專利名稱：優(yōu)化的TACI-Fc融合蛋白用于制備治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡藥物的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及應(yīng)用B淋巴細(xì)胞刺激因子受體-抗體融合蛋白治療自身免疫性疾病領(lǐng) 域，更具體地說，涉及優(yōu)化的TACI-Fc融合蛋白用于制備治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡藥物的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)是一種慢性、多系統(tǒng)受累 的自身免疫性疾病，以B淋巴細(xì)胞異常激活并異常分化為漿細(xì)胞和記憶性效應(yīng)細(xì)胞，產(chǎn)生 大量的自身抗體為特征，嚴(yán)重威脅了人類健康。目前臨床上缺乏針對(duì)SLE特異性的治療藥 物，對(duì)于SLE的常規(guī)治療主要還是糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑為主，皮質(zhì)激素是全部治療方 案的基礎(chǔ)，環(huán)磷酰胺是目前治療重癥狼瘡性腎炎的重要藥物，但不良反應(yīng)較大限制了其臨 床使用。雖然SLE的發(fā)病機(jī)制目前尚不完全清楚，但近年來的研究結(jié)果顯示，B細(xì)胞作為經(jīng) 典的免疫效應(yīng)細(xì)胞在SLE自身免疫過程中發(fā)揮了不可替代的作用。SLE病人的B淋巴細(xì)胞 高度活化并產(chǎn)生大量的自身抗體，引起溶血性貧血和腎小球腎炎等臨床表現(xiàn)。B淋巴細(xì)胞 還產(chǎn)生腫瘤壞死因子、IL-4、IL-10等多種促炎癥細(xì)胞因子，影響其它效應(yīng)細(xì)胞，產(chǎn)生炎癥反 應(yīng)。SLE易感基因BLK和BANKl可能直接參與B細(xì)胞抗原受體(BCR)信號(hào)通路的活化、導(dǎo)致 B細(xì)胞免疫耐受的喪失，提示BCR信號(hào)通路相關(guān)的B細(xì)胞失耐受是SLE發(fā)病的重要環(huán)節(jié)。B 細(xì)胞參與SLE發(fā)病機(jī)制的分子水平的其他證據(jù)還包括FCGR基因的多態(tài)性對(duì)自身反應(yīng)性B 細(xì)胞激活、記憶B細(xì)胞的產(chǎn)生和維持、效應(yīng)細(xì)胞抗體介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的影響；參與調(diào)控B細(xì) 胞壽命及活化的分子如腫瘤壞死因子家族BLyS、參與凋亡產(chǎn)物和自身抗原加工和處理的相 關(guān)分子等均在SLE發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮作用。另外，B細(xì)胞還可能通過非抗體依賴的機(jī)制影響T 細(xì)胞激活而參與自身免疫。因此，在SLE發(fā)病過程中，B淋巴細(xì)胞被認(rèn)為與SLE的發(fā)病機(jī)制 有更直接的關(guān)聯(lián)，其治療新藥的研究熱點(diǎn)也主要集中在B淋巴細(xì)胞。研究表明，BLyS基因敲除小鼠的成熟B淋巴細(xì)胞減少，免疫球蛋白降低，而BLyS轉(zhuǎn) 基因小鼠則出現(xiàn)嚴(yán)重B淋巴細(xì)胞增生、高滴度抗dsDNA自身抗體、蛋白尿和免疫復(fù)合物在腎 臟沉積等狼瘡樣表現(xiàn)；在兩種SLE小鼠模型MRL/lpr和NZB/WF1中，發(fā)病時(shí)均存在血清BLyS 水平增高，并與腎臟損害相關(guān)，阻斷BLyS的作用可顯著改善狼瘡樣癥狀小鼠的生存。在一 些SLE患者的血清和血漿中，BLyS的水平也較正常人顯著升高，且生物學(xué)活性較正常水平 明顯增強(qiáng)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究和人體外實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果提示，BLyS過表達(dá)是參與SLE發(fā)病的重要 機(jī)制之一，因此作用于BLyS靶點(diǎn)、清除B淋巴細(xì)胞就成為非常有希望的SLE治療策略。目前，針對(duì)BLyS治療SLE的靶向生物制劑已成研究熱點(diǎn)?？赡苡糜赟LE治療的 BLyS拮抗劑包括BLyS單克隆抗體、由BLyS受體與IgG-Fc段構(gòu)成的融合蛋白、能結(jié)合于 BAFF-R但不能啟動(dòng)信號(hào)傳導(dǎo)的BLyS擬似物以及非激動(dòng)性BLyS受體抗體等。B 淋巴細(xì)胞刺激因子(B lymphocyte stimulators，BLyS)是 1999 年發(fā)現(xiàn)的 TNF 超家族新成員，主要由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和中性粒細(xì)胞分泌產(chǎn)生。BLyS通過與其相應(yīng)受體結(jié)合發(fā)揮其調(diào)控B淋巴細(xì)胞成熟、促進(jìn)免疫球蛋白類別轉(zhuǎn)換、輔助T細(xì)胞 活化和參與自身免疫等功能。BLyS由285個(gè)氨基酸組成，作為II型跨膜蛋白表達(dá)于細(xì)胞 表面，剪切后釋放的171Λ可溶性片段具有生物活性，以同源三聚體形式參加循環(huán)。目前已 知 BLyS 受體有三個(gè)BCMA(B cell maturation antigen)、BAFF-R(BAFF receptor, BR3)、 禾口 TACI (transmembrane activater and calcium modulator and cyclophilin ligand interactor, TACI)。BAFF-R是BLyS的專有受體，而TACI和BCMA除與BLyS結(jié)合外，還能與 APRIL結(jié)合。BLyS的三種受體在與BLyS結(jié)合時(shí)發(fā)揮的作用不同。BLyS促進(jìn)小鼠過渡期B 細(xì)胞成熟、延長(zhǎng)小鼠和人成熟B細(xì)胞的壽命以及輔助T細(xì)胞活化的作用主要是通過BAFF-R 實(shí)現(xiàn)的。TACI受體對(duì)小鼠B細(xì)胞的活化具有雙重效應(yīng)一方面TACI缺陷的小鼠表現(xiàn)為外周 B細(xì)胞增多、抗原合成增加，出現(xiàn)自身免疫甚至致死性淋巴增殖現(xiàn)象，提示TACI為BLyS的抑 制性受體；另一方面TACI又參與T細(xì)胞非依賴性抗原(Tl)的免疫應(yīng)答。BCMA則具有維持 漿母細(xì)胞存活和促進(jìn)成熟B細(xì)胞的抗原呈遞作用。由于TACI受體對(duì)BLyS和APRIL這兩者 均有很強(qiáng)的親和力，因此TACI-Fc融合蛋白較其他兩種融合蛋白為優(yōu)，是首選的藥物結(jié)構(gòu)。TACI最早是由美國(guó)著名學(xué)術(shù)機(jī)構(gòu)St. Jude兒童醫(yī)院科學(xué)家Von Bulow和Bram發(fā) 現(xiàn)的，但后來的研究發(fā)現(xiàn)，TACI細(xì)胞外區(qū)的自然序列存在蛋白質(zhì)易于降解的問題，不適合作 為藥物生產(chǎn)。此后，有幾家公司對(duì)TACI原分子做了改進(jìn)，包括美國(guó)著名的生物技術(shù)公司基 因泰克(Genentech)、Amgen禾口 ZymoGenetics0 目前,ZymoGenetics公司與瑞士默克雪蘭諾 公司合作的TACI融合蛋白Ataci^pt已針對(duì)SLE、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、淋巴瘤等疾病進(jìn)行臨床 試驗(yàn)，結(jié)果表明Ataci^pt具有明確的生物學(xué)活性，無明顯的副作用。申請(qǐng)人:采用蛋白質(zhì)前體加工酶人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)計(jì)算機(jī)軟件系統(tǒng)的獨(dú)特方法找 到了 TACI自然序列降解的原因，進(jìn)而用基因工程構(gòu)建了優(yōu)化的TACI-Fc融合蛋白 (CN200710111162.幻，研究結(jié)果表明優(yōu)化的TACI-Fc融合蛋白具有更好的生物學(xué)活性，具 有抑制自身免疫疾病的作用，對(duì)SLE、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫病有潛在的治療前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供優(yōu)化的TACI-Fc融合蛋白用于制備治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡藥 物的應(yīng)用。申請(qǐng)人研究了優(yōu)化的TACI-Fc融合蛋白的具體作用機(jī)制并確認(rèn)其對(duì)系統(tǒng)性紅斑 狼瘡的療效，本發(fā)明所提供的治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡藥物具有生物學(xué)活性高、用量小、安全有 效的優(yōu)點(diǎn)。申請(qǐng)人:通過蛋白質(zhì)前體加工酶人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)分析找到了天然TACI降解的位點(diǎn)， 最大限度的保留TACl氨基末端區(qū)的大部分氨基酸殘基，使優(yōu)化的TACI-Fc融合蛋白解決了 TACI降解的難題并具有更好的生物學(xué)活性。本發(fā)明所述的優(yōu)化的TACI-Fc融合蛋白的TACI部分包括來自TACI胞外區(qū)從氨基 酸殘基13開始的氨基術(shù)端區(qū)序列，富半胱氨酸區(qū)的全部序列，和柄區(qū)的部分序列，融合蛋 白的免疫球蛋白Fc包括鉸鏈區(qū)，CH2區(qū)和CH3區(qū)，TACI序列與Fc序列之間是直接融合或經(jīng) 連接序列融合。本發(fā)明所述的優(yōu)化的TACI-Fc融合蛋白的TACI序列優(yōu)選TACI的第13至108氨 基酸序列或第13至118氨基酸序列。本發(fā)明所述的免疫球蛋白Fc序列選自人或動(dòng)物的免疫球蛋白Fe，是Fc全長(zhǎng)或是部分序列，F(xiàn)c選自IgG,，IgM, IgD, IgA，每種免疫球蛋白類型包括各亞型，如IgGl, IgG2， IgG3，IgG4，優(yōu)選 IgGl。本發(fā)明所述的優(yōu)化的TACI-Fc融合蛋白的TACI序列與免疫球蛋白Fc序列之間可 以直接融合或經(jīng)連接序列融合，如果經(jīng)連接序列融合優(yōu)選9Gly。本發(fā)明所述的優(yōu)化的TACI-Fc融合蛋白優(yōu)選由TACI的第13至118氨基酸序列和 免疫球蛋白IgGl Fc融合而成，即序列表中序列1，以下簡(jiǎn)稱RCT-18。本發(fā)明所述的優(yōu)化的TACI-Fc融合蛋白可與藥學(xué)上可接受的載體以本領(lǐng)域常規(guī) 方法制備治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡的藥物，所述載體包括賦形劑、稀釋劑、填充劑、粘合劑、濕潤(rùn) 劑、崩解齊 、吸收促進(jìn)齊 、表面活性齊 、吸附載體、穩(wěn)定劑等。本發(fā)明所述藥物可制成臨床上可接受的各種劑型，包括但不限于口服制劑或注射 制劑，優(yōu)選注射劑。申請(qǐng)人:通過體外給藥對(duì)血藍(lán)蛋白(Keyhole limpet hemocyanin，KLH)模型(以T 細(xì)胞活化為主要病理表現(xiàn)的動(dòng)物模型)小鼠T、B淋巴細(xì)胞，BLyS或抗CD3抗體刺激的T、B 淋巴細(xì)胞活性和功能的影響，探討優(yōu)化的TACI-Fc融合蛋白對(duì)免疫細(xì)胞的作用特點(diǎn)及其藥 效作用機(jī)制。優(yōu)化的TACI-Fc融合蛋白體外用藥抑制KLH誘導(dǎo)小鼠的T、B淋巴細(xì)胞活性和 功能，抑制BLyS或抗CD3抗體刺激的T、B淋巴細(xì)胞活性和功能，調(diào)節(jié)細(xì)胞因子和抗體產(chǎn)生， 同樣對(duì)異常活化的T、B淋巴細(xì)胞增殖、抗體及細(xì)胞因子產(chǎn)生以及T、B淋巴細(xì)胞亞群具有調(diào) 節(jié)作用。藥效學(xué)試驗(yàn)研究表明優(yōu)化的TACI-Fc融合蛋白的藥理作用與其以BLyS和APRIL 為作用靶標(biāo)的T、B淋巴細(xì)胞功能密切相關(guān)。整體給藥對(duì)RA和SLE動(dòng)物模型有明確療效；體 外用藥能直接抑制KLH小鼠T細(xì)胞異常增殖活化功能、調(diào)節(jié)細(xì)胞因子和抗體產(chǎn)生，調(diào)節(jié)T細(xì) 胞亞群；體外用藥能直接抑制BLyS或CD3單抗刺激的T、B淋巴細(xì)胞增殖活性，調(diào)節(jié)細(xì)胞因 子和抗體產(chǎn)生，調(diào)節(jié)T、B淋巴細(xì)胞亞群。整體和離體藥效試驗(yàn)顯示了優(yōu)化的TACI-Fc融合 蛋白的作用特點(diǎn)，其作用機(jī)制是其TACI胞外可溶性部分能中和淋巴細(xì)胞發(fā)育成熟的兩個(gè) 關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子BLyS和APRIL，高效阻斷了 BLyS和APRIL與其受體(TACI、BCMA和BAFF-R) 之間的相互作用，從而有效阻斷B淋巴細(xì)胞的增生和T淋巴細(xì)胞的成熟，具有抑制自身免疫 疾病的作用。動(dòng)物藥效試驗(yàn)表明優(yōu)化的TACI-Fc融合蛋白對(duì)SLE小鼠(紅斑狼瘡轉(zhuǎn)基因小鼠 MRL/lpr和ConA活化染色質(zhì)誘導(dǎo)的狼瘡樣小鼠)均有治療作用，皮下注射給藥對(duì)SLE模型 小鼠的顯著有效治療劑量是7. 5mg/kg,比對(duì)RA模型小鼠的顯著有效治療劑量大；優(yōu)化的 TACI-Fc融合蛋白體外給藥直接抑制BLyS對(duì)T和B淋巴細(xì)胞的活性和功能；研究還證實(shí) SLE與其調(diào)節(jié)T、B淋巴細(xì)胞增殖和活化、細(xì)胞因子水平和抑制抗體產(chǎn)生密切相關(guān)，也與其降 低外周循環(huán)血液和脾臟中升高的BLyS和APRIL水平密切相關(guān)，優(yōu)化的TACI-Fc融合蛋白作 用于B淋巴細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育階段的從未成熟B細(xì)胞至長(zhǎng)壽命漿細(xì)胞的各階段，但對(duì)記憶B細(xì) 胞沒有作用。動(dòng)物藥代試驗(yàn)表明單次皮下注射給藥在大鼠和恒河猴的藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)Tmax分 別為7-1 和6-12h，T172分別為40-50h和79_U9h ；且體內(nèi)的絕對(duì)生物利用度隨著給藥 劑量的增加呈下降趨勢(shì)；在大鼠和猴中的藥動(dòng)學(xué)行為沒有性別差異。優(yōu)化的TACI-Fc融合 蛋白在大鼠皮下給藥后，迅速分布到各組織，腎臟為最主要的分布器官，其次為心、肝、肺和性腺，再次為脾、胃、腸、肌肉、脂肪和胸腺，在腦組織中的分布最低；隨著給藥時(shí)間的延長(zhǎng)， 這些組織中的濃度逐漸下降，未觀察到蓄積現(xiàn)象。在糞便、尿液和膽汁中的排泄率分別為 17. 89% 士 3. %，77. 98% 士 4. 95%和12. 17% 士 3. 49 %，表明皮下注射給藥后優(yōu)化的 TACI-Fc融合蛋白主要通過尿液排泄，在糞便和尿液中的平均總排泄率為95. 87%。多次給 藥的藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)還顯示皮下注射給藥在大鼠體內(nèi)不存在明顯的蓄積性，但在猴體內(nèi)有一定 的蓄積現(xiàn)象。動(dòng)物的安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)表明優(yōu)化的TACI-Fc融合蛋白在所有試驗(yàn)動(dòng)物上均表現(xiàn)出 良好的耐受性和安全性。申請(qǐng)人:將RCT-18與文獻(xiàn)Atacic^pt非臨床SLE藥效進(jìn)行了對(duì)比，結(jié)果表明， RCT-18的總給藥劑量大于Atacic印t，但藥效作用優(yōu)于Atacic印t。Atacic印t對(duì)自發(fā)性SLE 小鼠的藥效試驗(yàn)文獻(xiàn)顯示在每只雌性NZBWFl小鼠ip給予20 μ g或100 μ g Atacicept (小 鼠體重以每只20g計(jì)算，分別相當(dāng)lmg/kg和5mg/kg)，每周給藥3次連續(xù)治療5周，顯著 降低蛋白尿長(zhǎng)達(dá)10周；高劑量組動(dòng)物生存率顯著增加，且該作用與外周血B細(xì)胞減少相 關(guān)(與對(duì)照組相比減少53% )，該藥效可持續(xù)到末次給藥后5周。但SLE特異性指標(biāo)雙鏈 DNA抗體滴度水平各組間無差異，該結(jié)果提示需要更長(zhǎng)的治療時(shí)間(Gross JA, Johnston J, Mudri S, et al. TACI and BCMA are receptors for a TNF homologue implicated in B-cell autoimmune disease. Nature, 2000, 27 (404) :995-999)。國(guó)外類似藥物研究結(jié)果 顯示，TACI-Ig腹腔注射給藥可明顯減少SLE模型小鼠蛋白尿的產(chǎn)生，小鼠脾臟和淋巴結(jié)縮 小，B淋巴細(xì)胞顯著減少，生發(fā)中心形成障礙，在NZB/NZWF1小鼠出現(xiàn)腎炎之前給藥可延緩 腎病出現(xiàn)并可推遲其死亡 4 5 個(gè)月(Ramanujam M,ffang XB, Huang WQ, et al. Mechanism of action of transmembrane activator and calcium modulator ligand interactor-Ig in murine systemic lupus erythematosus. Immunology, 2004 ;173 :3524-3534.)。RCT_18 和Ataci^pt兩者均在自發(fā)性SLE小鼠上進(jìn)行了藥效研究，均在SLE小鼠出現(xiàn)癥狀后給藥， RCT-18對(duì)MRL/lpr小鼠和Atacic^pt對(duì)NZBWFl小鼠的顯效劑量分別為sc 7. 5mg/kg和ip 5mg/kg ；給藥方法分別為2d/次連續(xù)8周(共給藥28次)和3次/周連續(xù)5周(共給藥15 次)，兩者總的給藥劑量雖然RCT-18大于Ataciapt (210mg/kg與75mg/kg)，但兩者的藥效 結(jié)果有差異。兩者均能抑制SLE疾病的進(jìn)程，可明顯減少白發(fā)性SLE模型小鼠蛋白尿的產(chǎn) 生，小鼠脾臟和淋巴結(jié)縮小，B淋巴細(xì)胞顯著減少，生發(fā)中心形成障礙等；但對(duì)SLE特異性指 標(biāo)雙鏈DNA抗體(Anti-dsDNA)滴度水平的作用不同，RCT-18顯著降低自發(fā)性SLE小鼠血清 中升高的 Crea、BUN、IgGUBLyS, ANA、Anti-dsDNA 和 IL-10 水平，對(duì) ANA 和 BLyS 水平的降 低具有劑量依賴性，對(duì)SLE小鼠異常的血清抗體水平有治療作用；而atacic印t對(duì)雙鏈DNA 抗體滴度水平?jīng)]有顯著作用，研究者推測(cè)可能是由于其用藥時(shí)間不足的緣故。本發(fā)明所述的優(yōu)化的TACI-Fc融合蛋白最大限度的保留TACI氨基末端區(qū)的大部 分氨基酸殘基，相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)大幅提高了融合蛋白與BlyS的親和力，藥物與靶標(biāo)的親和 力增加即意味著藥物所需有效濃度的下降，即可以用更少的藥而達(dá)到同樣的臨床治療目 的，這對(duì)于價(jià)格昂貴的重組蛋白質(zhì)藥物來說尤為重要。本發(fā)明的推廣應(yīng)用有利于降低藥物 成本，更適用于工業(yè)化生產(chǎn)。
具體實(shí)施例方式以RCT-18為例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的闡 述和解釋，而不應(yīng)被看作是對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例1 :RCT_18對(duì)紅斑狼瘡轉(zhuǎn)基因小鼠(MRL/lpr)和ConA活化淋巴細(xì)胞的染色 質(zhì)誘導(dǎo)SLE樣小鼠模型的治療作用1. 1試驗(yàn)方法1. 1. 1對(duì)紅斑狼瘡轉(zhuǎn)基因小鼠(MRL/lpr)的藥效學(xué)試驗(yàn)方法MRL/lpr轉(zhuǎn)基因小鼠60只，隨機(jī)分為6組，每組10只，即模型組(MRL/lpr組)、 RCT-18 組(3. 75,7. 5、15mg/Kg，sc)、陽性對(duì)照組(Pre 組，5mg/kg，ig)和 IgG-Fc 組(7. 5mg/ Kg，sc)。每周檢測(cè)MRL/lpr小鼠的尿蛋白含量，當(dāng)動(dòng)物尿蛋白含量大于30mg/dl時(shí)，RCT-18 給藥組和IgG-Fc組動(dòng)物皮下注射給藥(0. 2ml/10g體重)，隔日一次，連續(xù)給藥8周，模型 組皮下注射給予等量生理鹽水，陽性對(duì)照組每天灌胃給藥(0.2ml/10g體重)。觀察并記錄 動(dòng)物給藥8周的行為活動(dòng)、毛發(fā)狀態(tài)、排泄物等體征異常變化，用目測(cè)尿蛋白試紙檢測(cè)動(dòng)物 的尿蛋白變化，HE染色法檢查動(dòng)物的腎臟、脾臟和淋巴結(jié)病理改變，計(jì)算動(dòng)物的脾臟和胸 腺指數(shù)，3H-TdR摻入法檢測(cè)LPS和ConA誘導(dǎo)的B和T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)，生化法檢測(cè)血清 中肌酐(Crea)和尿素氮(BUN)水平，ELISA法檢測(cè)小鼠血清中免疫球蛋白(IgGl、IgG^i)、 抗核抗體(ANA)、抗雙鏈DNA抗體(Anti-dsDNA)、B淋巴細(xì)胞刺激因子(BLyS)、白細(xì)胞介素 IO(IL-IO)和干擾素(IFN-γ)水平，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)腸系膜淋巴結(jié)T淋巴細(xì)胞或脾臟T、B 淋巴細(xì)胞亞群及活性。1. 1. 2對(duì)ConA活化淋巴細(xì)胞的染色質(zhì)誘導(dǎo)SLE樣小鼠模型的的藥效學(xué)試驗(yàn)方法①ConA活化淋巴細(xì)胞的染色質(zhì)誘導(dǎo)SLE樣小鼠模型的建立(1)活化脾淋巴細(xì)胞的制備處死小鼠，無菌取脾臟，于RPMI1640 10%小牛血清(FCS)中制備細(xì)胞懸液，臺(tái)盼 藍(lán)計(jì)數(shù)(存活率> 95% )，加入培養(yǎng)瓶中，使終濃度為ConA 3mg · Λ細(xì)胞2 X IO9個(gè)· Λ 每瓶20ml，直立培養(yǎng)05cm2瓶)，于37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 后取出，倒置顯微鏡下 (X25)可見ConA活化瓶一個(gè)視野有5個(gè)以上大成團(tuán)細(xì)胞(未加入Con A瓶基本無成團(tuán)細(xì) 胞)，離心收集活化脾細(xì)胞。(2)染色質(zhì)的制備將分離的活化脾細(xì)胞按1 :5體積加入緩沖液A (0. 25M蔗糖、3mMMgcl2、IOmM Tris-HCl，0. 6% TritonX-100、0. ImM PMSF)勻菜破核，離心(800g/15min，4°C )，棄上清，沉 淀用緩沖液A(1 8)勻漿，涂片觀察核的逸出，離心(800Xg，15min，4°C)，所得粗核懸浮 于20倍體積的緩沖液^2. 2M蔗糖、3mM MgCl2UOmM Tris-HCl、0. ImM PMSF)中輕輕勻化 后，鋪于1/4體積的緩沖液B上，超速離心(51900Xg，90min，4°C )，收集沉淀，用20倍體積 緩沖液 C(10mM Tris-HClUmM EDTA、pH7. 9)懸浮，勻漿破核，離心(800Xg, 15min,4°C ), 再將沉淀懸浮于1 50的SSC溶液(0. 15M NaCl，1. 5mM檸檬酸鈉)中，離心(800 Xg, 20min，4°C )，收集底部染色質(zhì)。(3)模型誘導(dǎo)將活性染色質(zhì)100 μ g(0. 2ml)分別于d0、dl4、d28尾根部皮內(nèi)注射雌性6 7周 齡BALB/c小鼠。首次免疫將染色質(zhì)干粉和生理鹽水及BCG制備混懸液，將該懸液逐滴加入攪拌中的等體積弗氏不完全佐劑(ICFA)，4°C攪拌1 制成油包水乳劑，BCG終濃度為 IOg-T10 dl4以染色質(zhì)和ICFA免疫但不含BCG，d28以染色質(zhì)混懸液再次免疫?？瞻捉M未 做任何處理。在制備和致敏的過程中注意將免疫制劑4°C保存。②試驗(yàn)方法BALB/c小鼠，雌性，18 20g，將經(jīng)誘導(dǎo)為SLE模型的BALB/c小鼠隨機(jī)分為7組， 即模型組(生理鹽水，sc)、RCT-18三個(gè)劑量組(3. 75，7. 5、15mg/Kg，sc)、陽性對(duì)照組(醋 酸潑尼松，5mg/Kg，ig)和Ig-Fc (7. 5mg/Kg, sc)，另設(shè)正常對(duì)照組(生理鹽水，sc)，每組10 只。當(dāng)小鼠初次免疫后業(yè)8開始給藥，0.2ml/10g體重，隔日1次，連續(xù)給藥8周。觀察并記 錄動(dòng)物給藥8周的行為活動(dòng)、毛發(fā)狀態(tài)、排泄物等體征異常變化，用目測(cè)尿蛋白試紙檢測(cè)動(dòng) 物的尿蛋白變化，HE染色法檢查動(dòng)物的腎臟、脾臟和淋巴結(jié)病理改變，計(jì)算動(dòng)物的脾臟和胸 腺指數(shù)，3H-TdR摻入法檢測(cè)LPS和ConA誘導(dǎo)的B和T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)，生化法檢測(cè)血清 中肌酐(Crea)和尿素氮(BUN)水平，ELISA法檢測(cè)小鼠血清中免疫球蛋白(IgGl、IgG^i)、 抗核抗體(ANA)、抗雙鏈DNA抗體(Anti-dsDNA)、B淋巴細(xì)胞刺激因子(BLyS)、白細(xì)胞介素 IO(IL-IO)和干擾素(IFN-γ)水平，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)腸系膜淋巴結(jié)T淋巴細(xì)胞或脾臟T、B 淋巴細(xì)胞亞群及活性。1. 2試驗(yàn)結(jié)果①對(duì)紅斑狼瘡轉(zhuǎn)基因小鼠(MRL/lpr)有治療作用RCT-18皮下注射給藥后能顯著降低兩種SLE小鼠升高的蛋白尿水平，有效改善 MRL/Lpr小鼠的毛發(fā)脫落，降低MRL/Lpr小鼠的損傷指數(shù)能顯著改善兩種SLE小鼠的腎小 球腎炎、脾臟和淋巴結(jié)增生等病理變化。(1)RCT-18(7. 5，15mg/kg)皮下注射給藥可顯著降低MRL/lpr小鼠尿蛋白水平，有 效改善毛發(fā)脫落，降低小鼠的損傷指數(shù)。(2)RCT-18(3. 75，7. 5，15mg/kg)皮下注射給藥均可不同程度地減輕MRL/lpr小鼠 腎臟、脾臟及淋巴結(jié)的病理變化。(3)RCT-18(7. 5，15mg/kg)皮下注射給藥可顯著降低MRL/lpr小鼠升高的脾指數(shù)， 顯著抑制脾臟B淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)。(4) RCT-18(7. 5，15mg/kg)皮下注射給藥可顯著降低MRL/lpr小鼠血清中Crea和 BUN水平，顯著改善小鼠的腎功能；RCT-18(3. 75，7. 5，15mg/kg)給藥可劑量依賴性地降低 小鼠血清中高水平的ANA和BLyS水平，可顯著降低小鼠血清中高水平的anti-dsDNA水平 和IgGl的表達(dá)；RCT-18(3. 75，7. 5，15mg/kg)給藥也可顯著降低小鼠血清中較高的IL-10 和IFN-Y水平。(5)RCT-18(3. 75, 7. 5,15mg/kg)皮下注射給藥可顯著降低脾臟成熟B淋巴細(xì)胞 (CD19+IgD+)和早期B淋巴細(xì)胞(CD19+IgM+)的比例，RCT-18 (7. 5，15mg/kg)可顯著降低總B 淋巴細(xì)胞(CD19+)的比例，而對(duì)表達(dá)補(bǔ)體受體B淋巴細(xì)胞(⑶19+21+)和表達(dá)Fc受體B淋巴 細(xì)胞(CD19+CD23.)和記憶B淋巴細(xì)胞(CD19+CD27+)的比例無明顯影響。RCT-18 (15mg/kg) 皮下注射給藥可顯著升高M(jìn)RL/lpr模型小鼠腸系膜淋巴結(jié)T淋巴細(xì)胞的活化Th淋巴細(xì)胞 (CD4+CD25+)百分比，降低表達(dá)活化誘導(dǎo)分子Th淋巴細(xì)胞(⑶4+⑶69+)的表達(dá)，對(duì)總T淋巴 細(xì)胞(CD3+)、Th淋巴細(xì)胞(⑶3+CD4+)、表達(dá)CD40L的Th細(xì)胞(CD4+CD154+)及未致敏Th淋 巴細(xì)胞(⑶4+⑶62L+)等T淋巴細(xì)胞亞群細(xì)胞比例無明顯影響。
權(quán)利要求
1.優(yōu)化的TACI-Fc融合蛋白用于制備治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡的藥物的應(yīng)用，所述融合蛋 白的TACI部分包括來自TACI胞外區(qū)從氨基酸殘基13開始的氨基末端區(qū)序列，富半胱氨酸 區(qū)的全部序列，和柄區(qū)的部分序列，融合蛋白的免疫球蛋白Fc包括鉸鏈區(qū)，CH2區(qū)和CH3區(qū)， TACI序列與Fc序列之間是直接融合或經(jīng)連接序列融合。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，所述融合蛋白的TACI序列選自TACI的第13至108氨 基酸序列或第13至118氨基酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，所述的免疫球蛋白Fc序列選自人或動(dòng)物的免疫球蛋白 Fe，選自IgG，，IgM, IgD, IgA，每種免疫球蛋白類型包括各亞型。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，所述的免疫球蛋白Fc序列選自IgGl。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，所述的融合蛋白的TACI序列與免疫球蛋白Fc序列之 間經(jīng)連接序列9Gly融合。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，所述的優(yōu)化的TACI-Fc融合蛋白優(yōu)選序列表中的序列1。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，所述融合蛋白制備的治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡的藥物包含 作為活性物質(zhì)的權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的優(yōu)化的TACI-Fc融合蛋白和藥學(xué)上可接受的 載體。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，所述融合蛋白制備的治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡的藥物為口 服制劑或注射制劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及應(yīng)用B淋巴細(xì)胞刺激因子受體-抗體融合蛋白治療自身免疫性疾病領(lǐng)域，更具體地說，涉及優(yōu)化的TACI-Fc融合蛋白用于制備治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡藥物的應(yīng)用。本發(fā)明所述的藥物對(duì)于治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡安全有效，并且利于降低本類重組蛋白質(zhì)藥物的成本，適用于工業(yè)化推廣應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61K39/395GK102085368SQ20111002134
公開日2011年6月8日 申請(qǐng)日期2011年1月19日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月19日
發(fā)明者房健民 申請(qǐng)人:煙臺(tái)榮昌生物工程有限公司