專利名稱：用于創(chuàng)傷治療的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明通常地涉及組織創(chuàng)傷治療。
背景技術(shù)：
成纖維細(xì)胞是普遍存在的細(xì)胞，并且構(gòu)成幾乎所有組織的基質(zhì)。由于它們從頭發(fā)到腳趾的廣泛分布，不同組織中的成纖維細(xì)胞表達(dá)異質(zhì)基因型(I)。除了膠原生成細(xì)胞，據(jù)報(bào)道成纖維細(xì)胞與免疫細(xì)胞、炎性細(xì)胞相互作用。癌癥相關(guān)的成纖維細(xì)胞在癌癥基質(zhì)中具有推定的作用(2-4)。癌癥相關(guān)的成纖維細(xì)胞可以固定侵襲性腫瘤細(xì)胞并積累(elaborate)血管發(fā)生，這兩種情況都是轉(zhuǎn)移的先決條件(3，4)。器官纖維化的典型特征在于上皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞，所述成纖維細(xì)胞進(jìn)ー步獲得肌成纖維細(xì)胞表型(5-7)。肉芽組織(granular tissue)的成纖維細(xì)胞收縮是正常創(chuàng)傷愈合的過程(6,8)。在病理創(chuàng)傷愈合中，通過獲得α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(aSMA)表型和過度收縮性激活成纖維細(xì)胞是造成纖維化或異常瘢痕(9-11)的因素，包括目前沒有令人滿意的治療的瘢痕瘤和肥大性瘢痕(10，12)。除了基質(zhì)細(xì)胞，成纖維細(xì)胞還在幾種特化的結(jié)締組織如韌帶、腱和牙周韌帶中作為實(shí)質(zhì)(parenthymal)細(xì)胞。與其中成纖維細(xì)胞是基質(zhì)細(xì)胞的器官纖維化中過量的膠原生物合成相反，實(shí)質(zhì)成纖維細(xì)胞組織如腱和韌帶非常難以再生(13-15)。實(shí)質(zhì)成纖維細(xì)胞組織固有的較差愈合能力是由于稀缺作為膠原生成細(xì)胞的成纖維細(xì)胞(13-15)。最近將皮膚成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞(iPS) (16，17)。但是重編程的收率一般很低，這導(dǎo)致推測(cè)成纖維細(xì)胞群體中的出生后干細(xì)胞/祖細(xì)胞而不是最終階段成纖維細(xì)胞容易地重編程。盡管它們?cè)诩?xì)胞生物學(xué)中的廣泛應(yīng)用以及在疾病如癌癥和纖維化中的廣泛影響，但是就它們的起源和分化途徑而言，成纖維細(xì)胞是沒有很好研究的細(xì)胞。已提出成纖維細(xì)胞可能在稱為內(nèi)皮-或上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換(EMT)的過程中衍生自上皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞(18-22)。轉(zhuǎn)基因模型中的細(xì)胞追蹤顯示內(nèi)皮細(xì)胞或上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞(23)。但是EMT并未造成存在于器官纖維化中的所有成纖維細(xì)胞(24)。而且，EMT未解釋實(shí)質(zhì)成纖維細(xì)胞的起源，因?yàn)殡旎蝽g帶中缺乏上皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞。最近，在腱中發(fā)現(xiàn)多能間充質(zhì)細(xì)胞(25)，這支持成纖維細(xì)胞的間充質(zhì)起源的假設(shè)(26-28)。推定的成纖維細(xì)胞的間充質(zhì)起源可以是骨髄源性或結(jié)締組織源性。在骨髄中，認(rèn)為CD34+和CD45+纖維細(xì)胞是具有造血干細(xì)胞、單核細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的特征的干細(xì)胞/祖細(xì)胞亞群，并且可以在受傷時(shí)遷移至外周出，29)。然而，⑶34+和⑶45+纖維細(xì)胞僅占總骨髓細(xì)胞的〈1%(6)，并且可能不參與整個(gè)身體的結(jié)締組織的穩(wěn)態(tài)。因此，在諸如外傷、癌癥和感染的損傷時(shí)負(fù)責(zé)結(jié)締組織的穩(wěn)態(tài)和修復(fù)的成纖維細(xì)胞的起源和分化途徑仍令人費(fèi)解。到目前為止，尚沒有可靠和方便的方法使干細(xì)胞或祖細(xì)胞分化為成纖維細(xì)胞。而且，到目前為止也未報(bào)道成纖維細(xì)胞在器官纖維化中可以衍生自上皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞。發(fā)明概沭本發(fā)明的各方面提供用于創(chuàng)傷治療的組合物和方法。本發(fā)明的一方面提供ー種藥物組合物，其包含CCN2/CTGF以及藥學(xué)可接受的載體或賦形劑。在一些實(shí)施方案中，所述藥物組合物包含CCN2/CTGF。在一些實(shí)施方案中，所述藥物組合物包含CCN2/CTGF和TGFii的抑制劑。在一些實(shí)施方案中，所述藥物組合物包含CCN2/CTGF和P38抑制劑。在一些實(shí)施方案中，所述藥物組合物包含CCN2/CTGF和酪氨酸激酶抑制劑。在一些實(shí)施方案中，所述藥物組合物包含CCN2/CTGF，并且包含TGFβ的抑制劑、Ρ38抑制劑或酪氨酸激酶抑制劑中的兩種或更多種。在一些實(shí)施方案中，所述藥物組合物包含間充質(zhì)祖細(xì)胞。在各種實(shí)施方案中，所述間充質(zhì)祖細(xì)胞為α SM-間充質(zhì)祖細(xì)胞。在各種實(shí)施方案中，所述間充質(zhì)祖細(xì)胞為CD34-間充質(zhì)祖細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述CCN2/CTGF包含CCN2/CTGF多肽或者編碼CCN2/CTGF多肽的多核苷酸。在一些實(shí)施方案中，所述組合物包含可操作地連接至載體的編碼CCN2/CTGF多肽的多核苷酸。在ー些配置中，所述載體合適在創(chuàng)傷組織環(huán)境中表達(dá)所述CCN2/CTGF多肽。在一些實(shí)施方案中，所述CCN2/CTGF包含人CCN2/CTGF或重組人CCN2/CTGF。在一些實(shí)施方案中，所述CCN2/CTGF包含對(duì)應(yīng)于登錄號(hào)ΝΡ_001892的CCN2/CTGF。在一些實(shí)施方案中，所述CCN2/CTGF包含多肽，所述多肽具有SEQ ID NO: I的序列，或者與SEQ ID NO: I具有至少約80%相同性并且具有CCN2/CTGF活性。在一些實(shí)施方案中，所述CCN2/CTGF包含多肽，所述多肽與 SEQ ID NO: I 具有至少約 80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 相同性并且具有 CCN2/CTGF 活性。在一些實(shí)施方案中，所述組合物包含TGFP的抑制劑。在一些實(shí)施方案中，所述TGF^的抑制劑減少?gòu)某衫w維細(xì)胞形成肌成纖維細(xì)胞或者抑制纖維化。在一些實(shí)施方案中，所述TGFii的抑制劑大幅減少?gòu)某衫w維細(xì)胞形成肌成纖維細(xì)胞或者抑制纖維化。在一些實(shí)施方案中，所述組合物包含TGFP I的抑制劑。在一些實(shí)施方案中，所述組合物包含TGFii 2的抑制劑。在一些實(shí)施方案中，所述組合物包含TGFii 3的抑制劑。在一些實(shí)施方案中，所述組合物包含選自以下的TGFii的抑制劑ANG-1122 ；AP-11014 ;美替木單抗；夫蘇木單抗(fresolimumab);甘露糖-6-憐酸，BTG ;Pharmapro jects No. 6614 ；NAFBOOI ；NAFB002 JGF-β I 抗體，Lilly ;LY_2157299 ;胎球蛋白 JGF-β 拮抗劑，F(xiàn)ibroGen ；1D11 ；抗 TGF β MAb-1, Genzyme ；SB-431542 ;激活素樣激酶 5 抑制劑，Graceway ;抗 TGF-β 抗體，Genent ;反義寡核苷酸，Il ；TGF-^ 拮抗劑，Inflazyme ；TGF-^ 受體，Insmed ；TGF-^ 拮抗劑，Inspiraplex ;飾膠蛋白，Telios ;SX-007 JGF-β 受體抑制劑(inhibs)，J&J ;TGF_β 疫苗，Neovacs ；ADMP-1 ；TGF- β 抗體,Manchester ；TGF- β 拮抗劑，Sydney ;甘露糖-6-憐酸，Renovo ;癌癥基因治療，Resver JGF-β Shield ;IN_1130 ;LF_984 JGF-β 抑制劑，Mill ;以及 SB-431542。在一些實(shí)施方案中，所述組合物包含P38抑制劑。在一些實(shí)施方案中，所述組合物包含選自以下的 P38 抑制劑Tocriset、SD282、SB239063、SB203580、SB220025、SKF86002、PD169316、SB202190、SC68376、VX702、VX745、R130823、AMG548、BIRB796、SCI0469、SCI0323、FR167653、MW012069ASRM、SD169、RWJ67657 以及 ARRY797。在一些實(shí)施方案中，所述組合物包含酪氨酸激酶抑制劑。在一些實(shí)施方案中，所述組合物包含選自以下的酪氨酸激酶抑制劑K252a、阿昔替尼、波舒替尼、西地尼布 (Cediranib)、達(dá)沙替尼、厄洛替尼、吉非替尼、伊馬替尼、拉帕替尼、來妥替尼、尼洛替尼、司馬沙尼、舒尼替尼、托西尼布(Toceranib)、凡德他尼、伐他拉尼、ZD 1839、CI-1033、0SI-774.GW 2016、EKB-569、MC-C225、MDX-447、PKI 116、ABX_EGF、AG-82、AG_18、AG-490、AG-17、AG-213、AG-494, AG-825, AG-879, AG-1112, AG-1296, AG-1478, AG-126, RG-13022、RG-14620 以及 AG-555。在一些實(shí)施方案中，所述組合物包含抗生素或免疫抑制劑。在一些實(shí)施方案中，所述組合物包含選自以下的抗生素阿莫西林、β -內(nèi)酰胺酶、氨基糖苷、β -內(nèi)酰胺(糖肽)、克林霉素、氯霉素、頭孢菌素、環(huán)丙沙星、紅霉素、氟喹諾酮、大環(huán)內(nèi)酷、甲硝唑、青霉素、喹諾酮、雷帕霉素、利福平、鏈霉素、磺胺、四環(huán)素、甲氧芐啶、甲氧芐啶-磺胺甲噁唑以及萬古霉素。在一些實(shí)施方案中，所述組合物包含選自以下的免疫抑制劑類固醇、環(huán)胞素、環(huán)胞素類似物、環(huán)磷酰胺、甲基潑尼松(methylprednisone)、潑尼松、硫唑嘌呤、FK_506、15_脫氧精胍菌素、潑尼松龍、甲氨蝶呤、沙利度胺、甲氧沙林、雷帕霉素、來氟米特、咪唑立賓、布喹那、脫氧精胍菌素、氮雜螺烷、莫羅單抗-⑶3、山地明、Neoral、Sangdya、普樂可復(fù)、驍悉、硫唑嘌呤、糖皮質(zhì)類固醇、腎上腺皮質(zhì)類固醇、Deltasone、Hydeltrasol> Folex、甲氨蝶呤、甲氧沙林以及西羅莫司。在一些實(shí)施方案中，所述組合物配制為用于腸胃外、肺部、ロ服、局部、皮內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹腔內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)、硬膜外、眼部、ロ腔或直腸給藥。在一些實(shí)施方案中，所述組合物配制為用于局部給藥。在一些實(shí)施方案中，所述組合物配制為用于直接局部給予軟組織創(chuàng)傷部位。本發(fā)明的一方面提供一種用于創(chuàng)傷治療的試劑盒。在一些實(shí)施方案中，所述試劑盒包含上文所述的ー種或多種組合物。在一些實(shí)施方案中，所述試劑盒包含上文所述的ー種或多種藥物組合物。本發(fā)明的一方面提供上文所述的組合物用于治療組織創(chuàng)傷的用途。在一些實(shí)施方案中，上文所述的藥物組合物用于治療組織創(chuàng)傷。本發(fā)明的一方面提供上文所述的組合物在制備用于治療組織創(chuàng)傷的藥物中的用途。在一些實(shí)施方案中，上文所述的藥物組合物用于制備用于治療組織創(chuàng)傷的藥物。在一些實(shí)施方案中，所述組織創(chuàng)傷包括軟組織創(chuàng)傷。在一些實(shí)施方案中，所述組織創(chuàng)傷包括慢性組織創(chuàng)傷或急性組織創(chuàng)傷中的ー種或多種。在一些實(shí)施方案中，所述組織創(chuàng)傷包括皮膚創(chuàng)傷、韌帶創(chuàng)傷、腱創(chuàng)傷，或者上述創(chuàng)傷的組合中的ー種或多種。在一些實(shí)施方案中，所述組織創(chuàng)傷包括開放性組織創(chuàng)傷。在一些實(shí)施方案中，所述組織創(chuàng)傷包括切割創(chuàng)傷、撕裂創(chuàng)傷、擦傷創(chuàng)傷、穿刺創(chuàng)傷、穿透創(chuàng)傷或槍彈創(chuàng)傷中的ー種或多種。在一些實(shí)施方案中，所述組織創(chuàng)傷包括分裂裂傷(split laceration)、過度拉伸、磨壓、割裂或撕裂中的一種或多種。本發(fā)明的一方面提供一種用于愈合組織部位的創(chuàng)傷的系統(tǒng)。在一些實(shí)施方案中，所述系統(tǒng)包含醫(yī)療器械和上文所述的組合物。在一些實(shí)施方案中，所述系統(tǒng)包含醫(yī)療器械和上文所述的藥物組合物。在一些實(shí)施方案中，所述組合物適合在與組織部位接觸時(shí)從所述醫(yī)療器械釋放。在ー些實(shí)施方案中，所述醫(yī)療器械包括帷簾、繃帶、敷料、膠帶、粘結(jié)層、夾板、止血粉、免縫膠帶、氰基丙烯酸酯膠、釘(staple)和縫線，或者上述器械的組合中的一種或多種。本發(fā)明的一方面提供一種治療個(gè)體的方法。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括將包含CCN2/CTGF的組合物給予有需要的個(gè)體的組織創(chuàng)傷部位。在一些實(shí)施方案中，所述方 法包括將包含a SMA-成纖維細(xì)胞(衍生自CCN2/CTGF處理的間充質(zhì)祖細(xì)胞)的組合物給 予有需要的個(gè)體的組織創(chuàng)傷部位。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括使包含CCN2/CTGF的組合物與間充質(zhì)祖細(xì)胞接觸以刺激成纖維細(xì)胞分化。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括給予包含間充質(zhì)祖細(xì)胞的組合物。在一些實(shí)施方案中，所述間充質(zhì)祖細(xì)胞為a SMA-間充質(zhì)祖細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述間充質(zhì)祖細(xì)胞為CD34-間充質(zhì)祖細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述間充質(zhì)祖細(xì)胞是自體的、同種異體的、同基因的或異種的，或者它們的組合。在一些實(shí)施方案中，將分化的成纖維細(xì)胞包含在組合物中或給予個(gè)體。在ー些實(shí)施方案中，分化的成纖維細(xì)胞為α SM-成纖維細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述分化的成纖維細(xì)胞為FSP1+、波形蛋白+、Colll+和a SMA-0在一些實(shí)施方案中，所述分化的成纖維細(xì)胞存在于包含至少約80%、85%、90%、95%或99%分化的成纖維細(xì)胞的富集細(xì)胞培養(yǎng)物中。在一些實(shí)施方案中，所述治療個(gè)體的方法包括給予(i)TGFi3的抑制劑、(ii)P38抑制劑、或者(iii)酪氨酸激酶抑制劑中的至少ー種或多種。在一些實(shí)施方案中，所述治療個(gè)體的方法包括給予TGFP的抑制劑。在一些實(shí)施方案中，所述治療個(gè)體的方法包括給予P38抑制劑。在一些實(shí)施方案中，所述治療個(gè)體的方法包括給予酪氨酸激酶抑制劑。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括給予組合物，所述組合物包含CCN2/CTGF，并且包含所述TGF0的抑制劑、所述P38抑制劑或所述酪氨酸激酶抑制劑中的至少ー種。在一些實(shí)施方案中，第一組合物包含CCN2/CTGF，并且第二組合物包含所述TGFii的抑制劑、所述P38抑制劑或所述酪氨酸激酶抑制劑中的至少ー種。在一些實(shí)施方案中，所述第一組合物和所述第二組合物連續(xù)給藥。在一些實(shí)施方案中，所述第一組合物和所述第二組合物同時(shí)給藥。在一些實(shí)施方案中，所述TGF β的抑制劑、所述Ρ38抑制劑或所述酪氨酸激酶抑制劑中的至少ー種抑制纖維化。在一些實(shí)施方案中，所述TGFii的抑制劑抑制纖維化。在一些實(shí)施方案中，所述Ρ38抑制劑抑制纖維化。在一些實(shí)施方案中，所述酪氨酸激酶抑制劑抑制纖維化。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括給予包含TGFβ的抑制劑的組合物。在ー些實(shí)施方案中，所述TGFii的抑制劑減少?gòu)某衫w維細(xì)胞形成肌成纖維細(xì)胞或者抑制纖維化。在一些實(shí)施方案中，所述TGFii的抑制劑以大幅減少?gòu)某衫w維細(xì)胞形成肌成纖維細(xì)胞有效的量存在。在一些實(shí)施方案中，所述抑制劑為TGFii I的抑制劑。在一些實(shí)施方案中，所述抑制劑為TGFii 2的抑制劑。在一些實(shí)施方案中，所述抑制劑為TGFii 3的抑制劑。在一些實(shí)施方案中，所述TGFii的抑制劑選自ANG-1122 ;AP_11014 ;美替木單抗；夫蘇木單抗；甘露糖-6_ 磷酸，BTG ；Pharmaprojects No. 6614 ； NAFBOOI ；NAFB002 JGF-β I 抗體，Lilly ；LY-2157299 ;胎球蛋白 JGF-β 拮抗劑，F(xiàn)ibroGen ；1D11 ;抗丁6卩旦嫩13-1，Genzyme ；SB-431542 ;激活素樣激酶5抑制劑，Graceway ;抗TGF-β抗體，Genent ;反義寡核苷酸，
Il!TGF-β 拮抗劑，Inflazyme ；TGF-β 受體，Insmed ；TGF-β 拮抗劑，Inspiraplex ;飾膠蛋白，Telios ；SX-007 ；TGF- β 受體抑制劑，J&J ；TGF- β 疫苗，Neovacs ；ADMP-1 JGF-β 抗體,Manchester ；TGF- β拮抗劑，Sydney ;甘露糖-6_磷酸,Renovo ;癌癥基因治療,Resver ；TGF-β Shield ;IN-1130 ;LF_984 ;TGF_ β 抑制劑，Mill ;以及 SB-431542。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括給予包含P38抑制劑的組合物。在一些實(shí)施方案中，所述 P38 抑制劑是 Tocriset、SD282、SB239063、SB203580、SB220025、SKF860 02、PD169316、SB202190、SC68376、VX702、VX745、R130823、AMG548、BIRB796、SCI0469、SCI0323、FR167653, MW012069ASRM, SD169, RWJ67657 以及 ARRY797 中的ー種或多種。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括給予包含酪氨酸激酶抑制劑的組合物。在ー些實(shí)施方案中，酪氨酸激酶抑制劑是K252a、阿昔替尼、波舒替尼、西地尼布、達(dá)沙替尼、厄洛替尼、吉非替尼、伊馬替尼、拉帕替尼、來妥替尼、尼洛替尼、司馬沙尼、舒尼替尼、托西尼布、凡德他尼、伐他拉尼、ZD 1839、CI-1033、OSI-774、Gff 2016、EKB-569、頂C-C225、MDX-447、PKI116、ABX-EGF、AG-82、AG-18、AG-490、AG-17、AG-213、AG-494、AG-825、AG-879、AG-1112、AG-1296、AG-1478、AG-126、RG-13022、RG-14620 以及 AG-555 中的ー種或多種。在一些實(shí)施方案中，所述方法治療包括軟組織創(chuàng)傷在內(nèi)的組織創(chuàng)傷部位。在ー些實(shí)施方案中，所述組織創(chuàng)傷部位包括慢性軟組織創(chuàng)傷或急性軟組織創(chuàng)傷。在一些實(shí)施方案中，所述組織創(chuàng)傷部位包括皮膚創(chuàng)傷、韌帶創(chuàng)傷、腱創(chuàng)傷，或者上述創(chuàng)傷的組合中的ー種或多種。在一些實(shí)施方案中，所述組織創(chuàng)傷部位包括開放性組織創(chuàng)傷。在一些實(shí)施方案中，所述組織創(chuàng)傷部位包括切割創(chuàng)傷、撕裂創(chuàng)傷、擦傷創(chuàng)傷、穿刺創(chuàng)傷、穿透創(chuàng)傷或槍彈創(chuàng)傷中的ー種或多種。在一些實(shí)施方案中，所述組織創(chuàng)傷部位包括分裂裂傷、過度拉伸、磨壓、割裂或撕裂中的ー種或多種。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括腸胃外、肺部、ロ服、局部、皮內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹腔內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)、硬膜外、眼部、口腔或直腸給藥。在一些實(shí)施方案中，給藥包括局部給藥。在一些實(shí)施方案中，給藥包括直接局部給予組織創(chuàng)傷部位。在一些實(shí)施方案中，給予所述組合物導(dǎo)致成纖維細(xì)胞分化的增加。在一些實(shí)施方案中，給予所述組合物導(dǎo)致纖維發(fā)生的増加。在一些實(shí)施方案中，給予所述組合物導(dǎo)致肌成纖維細(xì)胞分化的抑制。在一些實(shí)施方案中，給予所述組合物導(dǎo)致纖維化的抑制。在ー些實(shí)施方案中，給予所述組合物導(dǎo)致成纖維細(xì)胞分化的増加、纖維發(fā)生的増加、肌成纖維細(xì)胞分化的抑制或者纖維化的抑制中的至少ー種。在一些實(shí)施方案中，給予所述組合物導(dǎo)致成纖維細(xì)胞分化的増加、纖維發(fā)生的増加、肌成纖維細(xì)胞分化的抑制以及纖維化的抑制。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括給予上文所述的任何組合物。在一些實(shí)施方案中，給予所述組合物包括將上文所述的任何系統(tǒng)給予組織創(chuàng)傷部位。
在一些實(shí)施方案中，所述組合物通過載體遞送系統(tǒng)給藥。在一些實(shí)施方案中，所述組合物通過載體遞送系統(tǒng)給藥。在一些實(shí)施方案中，所述組合物通過包含聚合微球的載體遞送系統(tǒng)給藥，并且所述組合物包裹在所述聚合微球中。在一些實(shí)施方案中，所述組合物以約IOOmg-約500mg聚合物比約I-約100 μ g的CCN2/CTGF的比例包裹在聚合微球中。在一些實(shí)施方案中，所述組合物以約250mg聚合物比約10μ g的CCN2/CTGF的比例包裹在聚合微球中。在一些實(shí)施方案中，給予所述組合物包括將約I-約50mg包裹CTGF的微球弓I入組織創(chuàng)傷。本發(fā)明的一方面提供ー種形成a SMA-成纖維細(xì)胞的方法。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括使a SMA-、⑶34-間充質(zhì)祖細(xì)胞與CCN2/CTGF接觸，其中CCN2/CTGF刺激的間充質(zhì)干細(xì)胞分化為a SMA_、FSP1+、波形蛋白+、Colll+成纖維細(xì)胞。本發(fā)明的其他目的和特征會(huì)部分地顯而易見，并且部分地在下文中指出。



本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解下文所描述的圖僅為了說明目的。這些圖不是為了以任何方式限制本發(fā)明的教導(dǎo)的范圍。圖I是示出CCN2/CTGF介導(dǎo)的間充質(zhì)細(xì)胞的成纖維細(xì)胞分化的一系列圖像和條形圖。圖IA是分離和培養(yǎng)擴(kuò)增的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)的圖像。比例尺ΙΟΟμπι。圖IB是三色染色的分離和培養(yǎng)擴(kuò)增的用CCN2/CTGF(100ng/mL)處理的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的圖像，其提示大量的膠原合成(與示出沒有CCN2/CTGF處理的MSC的圖IA相比)。比例尺100μπι。圖IC是示出I型膠原的條形圖，而圖ID是示出CCN2/CTGF處理的MSC細(xì)胞的生腱蛋白-C含量的圖，在測(cè)試的2和4wk其顯著高于沒有CCN2/CTGF處理的MSC (η=5, *:ρ〈0· 05，**:ρ〈0· 01)。圖 IE 是示出膠原沉積隨 CCN2/CTGF 劑量從 O-lOOng/mL增加而增加的一系列圖像。圖IF是示出MSC表面標(biāo)記(包括⑶29、⑶44、⑶105、⑶106、CD117、BMPR和Seal)在2和4wk的CCN2/CTGF處理時(shí)逐漸減弱(ρ〈0· 05)。圖IG是條形圖，其示出平行地，在2和4wk的CCN2/CTGF處理時(shí)，成纖維細(xì)胞標(biāo)記逐漸增加，包括I和III型膠原、Tn-C、纖連蛋白、基質(zhì)金屬蛋白酶I (MMP-I)、成纖維細(xì)胞特異性蛋白I(FSPl)以及波形蛋白。在圖IG中，成軟骨標(biāo)記(II型膠原)和肌成纖維細(xì)胞標(biāo)記(a SMA)不可檢測(cè)，而成骨標(biāo)記(骨橋蛋白)極少表達(dá)。圖2是示出CCN2/CTGF處理的MSC的克隆分化以及減弱的CCN2/CTGF處理的MSC分化為其他間充質(zhì)譜系的能力的一系列圖像。CCN2/CTGF處理的MSC(MSC-Fb) (4wk)表現(xiàn)出進(jìn)ー步分化為用茜素紅染色的成骨細(xì)胞(圖2A)、用番紅-O染色的軟骨細(xì)胞(圖2B)或用油紅O染色的脂肪細(xì)胞(圖2C)的最小能力。相比之下，沒有CCN2/CTGF處理的相同MSC亞群容易地分化為成骨細(xì)胞(圖2D)、軟骨細(xì)胞(圖2E)和脂肪細(xì)胞(圖2F)。為了解決MSC的異質(zhì)性，建立單克隆(B7、B12和E3)，并且分化為成纖維細(xì)胞(圖2G、圖2H、圖21)、成骨細(xì)胞(圖2J、圖2K、圖2L)、成脂細(xì)胞(圖2M、圖2N、圖20)、成軟骨細(xì)胞(圖2、圖2Q、圖2R)。比例尺50μπι(圖2C、圖2F、圖2Μ-0) ; 100 μ m(所有其他)。圖3是示出通過TGF β I的MSC衍生的成纖維細(xì)胞的肌成纖維細(xì)胞分化的一系列圖像以及線和散點(diǎn)圖。未分化的MSC或CCN2/CTGF處理的MSC表達(dá)極少α -平滑肌肌動(dòng)蛋白(a SMA)(圖3Α、圖3C)。當(dāng)TGF β I處理時(shí)，MSC或MSC衍生的成纖維細(xì)胞容易地表達(dá)a SMA+微絲(圖3B、圖3D)。流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)在MSC或MSC衍生的成纖維細(xì)胞(MSC-Fb)中不存在a SMA表達(dá)(圖3Ε、圖3G)。相比之下，31. 9%的CCN2/CTGF處理的MSC或MSC-Fb獲得a SMA表型(圖3Η)。引人注目的是，僅I. 8%的未分化的MSC在TGF β I刺激后獲得a SMA表型(圖3F)。膠原凝膠收縮測(cè)定顯示，與未分化的MSC的CCN2/CTGF単獨(dú)刺激(圖3J)或TGF β I單獨(dú)刺激(圖3Κ)的中度收縮相比，順序給予CCN2/CTGF和TGF β I的MSC產(chǎn)生最顯著的收縮(圖31)，沒有CCN2/CTGF或TGF β I刺激的MSC產(chǎn)生最少的收縮(圖3L)。定量地，通過CCN2/CTGF和TGF β I順序刺激MSC產(chǎn)生最顯著的膠原凝膠收縮(圖3Μ) (ρ〈0. 05)。比例尺100 μ m。圖4是示出CCN2/CTGF在體內(nèi)促進(jìn)纖維發(fā)生代替異位骨發(fā)生的一系列圖像以及線和散點(diǎn)圖。在圖4A中，在代表性3D重建μ CT圖像上，切除骨性聯(lián)結(jié)的顱骨縫后異位礦化容易地發(fā)生(方框)。在圖4Β中，當(dāng)CCN2/CTGF控釋時(shí)，顱骨縫的解剖形態(tài)學(xué)恢復(fù)，不存在異位礦化。包裹CCN2/CTGF的PLGA微球直徑為120±64 μ m每SEM圖像(圖4C)，并且在體外表現(xiàn)出長(zhǎng)達(dá)測(cè)試的6wk的緩釋(n=6)(圖4D)。H&E染色顯示與沒有CCN2/CTGF遞送的異 位礦化(圖4E、圖4G)相比，顱骨縫的顯微形態(tài)學(xué)在CCN2/CTGF控釋時(shí)恢復(fù)(圖4F、圖4H)。一些包裹CCN2/CTGF的微球(μ s)在操作后(post-op) 4wk保持存在(圖4F、圖4H)。豐富的FSPl和波形蛋白表達(dá)(分別為圖4J、圖4L)表明在再生的顱骨縫中存在成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞。相比之下，F(xiàn)SPl和波形蛋白表達(dá)僅限于沒有CCN2/CTGF遞送的閉塞骨的骨髄(圖41、圖 4K) ο 比例尺:1mm(圖 4A、圖 4B)，500 μ m(圖 4E、圖 4F)，200 μ m(圖 4G、圖 4H、圖 4I-L)。圖5是示出CCT2/CTGF促進(jìn)器官培養(yǎng)中顱骨縫的離體形態(tài)發(fā)生的一系列圖像和條形圖。Sprague Dawley大鼠的額間縫(IFS)在出生后第10天(plO)明顯(圖5A),顯示礦化骨之間的成纖維細(xì)胞軟組織。IFS在大約出生后第25天(p25)進(jìn)行異位礦化或骨性聯(lián)結(jié)。代表性P35的顱骨縫的特征在于成纖維細(xì)胞軟組織實(shí)際上消失并且其被現(xiàn)有的礦化骨之間致密的礦化組織代替(圖5B)。將50ng/mL的CCN2/CTGF遞送至plO外植體保持25天使得顱骨縫以免發(fā)生異位礦化(圖5C)，表明礦化骨之間存在成纖維細(xì)胞、軟組織界面。b :骨，s :縫。與沒有CCN2/CTGF的微弱FSPl表達(dá)和波形蛋白的幾乎不存在(分別為圖5E和圖5H)相比，F(xiàn)SPl和波形蛋白在代表性plO先天顱骨縫和代表性CCN2/CTGF處理的顱骨縫中表達(dá)(圖邪、圖5F為FSP1，而圖5G、圖51為波形蛋白)。與用CCN2/CTGF處理的p35的寬闊的明顯縫(圖5K)相比，代表性的沒有CCN2/CTGF遞送的p35的顱骨縫的寬度在3Dμ CT重建樣品上是狹窄的(圖5J)。定量地，CCN2/CTGF處理的縫的平均寬度顯著寬于沒有CCN2/CTGF的(圖5L) (ρ〈0· 05;Ν=8)。從CCN2/CTGF處理的縫收獲的軟組織表現(xiàn)出顯著多于無CCN2/CTGF的縫的Tn-C含量(圖5Μ) (ρ〈0· 05)。比例尺60 μ m。圖6是證實(shí)顱骨縫間充質(zhì)細(xì)胞表現(xiàn)出多譜系分化能力的一系列圖像。分離自p7的天然的明顯顱骨縫的細(xì)胞容易地分化為成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞，所述成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞在100ng/mL的CCN2/CTGF刺激時(shí)高度三色陽(yáng)性(圖6A)。相比之下，分離的沒有CCN2/CTGF處理的顱骨縫細(xì)胞繼續(xù)呈現(xiàn)MSC形態(tài)并合成很少的膠原(圖6E)。與分離的沒有成骨刺激的細(xì)胞(圖6F)相比，將在20-30天內(nèi)進(jìn)行骨性聯(lián)結(jié)的來自p7顱蓋的縫細(xì)胞在有或無CCN2/CTGF的成骨刺激下容易地分化為成骨細(xì)胞(圖6B、圖6C)。而且，與分離的沒有成脂刺激的縫細(xì)胞(圖6G)相比，分離的顱骨縫細(xì)胞在允許的條件下進(jìn)行成脂分化(圖6D)。比例尺100 μ m(圖 6A、圖 6D-G),50ym(圖 6B、圖 6C)。
圖7是示出CCN2/CTGF處理的細(xì)胞不是成骨的或成軟骨的一系列圖像和條形圖。馮庫(kù)薩(Von Kossa)染色在CCN2/CTGF處理的MSC中為陰性(圖7B)，正如沒有CCN2/CTGF處理的MSC(圖7A)。相比之下，接受成骨刺激的MSC容易地分化為積累(elaborate)礦物的成骨細(xì)胞(圖7C)。番紅O染色在CCN2/CTGF處理的MSC中為陰性(圖7E)，正如沒有CCN2/CTGF處理的MSC (圖7D)。相比之下，接受成軟骨刺激的MSC容易地分化為番紅O陽(yáng)性的成軟骨細(xì)胞(圖7F)。定量地，成骨刺激下的MSC積累比有或無CCN2/CTGF處理的相同細(xì)胞亞群顯著更多的鈣(圖7G) (n=5，*:p〈0.05，林:p〈0.01)。平行地，成軟骨刺激下的MSC產(chǎn)生比有或無CCN2/CTGF處理的相同細(xì)胞亞群顯著更多的糖胺聚糖(GAG) (H)(η=5, *:ρ〈0· 05, **:ρ〈0· 01)。比例尺100 μ m。圖8是來自用CTGF (100ng/ml)處理的人骨髓MSC的磷光體-p38和磷光體-TrKA的一系列凝膠圖像。圖9 是用 100ng/ml CTGF (圖 9A) ;0· 2 μ M ρ38 抑制劑和 lOOng/mlCTGF (圖 9B)； Iμ M ρ38 抑制劑和 100ng/ml CTGF (圖 9C)；以及 5 μ M ρ38 抑制劑和 100ng/ml CTGF (圖9D)處理的人骨髓MSC的一系列圖像。圖10是用抗壞血酸和100ng/ml CTGF (圖10A);抗壞血酸、0. 2 μ M ρ38抑制劑和100ng/ml CTGF (圖 10B);抗壞血酸、I μ M ρ38 抑制劑和 100ng/mlCTGF (圖 10C);以及抗壞血酸、5 μ M ρ38抑制劑和100ng/ml CTGF(圖10D)處理的人骨髓MSC的一系列圖像。圖11是染色的用抗壞血酸和100ng/ml CTGF (圖11A);抗壞血酸、50ng/mlK252a/DMS0 和 100ng/ml CTGF (圖 11B);抗壞血酸、100ng/mlK252a/DMS0 和 100ng/ml CTGF(圖 11C);抗壞血酸、200ng/mlK252a/DMS0 和 100ng/ml CTGF (圖 11D);抗壞血酸、500ng/mlK252a/DMS0和100ng/ml CTGF (圖I IE)處理的人骨髓MSC以及對(duì)照MSC (圖11F)的一系列圖像。圖12是染色的用抗壞血酸和100ng/ml CTGF (圖12A);抗壞血酸、50ng/mlK252a/DMS0 和 100ng/ml CTGF (圖 12B);抗壞血酸、100ng/mlK252a/DMS0 和 100ng/mlCTGF (圖 12C);抗壞血酸、200ng/mlK252a/DMS0 和 100ng/ml CTGF (圖 12D);抗壞血酸、500ng/mlK252a/DMS0 和 100ng/ml CTGF (圖 12E)處理的人骨髓 MSC 以及對(duì)照 MSC (圖 12F)的一系列圖像。圖13是示出P38抑制劑減少瘢痕瘤細(xì)胞基質(zhì)合成的一系列圖像。圖13A示出用O μ M P38抑制劑處理的細(xì)胞。圖13Β示出用0. 2 μ M Ρ38抑制劑處理的細(xì)胞。圖13C示出用I μ M Ρ38抑制劑處理的細(xì)胞。圖13D示出用5 μ M Ρ38抑制劑處理的細(xì)胞。圖14是示出Κ252Α抑制劑抑制瘢痕瘤細(xì)胞基質(zhì)合成的一系列圖像。圖14Α示出用 DMSO處理的細(xì)胞。圖14Β示出用0ng/ml K252A處理的細(xì)胞。圖14C示出用50ng/ml K252A處理的細(xì)胞。圖14D示出用100ng/mlK252A處理的細(xì)胞。圖14E示出用200ng/ml K252A處理的細(xì)胞。圖14F示出用500ng/ml K252A處理的細(xì)胞。圖15是示出圖14的細(xì)胞的4X放大的一系列圖像。圖15A示出用DMSO處理的細(xì)胞。圖15B示出用0ng/ml K252A處理的細(xì)胞。圖15C示出用50ng/ml K252A處理的細(xì)胞。圖KD示出用100ng/ml K252A處理的細(xì)胞。圖15E示出用200ng/ml K252A處理的細(xì)胞。圖15F示出用500ng/mlK252A處理的細(xì)胞。圖16是示出圖14的細(xì)胞的10X放大的一系列圖像。圖16A示出用DMSO處理的細(xì)胞。圖16B示出用Ong/ml K252A處理的細(xì)胞。圖16C示出用50ng/ml K252A處理的細(xì)胞。圖16D示出用100ng/ml K252A處理的細(xì)胞。圖16E示出用200ng/ml K252A處理的細(xì)胞。圖16F示出用500ng/mlK252A處理的細(xì)胞。發(fā)明詳沭本文提出的方面至少部分基于怎樣從間充質(zhì)細(xì)胞衍生成纖維細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)；特別是成纖維細(xì)胞可以衍生自四肢(appendicular)骨髓和顱骨間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)的發(fā)現(xiàn)。CCN2/CTGF刺激的MSC可以形成成纖維細(xì)胞。本文示出從多能MSC衍生FSP1+、波形蛋白+、Colll+和aSMA_成纖維細(xì)胞。
因此，CCN2/CTGF可以用來將創(chuàng)傷中的祖細(xì)胞如間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為具有最小瘢痕的參與正常創(chuàng)傷愈合的α平滑肌肌動(dòng)蛋白陰性成纖維細(xì)胞。還發(fā)現(xiàn)CCN2/CTGF和TGF3 I的軸可以指定成纖維細(xì)胞承擔(dān)(commitment)、纖維發(fā)生和纖維化的逐步和獨(dú)特的過程。TGF^ I刺激CCN2/CTGF衍生的成纖維細(xì)胞可以形成肌成纖維細(xì)胞，所述肌成纖維細(xì)胞牽涉癌癥基質(zhì)、病理性瘢痕和器官纖維化，包括心臟、肺、腎和肝。因此，抑制TGFii I可以減少或消除從創(chuàng)傷中的CCN2/CTGF刺激的MSC形成肌成纖維細(xì)胞，其中這類水平升高的α平滑肌肌動(dòng)蛋白陰性成纖維細(xì)胞可以參與創(chuàng)傷愈合，具有進(jìn)ー步減小的瘢痕。此外，據(jù)發(fā)現(xiàn)P38抑制劑可以用作纖維化抑制劑。并且已發(fā)現(xiàn)酪氨酸激酶抑制劑可以用作纖維化抑制劑。本發(fā)明的一方面涉及組合物，其包含CCN2/CTGF和纖維化抑制劑，例如TGFβ的抑制劑、Ρ38抑制劑或酪氨酸激酶抑制劑。如本文所示，CCN2/CTGF可以刺激間充質(zhì)祖細(xì)胞分化為成纖維細(xì)胞，從而提高纖維發(fā)生的水平并幫助創(chuàng)傷愈合。此外，TGFii的抑制劑可以減少或消除成纖維細(xì)胞分化為與愈合過程中的消極結(jié)果有關(guān)的肌成纖維細(xì)胞。并且Ρ38抑制劑或酪氨酸激酶抑制劑可以用作纖維化抑制劑。本文所述的組合物可以用來促進(jìn)或加速組織創(chuàng)傷的愈合，特別是軟組織創(chuàng)傷。本文所述的組合物可以是藥物組合物。如下文進(jìn)ー步詳細(xì)描述的，本文所述的藥物組合物可以包含藥學(xué)可接受的載體或賦形劑。本文所述的藥物組合物可以進(jìn)一歩配制為包含其他活性物質(zhì)，包括但不限于抗生素或免疫抑制劑。藥物組合物可以配制為用于各種給藥途徑，包括局部。這類組合物可以誘導(dǎo)纖維發(fā)生，促進(jìn)或加速創(chuàng)傷愈合，減少肌成纖維細(xì)胞形成，減少纖維化，或者減少瘢痕，連同本文所述的其他益處。本發(fā)明的另一方面涉及用于創(chuàng)傷愈合的系統(tǒng)。這類系統(tǒng)可以包含用于創(chuàng)傷愈合的常規(guī)醫(yī)療器械，例如繃帶、止血粉或縫線，所述醫(yī)療器械包含本文所述的組合物。這樣的系統(tǒng)可以通過誘導(dǎo)纖維發(fā)生，促進(jìn)或加速創(chuàng)傷愈合，減少肌成纖維細(xì)胞形成，減少纖維化，或者減少瘢痕(例如，異常、瘢痕瘤和肥大性瘢痕)，連同本文所述的其他益處來放大所述器械的愈合效果。本發(fā)明的另一方面涉及ー種治療個(gè)體的方法。如上文簡(jiǎn)要描述和下文更深入描述的，CCN2/CTGF可以誘導(dǎo)纖維發(fā)生，促進(jìn)或加速創(chuàng)傷愈合，減少肌成纖維細(xì)胞形成，減少纖維化，或者減少瘢痕，連同本文所述的其他益處。因此本文所述的方法可以幫助組織創(chuàng)傷的愈合，例如，急性或慢性創(chuàng)傷；皮膚、韌帶或腱創(chuàng)傷；開放性或閉合性創(chuàng)傷；切割、撕裂、擦傷、穿刺、穿透或槍彈創(chuàng)傷；或者分裂裂傷、過度拉伸、磨壓、割裂或撕裂創(chuàng)傷；或者上述創(chuàng)傷的各種組合。本發(fā)明的另一方面涉及ー種形成a SMA-成纖維細(xì)胞的方法。使a SMA-、⑶34_間充質(zhì)祖細(xì)胞與CCN2/CTGF接觸可以導(dǎo)致CCN2/CTGF刺激的間充質(zhì)干細(xì)胞分化為a SMA-、FSP1+、波形蛋白+、Colll+成纖維細(xì)胞。例如，可以將這樣的a SMA-成纖維細(xì)胞引入創(chuàng)傷部位或者包含在用于創(chuàng)傷治療的組合物中。下文提供這些和其他方面和特征的進(jìn)ー步討論。CCN2/CTGF本文所述的組合物、方法、系統(tǒng)和試劑盒的各種實(shí)施方案包含CCN2/CTGF。如本文所示，CCN2/CTGF可以刺激a SMA-⑶34-間充質(zhì)祖細(xì)胞分化為a SMA-成纖維細(xì)胞。還如本文所示，CCN2/CTGF可以減弱多能干性(sternness)基因，增加I型膠原的合成并刺激成纖維細(xì)胞標(biāo)志，包括FSP1、波形蛋白、纖連蛋白和生腱蛋白-C。此外，如本文所示，從CCN2/CTGF刺激a SMA-間充質(zhì)祖細(xì)胞分化的成纖維細(xì)胞可以保留a SMA-特征。CCN2/CTGF是36-38kDa的富含半胱氨酸的CCN家族蛋白。CCN2/CTGF可以單獨(dú)或者與其他生長(zhǎng)因子或物質(zhì)聯(lián)合包含在本文所述的組合物、方法、系統(tǒng)和試劑盒中。在一 些實(shí)施方案中，所述CCN2/CTGF為人CCN2/CTGF或重組人CCN2/CTGF。例如，所述CCN2/CTGF可以是對(duì)應(yīng)于登錄號(hào)NP_001892的CCN2/CTGF或其變體。CCN2/CTGF可從各種商業(yè)來源獲得(例如，BioVendor, Chandler, NC ;合成 CCN2/CTGF 肽 RANCLVQTTEWSAC SKT, SynPepCorporation, Dublin, CA)。在一些實(shí)施方案中，CCN2/CTGF包含SEQ ID NO: I的多肽，或者包含與SEQ ID NO: I具有至少約80%序列相同性并且具有CTGF活性的序列的多肽。例如，所述CCN2/CTGF可以包含多肽，所述多肽包含與SEQ IDNO: I具有至少約81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 序列相同性并且具有 CTGF 活性的序列。CCN2/CTGF可以作為例如分離的多肽或多核苷酸在制劑中給藥。CCN2/CTGF的多核苷酸組合物包括但不限于包含編碼CCN2/CTGF的多核苷酸的基因治療載體。基因治療方法需要可操作地連接或關(guān)聯(lián)至啟動(dòng)子的編碼CCN2/CTGF的多核苷酸，以及靶組織表達(dá)CCN2/CTGF所必需的任何其他遺傳元件。這類基因治療和遞送技術(shù)是本領(lǐng)域已知的(參見例如，Smyth Templeton (2003) Gene and Cell Therapy, CRC, ISBN 0824741048)。合適的基因治療載體包括但不限于不整合入宿主基因組的基因治療載體?；蛘?，合適的基因治療載體包括但不限于整合入宿主基因組的基因治療載體。CCN2/CTGF多核苷酸可以在質(zhì)粒制劑中遞送。質(zhì)粒DNA或RNA制劑一般包含游離于任何遞送媒介物的編碼CCN2/CTGF的序列，所述遞送媒介物用來輔助、推動(dòng)、或促進(jìn)進(jìn)入細(xì)胞，包括病毒序列、病毒顆粒、脂質(zhì)體(liposome)制劑、脂質(zhì)體(Iipofectin)或沉淀劑等。任選地，所述實(shí)施方案的基因治療組合物可以在脂質(zhì)體(liposome)制劑和脂質(zhì)體(Iipofectin)制劑中遞送,其可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法制備(參見例如，SmythTempleton(2003)Gene and Cell Therapy, CRC, ISBN 0824741048)?；蛑委熭d體還可以包括合適的腺病毒載體，包括但不限于例如Curiel and Douglas (2002) Adenoviral Vectorsfor Gene Therapy, Academic Press, ISBN0121995046 所述的腺病韋載體。上文所述的CCN2/CTGF可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子序列可以在構(gòu)建體中提供。構(gòu)建體一般包含可操作地連接至如上文所述的CCN2/CTGF及其變體的可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子的啟動(dòng)子。啟動(dòng)子選擇可以允許在各種條件下表達(dá)CCN2/CTGF。啟動(dòng)子還可以在它們的調(diào)控特征的基礎(chǔ)上選擇。這類特征的實(shí)例包括增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄活性以及誘導(dǎo)性。所述啟動(dòng)子可以是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。例如，所述啟動(dòng)子可以根據(jù)溫度、pH、激素、代謝物(例如，乳糖、甘露醇、氨基酸)、光(例如，波長(zhǎng)特異性)、滲透勢(shì)(例如，鹽誘導(dǎo))、重金屬或抗生素來誘導(dǎo)。許多標(biāo)準(zhǔn)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。術(shù) 語“構(gòu)建體”理解為指任何重組多核苷酸分子，例如質(zhì)粒、粘粒、病毒、自主復(fù)制的多核苷酸分子、噬菌體、或者線性或環(huán)狀單鏈或雙鏈DNA或RNA多核苷酸分子，其衍生自任何來源，能夠基因組整合或自主復(fù)制，包含多核苷酸分子，其中ー個(gè)或多個(gè)多核苷酸分子以功能上有效的方式連接，即可操作地連接。CCN2/CTGF可以通過轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞以表達(dá)CCN2/CTGF并將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞引入個(gè)體來遞送至所述個(gè)體?？梢岳帽绢I(lǐng)域已知的各種標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞(參見，例如，Sambrook and Russel (2006)Condensed Protocols from Molecular Cloning:ALaboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN-10:0879697717;Ausubel et al. (2002)Short Protocols in Molecular Biology,5th ed. , Current Protocols, ISBN-10:0471250929;Sambrook and Russel(2001)Molecular Cloning:A LaboratoryManual, 3d ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press,ISBN-10:0879695773;Elhai, J.and ffolk, C. P. 1988. Methods in Enzymology 167，747-754)。這類技術(shù)包括但不限于病韋感染、磷酸鈣轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、微粒介導(dǎo)的遞送、受體介導(dǎo)的吸收、細(xì)胞融合、電穿孔等?？梢詫⑥D(zhuǎn)染的細(xì)胞加以選擇并增殖以提供包含穩(wěn)定整合在宿主細(xì)胞基因組中的表達(dá)載體的重組宿主細(xì)胞。纖維發(fā)生物質(zhì)的多肽組合物包括但不限于CCN2/CTGF多肽。纖維發(fā)生物質(zhì)的多肽組合物包括但不限于分離的全長(zhǎng)蛋白、其片段和變體。纖維發(fā)生物質(zhì)的多肽片段可以包含分離的全長(zhǎng)多肽的前肽形式，或者可選地由分離的全長(zhǎng)多肽的前肽形式組成。生長(zhǎng)因子物質(zhì)的多肽片段可以包含分離的全長(zhǎng)多肽的成熟形式，或者可選地由分離的全長(zhǎng)多肽的成熟形式組成。本發(fā)明還提供編碼CCN2/CTGF的前肽和成熟多肽的多核苷酸。CCN2/CTGF的變體包括但不限于設(shè)計(jì)來增加CCN2/CTGF活性在體內(nèi)的持續(xù)時(shí)間的蛋白變體。例如，變體纖維發(fā)生物質(zhì)包括綴合至聚こニ醇(PEG)部分以增加它們的體內(nèi)半衰期(也稱為聚こニ醇化)的全長(zhǎng)CCN2/CTGF蛋白或其片段。CCN2/CTGF可以作為融合蛋白提供在制劑中。例如，CCN2/CTGF可以是與人IgG的F。部分的融合蛋白。作為另ー實(shí)例，CCN2/CTGF可以是異源ニ聚體或同源ニ聚體或者多聚體。融合蛋白的實(shí)例包括但不限于成熟CCN2/CTGF多肽與人免疫球蛋白G(IgG)的Fc部分之間的配體融合。制備融合蛋白的方法和編碼融合蛋白的構(gòu)建體是本領(lǐng)域公知的。各種實(shí)施方案還包括使用可以促進(jìn)纖維發(fā)生或刺激成纖維細(xì)胞分化的多核苷酸和多肽，其與本文所述的分離的CCN2/CTGF的多核苷酸和多肽具有至少80%序列相同性。例如，多核苷酸和多肽可以與本文所述的分離的CCN2/CTGF的多核苷酸和多肽具有至少約81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99%序列相同性。CCN2/CTGF 可以約 O. lng/ml-約 100mg/ml 的濃度給藥。例如，CCN2/CTGF 可以約O. lng/ml、lng/ml、10ng/ml、100ng/ml、lmg/ml、10mg/ml 或 100mg/ml 的濃度給藥。作為另一實(shí)例，CCN2/CTGF 可以約 10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290或300叩/111し的濃度給藥。作為另ー實(shí)例，CCN2/CTGF 可以約 50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、700、750、800、850、900、950或1000ng/mL的濃度給藥。作為進(jìn)ー步的實(shí)例，CCN2/CTGF可以約100ng/ml給藥。技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到這樣的有效量可以反映在存在于藥物組合物中的CCN2/CTGF的量，例如每劑量水平。在一些實(shí)施方案中，可以將CCN2/CTGF并入遞送媒介物。下文討論各種遞送媒介物。在一實(shí)施方案中，將包含CCN2/CTGF的組合物包裹在聚合微球中。CCN2/CTGF可以約IOOmg-約500mg聚合物比約I-約100 μ g的CCN2/CTGF的比例包裹在聚合微球中。例如，CCN2/CTGF 可以約 10:10、約 50:10、約 100:10、約 150:10、約 200:10、約 250:10、約 300:10、約350:10、約400:10、約450:10或500:10的mg聚合物μ g的CCN2/CTGF的比例包裹在聚合微球中。在一實(shí)施方案中，組合物以約250mg聚合物比約10μ g的CTGF的比例包裹在聚合微球中。在一些實(shí)施方案中，可以通過將約I-約IOOmg的包裹CTGF的微球引入組織創(chuàng)傷 來將包含CCN2/CTGF的組合物給予組織創(chuàng)傷。例如，可以將約10、約15、約20、約25、約30、約35、約40、約45、約50、約55、約60、約65、約76、約75、約80、約85、約90、約95或約IOOmg的包裹CTGF的微球引入組織創(chuàng)傷。CCN2/CTGF可以在約3-8的pH下給藥。CCN2/CTGF或CCN2/CTGF制劑可以是無菌的。例如，無菌可以通過無菌過濾膜(例如，0. 2微米膜或?yàn)V器)過濾容易地實(shí)現(xiàn)。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，CCN2/CTGF或其他纖維發(fā)生物質(zhì)的濃度可以基于促進(jìn)成纖維細(xì)胞分化或纖維發(fā)生的期望長(zhǎng)度或程度變化。相似地，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解緩釋的持續(xù)時(shí)間可以通過操縱包含緩釋制劑的組合物來改變，例如，改變緩釋聚合物中的生物穩(wěn)定聚合物的百分比。為本文所述的目的確定CCN2/CTGF的有效量在本領(lǐng)域的普通技術(shù)內(nèi)。MSC在一些實(shí)施方案中，所述組合物、方法、系統(tǒng)或試劑盒可以包含間充質(zhì)祖細(xì)胞。據(jù)發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞可以衍生自間充質(zhì)起源的祖細(xì)胞。如本文所示，CCN2/CTGF可以刺激⑶34-、a SMA-間充質(zhì)祖細(xì)胞分化為a SMA-成纖維細(xì)胞。從而在含有CCN2/CTGF的組合物中提供間充質(zhì)祖細(xì)胞(例如，CD34-間充質(zhì)干細(xì)胞)可以提供將α SMA-成纖維細(xì)胞遞送至創(chuàng)傷部位，在那里這樣的成纖維細(xì)胞可以例如増加纖維發(fā)生并幫助創(chuàng)傷愈合。如本文所用，間充質(zhì)祖細(xì)胞或間充質(zhì)起源的祖細(xì)胞為CD34—祖細(xì)胞，例如CD34—間充質(zhì)干細(xì)胞。通常，間充質(zhì)起源的祖細(xì)胞是成纖維細(xì)胞的前體，并且在CCN2/CTGF的存在下分化。成纖維細(xì)胞可以衍生自⑶34_祖細(xì)胞。⑶34_細(xì)胞實(shí)質(zhì)上與造血譜系的⑶34+不同(37，38)。成纖維細(xì)胞可以衍生自a SMAli細(xì)胞。成纖維細(xì)胞可以衍生自⑶34_、a SMA_祖細(xì)胞。例如，并且如本文所證實(shí)的，成纖維細(xì)胞可以衍生自中胚層起源的四肢骨髓以及神經(jīng)嵴起源的顱骨縫。在一些實(shí)施方案中，用作衍生成纖維細(xì)胞的起始原料的祖細(xì)胞不是CD34+和a SMA+纖維細(xì)胞，據(jù)認(rèn)為其從骨髓遷移至癌癥基質(zhì)或外周創(chuàng)傷(6)。用于分化為成纖維細(xì)胞的間充質(zhì)祖細(xì)胞可以獲得自各種來源。用于分化為成纖維細(xì)胞的間充質(zhì)祖細(xì)胞可以是個(gè)體自體的(即，來自相同個(gè)體)、同種異體的(即，來自相同物種的遺傳上不相同的供體)、同基因的(即，來自遺傳上相同的供體)或異種的(即，來自不同物種)。例如，間充質(zhì)祖細(xì)胞可以分離自待根據(jù)本文所述的方法治療的個(gè)體。間充質(zhì)祖細(xì)胞可以通過本領(lǐng)域已知的各種方法分離、純化和/或培養(yǎng)。分離和培養(yǎng)祖細(xì)胞的方法在例如 Vunjak-Novakovic and Freshney (2006)Culture of Cells forTissue Engineering, ffiley-Liss, ISBN 0471629359 中討論。例如，MSC 可以分離自骨髄。細(xì)胞分離可以通過本領(lǐng)域公知的方法進(jìn)行，例如骨髓穿刺。間充質(zhì)祖細(xì)胞可以來源于相同或不同物種作為移植受體。例如，間充質(zhì)祖細(xì)胞可以來源于動(dòng)物，包括但不限于哺乳動(dòng)物、爬行動(dòng)物和禽類，更優(yōu)選馬、牛、狗、貓、羊、豬和雞，并且最優(yōu)選人。成纖維細(xì)胞本文提供CCN2/CTGF誘導(dǎo)(derived)的a SMA-成纖維細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中， CCN2/CTGF誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞為FSP1+、波形蛋白+、Colll+和a SMA-。這類成纖維細(xì)胞可以參與例如正常創(chuàng)傷愈合，具有最少的瘢痕。如本文所示，CCN2/CTGF可以用來促成纖維發(fā)生而不是骨發(fā)生。36-38kDa的富含半胱氨酸的CCN家族蛋白CCN2/CTGF可以用于間充質(zhì)分化為成纖維細(xì)胞。CCN2/CTGF刺激的MSC可以減弱多能干性基因。CCN2/CTGF刺激的MSC可以具有増加的I型膠原合成。CCN2/CTGF刺激的MSC可以表達(dá)成纖維細(xì)胞標(biāo)志，包括FSP1、波形蛋白、纖連蛋白和生腱蛋白-C。CCN2/CTGF刺激的MSC可以為a SMA陰性。CCN2/CTGF刺激的MSC可以具有穩(wěn)定譜系。例如，CCN2/CTGF誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞可以具有減弱的分化為其他間充質(zhì)非成纖維細(xì)胞譜系(包括成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞)的能力。根據(jù)本文所述的各種實(shí)施方案，可以使CCN2/CTGF與間充質(zhì)祖細(xì)胞接觸以刺激形成成纖維細(xì)胞。培養(yǎng)祖細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域公知的，并且可以改變這類方法以提供與CCN2/CTGF接觸的間充質(zhì)祖細(xì)胞分化的最佳條件。在一些實(shí)施方案中，CCN2/CTGF誘導(dǎo)的a SMA-成纖維細(xì)胞作為富集的細(xì)胞培養(yǎng)物存在。例如，用CCN2/CTGF處理的間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)物可以包含至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%或者至少約99%的a SMA-成纖維細(xì)胞。TGF^ 抑制劑在一些實(shí)施方案中，組合物、方法、系統(tǒng)和試劑盒包含TGF β抑制劑。如本文所示，盡管CCN2/CTGF處理的MSC為α SM-,但是用TGF β I進(jìn)ー步刺激可以將所述細(xì)胞轉(zhuǎn)化為a SMA+細(xì)胞特征的肌成纖維細(xì)胞，其在體外顯著收縮膠原凝膠。TGF0抑制劑可以防止從成纖維細(xì)胞形成肌成纖維細(xì)胞。TGFii抑制劑可以抑制纖維化。肉芽組織的成纖維細(xì)胞收縮是正常皮膚創(chuàng)傷愈合必需的(6)。但是肌成纖維細(xì)胞(a SMA+細(xì)胞類型)過剩以及相關(guān)的過量膠原生成、混亂和過度創(chuàng)傷收縮可以導(dǎo)致病理性皮膚創(chuàng)傷愈合和瘢痕。a SMA+肌成纖維細(xì)胞牽涉侵襲性腫瘤(癌癥基質(zhì))、異常皮膚愈合、病理性瘢痕和器官纖維化，包括心臟、肺、腎和肝。通過減少肌成纖維細(xì)胞形成，可以減少這類消極的相關(guān)影響。因此，抑制或降低TGFP (例如，TGF^ I)的水平可以減少或消除CCN2/CTGF處理的成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，從而避免與a SMA+肌成纖維細(xì)胞相關(guān)的消極并發(fā)癥。TGFβ抑制劑可以包含在與CCN2/CTGF相同的組合物或另ー組合物中。TGFP抑制劑和CCN2/CTGF可以連續(xù)或同時(shí)給予個(gè)體。例如，當(dāng)?shù)谝唤M合物包含CCN2/CTGF和TGF3抑制劑時(shí)，則給藥可以是連續(xù)的。作為另ー實(shí)例，當(dāng)?shù)谝唤M合物包含CCN2/CTGF并且第二組合物包含TGFii抑制劑時(shí)，則給藥可以是連續(xù)的。或者，當(dāng)?shù)谝唤M合物包含CCN2/CTGF并且第ニ組合物包含TGFii抑制劑時(shí)，給藥可以是同時(shí)的。應(yīng)當(dāng)理解除了包含兩者的制劑，CCN2/CTGF或纖維化抑制劑(例如，TGFii抑制劑、P38抑制劑或酪氨酸激酶抑制劑)可以獨(dú)立地給藥，例如，以便進(jìn)ー步調(diào)整創(chuàng)傷部位存在的各物質(zhì)的量。在一些實(shí)施方案中，TGFP的抑制劑可以減少或消除從成纖維細(xì)胞形成肌成纖維細(xì)胞。例如，TGF^的抑制劑可以減少或消除從a SMA-成纖維細(xì)胞形成a SMA+肌成纖維細(xì)胞。所述抑制劑可以是TGF β I的抑制劑。所述抑制劑可以是TGF β 2的抑制劑。所述抑制劑可以是TGFβ 3的抑制劑。例如，TGFβ I的抑制劑可以減少或消除從CCN2/CTGF刺激的a SMA-、⑶34-間充質(zhì)祖細(xì)胞分化為a SMA+肌成纖維細(xì)胞。作為另ー實(shí)例，TGFβ I的抑制劑可以減少或消除從a SMA-成纖維細(xì)胞分化為aSMA+肌成纖維細(xì)胞。 在一些實(shí)施方案中，TGFβ的抑制劑可以減少?gòu)腶 SMA-成纖維細(xì)胞形成a SMA+肌成纖維細(xì)胞約5%。例如，TGFβ的抑制劑可以減少?gòu)腶 SMA-成纖維細(xì)胞形成a SMA+肌成纖維細(xì)胞約 10%、約 15%、約 20%、約 25%、約 30%、約 35%、約 40%、約 45%、約 50%、約 55%、約 60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%或約99%。在一些實(shí)施方案中，TGFβ的抑制劑可以大幅減少?gòu)腶 SMA-成纖維細(xì)胞形成a SMA+肌成纖維細(xì)胞。本文所用的TGFβ抑制劑(例如，TGFβ I抑制劑)一般包括抗體、作為競(jìng)爭(zhēng)性或不可逆拮抗劑的小分子、反義寡核苷酸、蛋白適配體、核苷酸適配體以及小干擾RNA。用于本文所述的組合物和方法的TGF0抑制劑可以包括但不限于描述于Saunierand Akhurst 2006 Current Cancer Drug Targets 6 (7)565-578;Callahan et al. 2002 JMed Chem 45 (5) 999-1001 和 Border et al. 1992 Nature360, 361-364 的那些 TGF β 抑制齊 。用于本文所述的組合物和方法的TGFP抑制劑可以包括但不限于 ANG-1122(Angion Biomedica) ;ΑΡ_11014(Antisense Pharma);美替木單抗(AstraZeneca);夫蘇木單抗(AstraZeneca);甘露糖-6_ 憐酸，BTG (BTG) ； Pharmapro jectsNo. 6614 (Celgene) ；NAFBOOI (Digna Biotech) ；NAFB002 (Digna Biotech) JGF-βΙ 抗體，Lill バ Eli Lilly) ;LY_2157299 (Eli Lilly);胎球蛋白(Eli Lilly) JGF-β 拮抗劑，F(xiàn)ibroGen (FibroGen) ； IDlI (Genzyme)；抗 TGF β MAb-I, Genzyme (Genzyme)；SB-431542(GlaxoSmithKline);激活素樣激酶 5 抑制劑，Graceway (Graceway)；抗 TGF-β 抗體，Genent (Hoffmann-La Roche);反義寡核苷酸，Il (Il-Yang)；TGF- β 拮抗劑，Inflazyme (Inflazyme) ；TGF- β 受體，Insmed (Insmed) ；TGF- β 拮手幾劑，Inspiraplex (Inspiraplex);飾月父蛋白，Telios (Integra LifeSciences)；SX-007(Johnson &Johnson) ；TGF-β 受體抑制劑，J&J(Johnson & Johnson) ；TGF-β疫苗，Neovacs (Neovacs) ;ADMP_1 (NIH) ；TGF- β 抗體，Manchester ;TGF_ β 拮抗齊[J，Sydney ;甘露糖-6-憐酸，Renovo (Renovo);癌癥基因治療，Resver (Resverlogix)；TGF-β Shield(Resverlogix) ；IN-1130 (SK Chemicals) ；LF-984(Solvay) JGF-β 抑制劑，Mill(Takeda);飾膠蛋白;以及 SB-431542 (Sigma)。用于本文所述的組合物和方法的其他TGFβ抑制劑可以獲得自本領(lǐng)域已知的來源，例如 Angion Biomedica;Antisense Pharma;AstraZeneca;AVIBioPharma;Biogeη Idec;BTG;CeIgene;Digna Biotech;Eli Lilly;FibroGen;Genzyme;GlaxoSmithKline;Graceway;Hoffmann-La Roche;丄l_Yang;Inilazyme;Insmed;Inspiraplex;IntegraLifeSciences;Johnson & Johnson;Neovacs;Renovo;Resverlogix;Solvay;Takeda;以及^igma0為本文所述的目的確定TGF β抑制劑的有效量在本領(lǐng)域的普通技術(shù)內(nèi)。纖維化抑制劑在一些實(shí)施方案中，組合物、方法、系統(tǒng)和試劑盒包含纖維化抑制劑。據(jù)發(fā)現(xiàn)Ρ38促分裂原活化蛋白激酶抑制劑或酪氨酸激酶抑制劑可以抑制纖維化。Ρ38抑制劑可以減少來自間充質(zhì)祖細(xì)胞的成纖維細(xì)胞分化，減少瘢痕瘤細(xì)胞膠原合成，減少瘢痕瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，或者它們的組合。Ρ38抑制劑的實(shí)例包括但不限于Tocriset、SD282、SB239063、SB203580、SB220025、SKF86002、PD169316、SB202190、SC68376、 VX702、VX745、R130823、AMG548、BIRB796、SCI0469、SCI0323、FR167653、MW012069ASRM、SD169、RWJ67657 以及 ARRY797。給予包含p38抑制劑的組合物或制劑可以抑制結(jié)締組織的形成。在一些實(shí)施方案中，使包含P38抑制劑的組合物或制劑與間充質(zhì)祖細(xì)胞接觸。酪氨酸激酶抑制劑可以減少來自間充質(zhì)祖細(xì)胞的成纖維細(xì)胞分化，減少瘢痕瘤細(xì)胞膠原合成，減少瘢痕瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，或者它們的組合。酪氨酸激酶抑制劑的實(shí)例包括但不限于K252a、AGO13736 (阿昔替尼)、SKI-606 (波舒替尼)、AZD2171 (西地尼布)、BMS-354825(達(dá)沙替尼)、0SI-774(厄洛替尼)、ZD1839 (吉非替尼)、STI_571(伊馬替尼)、GW572016 (拉帕替尼)、CEP-701 (來妥替尼)、AMN107 (尼洛替尼)、SU5416 (司馬沙尼)、SUl 1248 (舒尼替尼)、托西尼布、ZD6474(凡德他尼)、伐他拉尼(PTK787)、ZD 1839、CI-1033,0SI-774,Gff 2016、EKB_569、頂C_C225、MDX_447、PKI 116、ABX_EGF、AG-82、AG_18、AG-490、AG-17、AG-213, AG-494, AG-825, AG-879, AG-1112, AG-1296, AG-1478, AG-126,RG-13022,RG-14620以及AG-555。給予包含酪氨酸激酶抑制劑的組合物或制劑可以抑制結(jié)締組織的形成。在一些實(shí)施方案中，使包含酪氨酸激酶抑制劑的組合物或制劑與間充質(zhì)祖細(xì)胞接觸。制劑和載體在各種實(shí)施方案中，組合物、方法、系統(tǒng)和試劑盒包含配制的組合物。本文所述的組合物可以例如 Remington’ s Pharmaceutical Sciences (A. R. Gennaro, Ed. ), 21stedition, ISBN: 0781746736 (2005)所述，使用一種或多種藥學(xué)可接受的載體或賦形劑通過任何常規(guī)方式配制，該文獻(xiàn)整體援引加入本文。這類制劑包含治療有效量的本文所述的生物學(xué)活性物質(zhì)，優(yōu)選為純化的形式，連同適量的載體以提供適當(dāng)給予個(gè)體的形式。所述制劑應(yīng)當(dāng)適合給藥模式。與本發(fā)明一起使用的物質(zhì)可以通過已知的方法配制，用于利用幾種途徑給予個(gè)體，所述途徑包括但不限于局部、腸胃夕卜、肺部、ロ服、皮內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹腔內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)、硬膜外、眼部、口腔以及直腸。単獨(dú)的物質(zhì)還可以聯(lián)合一種或多種其他物質(zhì)給藥，或者與其他生物學(xué)活性物質(zhì)或生物學(xué)惰性物質(zhì)一起給藥。這類生物學(xué)活性物質(zhì)或惰性物質(zhì)可以在液體中，或者與所述物質(zhì)機(jī)械上聯(lián)系，或者通過離子、共價(jià)、范德華、疏水、親水或其他物理力連接至所述物質(zhì)。
本文所述的組合物和制劑可以任選包含抗生素，所述抗生素可以共給藥以預(yù)防被過程中引入個(gè)體的專性或機(jī)會(huì)致病菌感染。可與生長(zhǎng)因子制劑使用的抗生素包括但不限于阿莫西林、β -內(nèi)酰胺酶、氨基糖苷、β -內(nèi)酰胺(糖肽)、克林霉素、氯霉素、頭孢菌素、環(huán)丙沙星、紅霉素、氟喹諾酮、大環(huán)內(nèi)酷、甲硝唑、青霉素、喹諾酮、雷帕霉素、利福平、鏈霉素、磺胺、四環(huán)素、甲氧芐啶、甲氧芐啶-磺胺甲噁唑以及萬古霉素。本文所述的組合物和制劑可以任選還包含免疫抑制劑?？梢耘c生長(zhǎng)因子制劑聯(lián)合給藥的合適的免疫抑制劑包括但不限于類固醇、環(huán)胞素、環(huán)胞素類似物、環(huán)磷酰胺、甲基潑尼松、潑尼松、硫唑嘌呤、FK-506U5-脫氧精胍菌素以及通過抑制應(yīng)答T細(xì)胞的功能來發(fā)揮功能的其他免疫抑制劑?？梢耘c生長(zhǎng)因子制劑聯(lián)合給藥的其他免疫抑制劑包括但不限于潑尼松龍、甲氨蝶呤、沙利度胺、甲氧沙林、雷帕霉素、來氟米特、咪唑立賓(bredinin )、布喹那、脫氧精胍菌素、和氮雜螺烷(SKF 105685)、Orthoclone 0ΚΤ 3(莫羅單抗-CD3)、Sandimmune 、Neoral 、Sangdya (環(huán)胞素)、Prograf (FK506、他克莫司)、Cellcept (麥考酚酸酷，其活性代謝物為麥考酚酸)、Imuran (硫唑嘌呤)、糖皮質(zhì)類固醇、腎上腺皮質(zhì)類固醇如Deltasone (潑尼松)和Hydeltrasol (潑尼松龍)、Folex 和Mexate (甲氨蝶 呤)、Oxsoralen-Ultra (甲氧沙林)和 Rapamuen (西羅莫司)。本文所述的組合物和制劑可以任選還包含載體媒介物如水、鹽水、林格氏液、基于磷酸鈣的載體或葡萄糖溶液。非水性媒介物如不揮發(fā)性油和油酸こ酷，以及脂質(zhì)體也可用于本文。本文所述的組合物和制劑可以還任選包含增強(qiáng)等滲性和化學(xué)穩(wěn)定性的物質(zhì)。這類物質(zhì)在采用的劑量和濃度對(duì)個(gè)體無毒，并且包括緩沖液，如磷酸鹽、檸檬酸鹽、琥珀酸鹽、乙酸以及其他有機(jī)酸或它們的鹽；抗氧化劑，如抗壞血酸；低分子量(少于約10個(gè)殘基)多肽，例如，聚精氨酸或三肽；蛋白，如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸或精氨酸；單糖、ニ糖以及碳水化合物，包括纖維素或其衍生物、葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剤，如EDTA ;糖醇，如甘露醇或山梨醇；平衡離子，如鈉；和/或非離子型表面活性剤，如聚山梨酷、泊洛沙姆或PEG?？梢耘渲瓶蒯?或緩釋)制劑以延長(zhǎng)物質(zhì)的活性并降低劑量給藥頻率。控釋制劑還可以用來影響作用起效的時(shí)間或其他特征，如物質(zhì)的血液水平，并且因而影響副作用的發(fā)生。控釋制劑可以設(shè)計(jì)為最初釋放產(chǎn)生期望的療效的量的物質(zhì)，而且逐漸并持續(xù)釋放其他量的所述物質(zhì)以在延長(zhǎng)的時(shí)間中保持療效水平。為了保持體內(nèi)接近恒定水平的物質(zhì)，所述物質(zhì)可以代替代謝或從身體排泄的物質(zhì)的量的速率從劑型釋放。物質(zhì)的控釋可以通過各種誘導(dǎo)物刺激，例如，PH的變化、溫度的變化、酶、水或者其他生理?xiàng)l件或分子。本文所述的組合物和制劑可以制備為即釋制劑、緩釋制劑或兩者。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定個(gè)體會(huì)受益于即釋制劑或緩釋制劑。即釋制劑包括液體制劑，其包含施用于靶區(qū)域的物質(zhì)，如CCN2/CTGF。液體制劑可以由液體制劑的流體特性決定的速率提供生物可利用形式的CCN2/CTGF，例如在施用部位的擴(kuò)散速率、內(nèi)源流體的影響等。合適的液體制劑的實(shí)例包括水、鹽水或者不會(huì)誘導(dǎo)宿主免疫應(yīng)答的其他可接受的流體介質(zhì)。技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到CCN2/CTGF需要在缺陷的部位存在足夠長(zhǎng)的時(shí)間以促進(jìn)纖維發(fā)生，并且優(yōu)選不應(yīng)當(dāng)滲透至周圍區(qū)域。利用本文提供的指導(dǎo)，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠設(shè)計(jì)合適的制劑用于遞送。
本文所述的組合物和制劑，包括那些包含CCN2/CTGF的組合物和制劑，可以包裹在各種載體遞送系統(tǒng)中并在各種載體遞送系統(tǒng)中給藥。載體材料可以包含、包衣或注入本文所述的組合物和制劑，例如包含CCN2/CTGF的組合物或制劑?？梢赃@樣的方式使用的載體材料的實(shí)例包括但不限于聚合遞送系統(tǒng)(例如，生物可降解的聚合物材料、膠原海綿)。如本文所示，從生物相容性微球控釋的CCN2/CTGF在體內(nèi)恢復(fù)間充質(zhì)/纖維發(fā)生顱骨縫的形態(tài)發(fā)生，否則其注定發(fā)生異位礦化。換句話說，微包裹的CCN2/CTGF在體內(nèi)促使出現(xiàn)后(postnatal)的結(jié)締組織進(jìn)行纖維發(fā)生而不是異位礦化?？蒯屩苿┛梢园珻CN2/CTGF和其他物質(zhì)(例如，TGF β抑制劑)以及載體遞送系統(tǒng)。從緩釋制劑釋放的持續(xù)時(shí)間由制劑的性質(zhì)和其他因素決定，例如，與體液的接近性，以及制劑施用的密度、生物可降解的聚合物的降解速率和其他因素。然而，緩釋制劑可以設(shè)計(jì)為在延長(zhǎng)的時(shí)間中以相對(duì)一致的濃度和生物可利用的形式提供制劑中的CCN2/CTGF (和其他物質(zhì)，如TGFii抑制剤)。 載體遞送系統(tǒng)一般包裹活性物質(zhì)，如CCN2/CTGF，并且在延長(zhǎng)的時(shí)間中提供該物質(zhì)的控釋。通常，載體包含綴合至活性物質(zhì)(如CCN2/CTGF)、與活性物質(zhì)混合或用于包裹活性物質(zhì)的分子。用于生物分子物質(zhì)遞送的基于載體的系統(tǒng)可以調(diào)整生物分子/物質(zhì)釋放速率；提高到達(dá)其作用部位的生物分子的比例；增進(jìn)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)至其作用部位；允許與其他物質(zhì)或賦形劑共定位沉積；提高所述物質(zhì)的體內(nèi)穩(wěn)定性；通過降低清除率來延長(zhǎng)所述物質(zhì)在其作用部位的停留時(shí)間；減少所述物質(zhì)非特異性遞送至非靶組織；減少所述物質(zhì)引起的刺激；降低由于所述物質(zhì)的高初始劑量的毒性；改變所述物質(zhì)的免疫原性；降低劑量給藥頻率，改善產(chǎn)物的味道；和/或延長(zhǎng)產(chǎn)物的保質(zhì)期。聚合釋放系統(tǒng)可以用來遞送本文所述的組合物或制劑(參見WhittleseyandShea(2004)Experimental Neurology 190，1-16)。聚合系統(tǒng)還可以設(shè)計(jì)為遞送可以在細(xì)胞進(jìn)程上協(xié)同或順序作用的多種生物分子。聚合遞送系統(tǒng)可以保持本文所述的生長(zhǎng)因子如CCN2/CTGF的治療水平，減少有害副作用，減少所需的生物分子的量，減少劑量的數(shù)目，并且促進(jìn)體內(nèi)半衰期短的物質(zhì)的遞送。釋放速率可以通過改變孔徑、結(jié)構(gòu)和合成聚合物(如不可降解的合成聚合物EVAc和可降解的合成聚合物聚酯PLGA)的聚合物含量來控制。此外，材料本身的降解控制釋放曲線，提供對(duì)釋放速率的額外水平的控制。本文所述的聚合遞送系統(tǒng)可以為了例如數(shù)分鐘、數(shù)小時(shí)、數(shù)天、數(shù)周甚至數(shù)年的釋放持續(xù)時(shí)間而調(diào)整，這取決于遞送的分子的物理和化學(xué)特性、采用的聚合物以及制備期間所用的加工條件。天然(例如，膠原)和合成聚合物(例如，硅氧烷、聚乳酸-こ醇酸共聚物(PLGA)和聚こ烯-醋酸こ烯共聚物(EVAc))均可以用于CCN2/CTGF的局部遞送。對(duì)于生物分子遞送，優(yōu)選生物可降解的聚合物，因?yàn)樵撗b置可以隨時(shí)間消失，消除外科手術(shù)取回的需要。PLGA是廣泛使用的生物聚合物，因?yàn)槠淇缮藤?gòu)、可控制的降解速率、證實(shí)的生物相容性以及FDA 批準(zhǔn)(參見例如，Lu et al. (2000)Biomaterials 21,1837-1845)。聚酐是可以用于生物分子遞送的相似類型的可降解的聚合物。聚合微球可以促進(jìn)本文所述的包含CCN2/CTGF或其他物質(zhì)如TGFP抑制劑的組合物或制劑的遞送。例如，持續(xù)遞送微球可以立體定向注射以在靶部位(例如，創(chuàng)傷或顱縫)釋放生長(zhǎng)因子的多肽或多核苷酸。微球可以利用天然存在或合成的聚合物制備以制備大小范圍為O. 1-500 μ m的顆粒系統(tǒng)。通常，微球在物理和化學(xué)上比脂質(zhì)體更穩(wěn)定，并且允許更高的物質(zhì)負(fù)荷。聚合微團(tuán)和聚合體(polymerome)是具有與微球相似的特征的聚合遞送媒介物，并且也可以促進(jìn)包裹和遞送本文所述的物質(zhì)，如CCN2/CTGF或纖維化抑制劑(例如，TGF^抑制劑、P38抑制劑或酪氨酸激酶抑制剤)。用于如CCN2/CTGF或纖維化抑制劑(例如，TGF^抑制劑、P38抑制劑或酪氨酸激酶抑制劑)的生物分子有效載荷的微球的制備、包裹和穩(wěn)定在本領(lǐng)域的技術(shù)內(nèi)(參見例如，Varde & Pack(2004)Expert Opin.Biol. 4(1)35-51)?？捎糜谛纬晌⑶虻木酆衔锊牧习≒LA、PLGA、用DPPC包衣的PLGA、DPPC、DSPC、EVAc、明膠、白蛋白、殼聚糖、葡聚糖、DL-PLG, SDLMs、PEG (例如，ProMaxx)、透明質(zhì)酸鈉、哌嗪ニ酮衍生物(例如，Technosphere)、磷酸I丐-PEG顆粒以及寡糖衍生物DPPG (例如，Solidose)。包裹可以例如利用水/油單乳化方法、水_油-水雙乳化方法或冷凍干燥來完成。幾種商業(yè)包裹技術(shù)是可用的(例如，ProLease ,Alkerme)。微球的釋放速率可以通過聚合物的類型、聚合物分子量、共聚物組成、加入微球制劑的賦形劑和微球大小來調(diào)節(jié)。由親水聚合物如膠原、纖維蛋白和藻酸鹽組成的聚合水凝膠也可以用于加入的包含CCN2/CTGF或纖維化抑制劑(例如，TGF β抑制劑、Ρ38抑制劑或酪氨酸激酶抑制劑)的組合物或制劑的緩釋(參見例如，Sakiyama et al. (2001)FASEB J. 15，1300-1302)。加入水凝膠的生物分子可以直接從基質(zhì)或在釋放后刺激細(xì)胞功能。毫米至厘米級(jí)別的三維聚合植入物可以裝載包含CCN2/CTGF或纖維化抑制劑(例如，TGF0抑制劑、P38抑制劑或酪氨酸激酶抑制劑)的組合物或制劑(參見例如，Teng etal (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99，3024-3029)。這些聚合植入物可以為細(xì)胞粘附提供結(jié)構(gòu)功能，同時(shí)還提供生物分子的控釋。聚合植入物通常提供生物活性因子的較大儲(chǔ)庫(kù)。所述植入物還可以制備在結(jié)構(gòu)支持物中，調(diào)整施用的幾何形狀(例如，形狀、大小、孔隙度)(例如，符合創(chuàng)傷或顱縫)。用于生物分子遞送的三維聚合植入物可以本領(lǐng)域已知的各種方法配制，包括但不限于乳化方法、溶劑澆鑄和ニ氧化碳發(fā)泡方法(參見例如，Whittleseyand Shea(2004)Experimental Neurologyl90, 1-16)。各種大小和遞送曲線的基于可植入的基質(zhì)的遞送系統(tǒng)也可商購(gòu)(例如，Innovative Research of America, Sarasota, FL)。作為釋放的替代選擇，包含CCN2/CTGF或纖維化抑制劑(例如，TGFβ抑制劑、Ρ38抑制劑或酪氨酸激酶抑制劑)的組合物或制劑可以固定在聚合遞送系統(tǒng)之上或其中。這種方法包括底物介導(dǎo)的遞送和固相遞送。通常，聚合底物的功能是支持細(xì)胞粘附并將生物分子貨物直接放置在細(xì)胞微環(huán)境中(參見例如，Whittlesey and Shea(2004)ExperimentalNeurology 190, 1-16) 底物介導(dǎo)的遞送可以用來遞送非病毒和病毒載體。這種方法對(duì)于病毒載體特別優(yōu)選，因?yàn)槠淠M有多少這樣的載體與胞外基質(zhì)關(guān)聯(lián)來作為促進(jìn)細(xì)胞結(jié)合和內(nèi)化的方法。例如，植入腺病毒修飾的膠原凝膠可以導(dǎo)致轉(zhuǎn)導(dǎo)通過基質(zhì)，具有與直接注射相比不同的遞送曲線，因此定位基因遞送并避免遠(yuǎn)端副作用(參見例如，Levy et al. (2001)Gene Ther. 8, 659-667)。脂質(zhì)體可以用來促進(jìn)將包含CCN2/CTGF或纖維化抑制劑(例如，TGF0抑制劑、P38抑制劑或酪氨酸激酶抑制劑)的組合物或制劑遞送至靶部位。脂質(zhì)體的藥物攜帯能力和釋放速率可以取決于脂質(zhì)組成、大小、電荷、藥物/脂質(zhì)比例以及遞送方法。常規(guī)脂質(zhì)體由中性或陰離子脂質(zhì)(天然的或合成的)組成。常用的脂質(zhì)為卵磷脂如(磷脂酰膽堿)、磷脂酰こ醇胺(PE)、鞘磷脂、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰甘油(PG)以及磷脂酰肌醇(PI)。常用的包裹方法是將脂質(zhì)膜用生物分子溶液再水合，然后凍融并擠壓。形成生物分子脂質(zhì)體的其他技術(shù)包括前體脂質(zhì)體技術(shù)(參見例如，Galovic et al. (2002)Eur. J. Pharm. Sci. 15, 441-448)和交叉流動(dòng)注射技術(shù)(參見例如，Wagner et al. (2002) J. Liposome Res. 12,259-270)。脂質(zhì)體包裹效率可以通過本領(lǐng)域已知的各種方法監(jiān)測(cè)和優(yōu)化，包括差示掃描量熱法(參見例如，Lo et al. (199%) J. Pharm. Sci. 84，805-814)?？梢詫①x形劑加入遞送系統(tǒng)，以便在制備期間穩(wěn)定乳劑并在制備和/或釋放期間穩(wěn)定生長(zhǎng)因子。在包裹蛋白如CCN2/CTGF的情況下，加入諸如PEG、碳水化合物和緩沖鹽(例如，氫氧化鎂)的賦形劑可以預(yù)防聚集并穩(wěn)定折疊蛋白結(jié)構(gòu)。作為另ー實(shí)例，PLGA微球中包裹的蛋白生物分子在親水賦形劑甘露醇的存在下可以提高生物分子穩(wěn)定性。賦形劑還可以影響釋放速率。例如，生物分子溶液中的PVA可以穩(wěn)定初乳劑，提供更均勻地分布于整個(gè)基質(zhì)中，防止內(nèi)水相液滴的凝聚，并且降低初始突釋和整體釋放速率。微球的包衣可以用來改變體內(nèi)特性。例如，用DPPC包衣PLGA微球可以減少生物分子貨物吸收入巨噬細(xì)胞 。作為另ー實(shí)例，具有諸如殼聚糖和羥丙基纖維素的粘膜粘附聚合物的包衣顆?？梢栽黾虞d體的停留時(shí)間?？捎糜隗w內(nèi)遞送生長(zhǎng)因子制劑的液體組合物包含CCN2/CTGF與不溶于水的生物相容性聚合物的綴合物，所得的聚合物-活性物質(zhì)綴合物在生物相容性溶劑中溶解以形成液體聚合物系統(tǒng)。此外，所述液體聚合物系統(tǒng)還可以包括未綴合至CCN2/CTGF的不溶于水的生物相容性聚合物。在一實(shí)施方案中，可以將這些液體組合物以液體形式引入個(gè)體內(nèi)。然后所述液體組合物原位固化或凝結(jié)以形成控釋植入物，其中生長(zhǎng)因子綴合至固體基質(zhì)聚合物。在一實(shí)施方案，提供載體材料，但該載體材料內(nèi)沒有加入生長(zhǎng)因子制劑。在這個(gè)實(shí)施方案，在將載體材料植入個(gè)體前將生長(zhǎng)因子制劑引入該材料。在這種情況下，將物質(zhì)如CCN2/CTGF或纖維化抑制劑(例如，TGF^抑制劑、P38抑制劑或酪氨酸激酶抑制劑)放置在具有無菌入口的容器中，例如，具有通過皮下注射針可刺穿的塞子的靜脈輸注液袋或小瓶。在一實(shí)施方案中，物質(zhì)和制備的制劑可以作為水溶液或作為用于重建的凍干制劑儲(chǔ)存在不同容器中，例如，密封的安瓿或小瓶。作為凍干制劑的實(shí)例，向10-ml小瓶加入5ml無菌過濾的l%(w/v) CCN2/CTGF水溶液，并且將所得的混合物凍干。通過在給藥前將凍干劑重建于適當(dāng)?shù)娜芤褐衼碇苽淅w維發(fā)生物質(zhì)，在植入個(gè)體之前或同時(shí)與制備的CCN2/CTGF制劑混合，并且給予載體材料的表面或注入載體材料。施用可以通過例如將載體材料浸泡在CCN2/CTGF制劑中、將CCN2/CTGF制劑噴灑在載體材料的表面上或者任何其他施用方法來實(shí)現(xiàn)。如下文進(jìn)ー步描述的，本文所述的物質(zhì)還可以與其他治療方法聯(lián)用。因此，除了本文所述的治療劑，還可以向個(gè)體提供已知有效治療疾病、病癥或疾病狀況的其他治療劑。治療方法本發(fā)明的一方面提供ー種通過將本文所述的組合物給予有需要的個(gè)體來治療個(gè)體的創(chuàng)傷的方法。例如，可以通過將CCN2/CTGF組合物給予有需要的個(gè)體來治療創(chuàng)傷。作為另ー實(shí)例，可以通過將CCN2/CTGF誘導(dǎo)的a SMA-成纖維細(xì)胞給予有需要的個(gè)體來治療創(chuàng)傷。作為另ー實(shí)例，可以通過將CCN2/CTGF誘導(dǎo)的a SMA-成纖維細(xì)胞和CCN2/CTGF組合物給予有需要的個(gè)體來治療創(chuàng)傷。作為另ー實(shí)例，可以通過將間充質(zhì)祖細(xì)胞和CCN2/CTGF組合物給予有需要的個(gè)體來治療創(chuàng)傷。
CCN2/CTGF組合物，包括具有TGF β抑制劑、Ρ38抑制劑或酪氨酸激酶抑制劑的那些組合物，可以是上文所述的那些組合物。用于分化為成纖維細(xì)胞或給予個(gè)體的的間充質(zhì)祖細(xì)胞，或者兩者，可以是個(gè)體自體的(即，來自相同個(gè)體)、同種異體的(即，來自相同物種的遺傳上不相同的供體)、同基因的(即，來自遺傳上相同的供體)或異種的(即，來自不同物種)。例如，可以將間充質(zhì)祖細(xì)胞或由其衍生的a SMA-成纖維細(xì)胞給予分離所述間充質(zhì)祖細(xì)胞的相同個(gè)體。在一些實(shí)施方案中， 向個(gè)體給予治療有效量的CCN2/CTGF，以便促進(jìn)纖維發(fā)生。一些實(shí)施方案提供一種促進(jìn)創(chuàng)傷愈合的方法。一些實(shí)施方案提供ー種再生腱和韌帶的方法。一些實(shí)施方案提供ー種在正常愈合過程中減少瘢痕(例如，異常、瘢痕瘤和肥大性瘢痕)的方法。代表正常創(chuàng)傷愈合過程的纖維發(fā)生與代表異常瘢痕的纖維化之間存在重要區(qū)別。本文提供治療方法，相對(duì)于纖維化和異常瘢痕，所述治療方法有利于纖維發(fā)生和正常創(chuàng)傷愈合。如本文所示，成纖維細(xì)胞分化、纖維發(fā)生和纖維化是三個(gè)不同過程。間充質(zhì)衍生的成纖維細(xì)胞可以作為韌帶和腱損傷的修復(fù)細(xì)胞。這類損傷具有很少有效的常規(guī)治療(13，14)。雖然腱可以包含分化為典型的間充質(zhì)譜系(包括脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞)的多能干細(xì)胞/祖細(xì)胞(25)，但是當(dāng)用作組織修復(fù)的自體細(xì)胞來源時(shí)，這些祖細(xì)胞傾向于劃破正常的腱。相比之下，CCN2/CTGF刺激的MSC可以分化為與纖維化或過量瘢痕無關(guān)的α SM-成纖維細(xì)胞。間充質(zhì)衍生的成纖維細(xì)胞可以促進(jìn)腱和韌帶再生。本文所述的方法一般在有需要的個(gè)體上進(jìn)行。需要本文所述的治療方法的個(gè)體可以診斷為有創(chuàng)傷。確定需要治療通常通過與有問題的疾病或疾病狀況一致的歷史或體檢來評(píng)價(jià)?？赏ㄟ^本文所述的方法治療的各種疾病狀況的診斷在本領(lǐng)域技術(shù)內(nèi)。所述個(gè)體可以是動(dòng)物個(gè)體，優(yōu)選哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選馬、牛、狗、貓、羊、豬、小鼠、大鼠、猴、豚鼠和雞，并且最優(yōu)選人。可用本文所述的組合物和方法治療的創(chuàng)傷包括但不限于軟組織創(chuàng)傷。例如，軟組織創(chuàng)傷可以包括皮膚創(chuàng)傷、脂肪創(chuàng)傷、肌肉創(chuàng)傷、韌帶創(chuàng)傷、腱創(chuàng)傷、血管創(chuàng)傷、結(jié)締組織創(chuàng)傷、軟骨創(chuàng)傷或者上述創(chuàng)傷的ー些組合。在一些實(shí)施方案中，軟組織創(chuàng)傷包括皮膚創(chuàng)傷?？捎帽疚乃龅慕M合物和方法治療的創(chuàng)傷包括但不限于慢性組織創(chuàng)傷或急性組織創(chuàng)傷。例如，慢性組織創(chuàng)傷包括慢性軟組織創(chuàng)傷。作為另ー實(shí)例，急性組織創(chuàng)傷包括急性軟組織創(chuàng)傷?？捎帽疚乃龅慕M合物和方法治療的創(chuàng)傷包括但不限于開放性創(chuàng)傷或閉合性創(chuàng)傷。在一些實(shí)施方案中，組織創(chuàng)傷包括開放性組織創(chuàng)傷。例如，開放性組織創(chuàng)傷可以包括開放性創(chuàng)傷，所述開放性創(chuàng)傷包括皮膚、韌帶或腱損傷，或者上述創(chuàng)傷的ー些組合。用本文所述的組合物或方法治療之前、期間或之后，開放性創(chuàng)傷可以是部分、基本上或完全閉合的。創(chuàng)傷閉合方法可以是任何常規(guī)技術(shù)，例如免縫膠帶、氰基丙烯酸酯膠、釘或縫線。如本文進(jìn)一步描述的，本文所述的組合物可以包衣、布滿或吸收入這類常規(guī)創(chuàng)傷治療裝置或在其上。可用本文所述的組合物和方法治療的創(chuàng)傷包括但不限于切割創(chuàng)傷、撕裂創(chuàng)傷(例如，分裂裂傷、過度拉伸、磨壓、割裂或撕裂)、擦傷創(chuàng)傷、穿刺創(chuàng)傷、穿透創(chuàng)傷或槍彈創(chuàng)傷。本文所述的組合物或方法可以在常規(guī)創(chuàng)傷治療方法之前、期間或之后使用。本文所述的組合物或制劑的有效量一般是這樣的量，其可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞分化；促進(jìn)纖維發(fā)生；抑制肌成纖維細(xì)胞分化；抑制纖維化；擴(kuò)大或加速愈合；或者減少瘢痕。根據(jù)本文所述的方法，給藥可以是腸胃外、肺部、ロ服、局部、皮內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹腔內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)、硬膜外、眼部、ロ腔或直腸給藥。當(dāng)用于本文所述的治療時(shí)，治療有效量的包含CCN2/CTGF (和任選存在的TGF3抑制劑)的組合物可以純的形式使用，或者當(dāng)這樣的形式存在時(shí)，以藥學(xué)可接受的鹽形式使用，并且有或無藥學(xué)可接受的賦形劑。例如，本發(fā)明的化合物可以適用于任何醫(yī)學(xué)治療的合理的益處/風(fēng)險(xiǎn)比例足量給藥以増加成纖維細(xì)胞的分化，増加纖維發(fā)生或減少纖維化?？梢耘c藥學(xué)可接受的載體組合以制備單ー劑型的本文所述的組合物的量會(huì)根據(jù)治療的宿主和具體給藥模式變化。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解每種劑型的單個(gè)劑量中所含的物質(zhì)的單位含量本身不必構(gòu)成治療有效量，因?yàn)楸匦璧闹委熡行Я靠梢酝ㄟ^給予許多單個(gè)劑 量來達(dá)到。本文所述的組合物的毒性和療效可以通過用于測(cè)定LD5tl (對(duì)50%的群體致死的劑量)和ED5。(在50%的群體中治療有效的劑量)的細(xì)胞培養(yǎng)或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物中的標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)方法來確定。毒性與療效之間的劑量比例是可以表示為比例LD5tZED5tl的治療指數(shù)，其中優(yōu)選大的治療指數(shù)。任何特定個(gè)體的具體治療有效水平取決于各種因素，包括治療的病癥和該病癥的嚴(yán)重程度；所采用的具體化合物的活性；所采用的具體化合物；患者的年齡、體重、整體健康、性別和飲食；給藥時(shí)間；給藥途徑；所采用的組合物的排泄速率；治療的持續(xù)時(shí)間；與所采用的具體化合物聯(lián)用或同時(shí)使用的藥物；以及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域公知的類似因素(參見例如，Koda-Kimble et al. (2004) AppliedTherapeutics:The Clinical Use of Drugs,Lippincott Williams & Wilkins, ISBN0781748453;Winter(2003)Basic Clinical Pharmacokinetics, 4th ed. , LippincottWilliams & Wilkins, ISBN 0781741475;Sharqel(2004)Applied Biopharmaceutics &Pharmacokinetics, McGraw-Hi11/Appleton & Lange, ISBN 0071375503)。例如，本領(lǐng)域技術(shù)公知以低于實(shí)現(xiàn)期望的療效所需的劑量的水平開始組合物的劑量，并且逐漸增加劑量直至實(shí)現(xiàn)期望的效果。如果期望，為了給藥的目的，可以將有效的每日劑量分為多個(gè)劑量。因此，單劑量組合物可以包含這樣的量或其部分以組成每日劑量。然而，應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的化合物和組合物的每日總使用由主治醫(yī)師在健全的醫(yī)學(xué)判斷的范圍內(nèi)決定。給予包含CCN2/CTGF(和任選存在的TGF0抑制劑)的組合物可以作為單一事件或隨治療的時(shí)間過程發(fā)生。例如，包含CCN2/CTGF (和任選存在的TGF0抑制劑)的組合物可以每天、每周、每?jī)芍芑驓霸陆o藥。為了治療急性疾病狀況，治療的時(shí)間過程通常為至少幾天。某些疾病狀況可以將治療從幾天延長(zhǎng)至幾周。例如，治療可以延長(zhǎng)一周、兩周或三周。對(duì)于更慢性的疾病狀況，治療可以從幾周延長(zhǎng)至幾個(gè)月或者甚至一年或更長(zhǎng)。CCN2/CTGF可以與TGF0的抑制劑、P38抑制劑或酪氨酸激酶抑制劑同時(shí)給藥。例如，CCN2/CTGF可以與TGF0的抑制劑同時(shí)給藥。同時(shí)給藥可以通過給予不同組合物來進(jìn)行，每種組合物包含CCN2/CTGF、TGFii的抑制劑、P38抑制劑和酪氨酸激酶抑制劑中的ー種或多種。同時(shí)給藥可以通過給予ー種組合物來進(jìn)行，所述組合物包含CCN2/CTGF、TGFii的抑制劑、P38抑制劑和酪氨酸激酶抑制劑中的兩種或更多種。CCN2/CTGF可以與TGF0的抑制劑、P38抑制劑或酪氨酸激酶抑制劑順序給藥。例如，CCN2/CTGF可以在給予TGF β抑制劑之前或之后給藥。根據(jù)本文所述方法的治療可以在常規(guī)創(chuàng)傷治療方法之前、同時(shí)或之后進(jìn)行。給藥本文所述的組合物可以本領(lǐng)域已知的各種方法給藥。所述組合物可以作為外源性物質(zhì)或作為內(nèi)源性物質(zhì)在治療上使用。外源性物質(zhì)是在體外制備或制造并給予身體的物質(zhì)。內(nèi)源性物質(zhì)是通過ー些類型的裝置(生物的或其他)在體內(nèi)制備或制造的物質(zhì)，所述裝置用于在體內(nèi)遞送或遞送至身體中的其他器官。如上文所討論的，給藥可以是腸胃タト、肺部、ロ服、局部、皮內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹腔內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)、硬膜外、眼部、ロ腔或直腸給藥。包含本文所述的物質(zhì)的組合物可以本領(lǐng)域公知的各種方法給藥。給藥可以包括這樣的方法，例如，包括ロ服攝入、直接注射(例如，全身或立體定向)、植入工程化以分泌所 關(guān)注的因子的細(xì)胞、釋放藥物的生物材料、聚合物基質(zhì)、凝膠、可滲透膜、滲透系統(tǒng)、多層包衣、微粒、可植入的基質(zhì)裝置、微量滲透泵、可植入泵、可注射的凝膠和水凝膠、脂質(zhì)體、微團(tuán)(例如，達(dá)30 μ m)、納米球(例如，少于I μ m)、微球(例如，1-100 μ m)、貯器裝置，上述任何方法的組合，或者其他合適的遞送媒介物，以便提供期望的變化比例的釋放曲線。物質(zhì)的控釋遞送的其他方法是技術(shù)人員已知的，并且在本發(fā)明的范圍內(nèi)。遞送系統(tǒng)可以包括，例如，可以用來以與將胰島素或化學(xué)療法遞送至特定器官或腫瘤相似的方式給予物質(zhì)的輸液泵。通常，利用這樣的系統(tǒng)，物質(zhì)與在所選的部位于控制的時(shí)間中釋放物質(zhì)的生物可降解的生物相容性聚合植入物聯(lián)合給藥。聚合材料的實(shí)例包括聚酐、聚原酸酷、聚こ醇酸、聚乳酸、聚こ烯醋酸こ烯酯以及它們的共聚物和組合。此外，可以將控釋系統(tǒng)放置在接近治療靶標(biāo)，因此僅需要全身劑量的一部分。如上文更詳細(xì)討論的，可以將物質(zhì)包裹在各種載體遞送系統(tǒng)中并在各種載體遞送系統(tǒng)中給藥。載體遞送系統(tǒng)的實(shí)例包括微球、水凝膠、聚合植入物、智能聚合載體和脂質(zhì)體(一般參見，Uchegbu and Schatzlein, eds. (2006)Polymers in Drug Delivery, CRC, ISBN-10:0849325331)。用于生物分子物質(zhì)遞送的基于載體的系統(tǒng)可以提供細(xì)胞內(nèi)遞送；調(diào)整生物分子/物質(zhì)釋放速率；提高到達(dá)其作用部位的生物分子的比例；增進(jìn)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)至其作用部位；允許與其他物質(zhì)或賦形劑共定位沉積；提高所述物質(zhì)的體內(nèi)穩(wěn)定性；通過降低清除率來延長(zhǎng)所述物質(zhì)在其作用部位的停留時(shí)間；減少所述物質(zhì)非特異性遞送至非靶組織；減少所述物質(zhì)引起的刺激；降低由于所述物質(zhì)的高初始劑量的毒性；改變所述物質(zhì)的免疫原性；降低劑量給藥頻率，改善產(chǎn)物的味道；或者延長(zhǎng)產(chǎn)物的保質(zhì)期。裝置和系統(tǒng)在一些實(shí)施方案中，本文所述的組合物可以包衣、布滿或吸收入常規(guī)創(chuàng)傷治療裝置或在其上，例如帷簾、繃帶、敷料、膠帶、粘結(jié)層、夾板、止血粉、免縫膠帶、氰基丙烯酸酯膠、釘、縫線?？梢赃x擇其中或其上可以包含本文所述的組合物的材料以優(yōu)化本領(lǐng)域已知的因素，例如止血、吸收滲出液、緩解疼痛、清創(chuàng)、控制含水量、控制局部藥物的吸收速率、保持pH、保持溫度、預(yù)防感染、指示升高的生物負(fù)荷水平或者促進(jìn)愈合。如組織部位期望或必需的，其中或其上可以包含本文所述的組合物的材料可以是可滲透的或不可滲透的。其中或其上可以包含本文所述的組合物的材料可以是膜、凝膠、泡沫、糊劑、顆粒劑或珠。其中或其上可以包含本文所述的組合物的材料可以為片形式。其中或其上可以包含本文所述的組合物的材料可以為適合通過本領(lǐng)域已知的其他方法傾倒或分配的流動(dòng)形式。其中或其上可以包含本文所述的組合物的材料可以為可噴灑形式。本文所述的組合物可以包含在材料中或其上，所述材料包括，例如，聚氨基甲酸酷、聚醚、聚酷、聚烯烴、聚烯烴燒結(jié)聚合物、基于硅氧烷的化合物、丙烯酸、藻酸鹽、水膠體、水凝膠、水凝膠成型材料、多糖、天然織物、合成織物、聚氯こ烯、聚酰胺、聚こニ醇-聚ニ甲基ニ氯散共聚物(polyethyl eneglycol-poIydimethyI diloxan co-polymer)、聚憐臆、纖維素聚合物、殼聚糖、PVdF, EVA燒結(jié)聚合物、PTFE、熱塑性弾性體(TPE)，或者它們的組合，如聚合組合、分層組合或兩者。例如，帷簾125可以包含EVA燒結(jié)聚合物。可商購(gòu)的示例性材料包括但不限于 Tyvek(PE), Avery Dennison Med 5625 ；3M Ioban2 ；3M Steri-Drape 125
2；Nitto Denko Yu-Kiban Perme ；3M Tegaderm ；First Water Hydroskin；Opsite ；Exopack(聚氨基甲酸酯膜和膠粘劑)；Bayer (聚氨基甲酸酯膜)；以及DuPont (醚酯膜)。
使用包含本文所述的組合物的這類裝置或系統(tǒng)可以容易地適應(yīng)本文所述的方法。試劑盒本發(fā)明還提供試劑盒。這類試劑盒可以包含本發(fā)明的組合物，并且在某些實(shí)施方案包含給藥說明書。這類試劑盒可以提高本文所述的方法的性能。當(dāng)作為試劑盒供應(yīng)吋，所述組合物的不同組分可以包裝在不同容器中，并且在使用前立即混合。組分包括但不限于包含CCN2/CTGF和TGF β抑制劑的組合物；以及本文所述的系統(tǒng)和裝置。如果期望，這樣単獨(dú)包裝的組分可以存在于包裝或分配器裝置中，其可以包含ー個(gè)或多個(gè)單位劑型，所述單位劑型包含所述組合物。例如，所述包裝可以包含金屬或塑料薄膜，如透明包裝。在某些情況下，這樣單獨(dú)包裝的組分允許長(zhǎng)期儲(chǔ)存，不會(huì)失去組分的活性。試劑盒還可以包含不同容器中的試劑，例如，待加入?yún)g獨(dú)包裝的凍干活性組分的無菌水或鹽水。例如，密封的玻璃安瓿可以包含凍干組分，并且在不同安瓿中包含無菌水、無菌鹽水，或者上述組分可以是無菌的，各自在中性非反應(yīng)氣體如氮?dú)庀掳b。安瓿可以由任何合適的材料組成，例如玻璃，有機(jī)聚合物如聚碳酸酷、聚苯こ烯，陶瓷，金屬或通常用來盛放試劑的任何其他材料。合適的容器的其他實(shí)例包括可以從與安瓿相似的物質(zhì)制備的瓶，或者可以由薄膜內(nèi)襯的內(nèi)部如鋁或合金組成的封套。其他容器包括試管、小瓶、燒瓶、瓶、注射器等。容器可以具有無菌接入端ロ，例如具有可以通過皮下注射針刺穿的塞子的瓶。其他容器可以具有通過可容易地去除的膜分隔的兩個(gè)室，當(dāng)去除所述膜時(shí)允許組分混合?？扇コ哪た梢允遣Ａ?、塑料、橡膠等。在某些實(shí)施方案中，試劑盒可以與指導(dǎo)材料一起提供。說明書可以印在紙或其他底板上，和/或可以作為電子可讀介質(zhì)提供，例如軟盤、迷你-CD_R0M、CD-R0M、DVD-R0M、Zip盤、錄像帯、錄音帶等。詳細(xì)說明可以不與試劑盒物理相關(guān)；取而代之，使用者可以被指引至試劑盒的制造商或經(jīng)銷商指定的互聯(lián)網(wǎng)網(wǎng)站。分子工程具有上文要求的相同性百分比并保留表達(dá)的蛋白的所需活性的變體核苷酸以及它們編碼的多肽的設(shè)計(jì)、制備和測(cè)試在本領(lǐng)域技術(shù)內(nèi)。例如，定向進(jìn)化和突變體的快速分離可以根據(jù)參考文獻(xiàn)所述的方法，所述參考文獻(xiàn)包括但不限于Link et al. (2007)Nature Reviews 5 (9)，680-688;Sanger et al. (1991)Gene 97 (I)，119-123;Ghadessy etal. (2001)Proc Natl Acad Sci USA98 (8)4552-4557。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以制備大量與本文所述的參考序列具有例如至少95-99%相同性的核苷酸和/或多肽變體，并且根據(jù)本領(lǐng)域的常規(guī)方法篩選期望的表型。通常，可以在任何位置進(jìn)行保守取代，只要保留所需的活性。核苷酸和/或氨基酸序列相同性百分比(%)理解為在比對(duì)兩個(gè)序列時(shí)，和與參考序列比較的候選序列中的核苷酸或氨基酸殘基相同的核苷酸或氨基酸殘基的百分比。為了確定百分比相同性，比對(duì)序列，并且如果必需，引入缺ロ以實(shí)現(xiàn)最大百分比序列相同性。確定百分比相同性的序列比對(duì)方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。通?？晒_獲得的計(jì)算機(jī)軟件如BLAST、BLAST2、ALIGN2或Megalign(DNASTAR)軟件用來比對(duì)序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定用于測(cè)量比對(duì)的適當(dāng)參數(shù)，包括在比較的全長(zhǎng)序列中實(shí)現(xiàn)最大比對(duì)所需的任何算法。當(dāng)比對(duì)序列時(shí)，給定序列A比、與或?qū)o定序列B的百分比序列相同性(其可以可選地表述為比、與或?qū)o定序列B具有或包含某百分比序列相同性的給定序列A)可以計(jì)算為百分比序列相同性=X/Y100，其中X是通過A和B的序列比對(duì)程序或算法的比對(duì)評(píng)分為相同匹配的殘基的數(shù)目，而Y是B中的殘基的總數(shù)目。如果序列A的長(zhǎng)度不等于序列B的長(zhǎng)度，那么A與B的百分比序列相同性并不等干B與A的百分比序列相同性。 “高度嚴(yán)格的雜交條件”定義為在65° C下于6Χ SSC緩沖液(即，O. 9Μ氯化鈉和0.09Μ檸檬酸鈉)中雜交?？紤]到這些條件，通過計(jì)算兩個(gè)序列之間的DNA雙鏈體的解鏈溫度(Tm)可以確定一組給定序列是否會(huì)雜交。如果特定雙鏈體在6Χ SSC的鹽條件下具有低于65° C的解鏈溫度，那么這兩個(gè)序列不會(huì)雜交。另ー方面，如果在相同鹽條件下解鏈溫度高于65° C，那么所述序列會(huì)雜交。一般來說，任何雜交的DNA:DNA序列的解鏈溫度可以利用以下式來確定Tm=81.5°〇+16.6(1呢1(|[似+])+0.41(分?jǐn)?shù)6/(含量)-0.63(%甲酰胺)-(600/1)。此外，核苷酸相同性每減少1%, DNA:DNA雜交物的Tm降低1-1. 5。C (參見例如，Sambrook and Russel, 2006)?？梢岳帽绢I(lǐng)域已知的各種標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞(參見，例如，Sambrookand Russel(2006)Condensed Protocols from Molecular Cloning:A LaboratoryManual, Cold Spring Harbor Laboratory Press,ISBN-10:0879697717;Ausubel etal. (2002)Short Protocols in Molecular Biology, 5th ed. , Current Protocols, ISBN-I0:0471250929;Sambrook and Russel (2001)Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 3ded. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN-10:0879695773;Elhai, J. and ffolk, C.P. 1988. Methods in Enzymology 167，747-754)。這類技術(shù)包括但不限于病毒感染、磷酸 丐轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、微粒介導(dǎo)的遞送、受體介導(dǎo)的吸收、細(xì)胞融合、電穿孔等。可以將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞加以選擇并增殖以提供包含穩(wěn)定整合在宿主細(xì)胞基因組中的表達(dá)載體的重組宿主細(xì)胞。根據(jù)本文所述的方法開發(fā)的宿主株可以通過本領(lǐng)域已知的許多方法評(píng)價(jià)(參見例如，Studier (2005) Protein Expr Purif. 41 (I), 207-234; Gellissen, ed. (2005) Productionof Recombinant Proteins:Novel Microbia丄 and Eukaryotic Expression Systems, ftiley-VCH, ISBN-10:3527310363;Baneyx(2004)Protein Expression Technologies, Taylor &Francis, ISBN-10:0954523253)。下調(diào)或沉默基因的方法是本領(lǐng)域已知的。例如，TGFi3表達(dá)的蛋白活性可以利用反義寡核苷酸、蛋白適配體、核苷酸適配體和RNA干擾(RNAi)(例如，小干擾RNA(SiRNA)、短發(fā)夾RNA(shRNA)和微小RNA(miRNA))來下調(diào)或消除(參見例如,Fanning and Symonds (2006)Handb Exp Pharmacol. 173，289-303G，描述錘頭狀核酶和小發(fā)夾 RNA ；Helene, C.，etal. (1992) Ann. N. Y. Acad. Sci. 660, 27-36 ; Maher (1992) Bioassays 14 (12) : 807-15，描述革巴向脫氧核糖核苷酸序列；Lee et al. (2006) Curr Opin Chem Biol. 10，1-8,描述適配體！Reynolds et al. (2004)Nature Biotechnology 22 (3), 326-330,描述 RNAi ；Pushparaj and Melendez(2006) Clinical and ExperimentalPharmacology andPhysiology 33(5-6), 504-510,描述 RNAi ;Dillon et al. (2005)Annual Review ofPhysiology 67，147-173,描述 RNAi ;Dykxhoorn and Lieberman (2005) Annual Review ofMedicine 56，401-423,描述 RNAi)。RNAi 分子可商購(gòu)自各種來源(例如,Ambion, TX; SigmaAldrich, MO; Invitrogen)。利用各種算法的幾種siRNA分子設(shè)計(jì)程序是本領(lǐng)域已知的(參見例如，Cenix 算法，Ambion;BL0CK-iT RNAi Designer, Invitrogen; siRNA WhiteheadInstitute Design Tools, Bioinofrmatics & Research Computing)。在石角定最佳 siRNAノ予 列中影響的性狀包括siRNA末端的G/C含量、siRNA的具體內(nèi)部結(jié)構(gòu)域的Tm、siRNA長(zhǎng)度、靶序列在CDS(編碼區(qū))內(nèi)的位置以及3’突出端的核苷酸含量。在一些實(shí)施方案中，用來描述和要求保護(hù)本發(fā)明的某些實(shí)施方案的表不成分的量、特性(如分子量、反應(yīng)條件等)的數(shù)字理解為在某些情況下通過術(shù)語“約”修飾。因此，在一些實(shí)施方案中，書面說明和所附權(quán)利要求中所示的數(shù)值參數(shù)為近似值，其可以根據(jù)具體實(shí)施方案意圖獲得的期望特性變化。在一些實(shí)施方案中，數(shù)值參數(shù)應(yīng)當(dāng)根據(jù)報(bào)道的有效數(shù)字的數(shù)目并通過應(yīng)用普通舍入技術(shù)來理解。盡管示出本發(fā)明的一些實(shí)施方案的廣泛范圍的數(shù)值范圍和參數(shù)為近似值，但是具體實(shí)例中所示的數(shù)值報(bào)道為盡可行地精確。本發(fā)明的一些實(shí)施方案中示出的數(shù)值可以包含由它們各自的測(cè)試測(cè)量中發(fā)現(xiàn)的標(biāo)準(zhǔn)差必然導(dǎo)致的某些誤差。在一些實(shí)施方案中，在描述本發(fā)明的具體實(shí)施方案的上下文中(特別是在下文權(quán)利要求的某些的上下文中)使用的術(shù)語“ー個(gè)(a)”和“ー個(gè)(an)”和“這個(gè)”和相似引用可以理解為包括単數(shù)和復(fù)數(shù)。本文中值的范圍的表述僅為了用作單獨(dú)提到落在所述范圍內(nèi)的每個(gè)不同值的速記方法。除非本文另有說明，每個(gè)單獨(dú)的值如其在本文中單獨(dú)陳述地加入本說明書。除非本文另有說明或其他地方顯然違背上下文，本文所述的所有方法可以任何合適的順序進(jìn)行。關(guān)于本文的某些實(shí)施方案提供的任何和所有實(shí)例或者示例性語言(例如“如”)的使用僅為了更好地說明本發(fā)明，并不對(duì)其他地方要求保護(hù)的本發(fā)明的范圍構(gòu)成限制。本說明書中沒有語言應(yīng)當(dāng)理解為說明對(duì)于本發(fā)明的實(shí)施必要的任何未要求保護(hù)的元素。本文所公開的發(fā)明的可選元素或?qū)嵤┓桨傅姆纸M不應(yīng)當(dāng)理解為限制。每個(gè)組成員可以單獨(dú)或者與該組的其他成員或本文發(fā)現(xiàn)的其他元素聯(lián)合提及并要求保護(hù)。為了方便或?qū)＠栽颍M的ー個(gè)或多個(gè)成員可以包含在組中或從組中刪除。當(dāng)任何這樣的包含或刪除發(fā)生時(shí)，在本文中本說明書被視為包含修改的組，因此滿足所附權(quán)利要求中所用的所有Markush組的書面說明。為了所有目的，本說明書中引用的所有出版物、專利、專利申請(qǐng)和其他參考文獻(xiàn)整體援引加入本文，與具體并單獨(dú)地表明每個(gè)單獨(dú)的出版物、專利、專利申請(qǐng)或其他參考文獻(xiàn)為了所有目的整體援引加入本文相同。在本文中引用參考文獻(xiàn)不應(yīng)當(dāng)理解為承認(rèn)對(duì)于本發(fā)明這是現(xiàn)有技木。本發(fā)明已詳細(xì)描述，很明顯修改、變化和等同的實(shí)施方案是可能的，不會(huì)背離所附權(quán)利要求中限定的本發(fā)明的范圍。此外，應(yīng)當(dāng)理解本公開中的所有實(shí)例提供為非限制性實(shí)例。
實(shí)施例提供以下非限制性實(shí)施例以進(jìn)ー步說明本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解下文實(shí)施例中公開的技術(shù)代表發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在本發(fā)明的實(shí)施中運(yùn)作良好的方法，并且因此可以認(rèn)為構(gòu)成其實(shí)施模式的實(shí)例。然而，鑒于本公開，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解在公開的具體實(shí)施方案中可以進(jìn)行許多變化，并且仍獲得類似或相似的結(jié)果，不會(huì)背離本發(fā)明的精神和范圍。實(shí)施例I :細(xì)胞分離和擴(kuò)增
人間充質(zhì)干細(xì)胞(hMSC)分離自兩個(gè)匿名成年捐贈(zèng)者(年齡范圍20-25歲)的新鮮全骨髓樣品(AllCells，Berkeley, CA)。根據(jù)我們以前的方法(30)通過密度梯度(Ficoll-Paque)離心并按照制造商的方案(RosetteSep, StemCellTechnologies, Vancouver, Canada)利用負(fù)選擇來分離單核和貼壁細(xì)胞以去除造血細(xì)胞和其他分化的細(xì)胞。簡(jiǎn)單地說，將骨髓轉(zhuǎn)移至50mL管，然后加入750mL的RosetteSep并溫育20min。然后向PBS中加入15mL的2%胎牛血清(FBS)和ImMこニ胺四こ酸(EDTA)至 30mL的總體積。將樣品分層放置在15mLFicoll-Paque上，并且在3000Xg下離心25min。將整層富集的細(xì)胞從Ficoll-Paque界面移出。將混合物在IOOOrpm下離心lOmin。將收集的細(xì)胞利用臺(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù)，以0. 5-1 X IO6個(gè)細(xì)胞/IOOmm皿平板接種并允許貼壁約5天，然后每?jī)商於ㄆ诟鼡Q培養(yǎng)基。在80-90%匯合時(shí)，將細(xì)胞胰蛋白酶消化、離心、重懸于生長(zhǎng)培養(yǎng)基 中作為第I代(Pl)細(xì)胞，并且在5%C02和37° C下培養(yǎng)，每3-4天更換新鮮培養(yǎng)基。生長(zhǎng)培養(yǎng)基定義為達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基-低葡萄糖(DMEM-LG; Sigma，St. Louis, MO)、1%抗生素(IX抗生素-抗真菌劑，包括10單位/L青霉素G鈉、10mg/mL硫酸鏈霉素和0. 25 μ g/mL 兩性霉素 B) (Gibco, Invitrogen, Carlsbad, CA)和 10% 胎牛血清(FBS; AtlantaBiologicals, Norcross, GA)。為了分離顱骨間充質(zhì)細(xì)胞，利用手術(shù)剪小心地從p7大鼠顱蓋解剖除顱蓋骨之外的后額間縫。在解剖顯微鏡下去除上層的骨膜和下層的硬膜。利用2mg/mL膠原酶將分離的縫間充質(zhì)在37° C下裂解Ihr,并且用組織滲濾器(Fisher,Pittsburgh, PA)過濾。離心之后，將收集的細(xì)胞利用臺(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù)，以20，000-30, 000個(gè)細(xì)胞/6-孔板平板接種，并且允許貼壁約5天，然后每2-3天更換培養(yǎng)基直至匯合。如下文所述，將Pl或P2顱骨細(xì)胞誘導(dǎo)成骨、成軟骨、成脂和成纖維細(xì)胞分化4wk。實(shí)施例2 :用結(jié)締組織生長(zhǎng)因子處理以下實(shí)施例描述選擇用于成纖維細(xì)胞分化的CCN2/CTGF濃度的選擇。除非另有說明，方法按照實(shí)施例I。將P3或P4hMSC在12-孔板中單層培養(yǎng)-擴(kuò)增( 5，000個(gè)細(xì)胞/孔)。在80-90%匯合時(shí)，將hMSC用O、10、50或100ng/mL重組人結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF) (BioVendor,Candler, NC)以及50 μ g/mL抗壞血酸(Sigma)培養(yǎng)-補(bǔ)充,姆三天更換條件培養(yǎng)基。4wk后，如通過Goldner三色染色所示，膠原沉積隨lO-lOOng/mL的CCN2/CTGF漸增劑量而增加(參見例如，圖1E)。因此，選擇100ng/mL CCN2/CTGF用于體外實(shí)驗(yàn)的成纖維細(xì)胞分化。實(shí)施例3 :膠原沉積、ELISA和RT-PCR在這個(gè)實(shí)施例中，測(cè)定膠原沉積。除非另有說明，方法按照實(shí)施例1-2。CCN2/CTGF 處理后 2-4 周，利用商業(yè)試劑盒(Chondrex, Redmond, WA 和IBL-America, Minneapolis, MN)通過 ELISA 測(cè)定 I 型膠原和生腱蛋白-C(Tn-C)。利用 O. 5Mこ酸裂解I型膠原基質(zhì)。利用三色染色使膠原沉積可見。利用Trizol從CCN2/CTGF處理的hMSC分離總RNA。用Trizol裂解后，將樣品在RT下溫育5min。加入總計(jì)O. 2mL氯仿/mLTrizol,然后混合并溫育3min。在12，000X g和4° C下離心15min后,將上層相轉(zhuǎn)移至加入500 μ L異丙醇的新管。溫育IOmin并在12，000 Xg下再離心IOmin后，棄去上清。將沉淀用ImL的75%こ醇洗滌并干燥5-10min。將RNA樣品洗脫在50 μ L的DEPC-水中，在260 和280nm下評(píng)價(jià)濃度和純度，并且在反轉(zhuǎn)錄之前儲(chǔ)存在-80° C下。利用試劑盒(AppliedBiosystems，F(xiàn)oster City, CA)將所有RNA樣品反轉(zhuǎn)錄。為了 mRNA定量，利用7300實(shí)時(shí)PCR 系統(tǒng)「aqMan 基因表達(dá)測(cè)定(Applied Biosystems, Foster City, CA)進(jìn)行 cDNA 樣品的實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)。使用可商購(gòu)的人I和III型膠原、Tn-C、纖連蛋白(FN)、基質(zhì)金屬肽酶-I (MMP-I)、成纖維細(xì)胞特異性蛋白I (FS Pl)和波形蛋白的引物和探針(49，50)。選擇II型膠原(Col-II)和骨鈣蛋白(OC)分別作為成軟骨和成骨分化標(biāo)記。選擇⑶29、⑶44、CD105、CD106、CD117、BMPR 和 seal 作為 MSC 標(biāo)記(30,31)。GAPDH 用作持家基因。實(shí)施例4 :成骨和成軟骨分化在這個(gè)實(shí)施例中，進(jìn)行負(fù)選擇實(shí)驗(yàn)以確定CCN2/CTGF處理的細(xì)胞是否為成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞。除非另有說明，方法按照實(shí)施例1-3。根據(jù)我們以前的方法(31，51)，成軟骨培養(yǎng)基補(bǔ)充了 10ng/mL轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β 3 (TGF β 3) (R&D Systems, Minneapolis, MN)，而成骨培養(yǎng)基補(bǔ)充了 IOOnM 地塞米松、IOmM的β -磷酸甘油和0. 05mM的2-磷酸抗壞血酸酯(Sigma)。在第14天和第28天，進(jìn)行馮庫(kù)薩染色和鈣測(cè)定以評(píng)價(jià)成骨分化，而進(jìn)行番紅O (Saf-O)染色和糖胺聚糖(GAG)測(cè)定以評(píng)價(jià)成軟骨分化(Blyscan , Biocolor, UK)。實(shí)施例5 hMSC的克隆在這個(gè)實(shí)施例中，通過有限稀釋建立幾個(gè)MSC克隆。除非另有說明，方法按照實(shí)施例 1-4。簡(jiǎn)單地說，將PO hMSC以I個(gè)細(xì)胞/200 μ L的濃度懸浮并接種在具有200 μ L培養(yǎng)基/孔的96-孔板中。24hr后，將僅有一個(gè)細(xì)胞的孔標(biāo)記，并且在37° C和5%C02下保持培養(yǎng)，每周兩次更換培養(yǎng)基。3-4wk后，將單細(xì)胞衍生的克隆用0. 25%胰蛋白酶-EDTA處理并接種至24-孔板用于進(jìn)一歩擴(kuò)增。當(dāng)10%匯合時(shí)將克隆子代轉(zhuǎn)移至6-孔板并保持，每3-4天更換培養(yǎng)基。實(shí)施例6 =MSC衍生的成纖維細(xì)胞的進(jìn)ー步分化在這個(gè)實(shí)施例中，使MSC衍生的成纖維細(xì)胞進(jìn)行成骨、成軟骨和成脂分化。除非另有說明，方法按照實(shí)施例1-5。如上文所述制備成骨和成軟骨培養(yǎng)基。根據(jù)我們以前的方法(31，52，53)，成脂培養(yǎng)基包含0. 5mM地塞米松、0. 5mM異丁基甲基黃嘌呤和50mM吲哚美辛。在4wk中，進(jìn)行茜素紅、Saf-O和油紅O染色。實(shí)施例7 =MSC衍生的成纖維細(xì)胞的肌成纖維細(xì)胞分化這個(gè)實(shí)施例描述MSC衍生的成纖維細(xì)胞的肌成纖維細(xì)胞分化。除非另有說明，方法按照實(shí)施例1-6。使MSC衍生的成纖維細(xì)胞接受5ng/mL重組人TGFM(R&DSystems, Minneapolis, MN) 7天。將未分化的hMSC用TGFP I處理作為對(duì)照。a SMA(Abeam, Cambridge, MA)的表達(dá)用羅丹明-鬼筆環(huán)妝(Invitrogen, Carlsbad, CA)通過免疫熒光來評(píng)價(jià)。a SMA+細(xì)胞的數(shù)量通過流式細(xì)胞術(shù)來定量。簡(jiǎn)單地說，將細(xì)胞胰蛋白酶消化、計(jì)數(shù)、重懸于I X 106個(gè)細(xì)胞/管并固定在O. 01%甲醒中。在O. l%triton中洗漆之后，將細(xì)胞與a SMA—抗(Abeam, Cambridge, MA)溫育30min。在400g下離心5min之后，將細(xì)胞與突光染料標(biāo)記的ニ抗(Abeam, Cambridge, MA) 避光溫育30min，并且重懸于補(bǔ)充了 3%BSA和1%疊氮化鈉的PBS中。然后利用多功能細(xì)胞分選儀(FACSAria II;BD Biosciences, San Jose, CA)分析樣品。實(shí)施例8 :膠原凝膠收縮測(cè)定這個(gè)實(shí)施例描述膠原凝膠收縮測(cè)定。除非另有說明，方法按照實(shí)施例1-7。將中和的I 型膠原(2mg/mL) (R&D Systems, Minneapolis, MN)與 I X 106/ml, MSC>MSC-Fb或a SMA+細(xì)胞完全混合。將包含細(xì)胞的膠原溶液放入24-孔板中在37° C下保持Ihr以誘導(dǎo)凝膠化。48-hr溫育時(shí)，包含細(xì)胞的膠原晶格物理脫落并允許在培養(yǎng)基中自由漂浮。直至測(cè)試的7天，在數(shù)字圖像上測(cè)量包含細(xì)胞的膠原晶格的直徑。實(shí)施例9 :通過CCN2/CTGF離體調(diào)節(jié)顱骨形態(tài)發(fā)生這個(gè)實(shí)施例描述通過CCN2/CTGF離體調(diào)節(jié)顱骨形態(tài)發(fā)生。除非另有說明，方法按照實(shí)施例1-8。從plO 雄性 Sprague-Dawley 大鼠(Harlan, Indianapolis, IN)收獲具有完整硬膜的顱骨外植體，其包括具有中間額間縫、冠狀縫和矢狀縫的額骨和頂骨。將分離的顱蓋放置在具有補(bǔ)充了 O或50ng/mL重組人CCN2/CTGF(35)的去血清培養(yǎng)基的12-孔組織培養(yǎng)板中，每2天更換培養(yǎng)基。確定CCN2/CTGF濃度(數(shù)據(jù)未顯示)。CCN2/CTGF處理后5_25天，利用ELISA測(cè)定上清中的Tn-C含量。將外植體-培養(yǎng)的顱骨縫矢狀切片用于H&E染色和免疫組織化學(xué)。將顱骨縫用yCT(vivaCT 40; Scanco, Southeastern, PA)掃描以測(cè)量縫寬度。實(shí)施例10 :用于體內(nèi)遞送的包裹CCN2/CTGF的PLGA微球的制備這個(gè)實(shí)施例描述用于體內(nèi)遞送的包裹CCN2/CTGF的PLGA微球的制備。除非另有說明，方法按照實(shí)施例1-9。通過雙乳化制備聚-d-Ι-乳酸-共-こ醇酸(PLGA)微球(32，54)。簡(jiǎn)單地說，將總計(jì)250mg的PLGA溶于ImL ニ氯甲烷。將重組人CCN2/CTGF(10 μ g)稀釋至50 μ L并加入PLGA溶液，形成混合物(初乳液)，使該混合物乳化Imin (油包水)。然后將初乳液加入2mL的1%聚こ烯醇(PVA，30, 000-70, 000MW)，然后混合Imin (水包[油包水])。加入IOOmL的PVA時(shí)，將混合物攪拌lmin。將總計(jì)IOOmL的2%異丙醇加入終乳液并持續(xù)攪拌2h以去除溶剤。制備對(duì)照微球(空的并且沒有CCN2/CTGF)，除了用50 μ L蒸餾水代替CCN2/CTGF。實(shí)施例11 :通過控釋的CCN2/CTGF的體內(nèi)顱骨縫再生這個(gè)實(shí)施例描述通過控釋的CCN2/CTGF的體內(nèi)顱骨縫再生。除非另有說明，方法按照實(shí)施例1-10。Sprague-Dawley大鼠在 p25發(fā)育天然骨性聯(lián)結(jié)的額間縫。按照IAOJC批準(zhǔn),將大鼠用1-5%異氟烷麻酔。利用牙鉆通過切除后額間縫產(chǎn)生2X4_缺損，用PBS沖洗并小心不要損傷下層的硬膜。將包含IOmg包裹CCN2/CTGF的PLGA或空PLGA微球的膠原海綿(Integra LifeSciences, Plainsboro, NJ)植入手術(shù)產(chǎn)生的缺損。op后4wk,將組織收獲并通過UCT分析。將收獲的組織每4μπι切片用于組織學(xué)以及FSPl和波形蛋白免疫組織化字(banta Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)。實(shí)施例12 :數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計(jì)除非另有說明，方法按照實(shí)施例1-11。確認(rèn)正態(tài)數(shù)據(jù)分布后，使用單 向方差分析(ANOVA)與邦費(fèi)羅尼寒后(post-hoc Bonferroni)檢驗(yàn)，p 為 O. 05。實(shí)施例13 :CCN2/CTGF將間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞除非另有說明，方法按照實(shí)施例1-12。單核和貼壁細(xì)胞分離自多個(gè)成年初級(jí)人骨髓樣品(30，31)(參見例如，圖1A)。與沒有CCN2/CTGF處理的MSC (參見例如，圖1A)相比，100ng/mL重組人CCN2/CTGF的暴露4wk誘導(dǎo)顯著的膠原合成(參見例如，圖1B)。定量地，CCN2/CTGF處理的MSC的膠原和生腱蛋白-C合成在2和4wk顯著大于沒有CCN2/CTGF處理的相同MSC亞群(參見例如，圖1C、D)。與沒有CCN2/CTGF的MSC (參見例如，圖IE中左圖)相比，10ng/mL的CCN2/CTGF足以刺激膠原合成，盡管50ng/mL和100ng/mL顯然更有效(參見例如，圖IE中右邊的3個(gè)圖)。與MSC 相關(guān)的一大批多能干性標(biāo)記(30)，包括 CD29、CD44、CD105、CD106、CDl 17、BMPR和Scal在CCN2/CTGF處理后觀察的2和4wk表現(xiàn)出穩(wěn)步下降(參見例如，圖IF ;p〈0. 01)。當(dāng)CCN2/CTGF刺激吋，這種MSC干性標(biāo)記的減少伴隨著成纖維細(xì)胞mRNA標(biāo)記的増加，包括I和III型膠原、Tn-C、纖連蛋白、基質(zhì)金屬蛋白酶I (MMP-I)、成纖維細(xì)胞特異性蛋白I (FSPl)和波形蛋白(參見例如，圖1G)。晚期成骨標(biāo)記骨橋蛋白和成軟骨標(biāo)記II型膠原不可檢測(cè)，證實(shí)CCN2/CTGF處理的MSC沒有分化為兩種常見的間充質(zhì)譜系成骨細(xì)胞或軟骨細(xì)胞。CCN2/CTGF刺激的MSC保留a SMA陰性(參見例如，圖1G，a SMA不可檢測(cè))，這在下文的進(jìn)ー步實(shí)驗(yàn)中證實(shí)(參見例如，圖3Α、C)。實(shí)施例14 :減弱的CCN2/CTGF刺激的間充質(zhì)先祖分化為非成纖維細(xì)胞譜系的能力除非另有說明，方法按照實(shí)施例1-13。與在相應(yīng)的允許的條件下容易地分化為成骨細(xì)胞(參見例如，圖2D中的茜素紅陽(yáng)性細(xì)胞)、軟骨細(xì)胞(參見例如，圖2Ε中的番紅-O陽(yáng)性細(xì)胞)或脂肪細(xì)胞(參見例如，圖2F中的油紅O陽(yáng)性細(xì)胞)的相同MSC亞群的無CCN2/CTGF培養(yǎng)物相比，4wk CCN2/CTGF刺激(100ng/mL)吋，MSC表現(xiàn)出減弱的分化為成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞和成脂細(xì)胞的能力(分別參見例如，圖2A、B、C)。為了解決圖I中MSC衍生的成纖維細(xì)胞可以源自異質(zhì)MSC群體中的成纖維細(xì)胞的想法，從上文研究的相同MSC亞群分離克隆(參見例如，圖I)。三個(gè)測(cè)試的MSC克隆B7、B12和E3容易地分化為積累膠原的成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞(參見例如，圖2G、H、I)、產(chǎn)生堿性磷酸酶和礦物的成骨細(xì)胞(參見例如，圖2J、K、L)、油紅O陽(yáng)性的成脂細(xì)胞(參見例如，圖2M、N)(除了圖20中的E3)、以及番紅O陽(yáng)性的成軟骨細(xì)胞(參見例如，圖2P、Q、R)。分離了總計(jì)12個(gè)克隆,包括B7和B12,分化為成纖維細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、成脂細(xì)胞；而總計(jì)2個(gè)克隆，包括E3，分化為成纖維細(xì)胞、成骨細(xì)胞和成軟骨細(xì)胞，但不分化為成脂細(xì)胞?？寺?shù)據(jù)顯示異質(zhì)MSC群體的確包含多能細(xì)胞，所述多能細(xì)胞不是最終階段成纖維細(xì)胞，而是能夠分化為常見間充質(zhì)譜系的成纖維細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞。雖然間充質(zhì)分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞是常例，但是如本文說明的成纖維細(xì)胞分化以前尚未報(bào)道。此外，CCN2/CTGF處理的細(xì)胞不是成骨的或成軟骨的。馮庫(kù)薩染色在CCN2/CTGF處理的MSC中為陰性(參見例如，圖7B)，正如沒有CCN2/CTGF處理的MSC (參見例如，圖7A)。相比之下，接受成骨刺激的MSC容易地分化為積累礦物的成骨細(xì)胞(參見例如，圖7C)。番紅O染色在CCN2/CTGF處理的MSC中為陰性(參見例如，圖7E)，正如沒有CCN2/CTGF處理的MSC (參見例如，圖7D)。相比之下，接受成軟骨刺激的MSC容易地分化為番紅O陽(yáng)性的成軟骨細(xì)胞(參見例如，圖7F)。定量地，成骨刺激下的MSC積累比有或無CCN2/CTGF處理的相同細(xì)胞亞群顯著更多的鈣(參見例如，圖7G) (n=5，*:p〈0.05，**:p〈0.01)。平行地，成軟 骨刺激下的MSC產(chǎn)生比有或無CCN2/CTGF處理的相同細(xì)胞亞群顯著更多的糖胺聚糖(GAG)(參見例如，圖 7H) (η=5, **:ρ〈0· 01)。實(shí)施例15 CCN2/CTGF誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞為a SMA陰性細(xì)胞除非另有說明，方法按照實(shí)施例1-14。α平滑肌肌動(dòng)蛋白(α SM)是從其他細(xì)胞類型中的a SMA-陰性成纖維細(xì)胞激活的肌成纖維細(xì)胞的關(guān)鍵標(biāo)志。認(rèn)為肌成纖維細(xì)胞獲得a SMA在皮膚創(chuàng)傷愈合、癌癥基質(zhì)和器官纖維化中具有功能意義?？紤]到a SMA在CCN2/CTGF刺激的MSC中不可檢測(cè)(參見例如，圖1G)，用已知的肌成纖維細(xì)胞表型的刺激物TGF β I進(jìn)行α SMA表達(dá)的這種進(jìn)一歩分祈。結(jié)果顯示CCN2/CTGF處理的MSC不表達(dá)a SMA (參見例如，圖3A、C)。但是，用5ng/mL TGF β I處理CCN2/CTGF處理的MSC或MSC衍生的成纖維細(xì)胞容易地表達(dá)a SMA (參見例如，圖3Β、D)。流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)有或無CCN2/CTGF處理的MSC中一般不存在a SMA (分別參見例如，圖3E、G)。此外，31. 9%的TGF β I處理的MSC衍生的成纖維細(xì)胞獲得a SMA表型(參見例如，圖3Η)。但是，僅I. 8%的沒有先前CCN2/CTGF處理的MSC在TGF β I刺激后獲得a SMA表型(參見例如，圖3F)。這表明與CCN2/CTGF處理的MSC相比，沒有成纖維細(xì)胞分化的MSC可以具有一定水平的先天抵抗獲得a SMA表型的能力。在建立的膠原凝膠收縮模型中，發(fā)現(xiàn)與CCN2/CTGF単獨(dú)刺激(參見例如，圖3J)或TGF^ I單獨(dú)刺激(參見例如，圖3Κ)相比，順序暴露于CCN2/CTGF和TGFP I的MSC產(chǎn)生最顯著的收縮(參見例如，圖31)。沒有TGFii I和CCN2/CTGF刺激的MSC收縮膠原凝膠的能力最小(參見例如，圖3L)。定量數(shù)據(jù)證實(shí)通過CCN2/CTGF和TGF β I順序刺激MSC的確產(chǎn)生最能收縮膠原凝膠數(shù)據(jù)的肌成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞(參見例如，圖3Μ)。實(shí)施例16 :CCN2/CTGF在結(jié)締組織愈合中促成纖維發(fā)生而不是異位骨發(fā)生在這個(gè)實(shí)施例中，考慮到上文所述的CCN2/CTGF促進(jìn)多能間充質(zhì)細(xì)胞的纖維發(fā)生命運(yùn)的體外效力，將顱縫早閉用作體內(nèi)模型以測(cè)試CCN2/CTGF是否能夠決定結(jié)締組織愈合的結(jié)果。
除非另有說明，方法按照實(shí)施例1-15。控釋方法通過微包裹增強(qiáng)CCN2/CTGF的體內(nèi)生物利用度(32)，通過注射提供生物活性信號(hào)的遞送的快速變性和擴(kuò)散(33)。微包裹的CCN2/CTGF的體外釋放曲線例如圖4D所示。在建立的大鼠顱縫早閉模型(34，35)中手術(shù)去除骨性聯(lián)結(jié)的顱骨縫時(shí)，組織修復(fù)的結(jié)果是與完全閉塞的異位骨重新骨性聯(lián)結(jié)(參見例如，圖4A)(參見例如，圖4E、G)，與顱縫早閉患者中的重新骨性聯(lián)結(jié)相似(34)。引人注目的是，控釋的CCN2/CTGF (參見例如，圖4C、D)単獨(dú)促進(jìn)纖維發(fā)生，并且恢復(fù)使人聯(lián)想到天然顱骨縫的解剖結(jié)構(gòu)的形態(tài)發(fā)生(參見例如，圖4B;見(44))。通過控釋遞送CCN2/CTGF進(jìn)ー步恢復(fù)在礦化骨之間的軟組織界面中具有間充質(zhì)和成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞的顱骨縫的顯微特征(參見例如，圖4F、H)。生物工程
化的軟組織界面中微球的存在(參見例如，圖4F、H中的μ s)表明微包裹的CCN2/CTGF持續(xù)釋放。重要的是，與閉塞骨的骨髓中FSPl陽(yáng)性細(xì)胞的存在(圖41)以及沒有CCN2/CTGF遞送的波形蛋白的一般不存在(圖41、K)相比，控釋的CCN2/CTGF在恢復(fù)的顱骨縫中誘導(dǎo)大量FSPl和波形蛋白表達(dá)(圖4J、L)。這些發(fā)現(xiàn)證實(shí)CCN2/CTGF的控釋可以在修正心臟、矯形外科、血管和其他軟組織缺損中的異位礦化中具有意義。利用建立的模型(35)離體培養(yǎng)同齡顱蓋(如上文的體內(nèi)實(shí)驗(yàn))顯示與上文所述的體內(nèi)顱縫早閉模型基本上相似的發(fā)現(xiàn)。在出生后第10天(PlO)，明顯的顱骨縫的特征在于兩個(gè)骨形成正面之間存在間充質(zhì)/成纖維細(xì)胞組織(參見例如，圖5A)，并且表達(dá)FSPl和波形蛋白(分別參見例如，圖OT、G)。在離體培養(yǎng)中沒有CCN2/CTGF遞送，顱骨縫在p35容易地發(fā)生骨性聯(lián)結(jié)(參見例如，圖5B)，伴隨著減少的FSPl和波形蛋白表達(dá)(分別參見例如，圖5E、H)。相比之下，100ng/mL CCN2/CTGF遞送使得顱骨縫免于發(fā)生骨性聯(lián)結(jié)，伴隨著FSPl和波形蛋白表達(dá)(分別參見例如，圖5C、F、I)。通過μ CT,與不含CCCN2/CTGF的縫中的實(shí)際閉合(參見例如，圖5J、K)相比，CCN2/CTGF作用的顱骨縫表現(xiàn)通暢，這由定量分析證實(shí)，其顯示CCN2/CTGF遞送產(chǎn)生比沒有CCN2/CTGF的情況明顯更大的縫寬度(參見例如，圖5L)。在CCN2/CTGF作用的顱骨縫中，生腱蛋白C含量顯著大于無CCN2/CTGF的縫(參見例如，圖5Μ)，這進(jìn)ー步表明CCN2/CTGF促進(jìn)纖維發(fā)生。此外，分離自天然的明顯的ρ7顱骨縫的細(xì)胞在100ng/mL CCN2/CTGF刺激時(shí)容易地分化為高度三色陽(yáng)性的成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞(參見例如，圖6A)，這證實(shí)四肢骨髄(如上文所述)或顱蓋中的多能間充質(zhì)細(xì)胞能夠成纖維細(xì)胞分化。相比之下，分離的沒有CCN2/CTGF處理的顱骨縫繼續(xù)呈現(xiàn)MSC形態(tài)并合成很少的膠原(參見例如，圖6E)。與分離的沒有成骨刺激的細(xì)胞(參見例如，圖6F)相比，將在20-30天內(nèi)進(jìn)行骨性聯(lián)結(jié)的分離自p7顱骨縫的細(xì)胞在有或無CCN2/CTGF的成骨刺激下容易地分化為成骨細(xì)胞(參見例如，圖6B、C)。而且，與分離的沒有成脂刺激的細(xì)胞(參見例如，圖6G)相比，分離的顱骨縫細(xì)胞在允許的條件下進(jìn)行成脂分化(參見例如，圖6D)。這些發(fā)現(xiàn)表明顱骨縫由多能間充質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成，除了分化為其他間充質(zhì)譜系，所述多能間充質(zhì)細(xì)胞在CCN2/CTGF刺激時(shí)容易地分化為成纖維細(xì)胞并經(jīng)歷纖維發(fā)生。參考文獻(xiàn)I. H. Y. Chang et al. , Proc Natl Acad Sci U S A 99，12877 (Oct I, 2002).
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241 pceadleeni kkgkkcirtp kiskpikfel sgctsmktyr akfcgvctdg rcctphrtt t301 lpvefkcpdg evmkknmmfi ktcachyncp gdndifesly yrkmygdma
權(quán)利要求
1.ー種藥物組合物,其包含CCN2/CTGF ； (i)TGF^的抑制劑、(ii)P38抑制劑、或(iii)酪氨酸激酶抑制劑中的至少ー種；以及 藥學(xué)可接受的載體或賦形劑。
2.如權(quán)利要求2所述的組合物，其中所述組合物還包含間充質(zhì)祖細(xì)胞。
3.如權(quán)利要求2所述的組合物，其中所述間充質(zhì)祖細(xì)胞為aSMA-間充質(zhì)祖細(xì)胞。
4.如權(quán)利要求2-3中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述間充質(zhì)祖細(xì)胞為CD34-間充質(zhì)祖細(xì)胞。
5.如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述CCN2/CTGF包含CCN2/CTGF多肽或編碼CCN2/CTGF多肽的多核苷酸。
6.如權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述組合物包含編碼CCN2/CTGF多肽的多核苷酸，所述多核苷酸可操作地連接至適合在創(chuàng)傷組織環(huán)境中表達(dá)所述CCN2/CTGF多肽的載體。
7.如權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述CCN2/CTGF包含人CCN2/CTGF或重組人 CCN2/CTGF。
8.如權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述CCN2/CTGF包含對(duì)應(yīng)于登錄號(hào)ΝΡ_001892 的 CCN2/CTGF。
9.如權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述CCN2/CTGF包含多肽，所述多肽具有SEQ ID NO: I的序列，或者與SEQ ID NO: I具有至少約80%相同性并且具有CCN2/CTGF活性。
10.如權(quán)利要求9所述的組合物，其中所述CCN2/CTGF包含多肽，所述多肽與SEQIDΝΟ:1 具有至少約 80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同性并且具有CCN2/CTGF活性。
11.如權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述組合物包含TGFβ的抑制劑。
12.如權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述TGFβ的抑制劑減少?gòu)某衫w維細(xì)胞形成肌成纖維細(xì)胞或者抑制纖維化。
13.如權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述TGFii的抑制劑大幅減少?gòu)某衫w維細(xì)胞形成肌成纖維細(xì)胞或者抑制纖維化。
14.如權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述抑制劑為TGFiiI的抑制劑。
15.如權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述TGFii的抑制劑選自ANG-1122 ；ΑΡ-11014 ;美替木單抗；夫蘇木單抗；甘露糖-6-磷酸，BTG ；PharmaprojectsNo. 6614 ；NAFBOOI ；NAFB002 JGF-β I 抗體，Lilly ;LY_2157299 ;胎球蛋白 JGF-β 拮抗劑，F(xiàn)ibroGen ；1D11 ;抗16卩旦嫩13-1, Genzyme ;SB_431542 ;激活素樣激酶 5 抑制劑，Graceway ；抗TGF-β抗體，Genent ;反義寡核苷酸，Il ；TGF-^拮抗劑，Inflazyme ;TGF_β受體，Insmed ；TGF- β 拮抗劑，Inspiraplex ;飾膠蛋白,Telios ;SX_007 ；TGF- β 受體抑制劑，J&J ；TGF- β 疫苗，Neovacs ；ADMP-1 ；TGF- β 抗體，Manchester ；TGF- β 拮抗劑，Sydney ;甘露糖-6-磷酸，Renovo ;癌癥基因治療，Resver JGF-β Shield ;IN_1130 ;LF_984 JGF-β 抑制劑，Mill ;以及 SB-431542。
16.如權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述組合物包含P38抑制劑。
17.如權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述組合物包含選自以下的P38抑制劑Tocriset, SD282、SB239063、SB203580、SB220025、SKF86002、PD169316、SB202190、SC68376、VX702、VX745、R130823、AMG548、BIRB796、SCI0469、SCI0323、FR167653、MW012069ASRM、SD169、RWJ67657 以及 ARRY797。
18.如權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述組合物包含酪氨酸激酶抑制齊 。
19.如權(quán)利要求1-18中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述組合物包含選自以下的酪氨酸激酶抑制劑K252a、阿昔替尼、波舒替尼、西地尼布、達(dá)沙替尼、厄洛替尼、吉非替尼、伊馬替尼、拉帕替尼、來妥替尼、尼洛替尼、司馬沙尼、舒尼替尼、托西尼布、凡德他尼、伐他拉尼、ZD 1839、CI-1033、OSI-774、Gff 2016、EKB-569、頂C-C225、MDX-447、PKI 116、ABX-EGF,AG-82、AG-18、AG-490、AG-17、AG-213、AG-494、AG-825、AG-879、AG-1112、AG-1296、AG-1478、AG-126, RG-13022、RG-14620 以及 AG-555。
20.如權(quán)利要求1-19中任一項(xiàng)所述的組合物，所述組合物還包含抗生素或免疫抑制齊 。
21.如權(quán)利要求1-19中任一項(xiàng)所述的組合物，所述組合物還包含選自以下的抗生素阿莫西林、β -內(nèi)酰胺酶、氨基糖苷、β -內(nèi)酰胺(糖肽)、克林霉素、氯霉素、頭孢菌素、環(huán)丙沙星、紅霉素、氟喹諾酮、大環(huán)內(nèi)酷、甲硝唑、青霉素、喹諾酮、雷帕霉素、利福平、鏈霉素、磺胺、四環(huán)素、甲氧芐啶、甲氧芐啶-磺胺甲噁唑以及萬古霉素。
22.如權(quán)利要求1-21中任一項(xiàng)所述的組合物，所述組合物還包含選自以下的免疫抑制劑類固醇、環(huán)胞素、環(huán)胞素類似物、環(huán)磷酰胺、甲基潑尼松、潑尼松、硫唑嘌呤、FK-506、15-脫氧精胍菌素、潑尼松龍、甲氨蝶呤、沙利度胺、甲氧沙林、雷帕霉素、來氟米特、咪唑立賓、布喹那、脫氧精胍菌素、氮雜螺烷、莫羅單抗-⑶3、山地明、Neoral, Sangdya、普樂可復(fù)、騎悉、硫唑嘌呤、糖皮質(zhì)類固醇、腎上腺皮質(zhì)類固醇、Deltasone、Hydeltrasol> Folex、甲氨蝶呤、甲氧沙林以及西羅莫司。
23.如權(quán)利要求1-22中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述組合物配制為用于腸胃外、肺部、ロ服、局部、皮內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹腔內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)、硬膜タト、眼部、口腔或直腸給藥。
24.如權(quán)利要求1-23中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述組合物配制為用于局部給藥。
25.如權(quán)利要求1-24中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述組合物配制為用于直接局部給予軟組織創(chuàng)傷部位。
26.ー種用于創(chuàng)傷治療的試劑盒，其包含權(quán)利要求1-25中任一項(xiàng)所述的藥物組合物。
27.權(quán)利要求1-25中任一項(xiàng)所述的組合物用于治療組織創(chuàng)傷的用途。
28.權(quán)利要求1-25中任一項(xiàng)所述的組合物在制備用于治療組織創(chuàng)傷的藥物中的用途。
29.如權(quán)利要求27-28中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述組織創(chuàng)傷包括軟組織創(chuàng)傷。
30.如權(quán)利要求27-29中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述組織創(chuàng)傷包括慢性組織創(chuàng)傷或急性組織創(chuàng)傷。
31.如權(quán)利要求27-30中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述組織創(chuàng)傷包括皮膚創(chuàng)傷、韌帶創(chuàng)傷、腱創(chuàng)傷，或者上述創(chuàng)傷的組合。
32.如權(quán)利要求27-31中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述組織創(chuàng)傷包括開放性組織創(chuàng)傷。
33.如權(quán)利要求27-32中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述組織創(chuàng)傷包括切割創(chuàng)傷、撕裂創(chuàng)傷、擦傷創(chuàng)傷、穿刺創(chuàng)傷、穿透創(chuàng)傷或槍彈創(chuàng)傷。
34.如權(quán)利要求27-33中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述組織創(chuàng)傷包括分裂裂傷、過度拉イ申、磨壓、割裂或撕裂。
35.一種用于愈合組織部位的創(chuàng)傷的系統(tǒng)，其包含 醫(yī)療器械，以及 權(quán)利要求1-25中任一項(xiàng)所述的組合物； 其中所述組合物適合在與所述組織部位接觸時(shí)從所述醫(yī)療器械釋放。
36.如權(quán)利要求35所述的系統(tǒng)，其中所述醫(yī)療器械選自帷簾、繃帶、敷料、膠帶、粘結(jié)層、夾板、止血粉、免縫膠帶、氰基丙烯酸酯膠、釘和縫線，或者上述器械的組合。
37.一種治療個(gè)體的方法，其包括 將包含CCN2/CTGF的組合物給予有需要的個(gè)體的組織創(chuàng)傷部位。
38.如權(quán)利要求37所述的方法，其中給予所述組合物包括使所述包含CCN2/CTGF的組合物與間充質(zhì)祖細(xì)胞接觸以刺激成纖維細(xì)胞分化。
39.如權(quán)利要求37-38中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述組合物還包含間充質(zhì)祖細(xì)胞。
40.如權(quán)利要求38-40中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述間充質(zhì)祖細(xì)胞為aSMA-間充質(zhì)祖細(xì)胞。
41.如權(quán)利要求38-40中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述間充質(zhì)祖細(xì)胞為CD34-間充質(zhì)祖細(xì)胞。
42.如權(quán)利要求38-41中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述分化的成纖維細(xì)胞為aSMA-成纖維細(xì)胞。
43.如權(quán)利要求38-42中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述分化的成纖維細(xì)胞為FSP1+、波形蛋白 +、Colll+和 a SMA-o
44.如權(quán)利要求37-43中任一項(xiàng)所述的方法，所述方法還包括給予(i)TGF0的抑制劑、(ii)P38抑制劑、或者(iii)酪氨酸激酶抑制劑中的至少ー種。
45.如權(quán)利要求44所述的方法，其中所述組合物包含所述CCN2/CTGF，并且包含所述TGF^的抑制劑、所述P38抑制劑或所述酪氨酸激酶抑制劑中的至少ー種。
46.如權(quán)利要求44所述的方法，其中第一組合物包含所述CCN2/CTGF，并且第二組合物包含所述TGFii的抑制劑、所述P38抑制劑或所述酪氨酸激酶抑制劑中的至少ー種。
47.如權(quán)利要求46所述的方法，其中所述第一組合物和所述第二組合物連續(xù)給藥。
48.如權(quán)利要求46所述的方法，其中所述第一組合物和所述第二組合物同時(shí)給藥。
49.如權(quán)利要求44-48中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述TGFβ的抑制劑、所述Ρ38抑制劑或所述酪氨酸激酶抑制劑中的至少ー種抑制纖維化。
50.如權(quán)利要求44-49中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述組合物包含TGFβ的抑制劑。
51.如權(quán)利要求44-50中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述TGFii的抑制劑減少?gòu)某衫w維細(xì)胞形成肌成纖維細(xì)胞或者抑制纖維化。
52.如權(quán)利要求44-51中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述TGFii的抑制劑以大幅減少?gòu)某衫w維細(xì)胞形成肌成纖維細(xì)胞有效的量存在。
53.如權(quán)利要求44-52中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述抑制劑為TGFiiI的抑制劑。
54.如權(quán)利要求44-53中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述TGFβ的抑制劑選自ANG-1122 ;AP-11014 ;美替木單抗；夫蘇木單抗；甘露糖-6-磷酸，BTG ；Pharmaprojects No. 6614 ；NAFBOOI ；NAFB002 JGF-β I 抗體，Lilly ;LY_2157299 ;胎球蛋白 JGF-β 拮抗劑，F(xiàn)ibroGen ；1D11 ;抗 TGFP MAb-1, Genzyme ;SB_431542 ;激活素樣激酶 5 抑制劑，Graceway ；抗TGF-β抗體，Genent ;反義寡核苷酸，Il JGF-β拮抗劑，Inflazyme JGF-β受體，Insmed ；TGF-β 拮抗劑，Inspiraplex ;飾膠蛋白,Telios ;SX_007 ；TGF-β 受體抑制劑，J&J ；TGF- β 疫苗，Neovacs ；ADMP-1 ；TGF- β 抗體，Manchester ；TGF- β 拮抗劑，Sydney ;甘露糖-6-磷酸，Renovo ;癌癥基因治療，Resver JGF-β Shield ;IN_1130 ;LF_984 JGF-β 抑制劑，Mill ;以及 SB-431542。
55.如權(quán)利要求44-54中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述組合物包含P38抑制劑。
56.如權(quán)利要求44-55中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述組合物包含選自以下的P38抑制劑Tocriset, SD282、SB239063、SB203580、SB220025、SKF86002、PD169316、SB202190、SC68376、VX702、VX745、R130823、AMG548、BIRB796、SCI0469、SCI0323、FR167653、MW012069ASRM、SD169、RWJ67657 以及 ARRY797。
57.如權(quán)利要求44-56中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述組合物包含酪氨酸激酶抑制劑。
58.如權(quán)利要求44-57中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述組合物包含選自以下的酪氨酸激酶抑制劑K252a、阿昔替尼、波舒替尼、西地尼布、達(dá)沙替尼、厄洛替尼、吉非替尼、伊馬替尼、拉帕替尼、來妥替尼、尼洛替尼、司馬沙尼、舒尼替尼、托西尼布、凡德他尼、伐他拉尼、ZD 1839、CI-1033、OSI-774、Gff 2016、EKB-569、IMC-C225, MDX-447、PKI 116、ABX-EGF,AG-82、AG-18、AG-490、AG-17、AG-213、AG-494、AG-825、AG-879、AG-1112、AG-1296、AG-1478、AG-126, RG-13022、RG-14620 以及 AG-555。
59.如權(quán)利要求37-58中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述組織創(chuàng)傷部位包括軟組織創(chuàng)傷。
60.如權(quán)利要求37-59中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述組織創(chuàng)傷部位包括慢性軟組織創(chuàng)傷或急性軟組織創(chuàng)傷。
61.如權(quán)利要求37-60中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述組織創(chuàng)傷部位包括皮膚創(chuàng)傷、韌帶創(chuàng)傷、腱創(chuàng)傷，或者上述創(chuàng)傷的組合。
62.如權(quán)利要求37-61中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述組織創(chuàng)傷部位包括開放性組織創(chuàng)傷。
63.如權(quán)利要求37-62中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述組織創(chuàng)傷部位包括切割創(chuàng)傷、撕裂創(chuàng)傷、擦傷創(chuàng)傷、穿刺創(chuàng)傷、穿透創(chuàng)傷或槍彈創(chuàng)傷。
64.如權(quán)利要求37-63中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述組織創(chuàng)傷部位包括分裂裂傷、過度拉伸、磨壓、割裂或撕裂。
65.如權(quán)利要求37-64中任一項(xiàng)所述的方法，其中給藥為腸胃外、肺部、口服、局部、皮內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹腔內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)、硬膜外、眼部、口腔或直腸給藥。
66.如權(quán)利要求37-65中任一項(xiàng)所述的方法，其中給藥包括局部給藥。
67.如權(quán)利要求37-66中任一項(xiàng)所述的方法，其中給藥包括直接局部給予所述組織創(chuàng)傷部位。
68.如權(quán)利要求37-67中任一項(xiàng)所述的方法，其中給予所述組合物導(dǎo)致(i)成纖維細(xì)胞分化的增加、(ii)纖維發(fā)生的增加、(iii)肌成纖維細(xì)胞分化的抑制、或者(iv)纖維化的抑制中的至少一種。
69.如權(quán)利要求37-68中任一項(xiàng)所述的方法，其中給予所述組合物導(dǎo)致(i)成纖維細(xì)胞分化的增加、( )纖維發(fā)生的增加、(iii)肌成纖維細(xì)胞分化的抑制、以及(iv)纖維化的抑制。
70.如權(quán)利要求37-69中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述組合物包含權(quán)利要求1-25中任一項(xiàng)所述的組合物。
71.如權(quán)利要求37-70中任一項(xiàng)所述的方法，其中給予所述組合物包括將權(quán)利要求35-36中任一項(xiàng)所述的系統(tǒng)給予所述組織創(chuàng)傷部位。
72.如權(quán)利要求37-71中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述組合物通過載體遞送系統(tǒng)給藥。
73.如權(quán)利要求37-72中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述組合物通過載體遞送系統(tǒng)給藥，所述載體遞送系統(tǒng)包含聚合微球，并且所述組合物包裹在所述聚合微球中。
74.如權(quán)利要求73所述的方法，其中所述組合物以約IOOmg-約500mg聚合物比約I-約100 μ g的CCN2/CTGF的比例包裹在聚合微球中。
75.如權(quán)利要求74所述的方法，其中所述組合物以約250mg聚合物比約10μg的CCN2/CTGF的比例包裹在聚合微球中。
75.如權(quán)利要求73-74中任一項(xiàng)所述的方法，其中給予所述組合物包括將約I-約50mg包裹CTGF的微球引入組織創(chuàng)傷。
76.—種形成a SMA-成纖維細(xì)胞的方法，其包括 使α SM-,⑶34-間充質(zhì)祖細(xì)胞與CCN2/CTGF接觸； 其中CCN2/CTGF刺激的間充質(zhì)干細(xì)胞分化為α SM-, FSP1+、波形蛋白+、Colll+成纖維細(xì)胞。
全文摘要
本文提供用于創(chuàng)傷愈合的組合物、方法、系統(tǒng)和試劑盒。如本文所示，CCN2/CTGF刺激的間充質(zhì)祖細(xì)胞可以形成αSMA-成纖維細(xì)胞。此外，證實(shí)TGFβ刺激αSMA-成纖維細(xì)胞進(jìn)一步分化為與纖維化相關(guān)的肌成纖維細(xì)胞。本發(fā)明的一方面提供一種組合物，其包含CCN2/CTGF以及TGF抑制劑、P38抑制劑或酪氨酸激酶抑制劑。本發(fā)明的另一方面提供一種用包含CCN2/CTGF的組合物治療組織創(chuàng)傷的方法。本發(fā)明還提供用于創(chuàng)傷愈合的系統(tǒng)和試劑盒。本發(fā)明還提供形成αSMA-成纖維細(xì)胞間充質(zhì)祖細(xì)胞的方法。
文檔編號(hào)A61K38/18GK102711799SQ201080060072
公開日2012年10月3日 申請(qǐng)日期2010年11月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月10日
發(fā)明者C·H·李, J·J·毛 申請(qǐng)人:紐約市哥倫比亞大學(xué)理事會(huì)