專利名稱：原始干細胞亞群在制備治療心血管疾病的藥物中的用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及原始干細胞亞群分離培養(yǎng)及誘導的有效方法，并涉及首次利用5-氮胞雜苷誘導骨髓原始干細胞亞群向心肌細胞分化，利用血管內皮生長因子VEGF-B誘導原始干細胞亞群向血管內皮細胞分化，并應用于體內治療急性心肌梗塞。
背景技術：
目前，我國己經進入老齡化社會，心血管疾病的發(fā)病率、致死率呈逐年上升趨勢，心血管疾病成為人類三大死亡原因之一?，F在臨床上對其進行治療的藥物、介入和手術等常用方法較難糾正已經壞死和衰老的心血管組織，而心血管組織自身修復能力有限。替代治療為另一種治療策略，分為器官移植和細胞移植。由于器官來源不足、免疫排斥、費用高昂，嚴重限制了器官移植的應用。干細胞具有自我更新和多分化能力，為細胞移植的理想細胞，其中，骨髓原始干細胞亞群由于其易獲得、擴增等諸多優(yōu)點，成為首選種子細胞。本發(fā)明在國際上首次將骨髓原始干細胞亞群分別在體外和體內誘導分化為心肌和血管內皮細胞，并建立了原始干細胞亞群分離培養(yǎng)及誘導的有效方法，為用于細胞移植以治療心血管疾病，特別是急性心肌梗塞提供了新的途徑。

發(fā)明內容
本發(fā)明建立了原始干細胞亞群分離培養(yǎng)及誘導的有效方法，涉及首次利用5-氮胞雜苷誘導骨髓原始干細胞亞群向心肌細胞分化，利用血管內皮生長因子VEGF-B誘導原始干細胞亞群向血管內皮細胞分化，并應用于體內治療急性心肌梗塞。從骨髓中分離、培養(yǎng)的原始干細胞亞群是一類亞全能干細胞，具有分化為心血管組織的潛能。體外經誘導的原始干細胞亞群表達肌凝蛋白重鏈和肌鈣蛋白I，表達VIII因予相關抗原和⑶31。在體內標記的原始干細胞亞群表達陽性的肌凝蛋白重鏈和VIII因子相關抗原，分化為心肌和血管內皮細胞。對急性心肌梗死患者PCI術后自體原始干細胞亞群行冠脈內注射，比較對照組檢測表明患者心功能及預后明顯改善。這就為心血管再生醫(yī)學提供理想種子細胞，為治療心血管疾病，特別是治療急性心肌梗塞提供了新方法。具體而言，本發(fā)明涉及原始干細胞亞群在制備用于治療心血管疾病的藥物中的用途。特別地，本發(fā)明所述用途中所使用的原始干細胞亞群是按下述步驟獲得的一類原始干細胞亞群a)從骨髓中分離出單個核細胞，和b)用擴增培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，其中擴增培養(yǎng)液含有胎牛血清和抗壞血酸，且其細胞表型為⑶29、⑶44、⑶105和Flk-I陽性。特別地，在本發(fā)明所述的用途中，利用5-氮胞雜苷分別誘導所述原始干細胞亞群在體外和體內向心肌細胞分化，經免疫熒光檢測出誘導的細胞表面表達心肌細胞特異性的表面標志分子和相關抗原，體外經誘導的原始干細胞亞群表達肌凝蛋白重鏈和肌鈣蛋白I;在體內標記的原始干細胞亞群表達陽性的肌凝蛋白重鏈，分化為有功能的心肌細胞。相似地,利用血管內皮生長因子VEGF-B分別誘導所述原始干細胞亞群在體外和體內向血管內皮細胞分化，經免疫熒光檢測誘導的細胞表面表達血管內皮細胞特異性的表面標志分子和相關抗原，體外經誘導的原始干細胞亞群表達VIII因子相關抗和CD31 ;在體內標記的原始干細胞亞群表達陽性的VIII因子相關抗原，分化為血管內皮細胞。特別地，在本發(fā)明所述的用途中，所述心血管疾病是先天性或獲得性、心血管疾病引起的心肌及血管缺損，特別是急性心肌梗塞。本發(fā)明的優(yōu)點在于
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I.本發(fā)明報道了骨髓原始干細胞亞群的分離、培養(yǎng)和擴增過程，操作方法簡單可行；2.本發(fā)明首次報道骨髓原始干細胞亞群在體內和體外分別誘導分化為心肌細胞和血管內皮細胞的過程，并證明了骨髓原始干細胞亞群胞分化為心血管組織的潛能；3.本發(fā)明確定了骨髓原始干細胞亞群誘導分化為心血管組織的檢測方法，細胞形態(tài)及功能性證明，這就為干細胞及組織工程應用研究提供了標準審核的基礎；4.本發(fā)明為治療心血管疾病，特別是急性心肌梗塞提供了實驗依據和臨床研究依據，為細胞移植治療提供了新的途徑。


圖I :顯示了原始干細胞亞群的免疫表型和細胞周期A免疫表型；B細胞周期。圖2 :顯示了原始干細胞亞群體外分化為心血管組織。A誘導為心肌細胞al誘導前；a2四周后；a3抗心肌凝蛋白重鏈-FITC ;a4抗心肌肌鈣蛋白I-PE ；B誘導為血管內皮細胞bl誘導前；b2 二周后；b3抗vWF-FITC ；b4抗CD31-PE圖3 :顯示了心臟冰凍切片中PKH26熒光檢測。圖4 :顯示了原始干細胞亞群體內分化為心血管組織。A al抗心肌凝蛋白重鏈-FITC ；a2抗fcdU_PE ；a3al和a2的合并B bl 抗 vWF-FITC ；b2 抗 fcdU-PE ；b3bl 和 b2 的合并圖5 :顯示了兩組的心肌核素檢查。圖6 :顯示了原始干細胞亞群的PKH26熒光和BrdU標記。A原始干細胞亞群注射前的PKH26熒光標記B心肌組織中PKfi26熒光顯色C Cl為培養(yǎng)的原始干細胞亞群經BrdU標記后的免疫熒光顯色；C2為培養(yǎng)的原始干細胞亞群的光鏡觀；C3為Cl和C2的合并7 :顯示了心肌組織的免疫熒光顯色。A紅色為抗心肌凝蛋白重鏈的PE顯色，綠色為抗BrdU的FITC顯色B紅色為BrdU的PE顯色，綠色為抗連接蛋白43的FITC顯色C紅色為BrdU的PE顯色，綠色為抗vWF的FITC顯色D紅色為BrdU的PE顯色，綠色為抗平滑肌肌動蛋白的FITC顯色
圖8 :顯示了兩組間左室壓力檢測結果比較。圖9 :顯示了兩組患者基線及3月隨訪超聲心動圖、核素之間指標比較。
具體實施例方式本發(fā)明具體涉及一種分離，培養(yǎng)一類原始干細胞亞群的制備工藝，涉及一種原始干細胞亞群用于治療心血管損傷的方法。其特征在于細胞表型是⑶29、⑶44、⑶101、Flk-I陽性，誘導原始干細胞亞群分化為心 血管組織，涉及原始干細胞亞群的分離、培養(yǎng)，在體外經誘導因子誘導培養(yǎng)而分別表達心肌細胞和血管內皮細胞的特異性細胞表面標志和相關抗原分子。在體內標記的原始干細胞亞群誘導后檢測出同樣的陽性結果，并分化成有功能性的心肌和血管內皮細胞。對急性心肌梗死患者PCI術后自體原始干細胞亞群行冠脈內注射，比較對照組檢測表明患者心功能及預后明顯改善。這就為心血管損傷，特別是治療急性心肌梗塞提供了新途徑。本發(fā)明的另一個方面涉及一類干細胞亞群的制備工藝，其特征在于從骨髓中分離出單個核細胞，用擴增培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，從而獲得了一類原始干細胞亞群。如擴增培養(yǎng)液含有胎牛血清、抗壞血酸等。特別地，本發(fā)明的一個方面具體涉及心肌細胞誘導方法，其特征在于在體外和體內分別利用5-氮胞雜苷誘導原始干細胞亞群向心肌細胞分化。經免疫熒光檢測出誘導的細胞表面表達心肌細胞特異性的表面標志分子和相關抗原尿，如體外經誘導的原始干細胞亞群表達肌凝蛋白重鏈和肌鈣蛋白I ;在體內標記的原始干細胞亞群表達陽性的肌凝蛋白重鏈，分化為有功能的心肌細胞。特別地，本發(fā)明的一個方面具體涉及血管內皮細胞誘導方法，其特征在于在體外和體內分別利用血管內皮生長因子VEGF-B誘導原始干細胞亞群向血管內皮細胞分化。經免疫熒光檢測誘導的細胞表面表達血管內皮細胞特異性的表面標志分子和相關抗原，如體外經誘導的原始干細胞亞群表達VIII因子相關抗和⑶31。在體內標記的原始干細胞亞群表達陽性的VIII因子相關抗原，分化為血管內皮細胞。特別地，本發(fā)明的一個方面涉及一種應用于心血管疾病的治療干細胞亞群的制備工藝，其特征在于對急性心肌梗死患者行自體原始干細胞亞群冠脈內注射治療，和未使用原始干細胞亞群注射治療的對照組相比，可明顯改善患者心功能及預后。特別地，本發(fā)明的一個方面涉及一種原始干細胞亞群用于治療心血管損傷的方法，其特征在于應用于治療各種先天性或獲得性、心血管疾病引起的心肌及血管缺損，特別是急性心肌梗塞干細胞亞群的制備工藝。實施例本發(fā)明的目的是通過下述方法實現的。實施例一、骨髓原始干細胞亞群的分離和培養(yǎng)取胎兒骨髓，用Ficoll-Paque (I. 077g/ml)分離液分離出單個核細胞，離心取白環(huán)及白環(huán)上下細胞，將離心后的細胞打散并以I X IO7個/ml細胞接種在塑料培養(yǎng)瓶內。用含有胎牛血清、抗壞血酸的擴增培養(yǎng)液在含5%的C02，37°C培養(yǎng)箱內孵育。3天后胰酶消化傳代擴增。實施例二、原始干細胞亞群的免疫表型和細胞周期測定
用間接免疫熒光法(FITC熒光標記抗體)檢測細胞表型。流式細胞儀測定原始干細胞亞群的周期。結果顯示，⑶29、⑶44、⑶105、⑶166、Flk-I為陽性，內皮細胞表型vWF、⑶31和造血細胞表型⑶11a、⑶34、⑶45均為陰性，HLA-DR亦陰性，見圖1A。通過流式細胞儀分析細胞周期，約95. 61%細胞處在G0/G1期，而處在G2-M期和S期的細胞分別為I. 65%和2. 74%，見圖IB0實施例三、原始干細胞亞群體外分化為心肌細胞和免疫熒光檢測將第一代原始干細胞亞群接種貼壁后,加入5-氮胞雜苷(5-aza,5_azacytidine,Sigma公司)24小時后洗去，換用培養(yǎng)基，每3天換液。4周后固定，以紅色熒光PE或綠色熒光FITC標記的抗體行免疫熒光檢測。研究結果發(fā)現經5-aza誘導后，部分原始干細胞亞群更加細長，逐漸相連呈肌管狀，但未見自發(fā)性跳動。免疫熒光檢測結果提示，誘導后的原始干細胞亞群表達心肌細胞特異性蛋白心肌凝蛋白重鏈和肌鈣蛋白I，已分化為心肌細胞，見圖2A。實施例四、原始干細胞亞群體外分化為血管內皮細胞和免疫熒光檢測用fibronectin鋪底,將第一代原始干細胞亞群接種于24孔板中，加入擴增培養(yǎng)液。貼壁后，換用誘導培養(yǎng)液(不含血清和EGF，但含10ng/ml的VEGF-B)，每3天換液。2周后固定，進行免疫熒光檢測。經VEGF-B誘導后，部分原始干細胞亞群逐漸聚集，逐漸變得扁平。經抗vWF和CD31的免疫熒光檢測，分化的細胞為陽性，提示己分化為血管內皮細胞，見圖2B。實施例五、心肌損傷模型的建立、原始干細胞亞群的注入和體內分化檢測選用4只免疫功能嚴重缺陷的N0D/SCID小鼠(購于中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所)，腹腔注射異丙腎上腺素(20mg/kg) —次，制成心肌損傷模型。標記原始干細胞亞群方法為，嘧啶的類似物溴化脫氧尿嘧啶(BrdU，Sigma公司)或熒光PKH26 (Sigma公司)。2只小鼠的原始干細胞亞群的標記為BrdU ;另2只小鼠給其原始干細胞亞群進行PKH26熒光染色。取原始干細胞亞群經尾靜脈緩慢注。I月后，斷頸處死，取出心臟，PKH26熒光標記的小鼠心臟，冰凍切片查熒光可檢測到PKH26陽性的細胞，見圖3 ;BrdU標記的小鼠心臟，石蠟切片經免疫熒光檢測，可見BrdU標記陽性的細胞心肌凝蛋白重鏈表達陽性，提示在體內已分化為心肌細胞，并可見和原心肌細胞排列一致，端端相連，見圖4A ;可見BrdU標記陽性的細胞也表達vWF，提示在體內已分化為血管內皮細胞，見圖4B。實施例六.骨髓原始干細胞亞群誘導分化為心血管組織的應用例作(一 )原始干細胞亞群治療急性心肌梗塞的實驗研究I.原始干細胞亞群的分離、培養(yǎng)和標記選用20_30kg雄性家豬，心梗制作成功后存活者按心梗次序隨機分為治療組和對照組。在無菌條件下抽取髂骨骨髓，分離出原始干細胞亞群體外培養(yǎng)。注射前2天，在培養(yǎng)液中加入BrdU標記；部分豬在注射前給其原始干細胞亞群進行PKH26熒光染色。用間接免疫熒光法檢測，⑶105、⑶44、⑶29為陽性，內皮細胞表型vWF、⑶31和造血細胞表型⑶34、⑶45均為陰性。流式細胞周期結果顯示，約92. 00%細胞處在G0/G1期，而處在G2-M期和S期的細胞分別為4. 74% 和3. 25%。2.急性心肌梗塞(acute myocardial infarction,AMI)模型的制作和細胞注入氯氨酮麻醉后，送入心導管室，建立耳緣靜脈通道，給予咪達唑侖維持麻醉，心電和血氧飽和度監(jiān)護，無菌條件下穿刺右股動脈，置入動脈鞘管，送入2. OmmX 20mm的球囊至前降支中遠1/3處，充氣阻斷冠脈I小時，可見胸前導聯(lián)ST段抬高。期間輸注利多卡因直至再灌注時。拔除導管，壓迫止血，送返動物房。8-10天后，消化貼壁的原始干細胞亞群，經100目濾網過濾后，將10MSC重懸于肝素化的生理鹽水中，重返導管室，送入球囊至原阻斷血流處，充氣阻斷冠脈數分鐘，避免返流，注入原始干細胞亞群至遠端，未見ST段抬高和嚴重的心率失常。對照組注射生理鹽水。3.心肌核素顯像檢查4周后，核素心肌斷層顯像檢測相對心梗面積、心肌灌注評分和左室射血分數，從圖5可見，治療組和對照組相比，心肌灌注評分(30. 0±5. 3對41. 8±8. 8，p < O. 01)和相對心梗面積[(28.6 + 4. 7)%對(33. 5±3. 4)%,p<0. 05]顯著降低，射血數[(44. I±4. 3)%對(39. 0±5. 2) %，P < O. 05]顯著增加。 4.經導管的壓力檢測在心梗前、注入原始干細胞亞群前、處死前三個時間點，經導管檢測左室收縮壓((left ventricular systolic pressure, LVSP)、左室舒張末壓(left end-diastolicpressure, LVEDP)、壓力升高最大速率(peak rateof pressure rise, +dP/dt)和壓力下降最大速率(peak rate of pressure fall, -dP/dt)。研究結果見圖8,和對照組相比，LVSP(87. 1±8· 7mmHg 對 78. 0±4· 4mmHg，p < O. 05)、+dP/dt (1818. I ± 116. 7mmHg/s 對1610. 6±114· 5mmHg/s, ρ < O. 01)和-dP/dt (1800. 9±88· 5mmHg/s 對 1618. 4±65· 7mmHg/s，ρ < O. 01)顯著增加，LVEDP(9. 4±1. 7mmHg 對 12. 6±2. 8mmHg, ρ < 0. 05)顯著降低，心功能得以改善。5.心肌組織學和免疫熒光檢測取心梗周圍組織，部分送查ΡΚΗ26熒光，大部分在10%中性甲醛固定，石蠟包埋，切片后行HE染色和免疫熒光檢測。HE染色可見，治療組比對照組，纖維組織減少，血管密度增加[(6. 0± I. 3)根/0. 2mm2對(4. 5±0· 9)根/0. 2mm2, ρ < O. 05]，未見脂肪和骨骼組織沉積、未見腫瘤組織。圖6中可見，檢測ΡΚΗ26和BrdU的標記率，ΡΚΗ26約為99% (圖6Α)，BrdU約為80% (圖6C)。實驗組ΡΚΗ26熒光檢測，可見在心肌組織內有橙紅色熒光(圖6Β)。免疫熒光檢測顯示，在心肌細胞、血管內皮和平滑肌細胞中可見BrdU陽性細胞，提示MSC己植入并植活。如圖7所顯示，BrdU陽性細胞己分化為心肌細胞(圖7Α)，并和原心肌細胞有縫隙連接形成(圖7Β)，BrdU陽性細胞也可分化為血管內皮(圖7C)和平滑肌細胞(圖 7D)。(二)自體骨髓間充質干細胞移植修復梗死心肌的臨床研究為研究急性心肌梗死患者在接受自體原始干細胞亞群冠脈內注射治療的安全性以及對心功能的改善作用，我們選取10例急性心肌梗死患者作為實驗組(細胞治療組，cell therapy group, CT組)；選取10例PCI術后拒絕行細胞治療的急性心肌梗死患者作為對照組(標準治療組，standard therapy group, ST組)。I.原始干細胞亞群分離、培養(yǎng)及鑒定在無菌狀態(tài)下穿刺CT組患者髂后上棘，抽取骨髓分離原始干細胞亞群培養(yǎng)，擴增10-14天后當細胞總量達IO7時胰酶消化，移植術前I小時重懸于生理鹽水備用。培養(yǎng)后骨髓原始干細胞亞群移植前均取樣進行微生物學檢驗、細胞周期及流式細胞儀鑒定。24小時可見有貼壁細胞，呈圓形；72小時大多數貼壁細胞有胞漿突起，呈短棒狀；一周后呈梭形，胞漿豐富，核大，核仁明顯。細胞免疫表型和細胞周期造血細胞表型⑶34、⑶45和內皮細胞表型vWF、⑶31均為陰性，⑶29、⑶44、CD105、Flk-l為陽性。細胞周期結果顯示，約86. 54%細胞處在G0/G1期，而處在G2-M期和S期的細胞分別為I. 56%和11. 90%。2.冠脈內注射移植手術常規(guī)術前準備同PCI術，PCI術后10 14天，選用合適大小的OTW球囊仔細定位與靶血管支架內近端，以2atm壓力充盈球囊，于 指引導管內注入造影劑證實球囊遠端無造影劑通過后，重新以2atm壓力充盈球囊并退出導絲，于球囊中心腔高壓注入骨髓間質干細胞懸液5ml (細胞數量2 7X IOVml)，并以O. 2ml肝素生理鹽水沖洗中心腔，球囊充盈持續(xù)2分鐘后球囊撤壓，間隔2分鐘后重復上述操作。根據患者的耐受程度決定注射次數及細胞量。注射結束后復查冠脈造影證實靶血管通暢無損傷后終止手術。術后患者進入CCU病房監(jiān)護，移植術后24小時白細胞計數、C-反應蛋白及肌鈣蛋白I較術前比較沒有顯著差異(P > O. 05)，移植后無心功能惡化，未出現發(fā)熱及白細胞計數升高。隨訪期間細胞治療組無心悸暈厥發(fā)生，隨訪動態(tài)心電圖未發(fā)現惡性心律失常。3.隨訪所有20例患者于PCI術后I周及術后3月進行臨床隨訪,包括心電圖、24小時動態(tài)心動圖，心臟超聲心動圖以及18氟一脫氧葡萄糖(18F-FDG)核素心肌斷層顯像。兩組患者LVEDV、LVESV及代謝缺損均有不同程度下降，但CT組3月隨訪較基線下降有顯著性差異(P < O. 05)，表明3月隨訪CT組較ST組改善明顯(P < O. 05)，提示細胞治療組存活心肌增力口，梗死面積縮小，左室重構減輕，見圖9。研究表明急性心肌梗死患者自體骨髓原始干細胞亞群冠脈內注射安全有效，可以改善患者心功能及預后，骨髓來源的心肌細胞生成及血管新生可能為其機制。
權利要求
1.原始干細胞亞群在制備用于治療心血管疾病的藥物中的用途。
2.根據權利要求I所述的用途，其特征在于所述原始干細胞亞群是按 下述步驟獲得的一類原始干細胞亞群 a)從骨髓中分離出單個核細胞，和 b)用擴增培養(yǎng)液進行培養(yǎng)， 其中擴增培養(yǎng)液含有胎牛血清和抗壞血酸。
3.根據權利要求2所述的用途，其特征在于所述原始干細胞亞群的細胞表型是CD29、CD44、CD105 和 Flk-I 陽性。
4.根據權利要求3所述的用途，其特征在于利用5-氮胞雜苷分別誘導原始干細胞亞群在體外和體內向心肌細胞分化，經免疫熒光檢測出誘導的細胞表面表達心肌細胞特異性的表面標志分子和相關抗原，體外誘導的原始干細胞亞群表達肌凝蛋白重鏈和肌鈣蛋白I ;在體內標記的原始干細胞亞群表達陽性的肌凝蛋白重鏈，分化為有功能的心肌細胞。
5.根據權利要求3所述的用途，其特征在于利用血管內皮生長因子VEGF-B分別誘導所述原始干細胞亞群在體外和體內向血管內皮細胞分化，經免疫熒光檢測誘導的細胞表面表達血管內皮細胞特異性的表面標志分子和相關抗原，體外經誘導的原始干細胞亞群表達VIII因子相關抗和⑶31 ;在體內標記的原始干細胞亞群表達陽性的VIII因子相關抗原，分化為血管內皮細胞。
6.根據權利要求I所述的用途，其特征在于所述心血管疾病是先天性或獲得性、心血管疾病引起的心肌及血管缺損。
7.根據權利要求I所述的用途，其特征在于所述心血管疾病是急性心肌梗塞。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種分離、培養(yǎng)一類原始干細胞亞群的制備工藝，涉及一種原始干細胞亞群用于治療心血管損傷的方法。從骨髓中分離、培養(yǎng)的一類原始干細胞亞群，細胞表型是CD29、CD44、CD105、Flk-1陽性，誘導原始干細胞亞群分化為心血管組織，涉及原始干細胞亞群的分離、培養(yǎng)，在體外經誘導因子誘導培養(yǎng)而分別表達心肌細胞和血管內皮細胞的特異性細胞表面標志和相關抗原分子。在體內標記的原始干細胞亞群誘導后檢測出同樣的陽性結果，并分化成有功能性的心肌和血管內皮細胞。對急性心肌梗死患者PCI術后自體原始干細胞亞群行冠脈內注射，比較對照組檢測表明患者心功能及預后明顯改善。這就為心血管損傷，特別是治療急性心肌梗塞提供了新途徑。
文檔編號A61P9/10GK102716151SQ20111007755
公開日2012年10月10日 申請日期2011年3月30日 優(yōu)先權日2011年3月30日
發(fā)明者趙春華 申請人:河北貝特賽奧生物科技有限公司