)明第三方面中所述的表達載體或基因組中整合有本發(fā)明第二方面中所述的表達盒。在另一優(yōu)選例中，所述的宿主細胞是人胚腎細胞HEK-293T。在本發(fā)明第五方面，提供本發(fā)明上述表達盒、表達載體或宿主細胞的用途，它們被用于篩選抑制肝癌的候選藥物。在本發(fā)明的第六方面，提供了一種篩選抑制癌癥或癌細胞生長的候選化合物的方法，包括步驟(a)在本發(fā)明第四方面中所述的宿主細胞的培養(yǎng)體系中，添加測試物，并觀察所述報告基因的表達情況；其中，促進報告基因表達的測試物被選為抑制癌癥或抑制癌細胞生長的候選化合物。在另一優(yōu)選例中，所述的癌癥包括肝癌，所述的癌細胞包括肝癌細胞。在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括步驟(b):對步驟(a)中獲得的候選化合物，進一步測試該化合物是否可以抑制肝癌細胞的生長或增殖。在另一優(yōu)選例中，所述的表達情況包括報道基因的mRNA水平或報告基因所編碼的酶活性水平。在另一優(yōu)選例中，所述的報告基因包括熒光蛋白酶(Iuc)、GFP。在本發(fā)明的第六方面，提供用本發(fā)明第五方面所述方法篩選得到的抑制癌癥或癌細胞生長的候選化合物。還提供了含有所述候選化合物的藥物組合物。應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。


圖I顯示了 ACHE基因在肝癌的mRNA表達水平明顯低于相應(yīng)癌旁組織及正常組織。圖中，HCC, hepatocellular carcinoma,肝細胞肝癌；N, normal liver,正常肝；CNL,corresponding noncancerous liver,相應(yīng)的癌旁組織。圖2顯示了在IOii g/ml的工作濃度下，不同藥物對ACHE啟動子活性的影響(雙熒光素酶報告分析實驗)其中，橫坐標為化合物編號，縱坐標為熒光素酶活性(相對于對照的倍數(shù))。其中前 35 位的候選化合物為 98、231、430、115、228、30、232、267、146、95、500、33、383、223、262、450、10、265、2、487、434、499、276、377、344、455、149、270、268、112、333、433、229、454、498。圖3顯示了在IOii g/ml的工作濃度下，不同藥物對ACHE啟動子活性的影響。圖4顯示了在IOii g/ml的工作濃度下，不同藥物對ACHE啟動子活性的影響(HEK-293T穩(wěn)定株測試實驗)。其中，橫坐標為化合物編號，縱坐標為熒光素酶活性(相對于對照的倍數(shù))。其中前35位的候選化合物為2、232、500、386、276、270、33、267、112、450、115、146、95、499、430、231、487、434、228、30、98、377、10、265、219、498、139、63、383、223、262、229、454、369、356。
圖5顯示了在10 ii g/ml的工作濃度下，不同藥物對ACHE啟動子活性的影響。圖6顯示了篩選得到的部分藥物在IOii g/ml工作濃度的條件下，對肝癌細胞SMMC-7721生長的影響。
具體實施例方式本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，首次意外地發(fā)現(xiàn)，ACHE基因的全長啟動子區(qū)域?qū)ν饨绺蓴_因素非常敏感，因此可以利用該全長啟動子區(qū)域構(gòu)建相應(yīng)的表達盒、表達載體和宿主細胞，從而有效地篩選ACHE蛋白的激動劑。具體地，本發(fā)明人從基因組DNA中獲得ACHE全長基因啟動子，將該全長啟動子與熒光素酶編碼序列構(gòu)建成一表達盒，利用該表達盒進行了熒光素酶報告實驗和細胞生長實驗。結(jié)果證明，對ACHE啟動子活性有顯著上調(diào)作用的藥物中，大部分藥物能夠顯著抑制肝癌細胞生長和促進肝癌細胞凋亡。因此，可以把ACHE基因啟動子開發(fā)成用于篩選肝癌治療藥物的有效手段。此外，以慢病毒載體系統(tǒng)為介導(dǎo)系統(tǒng)，在人胚腎細胞HEK-293T細胞中過表達ACHE啟動子-熒光素酶報告基因聯(lián)合元件(經(jīng)鑒定過表達倍數(shù)為10倍)。通過熒光素酶報告實驗和細胞生長實驗檢測發(fā)現(xiàn)對ACHE啟動子活性有顯著上調(diào)作用的藥物中，大部分藥物能夠顯著顯著抑制肝癌細胞生長。因此，可以把過表達ACHE基因啟動子-熒光素酶報告基因的穩(wěn)定細胞株開發(fā)成用于篩選肝癌治療藥物的有效平臺。ACHE基因和啟動子如本文所用，術(shù)語“ACHE基因”指“乙酰膽堿酯酶”基因。如本文所用，術(shù)語“本發(fā)明的啟動子元件”、“ACHE基因的啟動子”或“ACHE啟動子”可互換使用，指“乙酰膽堿酯酶啟動子序列”。在本發(fā)明中，ACHE啟動子宜包括全長啟動子區(qū)域，或基本包括全長的啟動子區(qū)域(即包含至少80 %，較佳地至少90 %，更佳地至少95 %的完整啟動子區(qū)域)。完整的ACHE啟動子區(qū)域如SEQ ID NO. :1所示。ACHE啟動子的核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據(jù)已公開的ACHE啟動子的核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計引物，并用市售的基因組文庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的基因組文庫作為模板，擴增而得有關(guān)序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。表達盒在本發(fā)明中，還提供了一種含有本發(fā)明的啟動子元件的表達盒，所述的表達盒包括ACHE啟動子以及與該啟動子操作性相連的報告基因。
在本發(fā)明中，所示的報告基因沒有特別限制，可以是本領(lǐng)域常用的報告基因，代表性的來自包括(但并不限于)熒光素酶、GFP、抗性基因等。在本發(fā)明中，所述的報告基因包括起始密碼子(ATG)、報告基因的編碼序列(編碼報告蛋白)和終止密碼子。此外，報告基因還可含有前導(dǎo)肽或分泌肽的編碼序列或標簽序列(如6His標簽)。載體和宿主細胞將本發(fā)明的ACHE啟動子元件或表達盒插入載體，就可獲得攜帶所述ACHE啟動子元件或表達盒的載體。所述載體可用于轉(zhuǎn)染宿主細胞，從而獲得攜帶所述ACHE啟動子表達盒的表達載體的宿主細胞，或者基因組中整合有所述表達盒的宿主細胞。
在本發(fā)明中，宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如哺乳動物細胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬的細菌細胞；真菌細胞如酵母；植物細胞；昆蟲細胞；動物細胞等。用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進行。當宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態(tài)細胞可在指數(shù)生長期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進行。當宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。在本發(fā)明中，用上述方法轉(zhuǎn)化的、攜帶ACHE表達盒的宿主細胞，可用于篩選ACHE的激動劑。篩選方法利用本發(fā)明的ACHE啟動子元件和相應(yīng)的表達盒、載體或宿主細胞作為篩選平臺，可篩選出與ACHE蛋白的激動劑。本發(fā)明還提供了利用該篩選平臺的篩選抑制癌癥或癌細胞生長的候選化合物的方法。一種優(yōu)選的篩選方法包括步驟(a)在本發(fā)明上述宿主細胞的培養(yǎng)體系中，添加測試物，并觀察所述報告基因的表達情況；其中，促進報告基因表達的測試物被選為抑制癌癥或抑制癌細胞生長的候選化合物。在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括步驟(b):對步驟(a)中獲得的候選化合物，進一步測試該化合物是否可以抑制肝癌細胞的生長或增殖。在本發(fā)明中，所述的表達情況包括報道基因的mRNA水平或報告基因所編碼的酶活性水平。本發(fā)明還包括用上述方法篩選得到的抑制癌癥或癌細胞生長的候選化合物。篩選的激動劑和藥物組合物本發(fā)明ACHE蛋白的激動劑，當在治療上進行施用(給藥)時，可促進ACHE蛋白的表達，進而抑制癌細胞(包括肝癌)的生長或增殖。通常，可將這些物質(zhì)配制于無毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中PH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進行給藥，其中包括(但并不限于)瘤內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、或局部給藥。本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的、用本發(fā)明方法篩選獲得的ACHE激動劑以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規(guī)方法進行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量，例如每天約I微克-10毫克/千克體重。 本發(fā)明的主要優(yōu)點包括(a)利用ACHE全長基因啟動子以及相應(yīng)表達盒、載體和宿主細胞，可以快速、有效、簡便地篩選到ACHE的激動劑。(b)本發(fā)明的篩選方法有助于高通量篩選ACHE的激動劑。下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New York Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)是重量百分比和重量份數(shù)。一、材料I.組織樣本50對癌和癌旁組織來自于原發(fā)性肝癌患者的手術(shù)切除標本，這些標本來自于啟東肝癌研究所和浙江大學(xué)第一附屬醫(yī)院。9例正常肝來自于意外死亡者。上述所有標本的取得均通過上海市政府授權(quán)的WHO合作組織倫理委員會的同意。組織樣本的臨床資料包括性別、年齡、腫瘤大小、病理分級(Edmonson)、肝硬化與否、轉(zhuǎn)移與否、復(fù)發(fā)與否、HBV和HCV感染情況等。所有患者術(shù)前都沒有接受化療，術(shù)后隨訪最長達60個月。2、RNA樣本(組織總RNA提取):I.樣品的收集和保存離體組織切割成小塊后立即置于液氮中速凍，然后移至-80度冰箱保存。2.組織塊破碎組織塊放于液氮中研磨成粉，每克組織加入ImlTrizol (Invitrogen 公司)。3.總RNA抽提按每毫升Trizol加0. 2ml的氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫孵育2_3分鐘；4°C，10，000g離心15分鐘；將無色上清液移入新的離心管中，加0. 5ml異丙醇，室溫孵育10分鐘，IOOOOg 4°C離心10分鐘;倒掉上清，0. 75ml75%乙醇洗滌，4°C，7，500g離心5分鐘；倒掉上清，室溫干燥RNA沉淀5-10分鐘(勿使RNA完全干燥)，用DEPC處理后的無RNA酶H20溶解沉淀。4.分光光度計法定量RNA，并取少量Total RNA進行電泳，檢查RNA是否降解。3.抗體Anti-ACHE 抗體，購自 Santa Cruz Biotechnology。Anti-ACHE 抗體，購自 Millipore system。Anti-P-actin 抗體,購自 Sigma-Aldrich。
4.引物
權(quán)利要求
1.一種乙酰膽堿酯酶ACHE基因啟動子的用途，其特征在于，用于篩選抑制肝癌的候選藥物。
2.—種表達盒,其特征在于,所述的表達盒包括或由以下元件構(gòu)成ACHE啟動子以及與該啟動子操作性相連的報告基因。
3.—種表達載體，所述的表達載體中含有權(quán)利要求2所述的表達盒。
4.一種宿主細胞，其特征在于，所述的宿主細胞攜帶權(quán)利要求3所述的表達載體或基因組中整合有權(quán)利要求2所述的表達盒。
5.如權(quán)利要求2所述的表達盒、權(quán)利要求3所述的表達載體或權(quán)利要求4所述的宿主細胞的用途，其特征在于，用于篩選抑制肝癌的候選藥物。
6.一種篩選抑制癌癥或癌細胞生長的候選化合物的方法，其特征在于，包括步驟 (a)在如權(quán)利要求4所述的宿主細胞的培養(yǎng)體系中，添加測試物，并觀察所述報告基因的表達情況；其中，促進報告基因表達的測試物被選為抑制癌癥或抑制癌細胞生長的候選化合物。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述的癌癥包括肝癌，所述的癌細胞包括肝癌細胞。
8.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法還包括步驟(b):對步驟(a)中獲得的候選化合物，進一步測試該化合物是否可以抑制肝癌細胞的生長或增殖。
9.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述的表達情況包括報道基因的mRNA水平或報告基因所編碼的酶活性水平。
10.一種用權(quán)利要求6所述方法篩選得到的抑制癌癥或癌細胞生長的候選化合物。
全文摘要
本發(fā)明提供了乙酰膽堿酯酶基因啟動子用于抗肝癌藥物的篩選。具體地，本發(fā)明提供了乙酰膽堿酯酶(ACHE)的完整啟動子，含所述啟動子的表達盒、以及含所述表達盒的載體和宿主細胞。利用本發(fā)明的啟動子、表達盒、表達載體和宿主細胞，可以有效、簡便、快速地篩選ACHE蛋白激動劑。本發(fā)明還提供了相應(yīng)的篩選方法和篩選平臺。
文檔編號A61K45/00GK102719522SQ20111008018
公開日2012年10月10日 申請日期2011年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月31日
發(fā)明者何祥火, 趙瑩珺 申請人:上海市腫瘤研究所