專利名稱：鴨傳染性漿膜炎二價(jià)滅活疫苗的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于預(yù)防由1、2型鴨疫里默氏桿菌引起的鴨傳染性漿膜炎的油 乳劑疫苗制備方法，屬于獸用生物制品領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
鴨傳染性漿膜炎是由鴨疫里默氏桿菌(Riemerella anatipestifer, RA))引起鴨 的一種呼吸系統(tǒng)重要傳染病。鴨傳染性漿膜炎anfectious serositis)是由鴨疫里默氏 桿菌(Riemerella anatipestifer,RA)引起的鴨的一種慢性或急性敗血性接觸性傳染性疾 病，又稱鴨疫里默氏桿菌病、新鴨病、鴨敗血癥、鴨疫綜合癥。主要侵害雛鴨、雛鵝、以及雛火 雞等多種雛禽，以2 7周齡鴨最易感，主要表現(xiàn)為漿膜炎、纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊 炎、腦膜炎等。由于本病的高死亡率和高淘汰率目前已經(jīng)成為嚴(yán)重危害養(yǎng)鴨業(yè)的疾病之一。對(duì)鴨疫里默氏桿菌的血清型分類始于1969年，Harry采用試管凝集試驗(yàn)鑒定出16 個(gè)血清型(A P)，幾年后美國(guó)國(guó)立動(dòng)物疾病中心采用沉淀試驗(yàn)鑒定出7個(gè)血清型，以阿拉 伯?dāng)?shù)字命名為1 7型，考慮到命名的標(biāo)準(zhǔn)化以及將來(lái)新型的增加，1982年Bisgarrd建議 用阿拉伯?dāng)?shù)字對(duì)血清型進(jìn)行命名，將已有的血清型命名為1 13型。在此基礎(chǔ)上Sandhu 和Leister對(duì)血清型重新進(jìn)行整理，加上新發(fā)現(xiàn)的血清型取名為1 17型，加上后來(lái)Lon 等報(bào)道的18、19型和I^athansophon等報(bào)道的20、21型，至此世界上報(bào)道的RA血清型共有 21型。2003年我國(guó)四川農(nóng)業(yè)大學(xué)程安春教授等報(bào)道了 22 25四個(gè)新的血清型，進(jìn)一步豐 富了該病的病原學(xué)的研究。由于各型毒力有所差異，型間交叉保護(hù)性極差或缺少，因此對(duì)某 地區(qū)本病的預(yù)防，最好方法是制備與當(dāng)?shù)叵嚓P(guān)型疫苗，才能獲得最佳的免疫效果。(1、程安 春，等.我國(guó)鴨疫里默氏桿菌血清型調(diào)查及新血清型的發(fā)現(xiàn)[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)禽病學(xué) 分會(huì)第十一次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集，2004，453-457.)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是采用免疫原性良好的鴨疫里默氏桿菌1型YBYN株、2型TOSD株分 別接種于適宜培養(yǎng)基，收獲培養(yǎng)物，經(jīng)甲醛溶液滅活后，加入油佐劑混合乳化制成。用于預(yù) 防由1型和2型鴨疫里默氏桿菌引起的鴨傳染性漿膜炎。一、生產(chǎn)用菌株1.菌株來(lái)源制造和檢驗(yàn)用鴨疫里默氏桿菌1型YBYN株、2型TOSD株由本發(fā)明人分離、鑒定、保 存和供應(yīng)，該兩株已于2011年2月25日送交北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué) 院微生物研究所中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏編號(hào)YBSD株 為 CGMCC No. 4614，YBYN 株為 CGMCC No. 4615。2.毒株特點(diǎn)(1)形態(tài)本菌為革蘭氏陰性(G-)小桿菌，有莢膜、無(wú)芽孢、無(wú)鞭毛，常單個(gè)存在， 少數(shù)呈雙排列，偶見呈長(zhǎng)絲狀排列，涂片經(jīng)瑞氏染色，可見部分菌體兩端濃染。
(2)生化特性過(guò)氧化氫酶、氧化酶、精氨酸脫羧酶試驗(yàn)為陽(yáng)性，能緩慢液化明膠， 靛基質(zhì)、VP、甲基紅、檸檬酸利用、硝酸鹽還原試驗(yàn)為陰性，不產(chǎn)生硫化氫，不發(fā)酵葡萄糖、蔗 糖、乳糖、麥芽糖。(3)培養(yǎng)特性本菌在普通瓊脂培養(yǎng)基和麥康凱培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)。初次分離培養(yǎng)， 需要供給5% 10%的C02。將本菌接種于巧克力瓊脂、含3%小牛血清的胰蛋白胨大豆瓊 脂(改良TSA配方見附注2)，置5% 10% C02、37°C培養(yǎng)M 48小時(shí)，可生長(zhǎng)出圓形微 隆起、表面光滑、直徑1 2mm無(wú)色素菌落。在5%綿羊鮮血瓊脂平板上生長(zhǎng)但不溶血。在 含有3%小牛血清的胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)M小時(shí)，呈上下一致輕微渾濁， 管底有少量沉淀，無(wú)菌膜。(4)血清型YBYN株為鴨疫里默氏桿菌1型JBSD株為鴨疫里默氏桿菌2型。(5)最小致病菌量能使10只1月齡健康易感鴨至少7只發(fā)病的最小致病菌量分 別為YBYN 株為 1 X IO9CFU, YBSD 株為 2X l(fCFU。(6)免疫原性用鴨疫里默氏桿菌YBYN JBSD株滅活菌液按水相油相=1 2的 比例分別制備單價(jià)油乳劑滅活疫苗(滅活前各型活菌含量約為lX109CFU/ml)，分別頸部皮 下注射3-7日齡健康易感鴨10只，0.3ml/只，另設(shè)兩個(gè)非免疫對(duì)照組，每組各10只。免疫 后14日，連同相同飼養(yǎng)條件下的對(duì)照鴨各一組，分別用相應(yīng)的YBYN株JBSD株新鮮菌液腿 部肌肉注射攻毒Iml (TOYN株活菌含量約為2X 109CFU/ml，TOSD株活菌含量約為4X IO8CFU/ ml)，觀察10日，每株菌攻毒后對(duì)照組應(yīng)至少8只發(fā)病(發(fā)病判定標(biāo)準(zhǔn)詳見附注1)，免疫組 應(yīng)至少8只保護(hù)。二、鴨疫里默氏桿菌二價(jià)滅活疫苗的生產(chǎn)方法，主要是1.采用發(fā)酵罐分別培養(yǎng)YBYN菌株JBSD菌株。先將半合成肉湯培養(yǎng)基(胰蛋白胨 大豆肉湯粉5g、氯化鈉5g、牛肉浸膏5g、水解乳蛋白5g、7水硫酸鎂0. 5g、瓊脂粉12g、溶于 IOOOml無(wú)離子水中，加熱溶化后調(diào)pH至7. 0 7. 2，121°C高壓20min后，待冷卻至55°C左 右，按無(wú)菌要求加入經(jīng)抽濾無(wú)菌的維生素&lml。對(duì)發(fā)酵罐進(jìn)行滅菌，待溫度降至37 38°C時(shí)，將2 8°C保存的二級(jí)種子液分別按2% 2. 5%加入到發(fā)酵罐內(nèi)。培養(yǎng)溫度控制 在37 38°C，攪拌轉(zhuǎn)速為100 200r/min，pH為7. 2，罐壓為0. 03 0. 05Pa，容氧量為 40%，培養(yǎng)9 10小時(shí)收獲，留樣檢驗(yàn)，置2 8°C保存，不超過(guò)5日。2.根據(jù)活菌計(jì)數(shù)結(jié)果，將滅活的鴨疫里默氏桿菌1、2型菌液均稀釋成約 6X109CFU/ml后等量混合。3.按常規(guī)方法制備成油乳劑滅活疫苗。本發(fā)明的詳細(xì)描述一、疫苗制備1.生產(chǎn)用種子制備(1) 一級(jí)種子繁殖與鑒定將YBYN株、YBSD株的凍干菌種分別接種于巧克力瓊脂 平板上，置5 % 10 % CO2、37 °C培養(yǎng)20小時(shí)，選典型菌落接種于含3 %小牛血清的TSA瓊脂 斜面，37°C培養(yǎng)M小時(shí)，然后接種于TSA肉湯，37°C振蕩培養(yǎng)M小時(shí)，按15%加入滅菌甘油 混勻，定量分裝，注明菌株名稱、裝量、分裝日期，經(jīng)純粹檢驗(yàn)合格后，作為一級(jí)種子，"200C 保存，保存期不超過(guò)3個(gè)月。(2) 二級(jí)種子繁殖將一級(jí)種子劃線接種到3%小牛血清的TSA瓊脂平板，37°C培養(yǎng)M小時(shí)，挑選典型菌落(或菌苔)接種于TSA肉湯，37°C振蕩培養(yǎng)M小時(shí)，經(jīng)純粹檢驗(yàn) 后，作為二級(jí)種子。在2 8°C保存，應(yīng)不超過(guò)48小時(shí)。2.菌液培養(yǎng)采用發(fā)酵罐分別培養(yǎng)YBYN菌株JBSD菌株。先將半合成肉湯培養(yǎng)基 進(jìn)行滅菌，待溫度降至37 38°C時(shí)，將2 8°C保存的二級(jí)種子液分別按2% 2. 5%加入 到發(fā)酵罐內(nèi)。培養(yǎng)溫度控制在37 38°C，攪拌轉(zhuǎn)速為100 200r/min，pH為7. 2，罐壓為 0. 03 0. 05Pa,容氧量為40%，培養(yǎng)9 10小時(shí)收獲，留樣檢驗(yàn)，置2 8°C保存，不超過(guò)5曰。3.活菌計(jì)數(shù)取培養(yǎng)9 IOh的菌液1ml，按(中國(guó)獸藥典委員會(huì).中華人民共和 國(guó)獸藥典二〇〇五年版(三部).中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2006，本發(fā)明簡(jiǎn)稱《中國(guó)獸藥典》)附錄 方法進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，各型活菌含量均應(yīng)不低于6 X 109CFU/ml。4.滅活將檢驗(yàn)合格的菌液導(dǎo)入滅活罐中，按菌液體積的0.3%加入甲醛溶液， 37°C攪拌滅活20小時(shí)，置2 8°C保存，不超過(guò)7日。5.疫苗制備(1)水相配制取滅菌的吐溫-804份、無(wú)菌檢驗(yàn)合格的菌液96份，導(dǎo)入配液罐中， 開啟攪拌電機(jī)，勻速攪拌至吐溫-80完全溶解。(2)油相制備取注射用白油94份、司本-806份和硬脂酸鋁1份加入油相制備罐 中，開啟攪拌電機(jī)，勻速攪拌，同時(shí)開啟導(dǎo)熱油開關(guān)，125°C加熱30min，冷卻后，導(dǎo)入貯油罐 中備用。(3)乳化取油相2份置于乳化罐內(nèi)，開動(dòng)電機(jī)低速攪拌，同時(shí)緩緩加入水相1份， 再以4000r/min乳化30min。乳化后，取樣IOml,以3000r/min離心15min，應(yīng)不分層；若有 分層現(xiàn)象，應(yīng)重新乳化1次。(4)分裝定量分裝，加蓋密封。二、疫苗的安全試驗(yàn)1.鴨傳染性漿膜炎二價(jià)滅活疫苗對(duì)靶動(dòng)物的一次單劑量接種的安全性試驗(yàn)用本 發(fā)明人按本法試制的200801、200802、200803三批鴨疫里默氏桿菌二價(jià)滅活疫苗對(duì)3 7 日齡健康易感鴨(購(gòu)自青島平度)進(jìn)行一次單劑量接種安全性試驗(yàn)，0. :3ml/只，觀察14日， 記錄疫苗接種對(duì)試驗(yàn)鴨的安全性。試驗(yàn)結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)室試制的200801、200802、200803 批疫苗接種后，試驗(yàn)鴨的精神、飲食與對(duì)照鴨無(wú)明顯差異，接種后14日疫苗吸收良好。說(shuō)明 我們?cè)囍频囊呙缫淮螁蝿┝拷臃N3 7日齡健康易感鴨是安全的(詳見表1)。表1試驗(yàn)鴨一次單劑量接種安全性試驗(yàn)結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種鴨傳染性漿膜炎二價(jià)滅活疫苗，其特征是該疫苗含有經(jīng)甲醛溶液滅活的鴨疫里 默氏桿菌1型YBSD株菌、2型YBYN株菌及常規(guī)的礦物油佐劑，該兩株已于2011年2月25日 送交北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所中國(guó)微生物菌種保藏管理 委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏編號(hào)YBSD株為CGMCC No. 4614，TOYN株為CGMCCNo. 4615。
2.一種鴨傳染性漿膜炎二價(jià)滅活疫苗的生產(chǎn)方法，其特征在于(1)采用機(jī)械攪拌發(fā)酵罐分別培養(yǎng)1、2型鴨疫里默氏桿菌菌液采用發(fā)酵罐分別培養(yǎng) YBYN菌株JBSD菌株。先將半合成肉湯培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌，待溫度降至37 38°C時(shí)，將2 8°C保存的二級(jí)種子液分別按2% 2. 5%加入到發(fā)酵罐內(nèi)。培養(yǎng)溫度控制在37 38°C，攪 拌轉(zhuǎn)速為100 200r/min，pH為7. 2，罐壓為0. 03 0. 05Pa，溶氧量為40%，培養(yǎng)9 10 小時(shí)收獲，留樣檢驗(yàn)，置2 8°C保存，不超過(guò)5日；(2)根據(jù)活菌計(jì)數(shù)結(jié)果，將滅活的1、2型鴨疫里默氏桿菌菌液均稀釋成約6XIO9CFU/ ml后等量混合；(3)按常規(guī)方法制備成礦物油佐劑滅活疫苗。
3.按照權(quán)利要求2所述的一種鴨疫里默氏桿菌二價(jià)滅活疫苗的生產(chǎn)方法，其特征在于 其中所使用半合成肉湯培養(yǎng)基是胰蛋白胨大豆肉湯粉5g、氯化鈉5g、牛肉浸膏5g、水解乳 蛋白5g、七水硫酸鎂0. 5g、溶于IOOOml無(wú)離子水中，加熱溶化后調(diào)pH至7. 0 7. 2，121°C 高壓20分鐘后，待冷卻至55°C左右，按無(wú)菌要求加入經(jīng)抽濾無(wú)菌的維生素B1Iml1全文摘要
本發(fā)明涉及一種鴨傳染性漿膜炎二價(jià)滅活疫苗的生產(chǎn)方法。本發(fā)明所涉及的疫苗是采用免疫原性良好的鴨疫里默氏桿菌1型YBYN株、2型YBSD株分別接種于適宜培養(yǎng)基，收獲培養(yǎng)物，經(jīng)甲醛溶液滅活后，加入油佐劑混合乳化制成。用于預(yù)防由1型和2型鴨疫里默氏桿菌引起的鴨傳染性漿膜炎。此疫苗具有安全性好、免疫效力高且免疫期長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)A61K39/02GK102125687SQ20111005425
公開日2011年7月20日 申請(qǐng)日期2011年3月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月8日
發(fā)明者杜元釗, 申洪銀, 程增青, 胡瀟, 范根成, 郭玉廣, 馬爽 申請(qǐng)人:青島易邦生物工程有限公司