專(zhuān)利名稱(chēng)：Lpa用作促孕和致育劑的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在哺乳動(dòng)物生育治療中通過(guò)胚泡移植促進(jìn)懷孕的組合物，生產(chǎn)其的方法和用該組合物促進(jìn)懷孕的方法。
背景技術(shù)：
據(jù)說(shuō)在約10%的夫妻中觀察到人類(lèi)不育。因此，對(duì)生育治療有很大的需求，且迄今仍常用。在生育治療的不同現(xiàn)有方法中，直接操作精子細(xì)胞或卵細(xì)胞的方法分別稱(chēng)為人工授精和體外受精。人工授精是使用設(shè)備如導(dǎo)管等通過(guò)將精子細(xì)胞注射入陰道中接近子宮頸的位置或直接到子宮或輸卵管來(lái)促進(jìn)懷孕的技術(shù)，其目的是通過(guò)人工導(dǎo)入的方法然后引導(dǎo)精子細(xì)胞接觸卵細(xì)胞來(lái)增加受精的成功率。另一方面，體外受精是通過(guò)給予患者排卵誘導(dǎo)物以誘導(dǎo)生成卵細(xì)胞的技術(shù)，然后將所述卵細(xì)胞收集到體外并在測(cè)試管中與精子細(xì)胞混合使其受精，然后培養(yǎng)該受精卵細(xì)胞并通常在培養(yǎng)的2-3天，用導(dǎo)管將4或8細(xì)胞階段的胚胎 通常轉(zhuǎn)移到子宮腔中。為了使移植胚胎更容易的著床，常給予黃體化激素以給子宮內(nèi)膜提供條件。預(yù)著床的胚胎在發(fā)育期間產(chǎn)生數(shù)種因子給母體發(fā)出其存在的信號(hào)。例如，白介素I(IL-I)是調(diào)節(jié)胚胎和母體子宮內(nèi)膜之間的對(duì)話(huà)(cross talk)的主要因子，且在發(fā)育的所有階段發(fā)現(xiàn)所述IL-I系統(tǒng)(非專(zhuān)利文獻(xiàn)I)。關(guān)于另一種胚胎因子人絨毛膜促性腺素(hCG)，其基因的表達(dá)在2細(xì)胞階段胚胎中已發(fā)生(非專(zhuān)利文獻(xiàn)2)。胚胎體外(測(cè)試管中)培養(yǎng)時(shí)還觀察到涉及所述對(duì)話(huà)的數(shù)種胚胎因子釋放出細(xì)胞，包括上述兩種。即，在胚胎培養(yǎng)物上清中可檢測(cè)到數(shù)種調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜容受性的胚胎因子(非專(zhuān)利文獻(xiàn)3-9)。體內(nèi)也已知輸卵管中發(fā)育的胚胎誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜的分化(非專(zhuān)利文獻(xiàn)10)。所有這些現(xiàn)象一起表明在胚胎發(fā)育的早期階段，通過(guò)胚胎產(chǎn)生的因子發(fā)生胚胎和子宮內(nèi)膜之間的對(duì)話(huà)。事實(shí)上，已表明不僅子宮腔內(nèi)的預(yù)著床胚胎，甚至仍位于輸卵管中的早期胚胎具有調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜中某些分子的能力以使其在自己控制下著床(非專(zhuān)利文獻(xiàn)10)。近幾年，胚泡移植作為生育治療的體外受精技術(shù)，已在臨床上提出并實(shí)踐，作為提高人生育治療中著床成功率的方法(非專(zhuān)利文獻(xiàn)11-13)。本技術(shù)中，如上所述體外受精產(chǎn)生的胚胎培養(yǎng)5-6天使其發(fā)育為胚泡，然后將其注射入子宮腔。使用胚泡移植技術(shù)能實(shí)現(xiàn)較早期階段移植胚胎更高的著床率，因?yàn)榍罢咚械膬?yōu)勢(shì)其使子宮內(nèi)膜和胚胎的發(fā)育階段生理上同步，以及由于體外培養(yǎng)時(shí)間更長(zhǎng)，所以能相對(duì)早的選擇具有更高著床能力的胚胎(非專(zhuān)利文獻(xiàn)14和15)。然而，盡管如此，胚泡移植的懷孕成功率實(shí)際上仍為約36. 4%的較低水平。胚泡移植后不成功的著床被認(rèn)為是由于例如胚泡沒(méi)能從透明帶中逃出，或由于移植的胚泡在子宮腔內(nèi)發(fā)育停滯。此外，從早期胚胎到胚泡的發(fā)育階段子宮內(nèi)膜和胚胎之間對(duì)話(huà)的缺失被認(rèn)為是失敗的另一原因。此信息交換的缺失可能是子宮內(nèi)膜對(duì)胚胎容受性調(diào)節(jié)不足的原因。為了增加胚泡移植中的懷孕成功率開(kāi)發(fā)了一種方法，所述方法中在胚泡移植到子宮內(nèi)之前，將通過(guò)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)人胚胎直到其發(fā)育為胚泡而獲得的培養(yǎng)物上清注射入所述子宮腔[SEET(內(nèi)膜胚胎移植刺激)治療]。根據(jù)此方法，實(shí)現(xiàn)了 90%或更高的懷孕成功率(非專(zhuān)利文獻(xiàn)16和專(zhuān)利文獻(xiàn)I)。SEET治療產(chǎn)生的懷孕成功率的提高說(shuō)明注射入所述子宮腔的培養(yǎng)物上清含有一些能提高懷孕成功率的活性成分。然而，尚不知這些活性成分是什么。雖然磷脂通常具有兩種脂肪酸部分，活體中某些出現(xiàn)的某些磷脂具有不多于一種脂肪酸部分。這些稱(chēng)為“溶血磷脂”。一種已知的溶血磷脂-溶血磷 脂酸對(duì)應(yīng)于I-?；视?-磷酸鹽或2-?；视?-磷酸鹽。通常已知活體內(nèi)出現(xiàn)各種在脂肪酸部分彼此不同的溶血磷脂酸且其有生理活性例如促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)。溶血磷脂酸發(fā)揮其活性主要通過(guò)細(xì)胞表面受體，其中至少4類(lèi)已知(LPA1, LPA2, LPA3,和LPA4)。雖然缺失這些溶血磷脂酸受體之一(LPA3)基因的小鼠中的實(shí)驗(yàn)表明通過(guò)LPA3的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)受精卵的著床很重要(非專(zhuān)利文獻(xiàn)17)，但不知涉及哪種磷脂酸。引用文獻(xiàn)列表專(zhuān)利文獻(xiàn)PLl W02008/016039非專(zhuān)利文獻(xiàn)NPL I Del Ios Santos MJ.等，Biol Reprod. (1998)59,1419-1424NPL 2 Jurisicova A.等，Hum Reprod. (1999) 14,1852-1858NPL 3 Tanzuke SI.等，Semin Reprod Endocrinol. (1996) 14,231-245NPL 4 Simon C.等，Clin Endocrinol Metab. (1997)82,2607-2616NPL 5 Giudice LC.等，Semin Reprod Endocrinol. (1995) 13,93-101NPL 6 Sheth KV.等，F(xiàn)ertil Steril. (1991)55,952-957NPL 7 Baranao RI.等，Am J Reprod Immunol. (1997) 37,191-194NPL 8 Licht P.等，Semin Reprod Med. (2001) 19，37-47NPL 9 Perrier d，Hauterive.等，Hum Reprod. (2004) 19, 2633-2643NPL 10 Wakuda K.等，R印rod Fertil. (1999) 115,315-324NPL 11 Gardner DK.等，Hum Reprod. (1998) 13,3434-3440NPL 12 Scholtes MC.等，F(xiàn)ertil Steril. (1998)69,78-83NPL 13 Milki AA.等，F(xiàn)ertil Steril. (1999)72,225-228NPL 14 Gardner DK.等，F(xiàn)ertil Steril. (1998)69,84-88NPL 15 Edwards RG.等，Hum Reprod. (1999) 14,1-4NPL 16 Goto S.等，F(xiàn)ertil Steril. (1999)88,1339-1343NPL 17 Yo X.等，Nature (2005) 435，104-108發(fā)明概述技術(shù)問(wèn)題針對(duì)上述背景，本發(fā)明的目的是發(fā)現(xiàn)具有提高胚泡移植患者中著床和懷孕成功率的活性的化合物，和提供生產(chǎn)和使用其的方法，以及促進(jìn)懷孕的藥劑。技術(shù)方案通過(guò)SEET治療，接受胚泡移植的人的懷孕成功率可從約36%的現(xiàn)有數(shù)據(jù)提高到90%或更多，其中在胚胎在子宮內(nèi)著床之前，將通過(guò)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)人胚胎直到其發(fā)育為胚泡而獲得的培養(yǎng)物上清注射入所述子宮腔。本發(fā)明人假定所述培養(yǎng)物上清中含一些提高懷孕成功率的活性成分?；诖思僭O(shè)，本發(fā)明人用色譜和質(zhì)譜分析了所述培養(yǎng)物上清，發(fā)現(xiàn)在所述培養(yǎng)物上清中沒(méi)有檢測(cè)到來(lái)自人胚胎且具有能影響移植胚泡著床和懷孕的活性的蛋白，還發(fā)現(xiàn)所述培養(yǎng)物上清中檢測(cè)到的源自人胚胎的成分僅是5種不同溶血磷脂酸。本發(fā)明基于上述發(fā)現(xiàn)并通過(guò)進(jìn)一步研究完成。因此本發(fā)明提供如下項(xiàng)。I. 一種用于促進(jìn)經(jīng)胚泡移植患者懷孕的促孕劑，所述藥劑包括一種或多種溶血磷脂酸。2.如上述I所述的促孕劑，其特征在于，所述溶血磷脂酸為選自下組的一種或多種LPA-C16:0、LPA-C16:1、LPA-C18:0、LPA-C18:1 和 LPA_C18:2。
3.如上述I所述的促孕劑，其特征在于，所述溶血磷脂酸為L(zhǎng)PA_C16:0、LPA-CI6:I,LPA-CI8:0,LPA-CI8:I 和 LPA_C18:2。4.如上述3所述的促孕劑，其特征在于，所述LPA_C16:0、LPA-C16:1、LPA-C18:0、LPA_C18:1和LPA_C18:2和的相互含量比例為摩爾比36-66 1-2 5-10 13-25 15-28。5.如上述3所述的促孕劑，其特征在于，在一次給藥中將98_182pmol的LPA-C16:0,2. 8-5. 2pmol 的 LPA-C16:l、14_26pmol 的 LPA-C18:0、36_68pmol 的 LPA_C18:1和40-76pmol的LPA-C18:2注射入所述患者的子宮腔。6.如上述1-5中任一項(xiàng)所述的促孕劑，其特征在于，所述藥劑在胚泡移植前給予。7. 一種溶血磷脂酸的生產(chǎn)方法，所述方法包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)哺乳動(dòng)物胚胎并收集因此獲得的培養(yǎng)物上清的步驟。8.如上述7所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述溶血磷脂酸為選自下組的一種或多種LPA-C16:0、LPA-C16:1、LPA-C18:0、LPA-C18:1 和 LPA_C18:2。9.如上述7或8所述的方法，其特征在于，所述哺乳動(dòng)物是人。10.如上述7-9中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基為無(wú)血清培養(yǎng)基。11. 一種在胚泡移植中促進(jìn)懷孕的方法，所述方法包括將有效量的一種或多種溶血磷脂酸給予患者的子宮腔。12.如上述11所述的方法，其特征在于，所述溶血磷脂酸為選自下組的一種或多種LPA-C16:0、LPA-C16:1、LPA-C18:0、LPA-C18:1 和 LPA_C18:2。13.如上述11所述的方法，其特征在于，所述溶血磷脂酸為L(zhǎng)PA_C16:0、LPA-CI6:I,LPA-CI8:0,LPA-CI8:I 和 LPA_C18:2。14.如上述13所述的方法，其特征在于，所述^^-(16:0、^^-(16:1、^^-(18:0、LPA-C18:1 和 LPA-C18:2 的相互含量比例為摩爾比 36-66 1-2 5-10 13-25 15-28。15.如上述13所述的方法，其特征在于，在一次給藥中將98_182pmol的LPA-C16:0,2. 8-5. 2pmol 的 LPA-C16:l、14_26pmol 的 LPA-C18:0、36_68pmol 的 LPA_C18:1和40-76pmol的LPA-C18:2注射入所述患者的子宮腔。16.如上述11所述的方法，其特征在于，所述溶血磷脂酸在胚泡移植前給予。發(fā)明的有益效果胚泡移植到所述胚胎受體的子宮里之前，將上述根據(jù)本發(fā)明的促孕劑注射入所述子宮腔能顯著增加移植胚泡的著床和懷孕的成功率。附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1-1圖表顯示LPA-C18:1標(biāo)準(zhǔn)樣品的GC-SM分析結(jié)果。(A)m/z值為299. I的GC-SIM 分析，(B)m/z 值為 637. 3 的 GC-SIM 分析。圖1-2圖表顯示LPA-C18:1標(biāo)準(zhǔn)樣品的GC-MS(掃描)分析結(jié)果。(C)保留時(shí)間16. 33分鐘的GC-MS (掃描)分析(掃描范圍m/z值35-800)。圖2-1圖表顯示樣品中LPA-C16:0的GC-SM分析結(jié)果。(A)m/z值為299. I的GC-SIM 分析，(B)m/z 值為 611. 3 的 GC-SIM 分析。圖2-2圖表顯示樣品中LPA_C16:0的GC-MS(掃描)分析結(jié)果。(C)保留時(shí)間15. 31分鐘的GC-MS (掃描)分析(掃描范圍m/z值35-800)。
圖3-1圖表顯示樣品中LPA-C16:1的GC-SM分析結(jié)果。(A)m/z值為299. I的GC-SIM 分析。(B) m/z 值為 609. 3 的 GC-SIM 分析。圖3-2圖表顯示樣品中LPA-C16:1的GC-MS (掃描)分析結(jié)果。(C)保留時(shí)間15. 20分鐘的GC-MS (掃描)分析(掃描范圍m/z值35-800)。圖4-1圖表顯示樣品中LPA-C18:0的GC-SM分析結(jié)果。(A)m/z值為299. I的GC-SIM 分析，(B)m/z 值為 639. 4 的 GC-SIM 分析。圖4-2圖表顯示樣品中LPA-C18:0的GCMS (掃描)分析結(jié)果。(C)保留時(shí)間16. 58分鐘的GC-MS (掃描)分析(掃描范圍m/z值35-800)。圖5-1圖表顯示樣品中LPA-C18:1的GC-SM分析結(jié)果。(A)m/z值為299. I的GC-SIM 分析。(B) m/z 值為 637. 3 的 GC-SIM 分析。圖5-2圖表顯示樣品中LPA-C18:1的GC-MS (掃描)分析結(jié)果。(C)保留時(shí)間16. 39分鐘的GC-MS (掃描)分析(掃描范圍m/z值35-800)。圖6-1圖表顯示樣品中LPA_C18:2的GC-SM分析結(jié)果。(A)m/z值為299. I的GC-SIM 分析。(B) m/z 值為 635. 3 的 GC-SIM 分析。圖6-2圖表顯示樣品中LPA_C18:2的GC-MS(掃描)分析結(jié)果。(C)保留時(shí)間16. 35分鐘的GC-MS (掃描)分析(掃描范圍m/z值35-800)。圖7-1圖表顯示空白溶液的GC-S頂分析結(jié)果。顯示(A)m/z值為299. 1，和(B)m/z值為611. 3的GC-SIM分析結(jié)果。箭頭表示相應(yīng)檢測(cè)離子出現(xiàn)的保留時(shí)間。圖7-2圖表顯示空白溶液的GC-S頂分析結(jié)果。顯示(C)m/z值為609. 3，和(D)m/z值為639. 4的GC-SIM分析結(jié)果。箭頭表示相應(yīng)檢測(cè)離子出現(xiàn)的保留時(shí)間。圖7-3圖表顯示空白溶液的GC-S頂分析結(jié)果。顯示(E)m/z值為637. 3，和(F)m/z值為635. 3的GC-SIM分析結(jié)果。箭頭表示相應(yīng)檢測(cè)離子出現(xiàn)的保留時(shí)間。實(shí)施方式詳述前述通過(guò)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)人胚胎直到其發(fā)育為胚泡而獲得的培養(yǎng)物上清中沒(méi)有檢測(cè)到源自所述人胚胎的蛋白具有能影響移植胚泡的著床和懷孕的活性，而源自所述人胚胎的成分僅是所述培養(yǎng)物上清中獲得的5種具體的溶血磷脂酸。因此，這些溶血磷脂酸是其中之一單獨(dú)或其中一些聯(lián)合作用刺激所述子宮內(nèi)膜并為胚泡移植準(zhǔn)備最優(yōu)環(huán)境的成分。SEET治療中，根據(jù)本發(fā)明的促孕劑在胚泡移植前注射入患者的子宮腔內(nèi)可增加著床和懷孕成功率。
用本發(fā)明的促孕劑治療的患者為哺乳動(dòng)物，包括但不限于具體的人和家畜如牛和馬，和寵物如狗和貓。本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“溶血磷脂酸”包括I-?；视?-磷酸鹽和2-酰基甘油3-磷酸鹽，其中優(yōu)選I-甘油3-磷酸鹽。 根據(jù)本文的術(shù)語(yǔ)“溶血磷脂酸”包括下述結(jié)構(gòu)的化合物(不考慮其游離形式或其鹽)。當(dāng)其為鹽形式時(shí)，陽(yáng)離子M+的種類(lèi)沒(méi)有具體限制，但優(yōu)選單價(jià)金屬離子，如堿金屬離子如Na和K和銨尚子，其中特別優(yōu)選Na尚子。
權(quán)利要求
1.一種用于促進(jìn)經(jīng)胚泡移植患者懷孕的促孕劑，所述藥劑包括一種或多種溶血磷脂酸。
2.如權(quán)利要求I所述的促孕劑，其特征在于，所述溶血磷脂酸為選自下組的一種或多種LPA-C16:0、LPA-C16:1、LPA-C18:0、LPA-C18:1和 LPA_C18:2。
3.如權(quán)利要求I所述的促孕劑，其特征在于，所述溶血磷脂酸為L(zhǎng)PA-C16:0、LPA-C16:1、LPA-C18:0、LPA-C18:1 和 LPA_C18:2。
4.如權(quán)利要求3所述的促孕劑，其特征在于，所述LPA-C16:O、LPA-C16:1、LPA-C18: O、LPA-C18:1 和 LPA-C18:2 的相互含量比例為摩爾比 36-66 1-2 5-10 13-25 15-28。
5.如權(quán)利要求3所述的促孕劑，其特征在于，在一次給藥中將98-182pmol的LPA-C16:0,2. 8-5. 2pmol 的 LPA-C16:l、14_26pmol 的 LPA-C18:0、36_68pmol 的 LPA_C18:1和40-76pmol的LPA-C18:2注射入所述患者的子宮腔。
6.如權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的促孕劑，其特征在于，所述藥劑在胚泡移植前給予。
7.—種產(chǎn)生溶血磷脂酸的方法，所述方法包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)哺乳動(dòng)物胚胎并收集因此獲得的培養(yǎng)物上清的步驟。
8.如權(quán)利要求7所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述溶血磷脂酸為選自下組的一種或多種LPA-C16:0、LPA-C16:1、LPA-C18:0、LPA-C18:1 和 LPA_C18:2。
9.如權(quán)利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述哺乳動(dòng)物是人。
10.如權(quán)利要求7-9中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基為無(wú)血清培養(yǎng)基。
11.一種胚泡移植中促進(jìn)懷孕的方法，所述方法包括將有效量的一種或多種溶血磷脂酸給予患者的子宮腔。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述溶血磷脂酸為選自下組的一種或多種LPA-C16:0、LPA-C16:1、LPA-C18:0、LPA-C18:1 和 LPA_C18:2。
13.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述溶血磷脂酸為L(zhǎng)PA-C16:0、LPA-C16:1, LPA-C18:0,LPA-C18:1 和 LPA_C18:2。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述LPA-C16:O、LPA-C16:1、LPA-C18: O、LPA-C18:1 和 LPA-C18:2 的相互含量比例為摩爾比 36-66 1-2 5-10 13-25 15-28。
15.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，在一次給藥中將98-182pmol的LPA-C16:0,2. 8-5. 2pmol 的 LPA-C16:l、14_26pmol 的 LPA-C18:0、36_68pmol 的 LPA_C18:1和40-76pmol的LPA-C18:2注射入所述患者的子宮腔。
16.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述溶血磷脂酸在胚泡移植前給予。
全文摘要
目的是發(fā)現(xiàn)具有提高哺乳動(dòng)物胚泡移植中懷孕和著床成功率的活性的化合物，以提供生產(chǎn)和使用該化合物的方法并提供促孕劑。公開(kāi)的促孕劑包括一種或多種選自下組的溶血磷脂酸LPA-C16:0、LPA-C16:1、LPA-C18:0、LPA-C18:1和LPA-C18:2。
文檔編號(hào)A61K31/661GK102781453SQ201080049079
公開(kāi)日2012年11月14日 申請(qǐng)日期2010年8月25日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月26日
發(fā)明者塩谷雅英, 後藤栄, 清水光男 申請(qǐng)人:塩谷雅英, 後藤栄, 日本化學(xué)研究株式會(huì)社