專利名稱：一種草魚注射疫苗增效劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于草魚的注射疫苗增效劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
目前，草魚病害問題仍是決定養(yǎng)殖成功與否的重要因素之一。傳統(tǒng)的化學(xué)藥物防 治雖可起到一定的作用，但也引起了病原體產(chǎn)生耐藥性、病原變異頻率加快、養(yǎng)殖環(huán)境失衡 等問題，嚴(yán)重威脅人類健康，不利于水產(chǎn)養(yǎng)殖可持續(xù)發(fā)展。免疫防治是通過免疫接種的方式 提高水產(chǎn)動(dòng)物對(duì)病原的特異性抗體水平，從而減少疾病的發(fā)生。免疫防治無(wú)毒副作用，綠色 環(huán)保，且能從根本上提高機(jī)體的抵抗力，是將來(lái)水產(chǎn)動(dòng)物疾病防治的必然趨勢(shì)。國(guó)內(nèi)從上世 紀(jì)70年代開始，先后開展了草魚組織漿疫苗、出血病疫苗及草魚細(xì)菌性爛鰓、赤皮、腸炎等 疫苗方面的工作，但免疫效果不穩(wěn)定，因此一直沒有得到廣泛推廣應(yīng)用。佐劑能一定程度上 提高水產(chǎn)疫苗的免疫效果，如鋁膠、礦物油等，但這些常用的佐劑對(duì)很多抗原效果不確定， 或?qū)︳~體有較大的副作用。β -葡聚糖具有較強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)作用，能促進(jìn)機(jī)體巨噬細(xì)胞吞噬和殺菌活性，刺激 機(jī)體B細(xì)胞、T細(xì)胞的生成，提高機(jī)體對(duì)抗原的免疫應(yīng)答水平，β-葡聚糖作為非特異性的 免疫調(diào)節(jié)劑，不僅能激活免疫細(xì)胞，還能促進(jìn)細(xì)胞因子生成，激活補(bǔ)體系統(tǒng)，促進(jìn)抗體產(chǎn) 生，對(duì)免疫系統(tǒng)發(fā)揮多方面的調(diào)節(jié)作用。與其他免疫增強(qiáng)劑不同，葡聚糖對(duì)免疫系統(tǒng) 不會(huì)造成過度刺激，因此體弱和免疫機(jī)能受損的魚體同樣可以使用。半乳甘露寡糖不僅能夠激活巨噬細(xì)胞，誘導(dǎo)機(jī)體體液免疫反應(yīng)，增強(qiáng)動(dòng)物體的非 特異性免疫功能，且具有特殊的抗菌效果，能顯著增強(qiáng)動(dòng)物對(duì)各種環(huán)境的應(yīng)激機(jī)能?？莶菅挎邨U菌外膜蛋白和多糖能刺激機(jī)體免疫細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞活力，起到佐劑的 作用，且枯草芽孢桿菌可作為一種“自然微粒”佐劑使機(jī)體免疫相關(guān)的組織處于高度的“免 疫準(zhǔn)備狀態(tài)”，從而促進(jìn)機(jī)體較快的產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，促進(jìn)Τ、Β淋巴細(xì)胞的產(chǎn)生，提高機(jī)體體 液和細(xì)胞免疫水平。中國(guó)專利申請(qǐng)公開號(hào)CN101390925A (
公開日2009年3月25日)公開了一種淡水 魚苗用復(fù)合免疫增強(qiáng)劑，由β -葡聚糖、殼聚糖、枯草芽孢桿菌、維生素C、柴胡、黃芪和杜仲 所組成，重量百分?jǐn)?shù)范圍分別為25 ；35、20 30、15 25、10 15、8 13、7 11和5 8。主要在魚苗飼料中作為飼料添加劑使用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中免疫注射劑佐劑效果不穩(wěn)定、對(duì)動(dòng)物體副作用 大等缺陷，提供一種用于草魚的注射疫苗增效劑。本發(fā)明的另一目的在于提供上述用于草魚的注射疫苗增效劑的制備方法。本發(fā)明的又一目的是提供上述用于草魚的注射疫苗增效劑在免疫草魚中的應(yīng)用。本發(fā)明的上述目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)
一種草魚注射疫苗增效劑，每毫升增效劑有效成分為酵母β -1，3葡聚糖0. 1 0. 2g，半乳甘露寡糖0. 05 0. Ig,枯草芽孢桿菌3X IO8CFU 3X 101(ICFU。優(yōu)選方案為酵母 β -1，3葡聚糖0. 2g，半乳甘露寡糖0. lg，枯草芽孢桿菌3X 101(ICFU。上述增效劑中，酵母β-1，3葡聚糖為水溶性的，能夠激活機(jī)體免疫細(xì)胞，增強(qiáng)和 刺激動(dòng)物體的非特異性免疫功能和產(chǎn)生特異性免疫功能，提高機(jī)體的免疫能力。上述增效劑中半乳甘露寡糖激活巨噬細(xì)胞，誘導(dǎo)機(jī)體體液免疫反應(yīng)，且具有特殊 的抗菌效果，能顯著增強(qiáng)動(dòng)物對(duì)各種環(huán)境的應(yīng)激機(jī)能。上述增效劑中，枯草芽孢桿菌作為一種“自然微粒”佐劑使機(jī)體免疫相關(guān)的組織處 于高度的“免疫準(zhǔn)備狀態(tài)”，從而促進(jìn)機(jī)體較快的產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，促進(jìn)τ、B淋巴細(xì)胞的產(chǎn) 生，提高機(jī)體體液和細(xì)胞免疫水平。上述草魚注射疫苗增效劑的制備方法，包括以下步驟
稱取1 2g酵母β -1，3葡聚糖，0. 5 Ig半乳甘露寡糖加入到IOmL枯草芽孢桿菌菌 液中，充分混和均勻。優(yōu)選方案為將枯草芽孢桿菌用0. 01 M PBS, ρΗ7. 2的磷酸鹽緩沖液調(diào)整到3 X IO8 CFU/mL 3X 101(lCFU/mL，4°C保存；稱取酵母β _1，3葡聚糖和半乳甘露寡糖加入到上述枯 草芽孢桿菌菌液中，用0.01Μ，ρΗ7. 2的無(wú)菌PBS調(diào)節(jié)濃度，使酵母β _1，3葡聚糖終濃度為 0. 1 0. 2g /mL,更優(yōu)選0. 2g/mL ；半乳甘露寡糖終濃度為0. 05 0. Ig /mL,優(yōu)選0. Ig / mL，充分混和均勻。上述草魚注射疫苗增效劑在免疫草魚中的應(yīng)用，是在注射疫苗前配制增效劑，現(xiàn) 配現(xiàn)用，然后與注射疫苗按1:50 100的體積比混合，最大體積比為1 100，注射劑量為按 魚體重注射0. 1 0. 3ml。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果
在疫苗口服和浸泡效果不穩(wěn)定的情況下，疫苗注射仍為首選的免疫方式，本發(fā)明將酵 母β -1，3葡聚糖、半乳甘露寡糖及枯草芽孢桿菌聯(lián)合制成免疫增效劑，是專門針對(duì)草魚的 生物學(xué)特性制備而成的。該增效劑對(duì)注射用疫苗具有明顯的增強(qiáng)作用，起到較好的免疫效 果，提高疫苗的保護(hù)期，能夠滿足生產(chǎn)需求?？莶菅挎邨U菌與現(xiàn)有的注射用佐劑相比，這種 天然的微粒佐劑對(duì)魚體沒有副作用，且能刺激細(xì)胞活性，產(chǎn)生快速、持久的免疫應(yīng)答反應(yīng)。 酵母β -1，3葡聚糖和半乳甘露寡糖作為免疫增強(qiáng)劑在注射疫苗方面未見應(yīng)用。本發(fā)明增效劑組分較少，制備方法簡(jiǎn)單易操作，成本低廉，增效作用明顯，適于廣 泛應(yīng)用。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 :增效劑的制備
培養(yǎng)基配方20g葡萄糖+15g蛋白胨+5g氯化鈉+0. 5g牛肉膏+20g瓊脂，溶于IL蒸 餾水后高壓滅菌。將枯草芽孢桿菌在上述液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12小時(shí)后，用0.01 M PBS, PH7. 2的磷酸鹽緩沖液洗滌3次，然后用PBS調(diào)整到3X 101(lCFU/mL，4°C保存。注射前根據(jù) 菌液體積稱量酵母β -1，3葡聚糖、半乳甘露寡糖，使其在增效劑中的終濃度分別為0. 2g/ mL、0. 1 g/mL，將增效劑按1 :50加入疫苗中，現(xiàn)配現(xiàn)用。實(shí)施例2 增效劑的制備
培養(yǎng)基配方20g葡萄糖+15g蛋白胨+5g氯化鈉+0. 5g牛肉膏+20g瓊脂，溶于IL蒸餾水后高壓滅菌。將枯草芽孢桿菌在上述液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12小時(shí)后，用0.01 M PBS, PH7. 2的磷酸鹽緩沖液洗滌3次，然后用PBS調(diào)整到3X 101(lCFU/mL，4°C保存。注射前根據(jù) 菌液體積稱量酵母β -1，3葡聚糖、半乳甘露寡糖，使其在增效劑中的終濃度分別為0. 2g/ mL、0. 1 g/mL，將增效劑按1 100加入疫苗中，現(xiàn)配現(xiàn)用。
實(shí)施例3 本發(fā)明增效劑對(duì)草魚弱毒疫苗的增效作用
選取實(shí)施例1和2中的增效劑對(duì)草魚弱毒疫苗增效。草魚弱毒疫苗為珠江水產(chǎn)研究所 生產(chǎn)的草魚凍干細(xì)胞弱毒苗。選擇體質(zhì)健壯的草魚種，體重50士5g，共600尾，放養(yǎng)于3個(gè) : X an X an的網(wǎng)箱中，水溫洲士 2 °C，暫養(yǎng)7d確定無(wú)病后進(jìn)行免疫注射，分別為增效組、正 常疫苗組、對(duì)照組(PBS)，背鰭基部注射0. 2mL/尾，免疫觀天后，隨機(jī)抽取網(wǎng)箱內(nèi)的試驗(yàn)魚
；，連續(xù)觀察14d，統(tǒng)計(jì)死亡率，按下列公式計(jì)算
30尾，注射1 10病毒組織漿0. 3mL進(jìn)行攻 成活率和相對(duì)免疫保護(hù)率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。
成活率=(攻毒數(shù)-死亡數(shù))/攻毒數(shù)X 100%
相對(duì)保護(hù)率=(PBS對(duì)照組死亡數(shù)-實(shí)驗(yàn)組死亡數(shù))/PBS對(duì)照組死亡數(shù)X 100%
表1本發(fā)明對(duì)草魚疫苗的免疫增強(qiáng)效果
權(quán)利要求
1.一種草魚注射疫苗增效劑，其特征在于每毫升增效劑有效成分為酵母β-1，3葡聚 糖0. 1 0. 2g，半乳甘露寡糖0. 05 0. Ig,枯草芽孢桿菌3 X IO8CFU 3 X 101CICFU。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述草魚注射疫苗增效劑，其特征在于每毫升增效劑有效成分為酵 母β -1，3葡聚糖0. 2g，半乳甘露寡糖0. Ig,枯草芽孢桿菌3 X IO10CFU0
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述草魚注射疫苗增效劑，其特征在于所述酵母β-1，3葡聚糖為水 溶性的。
4.權(quán)利要求1 3所述草魚注射疫苗增效劑的制備方法，其特征在于包括以下步驟 稱取1 2g酵母β -1，3葡聚糖，0. 5 Ig半乳甘露寡糖加入到IOmL枯草芽孢桿菌菌液 中，充分混和均勻。
5.權(quán)利要求1 3所述草魚注射疫苗增效劑在免疫草魚中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述草魚注射疫苗增效劑在免疫草魚中的應(yīng)用，其特征在于使用方 法是在疫苗注射前現(xiàn)配現(xiàn)用，將酵母β-1，3葡聚糖和半乳甘露寡糖加入到枯草芽孢桿菌 菌液中，使酵母β -1，3葡聚糖終濃度為0. 1 0. 2g /mL,半乳甘露寡糖終濃度為0. 05 0. Ig /mL，充分混勻后與注射疫苗進(jìn)行混合，增效劑與注射疫苗的體積比為1:50 100。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種草魚注射疫苗增效劑，每毫升增效劑有效成分為酵母β-1,3葡聚糖0.1～0.2g，半乳甘露寡糖0.05～0.1g，枯草芽孢桿菌3×108CFU～3×1010CFU。本發(fā)明還公開了上述增效劑的制備方法，是將1～2g酵母β-1,3葡聚糖，0.5～1g半乳甘露寡糖加入到10mL枯草芽孢桿菌菌液中，充分混和均勻。本發(fā)明還公開了上述草魚注射疫苗增效劑在免疫草魚中的應(yīng)用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明增效劑組分較少，制備方法簡(jiǎn)單，且對(duì)草魚疫苗具有明顯的增效作用，能夠提高疫苗對(duì)草魚的保護(hù)效果，延長(zhǎng)免疫保護(hù)期。
文檔編號(hào)A61K36/064GK102058884SQ20111002808
公開日2011年5月18日 申請(qǐng)日期2011年1月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月26日
發(fā)明者余露軍 申請(qǐng)人:廣東海大集團(tuán)股份有限公司