專利名稱：脂質(zhì)體組合物及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明在其一些實(shí)施方式中涉及脂質(zhì)體組合物及其用途。
背景技術(shù)：
基于脂質(zhì)體的DNA和藥物遞送系統(tǒng)在過去四十年有著廣泛的研究，并用作治療各種病況的裝置(mean)。脂質(zhì)體系統(tǒng)允許在良好界定的生物相容性和非免疫原性脂質(zhì)囊泡中高效地包埋親水性和水性化合物，該脂質(zhì)囊泡的直徑為幾納米至幾微米。脂質(zhì)體也可以利用特異性配體如蛋白質(zhì)結(jié)合物或結(jié)合特異細(xì)胞受體的抗體靶向。在癌癥治療中，脂質(zhì)體系統(tǒng)是最受歡迎且全面研究的藥物載體之一。這主要由于增強(qiáng)滲透性和滯留(EPR)效應(yīng)， 所述增強(qiáng)滲透性和滯留效應(yīng)是指腫瘤血管的血管滲透性由于腫瘤血管新生而增大。EPR效應(yīng)導(dǎo)致脂質(zhì)體累積在腫瘤細(xì)胞外液中，這作為被動(dòng)靶向機(jī)制而被利用。用于癌癥治療的脂質(zhì)體藥物遞送的現(xiàn)有技術(shù)狀態(tài)主要包括批準(zhǔn)用于臨床使用的藥物(例如，DaunoXome , Myocet , DoxiI , Caelyx )。當(dāng)前調(diào)查了使脂質(zhì)體系統(tǒng)靶向癌癥的數(shù)種途徑，包括使靶向部分(targeting moiety)與脂質(zhì)體表面(例如，抗體)結(jié)合。合成的陽離子脂質(zhì)體是最常用的DNA遞送載體，但不論是體外還是體內(nèi)優(yōu)選的DNA轉(zhuǎn)移途徑，它們的細(xì)胞毒性仍然是個(gè)問題。另一方面，更加類似于細(xì)胞來源的脂質(zhì)體(就它們的電荷而言)的陰離子脂質(zhì)體也被證明可以介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移，但包封率較差，這由未凝集DNA(uncondensed DNA)的大尺寸和負(fù)電荷引起。通過使DNA與陽離子或聚陽離子(poly-cations)絡(luò)合(complexation)可以提高包封率和保護(hù)DNA不受降解，這種絡(luò)合隨后也顯著提高轉(zhuǎn)染效率。近十年來，數(shù)個(gè)研究已揭示當(dāng)向荷瘤動(dòng)物給予某些原代細(xì)胞，如成人間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell, MSC)、成人造血干細(xì)胞(HSC)和內(nèi)皮細(xì)胞時(shí)，它們累積在腫瘤微環(huán)境中。最新數(shù)據(jù)表明分離的腫瘤細(xì)胞膜組分似乎包含強(qiáng)有力的MSC引誘劑 (attractant)，多于從相同細(xì)胞分離的細(xì)胞質(zhì)組分中所包含的。這個(gè)數(shù)據(jù)暗示，MSC靶向腫瘤細(xì)胞的機(jī)制主要由在腫瘤和MSC上發(fā)現(xiàn)的表面分子結(jié)合產(chǎn)生的細(xì)胞與細(xì)胞之間的相互作用控制。然而，細(xì)胞對(duì)新生血管和腫瘤細(xì)胞分泌的不同可溶性因子(例如，趨化因子)的反應(yīng)被認(rèn)為也被暗示在某種程度上參與MSC歸巢(homing)機(jī)制。該歸巢機(jī)制激發(fā)人們研究這些細(xì)胞作為癌癥治療的靶向遞送媒介物(vehicle)的應(yīng)用。在這些研究中，原代細(xì)胞被分離并用感興趣的不同基因，抗癌基因或報(bào)告基因轉(zhuǎn)導(dǎo)。將該細(xì)胞移植到荷瘤動(dòng)物中，并利用表達(dá)的報(bào)告蛋白確定它們對(duì)腫瘤微環(huán)境的歸巢。腫瘤抑制利用表達(dá)的抗癌癥蛋白質(zhì)實(shí)現(xiàn)。源自哺乳動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)膜的脂質(zhì)體通常用作研究膜和細(xì)胞機(jī)制的工具。也對(duì)細(xì)胞來源的脂質(zhì)體(CDL或復(fù)數(shù)的CDL)作為癌癥免疫治療的工具進(jìn)行了研究。在這些研究中，脂質(zhì)體由腫瘤細(xì)胞膜制備，并用作激發(fā)針對(duì)位于脂質(zhì)體膜上的腫瘤抗原的免疫系統(tǒng)的佐劑。然而，細(xì)胞來源的脂質(zhì)體從未從干細(xì)胞生產(chǎn)出，也從未用作遞送媒介物。此外，也從未開發(fā)出用作靶向平臺(tái)的CDL系統(tǒng)。相關(guān)技術(shù)Boone, C. ff. , Ford, L. E. , Bond, H. E. , Stuart, D. C. & Lorenz, D. Isolation of plasma membrane fragments from HeLa cells. J Cell Biol 41,378-392 (1969).Westerman and Jensen Methods Enzymol. 2003 ；373 :118-27.

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)本發(fā)明一些實(shí)施方式的方面，提供了包含附連(連接，attach)到藥劑上或包封(encapsulate)藥劑(pharmaceutical gent)的脂質(zhì)體的物質(zhì)組合物(組合物， composition-of-matter),該脂質(zhì)體由全細(xì)胞膜組分(whole cell membrane fraction)組成。根據(jù)本發(fā)明一些實(shí)施方式，該細(xì)胞是人細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明一些實(shí)施方式，全細(xì)胞膜的細(xì)胞來源選自干細(xì)胞、原代細(xì)胞(primary cell)、細(xì)胞系(cell-line)、非致瘤細(xì)胞(non-tumorigenic cell)、癌細(xì)胞和免疫細(xì)胞組成的組。根據(jù)本發(fā)明一些實(shí)施方式的方面，提供了包含由干細(xì)胞的全細(xì)胞膜組分組成的脂質(zhì)體的物質(zhì)組合物。根據(jù)本發(fā)明一些實(shí)施方式，該干細(xì)胞包含人間充質(zhì)干細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明一些實(shí)施方式的方面，提供了包含由原代人細(xì)胞的全細(xì)胞膜組分組成的脂質(zhì)體的物質(zhì)組合物。根據(jù)本發(fā)明一些實(shí)施方式的方面，提供了包含由非致瘤人細(xì)胞的全細(xì)胞膜組分組成的脂質(zhì)體的物質(zhì)組合物。根據(jù)本發(fā)明一些實(shí)施方式，該細(xì)胞膜經(jīng)受基因修飾從而表達(dá)外源蛋白(exogenous protein)。根據(jù)本發(fā)明一些實(shí)施方式，該外源蛋白選自細(xì)胞標(biāo)記(細(xì)胞標(biāo)記物，cell marker)、革巴向部分(targeting moiety)和藥劑組成的組。根據(jù)本發(fā)明一些實(shí)施方式，該脂質(zhì)體包封藥劑，或者附連到藥劑上。根據(jù)本發(fā)明一些實(shí)施方式,該藥劑是治療劑(治療劑，therapeutic agent)。根據(jù)本發(fā)明一些實(shí)施方式，物質(zhì)組合物在人對(duì)象(主體、受驗(yàn)者，subject)中是非免疫原性的。根據(jù)本發(fā)明一些實(shí)施方式，該全細(xì)胞膜組分的細(xì)胞來源包含宿主對(duì)象的自體 (autologous)細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明一些實(shí)施方式，該全細(xì)胞膜組分的細(xì)胞來源包含宿主對(duì)象的非自體 (non-autoIogous)細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明一些實(shí)施方式，所述脂質(zhì)體在其外表面上附連到合成的聚合物上。根據(jù)本發(fā)明一些實(shí)施方式，該藥劑是診斷劑。根據(jù)本發(fā)明一些實(shí)施方式，該脂質(zhì)體是單層脂質(zhì)體(單層的、單室的，unilamellar)。根據(jù)本發(fā)明一些實(shí)施方式，該脂質(zhì)體在其外表面上附連到合成的聚合物上。根據(jù)本發(fā)明一些實(shí)施方式，合成的聚合物是聚乙二醇(PEG)。根據(jù)本發(fā)明一些實(shí)施方式，該脂質(zhì)體的尺寸在30_1000nm的范圍內(nèi)。根據(jù)本發(fā)明一些實(shí)施方式的方面，提供了生產(chǎn)脂質(zhì)體的方法，包含(a)使細(xì)胞經(jīng)受低滲條件(hypotonic conditions),以便獲得破裂的細(xì)胞膜和/ 或空胞(ghost);和(b)使破裂的細(xì)胞膜和/或空胞均質(zhì)化(homogenize)從而產(chǎn)生脂質(zhì)體。根據(jù)本發(fā)明一些實(shí)施方式，該均質(zhì)化通過以下而實(shí)現(xiàn)(c)超聲處理破裂的細(xì)胞膜和/或空胞，和可選地(d)通過具有預(yù)定孔隙(孔隙度，porosity)的基質(zhì)(matrix)擠出破裂的細(xì)胞膜和/或空胞。根據(jù)本發(fā)明一些實(shí)施方式，該方法進(jìn)一步包含在步驟(C)之后使合成的聚合物結(jié)合到脂質(zhì)體上。根據(jù)本發(fā)明一些實(shí)施方式的方面，提供了將藥劑包封在脂質(zhì)體中的方法，該方法包含根據(jù)上面的方法制造脂質(zhì)體和在均質(zhì)化步驟之前加入藥劑。根據(jù)本發(fā)明一些實(shí)施方式的方面，提供了包含作為活性成分的物質(zhì)組合物，和藥物可接受載體的藥物組合物。根據(jù)本發(fā)明一些實(shí)施方式的方面，提供了遞送藥劑的方法，該方法包含向需要其的對(duì)象給予物質(zhì)組合物，從而遞送藥劑。根據(jù)本發(fā)明一些實(shí)施方式，該全細(xì)胞膜組分的細(xì)胞來源對(duì)于對(duì)象是自體的。根據(jù)本發(fā)明一些實(shí)施方式，該全細(xì)胞膜組分的細(xì)胞來源對(duì)于所述對(duì)象是非自體的。除非另有限定，否則本文使用的所有技術(shù)和/或科學(xué)術(shù)語的含義都與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的相同。雖然下面描述了示例方法和/或材料，但本發(fā)明實(shí)施方式的實(shí)施或試驗(yàn)中可使用與本文所描述的那些相似或者等效的方法和材料。如有沖突， 以專利說明書為準(zhǔn)，包括定義。另外，材料、方法和實(shí)施例僅為了說明，而未必是限制。


本文僅參考隨附的圖像和圖片[圖像1-10，圖片11]舉例說明本發(fā)明的一些實(shí)施方式。關(guān)于下面詳細(xì)討論的圖像/圖片，要強(qiáng)調(diào)的是，所示細(xì)節(jié)僅為了舉例，用于示意性地討論本發(fā)明的實(shí)施方式。在這方面，參考圖像/圖片所作的描述將使本領(lǐng)域普通技術(shù)人員明了本發(fā)明的實(shí)施方式如何實(shí)施。在圖中圖1A-1C描繪了人MSC。通過吉姆薩(Giemsa)染色顯現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)(圖1A、1B)并通過流式細(xì)胞術(shù)分析典型的MSC(陽性和陰性)表面標(biāo)記(圖1C)。圖2是示出hMSC朝癌細(xì)胞遷移的照片。逐滴接種DiI (紅色)標(biāo)記的hMSC和 DiO(綠色)標(biāo)記的BHK、PC3、Cf2Th和C0S-7細(xì)胞。溫育72小時(shí)后的Maestro顯像證明 hMSC朝PC3前列腺細(xì)胞特異性遷移，同時(shí)“避開”其它細(xì)胞系。
圖3是示出MCF 7來源的調(diào)整培養(yǎng)基(條件培養(yǎng)基，condition media)刺激hMSC 靶向MCF7乳腺癌細(xì)胞系的圖片。圖4A-4B是細(xì)胞來源的脂質(zhì)體的低溫(Cryo) TEM圖像。細(xì)胞來源的脂質(zhì)體由hMSC 細(xì)胞質(zhì)膜制備，并通過與單甲氧基-PEG結(jié)合而PEG化(聚乙二醇化，PEGylated)。然后通過低溫TEM使形成的PEG化(圖4A)和未PEG化⑶L(圖4B)顯像。圖5A-5C是示出⑶L的DLS和Z (Zeta)-電位(Z電勢)分析的圖片。通過數(shù)量重量 (數(shù)均重量，Number-weight) DLS (圖5A)、體積重量(體積均重量，Volume-Weight) DLS (圖 5B)和Z-電位(圖5C)分析未PEG化和PEG化的hMSC來源的CDL的尺寸、尺寸分布和電荷。圖6示出hMSC來源的脂質(zhì)體的表面標(biāo)記特征。由hMSC制備⑶L，使其與甲苯磺酰基活化的Dynabeads 結(jié)合，并針對(duì)hMSC特異性膜標(biāo)記(S卩，CD44、CD29、CD90和CD105) 進(jìn)行FACS分析。圖7A-7B示出由hMSC制備的CDL與前列腺癌細(xì)胞系(PC3)的結(jié)合。將PC3細(xì)胞用DiO(綠色)標(biāo)記,并與之前用DiI (紅色)標(biāo)記的⑶L 一起溫育。溫育12小時(shí)后使培養(yǎng)物顯像。示出代表性3D-投影圖像(圖7A)和單層(單片，single slice)圖像(圖7B)。圖8A-8B是示出由hMSC制備的⑶L與前列腺癌細(xì)胞系(PC3)的濃度依賴性結(jié)合的圖片和FACS直方圖(histogram)。將PC3細(xì)胞與之前用紅色熒光染料(DiI)標(biāo)記的各種濃度的CDL —起溫育。溫育24小時(shí)后，洗滌、收獲細(xì)胞并通過FACS分析(圖8A)。計(jì)算該細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度，對(duì)該平均熒光強(qiáng)度與CDL濃度的自然對(duì)數(shù)作圖(圖8B)。圖9示出由調(diào)整hMSC ( S卩，用癌細(xì)胞調(diào)整培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞)制備的⑶L與前列腺癌細(xì)胞系(PC3)的特異性結(jié)合。由之前已與源自前列腺癌細(xì)胞系(PC3)和非人細(xì)胞系(BHK) 的調(diào)整培養(yǎng)基一起溫育24小時(shí)的hMSC制備DiI-標(biāo)記的⑶L。將由此形成的“調(diào)整”⑶L， 以及由未調(diào)整hMSC(對(duì)照，無CM)制備的⑶L，與PC3和BHK細(xì)胞一起溫育15min、l小時(shí)和 3小時(shí)。溫育后，洗滌、收獲細(xì)胞并通過FACS分析。標(biāo)記中的百分比是指標(biāo)記中DiI標(biāo)記的細(xì)胞比率。僅在左上角直方圖中指出的括號(hào)內(nèi)的百分比是指標(biāo)記中未標(biāo)記細(xì)胞的比率。標(biāo)記和標(biāo)記中未標(biāo)記細(xì)胞百分比對(duì)于所有直方圖都是相同的。圖10A-10B是包埋可溶性腫瘤壞死因子相關(guān)性細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)配體(sTRAIL)的， hMSC來源的脂質(zhì)體的低溫TEM圖像。所制備的含sTRAIL的CDL(圖10A)和空CDL (圖10B) 的終濃度相同，并在相同條件下通過低溫TEM顯像。為了突出CDL含量，將初始灰度的低溫 TEM圖像(左側(cè))重新著色成黑色和白色(右側(cè))。圖11示意性示出基于細(xì)胞來源的脂質(zhì)體(CDL)的靶向載體的整體設(shè)計(jì)。選擇天然特異性地與靶細(xì)胞相互作用的源細(xì)胞(原始細(xì)胞，origin cell)作為細(xì)胞來源的脂質(zhì)體來源。例如，因此選擇通過膜與癌細(xì)胞相互作用的MSC作為癌癥靶向載體來源。對(duì)來源細(xì)胞(source cell)進(jìn)行低滲處理從而得到空胞細(xì)胞(ghost cell),然后使空胞細(xì)胞均質(zhì)化從而制得CDL。由此產(chǎn)生的CDL然后可以與它的來源細(xì)胞類似的方式特異性地結(jié)合其靶細(xì)胞。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明在其一些實(shí)施方式中涉及脂質(zhì)體組合物及其用途。
在詳細(xì)解釋本發(fā)明的至少一個(gè)實(shí)施方式之前，應(yīng)理解本發(fā)明的應(yīng)用不必局限于下面說明中陳述的或通過實(shí)施例舉例說明的細(xì)節(jié)。本發(fā)明能夠有其它實(shí)施方式，或能夠以多種方式實(shí)施或?qū)崿F(xiàn)。癌癥治療面臨的主要挑戰(zhàn)是對(duì)癌細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒作用，同時(shí)不傷害健康細(xì)胞。開發(fā)用于癌癥治療的新型靶向治療遞送策略的重要性早已被世界公以。本發(fā)明人已設(shè)計(jì)出用于將治療和診斷劑靶向遞送到細(xì)胞和組織中的新型遞送媒介物。該遞送媒介物基于脂質(zhì)體，由包含天然脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的全細(xì)胞膜組分組成。通過采用自然(天然，native)細(xì)胞膜，可以將本發(fā)明遞送媒介物調(diào)配成具有低潛在免疫原性，容易歸巢到靶組織中，且可以進(jìn)行基因修飾從而表達(dá)治療劑或靶向部分。如下面和后面實(shí)施例部分說明的以及圖12中進(jìn)一步描繪的，本發(fā)明人已制得由間充質(zhì)干細(xì)胞的全細(xì)胞膜組成的脂質(zhì)體，間充質(zhì)干細(xì)胞因它們的歸巢能力以及它們的免疫抑制能力(即，它們減輕炎癥和抑制免疫細(xì)胞的能力)和低免疫原性特征(即，似隱形特征(stealth-like feature),這種特征使得在進(jìn)行異源移植時(shí)它們作為外來物質(zhì)免疫原性較小且不太容易被識(shí)別)而聞名。該脂質(zhì)體表現(xiàn)出間充質(zhì)干細(xì)胞的蛋白質(zhì)簽章(protein signature)，因此預(yù)期可以介導(dǎo)與完整間充質(zhì)干細(xì)胞類似的免疫抑制和遷移特性。使這些細(xì)胞來源的脂質(zhì)體進(jìn)一步PEG化從而增大它們的生物利用率和分散性，并降低它們的凝聚性。還對(duì)該細(xì)胞來源的脂質(zhì)體進(jìn)行處理從而使其包封治療劑。總之，從這些研究結(jié)果可以看出，本發(fā)明遞送系統(tǒng)可以作為診斷和治療人疾病如癌癥的重要工具。因此，根據(jù)本發(fā)明的方面，提供了包含附連到藥劑上或包封藥劑的脂質(zhì)體的物質(zhì)組合物，所述脂質(zhì)體由全細(xì)胞膜組分組成。如本文使用的術(shù)語“脂質(zhì)體”是指全封閉的載體分子(fully closed carrier molecules),其包含本身為液晶相或液體凝膠相的球形脂質(zhì)膜,其中包含所包埋液體的體積。該兩種液相是不混溶的。因而，本發(fā)明脂質(zhì)體(在本文也稱為細(xì)胞來源的脂質(zhì)體(CDL)， 類似于細(xì)胞的膜，是完全凝膠/液體狀態(tài)和/或液晶狀態(tài)而不是固體狀態(tài)。本發(fā)明一些實(shí)施方式的脂質(zhì)體具有預(yù)期的蛋白質(zhì)脂質(zhì)比，約為O. 8w/w。應(yīng)注意，hMSCc CDL的蛋白質(zhì)含量約為O. 8mg/108個(gè)細(xì)胞(如通過Bradford分析測得的)。該脂質(zhì)含量容易利用Stewart磷脂分析測定。預(yù)期它為約lmg/108個(gè)細(xì)胞。可以利用下面的計(jì)算確定理論磷脂含量。因?yàn)閱蝹€(gè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的干質(zhì)量(干重)為KTmg1數(shù)量級(jí)，且因?yàn)榱字蠹s構(gòu)成該干細(xì)胞質(zhì)量2的10%，因此該細(xì)胞來源的脂質(zhì)體生產(chǎn)過程(假定100%效率)的理論產(chǎn)量應(yīng)為10_8mg磷脂/單個(gè)細(xì)胞或lmg/108個(gè)細(xì)胞的數(shù)量級(jí)。脂質(zhì)體包括泡囊(niosome)、轉(zhuǎn)鐵體(transfersome)、乳劑、泡沫、膠束 (micelle)、液晶、分散體、層狀層(片狀層，lamellar layer)等。該脂質(zhì)體可以是單層脂質(zhì)體或多層脂質(zhì)體(多層的，multilamellar)。根據(jù)本發(fā)明具體實(shí)施方式
，該脂質(zhì)體是單層脂質(zhì)體，如通過低溫TEM測定的。根據(jù)本發(fā)明具體實(shí)施方式
，該脂質(zhì)體具有自然膜對(duì)稱性和自然標(biāo)記的表達(dá)。本發(fā)明脂質(zhì)體由全細(xì)胞膜組分組成。如本文使用的短語“細(xì)胞膜”或“細(xì)胞的膜”(它們可以互換使用)是指生物膜，該生物膜包圍細(xì)胞或者是其細(xì)胞器(例如，葉綠體、ER、高爾基質(zhì)、線粒體、液泡、細(xì)胞核和溶酶體)不可缺少的部分。根據(jù)本發(fā)明具體實(shí)施方式
，細(xì)胞膜是指質(zhì)膜。使用質(zhì)膜具有特別的優(yōu)勢，因?yàn)樗蔬f和細(xì)胞與細(xì)胞之間的相互作用關(guān)聯(lián)的蛋白質(zhì)，以及其它識(shí)別分子，如結(jié)合可溶性配體的受體。如本文使用的“全細(xì)胞膜組分”是指不僅包括脂質(zhì)而且包括膜蛋白質(zhì)的組分。膜蛋白質(zhì)實(shí)例包括,但不局限于,整合蛋白(integral protein)、跨膜蛋白、脂質(zhì)錨定蛋白(lipid anchored protein)和糖蛋白。根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式，全細(xì)胞膜組分也包括碳水化合物。根據(jù)具體實(shí)施方式
，該細(xì)胞是真核細(xì)胞[例如，哺乳動(dòng)物(如人)、植物、昆蟲細(xì)胞]。根據(jù)另外的具體實(shí)施方式
，該真核細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。根據(jù)又一個(gè)另外的實(shí)施方式，該細(xì)胞可以是原代細(xì)胞(S卩，非永生化 (non-immortalized)且有時(shí)未被培養(yǎng))或細(xì)胞系。根據(jù)又一個(gè)另外的實(shí)施方式，該細(xì)胞可以是胚細(xì)胞。對(duì)于在自體或非自體(同系異體(同種異體，syngeneic allogeneic)或異種 (xenogeneic))環(huán)境中使用未培養(yǎng)細(xì)胞的臨床應(yīng)用，使用原代細(xì)胞是有利的。根據(jù)具體實(shí)施方式
，該真核細(xì)胞是干細(xì)胞。如本文使用的短語“干細(xì)胞”是指，在培養(yǎng)時(shí)能夠長時(shí)間保持未分化狀態(tài)(例如， 多能性(全能,pluripotent)干細(xì)胞或多能(multipotent)干細(xì)胞)，直到被誘導(dǎo)分化成具有特定專一化功能的其它細(xì)胞類型(例如，完全分化的細(xì)胞)的細(xì)胞。優(yōu)選地，短語“干細(xì)胞”包括胚胎干細(xì)胞(ESC)、誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞(iPS)、成人干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞和造血干細(xì)胞。根據(jù)具體實(shí)施方式
，該干細(xì)胞是間充質(zhì)干細(xì)胞。間充質(zhì)干細(xì)胞是形成多能母細(xì)胞(formative pluripotent blast cells)。間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)可以產(chǎn)生一種或多種間充質(zhì)組織(例如，脂肪、骨、軟骨、彈性和纖維結(jié)締組織、成肌細(xì)胞、心肌樣細(xì)胞)以及除起源于胚胎中胚層(例如，神經(jīng)細(xì)胞)的組織之外的組織，這取決于來自生物活性因子如細(xì)胞因子的各種影響。MSC可以從胚胎卵黃囊(embryonic yolk sac)、胎盤(placenta)、臍帶、胎兒和青少年皮膚、血液、骨髓、脂肪和其它組織中分離出，但它們?cè)诠撬柚械呢S富度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過它們?cè)谄渌M織中的豐富度。MSC已被證明在包括自身免疫性疾病和移植在內(nèi)的多種環(huán)境下具有免疫抑制功能，使得從其產(chǎn)生的脂質(zhì)體成為炎癥和自身免疫性環(huán)境中的終極工具。分離、純化和擴(kuò)增間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)的方法在本領(lǐng)域中是已知的，包括例如 Caplan 和 Haynesworth 的美國專利 No. 5, 486, 359,以及 Jones E. A.等人，2002, Isolation and characterization of bone marrow multipotential mesenchymal progenitor cells, Arthritis Rheum. 46 (12) :3349-60 中公開的那些。優(yōu)選地，間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)物如下制得用等體積的漢克(Hank' s)平衡鹽溶液 (HBSS ；GIBC0 Laboratories, Grand Island, NY, USA)稀釋 BM 抽吸物(aspirate)(通常 20ml)，并使所稀釋細(xì)胞在約 10ml Ficoll 柱(Ficoll-Paque ;Pharmacia，Piscataway, NJ， USA)上分層。以2，500xg，離心30分鐘后，從分界面中移出單核細(xì)胞層，將其懸浮在HBSS中。然后以1，500xg離心細(xì)胞15分鐘，將其重懸在完全培養(yǎng)基(MEM，無脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的α培養(yǎng)基；GIBC0)中；批量選擇用于使MSC快速生長的20%胎牛血清(FCS) (Atlanta Biologicals, Norcross, GA) ;100 單位/ml 青霉素(GIBCO) ;100yg/ml 鏈霉素 (GIBCO) -M 2mM L-谷氨酰胺(GIBCO)。將重懸細(xì)胞接種(涂平板，plate)于IOcm培養(yǎng)皿 (CorningGlass Works, Corning, NY)中的約 25ml 培養(yǎng)基中，并在 37。。和 5%加濕 CO2 下溫育。培養(yǎng)24小時(shí)后，棄去非粘附性細(xì)胞，用磷酸緩沖鹽水(PBS)充分洗滌粘附細(xì)胞兩次。每隔3天或4天用新鮮完全培養(yǎng)基更換培養(yǎng)基，持續(xù)約14天。然后在37°C下利用O. 25%胰蛋白酶和ImM EDTA(胰蛋白酶/EDTA，GIBCO)收獲粘附細(xì)胞5min，將其重新接種(r印late) 于6-cm板中，再培養(yǎng)14天。然后使細(xì)胞胰蛋白酶化(trypsinize),并利用細(xì)胞計(jì)數(shù)裝置如血球計(jì)(Hausser Scientific,Horsham,PA)進(jìn)行計(jì)數(shù)。培養(yǎng)的細(xì)胞通過離心回收，并用5% DMSO和30% FCS以I 2X106個(gè)細(xì)胞/ml的濃度重懸。緩慢冷凍每個(gè)約Iml等分試樣，存放在液氮下。為了擴(kuò)增間充質(zhì)干細(xì)胞組分，在37°C下使冷凍細(xì)胞解凍(thaw)，用完全培養(yǎng)基稀釋并通過離心回收從而除去DMS0。將細(xì)胞重懸在完全培養(yǎng)基中，并按約5，000個(gè)細(xì)胞/cm2 的濃度接種。培養(yǎng)24h后，除去非粘附性細(xì)胞，利用胰蛋白酶/EDTA收獲并通過窄型巴士德移液管(Pasteur pipette)分離(dissociate)粘附細(xì)胞，優(yōu)選以約L 5 約3. O個(gè)細(xì)胞/cm2的密度重新接種。在這些條件下,MSC培養(yǎng)物可以生長約倍增50次(50population doublings),并擴(kuò)增約 2000 倍[Colter DC,等人，Rapid expansion ofrecycling stem cells in cultures of plastic-adherent cells from human bone marrow. Proc Natl Acad Sci USA. 97 :3213-3218,2000]0本發(fā)明利用的MSC培養(yǎng)物優(yōu)選包括通過形態(tài)特征限定的三組細(xì)胞小的無顆粒細(xì)胞(agranular cells)(本文下面稱為RS-1)、小的粒細(xì)胞(顆粒細(xì)胞,granular cells)(本文下面稱為RS-2),以及大的中度粒細(xì)胞(moderately granular cells)(本文下面稱為成熟MSC)。培養(yǎng)物中此種細(xì)胞的存在和濃度可以通過利用例如免疫熒光、原位雜交和活性分析鑒定是否存在各種細(xì)胞表面標(biāo)記來測定。當(dāng)在本發(fā)明培養(yǎng)條件下培養(yǎng)MSC時(shí)，它們對(duì)造血干細(xì)胞標(biāo)記⑶34、⑶11B、⑶43和 ⑶45呈陰性染色。少部分細(xì)胞(少于10% )對(duì)⑶31和/或⑶38標(biāo)記呈弱陽性。另外， 成熟MSC對(duì)造血干細(xì)胞標(biāo)記⑶117 (c-Kit)呈弱陽性；對(duì)成骨MSC標(biāo)記Stro-I呈中度陽性 [Simmons, P. J. &Torok_Storb，B. (1991) · Blood 78，5562]，且對(duì)胸腺細(xì)胞和外周 T 淋巴細(xì)胞標(biāo)記⑶90 (Thy-I)呈陽性。另一方面，RS-I細(xì)胞對(duì)⑶117和Strol標(biāo)記呈陰性，而對(duì)⑶90 標(biāo)記呈弱陽性，RS-2細(xì)胞對(duì)所有這些標(biāo)記都呈陰性?？捎米魅?xì)胞膜組分有效來源的其它細(xì)胞包括，但不局限于，內(nèi)皮細(xì)胞、肝細(xì)胞、 胰腺細(xì)胞、骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞(chondrocyte)、神經(jīng)細(xì)胞等。該細(xì)胞可以以自然形式使用(used native) (B卩，未通過基因修飾操縱)或?qū)υ摷?xì)胞進(jìn)行基因修飾從而操縱該細(xì)胞的膜組分。基因修飾的優(yōu)點(diǎn)在于其效率提高。基因修飾細(xì)胞產(chǎn)生的基本所有(> 95% )OTL 都表達(dá)感興趣的基因。該感興趣的基因可以組成型表達(dá)于細(xì)胞來源(通過整合到細(xì)胞基因組中)或短暫表達(dá)(游離型表達(dá)(episomal expression))以便避免穩(wěn)定轉(zhuǎn)染劑(例如，慢病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體)的有害影響。
因而，該細(xì)胞可以經(jīng)過基因修飾從而表達(dá)感興趣的基因(即，不但表達(dá)未天然表達(dá)于天然膜中的基因，而且用以增強(qiáng)以較低水平天然表達(dá)于該細(xì)胞膜上的內(nèi)源蛋白質(zhì)的表達(dá))。根據(jù)具體實(shí)施方式
，感興趣的基因編碼膜蛋白質(zhì)。感興趣的基因可以是天然膜蛋白質(zhì)，或者經(jīng)修飾從而具有膜錨定所需的膜定位信號(hào)和其它基序，如跨膜結(jié)構(gòu)域。可以異源(外源)表達(dá)的膜蛋白質(zhì)實(shí)例包括，但不局限于，靶向蛋白質(zhì)(例如，抗體、受體、膜錨定配體、誘餌蛋白(誘騙體，decoy))、影響膜化學(xué)(性質(zhì))的蛋白質(zhì)(例如， 結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)、帶電荷蛋白質(zhì))、診斷蛋白質(zhì)(例如，在以下段落中描述的酶)，和治療性蛋白質(zhì)(如在以下段落中描述的)。靶向部分包括與細(xì)胞表面或細(xì)胞外基質(zhì)標(biāo)記結(jié)合的靶向蛋白質(zhì)，如抗體、受體配體和非蛋白質(zhì)性分子如碳水化合物。例如，在前列腺癌細(xì)胞上過表達(dá)的前列腺特異膜抗原 (PSMA)可以被它的結(jié)合到跨膜基序(例如，截?cái)郩ME)4上的配體NAAG3靶向。這可以通過遺傳改造該細(xì)胞(CDL來源于其中)從而使其表達(dá)NAAG的嵌合或自然形式實(shí)現(xiàn)。例如，編碼UME的表達(dá)質(zhì)粒通過PCR以及隨后將相應(yīng)片段插入到pcDNA3. I (Invitrogen)中來構(gòu)建。該引物也具有BamHI (5'引物和3'引物)位點(diǎn)延伸從而使亞克隆容易進(jìn)行。PCR產(chǎn)物利用BamHI消化并插入到pcDNA3. 1(+) (CLONTECH Laboratories, Inc.)中的相應(yīng)位點(diǎn)處。 對(duì)于編碼LME-乙?；於滨；劝彼?NAAG)的表達(dá)載體，可以將開放閱讀框插入到編碼UME的質(zhì)粒中，以便NAAG通過其N-端結(jié)合并且它的C端保持游離從而與PSMA[ BP, LIME (C) - (N) NAAG-C00H]反應(yīng)。替換地，編碼NAAG-UME嵌合體的表達(dá)質(zhì)?？梢园凑涨懊驷槍?duì)⑶8-UME嵌合體5描述的方法構(gòu)建。與NAAG和UME跨膜區(qū)對(duì)應(yīng)的片段通過PCR產(chǎn)生。 對(duì)編碼NAAG的3’序列和UME片段的5’序列的引物進(jìn)行設(shè)計(jì)從而使其重疊(overlap)， 以便使該兩種產(chǎn)物退火產(chǎn)生混合模版(hybrid template)。從這個(gè)模板,利用包含Xbal位點(diǎn)的外側(cè)引物(external primer)擴(kuò)增該嵌合體。將NAAG-LIME嵌合體插入pcDNA3. I (+) 中。如本文使用的短語“表面標(biāo)記”是指被靶細(xì)胞/組織的細(xì)胞表面或細(xì)胞外基質(zhì)以獨(dú)特的高密度特異性展示，和/或以獨(dú)特構(gòu)型展示的任何化學(xué)結(jié)構(gòu)。例如，靶向部分可能對(duì)靶向腫瘤細(xì)胞有用。例如，人們通常認(rèn)為腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的堿性大于它們鄰近的細(xì)胞外環(huán)境，反過來它們鄰近的細(xì)胞外環(huán)境的酸性大于在滋養(yǎng)腫瘤的新生血管(angiogenic blood vessel)中發(fā)現(xiàn)的微環(huán)境。另外,許多先前的研究已證明，腫瘤細(xì)胞的表面電荷比良性正常細(xì)胞的表面電荷的負(fù)性更強(qiáng)(more negative)，更不必說侵襲性腫瘤細(xì)胞。因此，表達(dá)膜結(jié)合酶和/或蛋白質(zhì)可能有用，這將使得僅帶正電荷的脂質(zhì)體位于酸性的腫瘤中間細(xì)胞外環(huán)境。例如，可以使用落在新生血管高堿性pH (pH > 7. 4) 和腫瘤鄰近的細(xì)胞外環(huán)境低酸性pH (pH < 7. 2)之間pi為約7. 2-7. 4的任何膜蛋白。此種蛋白質(zhì)可以通過交叉參考人血漿膜蛋白的RCSB Protein Data Bank(PDB)特異性鑒定。這些蛋白質(zhì)預(yù)期理想的Pl (7. 2-7. 4)可以利用標(biāo)準(zhǔn)迭代算法1(Μ1計(jì)算，標(biāo)準(zhǔn)迭代算法將為粗蛋白質(zhì)序列12’13給出相對(duì)精確的PI計(jì)算結(jié)果。在ExPASy服務(wù)器中的Compute pI/Mw工具中運(yùn)用該算法。預(yù)期此種脂質(zhì)體在新生腫瘤血管堿性微環(huán)境中具有負(fù)電荷或中性電荷，而在較酸性的腫瘤鄰近的細(xì)胞外環(huán)境中具有正電荷。因此，這種電荷改變對(duì)于顯著增大中性顆粒負(fù)性的脂質(zhì)體外滲(liposomal extravasation)有利,而且對(duì)于更容易利用帶正電荷顆粒完成的腫瘤內(nèi)遞送有利8’14’15。關(guān)于在疾病如癌癥中特異性過表達(dá)的表面標(biāo)記以及對(duì)此種表面標(biāo)記有特異性的抗體的詳盡指導(dǎo)記載在現(xiàn)有技術(shù)的文獻(xiàn)(例如，參考AM Scott, C Renner." Tumour Antigens Recognised by Antibodies. " , Encyclopedia of Life Sciences, Nature Publishing Group, Macmillan, London, UK, www. els, net, 2001)中。與特異性展示生長因子受體/TAA表面標(biāo)記的靶細(xì)胞/組織關(guān)聯(lián)的，可通過本發(fā)明方法治療的疾病包括，例如，特異性展示生長因子受體/TAA的許多疾病中的一些，所述的生長因子受體/TAA為，例如EGF受體、血小板來源的生長因子(TOGF)受體、胰島素樣生長因子受體、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)受體、成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)受體、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體，和葉酸受體。此種疾病和這些疾病特異性展示的生長因子受體/TAA的具體實(shí)例在下表 I中列出。表I
權(quán)利要求
1.一種包含附連到藥劑上或包封藥劑的脂質(zhì)體的物質(zhì)組合物，所述脂質(zhì)體由全細(xì)胞膜組分組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的物質(zhì)組合物，其中，所述細(xì)胞是人細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的物質(zhì)組合物，其中，所述全細(xì)胞膜的細(xì)胞來源選自干細(xì)胞、原代細(xì)胞、細(xì)胞系、非致瘤細(xì)胞、癌細(xì)胞和免疫細(xì)胞組成的組。
4.一種包含由干細(xì)胞的全細(xì)胞膜組分組成的脂質(zhì)體的物質(zhì)組合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的物質(zhì)組合物，其中，所述干細(xì)胞包含人間充質(zhì)干細(xì)胞。
6.一種包含由原代人細(xì)胞的全細(xì)胞膜組分組成的脂質(zhì)體的物質(zhì)組合物。
7.一種包含由非致瘤人細(xì)胞的全細(xì)胞膜組分組成的脂質(zhì)體的物質(zhì)組合物。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-6所述的物質(zhì)組合物，其中，所述細(xì)胞膜經(jīng)受基因修飾從而表達(dá)外源蛋白。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的物質(zhì)組合物，其中，所述外源蛋白選自細(xì)胞標(biāo)記、靶向部分和所述藥劑組成的組。
10.根據(jù)權(quán)利要求4-8所述的物質(zhì)組合物，其中，所述脂質(zhì)體包封藥劑，或者附連到藥劑上。
11.根據(jù)權(quán)利要求I所述的物質(zhì)組合物，其中，所述藥劑是治療劑。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的物質(zhì)組合物，其在人對(duì)象中是非免疫原性的。
13.根據(jù)權(quán)利要求1-12所述的物質(zhì)組合物，其中，所述全細(xì)胞膜組分的細(xì)胞來源包含宿主對(duì)象的自體細(xì)胞。
14.根據(jù)權(quán)利要求1-12所述的物質(zhì)組合物，其中，所述全細(xì)胞膜組分的細(xì)胞來源包含宿主對(duì)象的非自體細(xì)胞。
15.根據(jù)權(quán)利要求11所述的物質(zhì)組合物，其中，所述藥劑是診斷劑。
16.根據(jù)權(quán)利要求1-11所述的物質(zhì)組合物，其中，所述脂質(zhì)體是單層脂質(zhì)體。
17.根據(jù)權(quán)利要求1-16所述的物質(zhì)組合物，其中，所述脂質(zhì)體在其外表面上附連到合成的聚合物上。
18.根據(jù)權(quán)利要求1-17所述的物質(zhì)組合物，其中，所述合成的聚合物是聚乙二醇 (PEG)。
19 根據(jù)權(quán)利要求1-18所述的物質(zhì)組合物，其中，所述脂質(zhì)體的尺寸在30-1000nm的范圍內(nèi)。O
20.根據(jù)權(quán)利要求1-19所述的物質(zhì)組合物，其中，所述脂質(zhì)體進(jìn)一步由合成的脂質(zhì)組成。
21.一種生產(chǎn)脂質(zhì)體的方法，包括(a)使細(xì)胞經(jīng)受低滲條件，以便獲得破裂的細(xì)胞膜和/或空胞；和(b)使所述破裂的細(xì)胞膜和/或空胞均質(zhì)化從而產(chǎn)生脂質(zhì)體。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中，所述均質(zhì)化通過以下實(shí)現(xiàn)(c)超聲處理所述破裂的細(xì)胞膜和/或空胞，和可選地(d)通過具有預(yù)定孔隙的基質(zhì)擠出所述破裂的細(xì)胞膜和/或空胞。
23.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，進(jìn)一步包括在步驟(c)之后使合成的聚合物結(jié)合到所述脂質(zhì)體上。
24.一種將藥劑包封在脂質(zhì)體中的方法，所述方法包括根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法制造脂質(zhì)體，和在所述均質(zhì)化步驟之前加入所述藥劑。
25.一種包含作為活性成分的權(quán)利要求I所述的物質(zhì)組合物、和藥物可接受載體的藥物組合物。
26.—種遞送藥劑的方法，所述方法包括向需要其的對(duì)象給予權(quán)利要求I所述的物質(zhì)組合物，從而遞送所述藥劑。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中，所述全細(xì)胞膜組分的細(xì)胞來源對(duì)于所述對(duì)象是自體的。
28.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中，所述全細(xì)胞膜組分的細(xì)胞來源對(duì)于所述對(duì)象是非自體的。
全文摘要
提供了包含由全細(xì)胞膜組分組成的脂質(zhì)體的組合物。該脂質(zhì)體可以附連到藥劑上或包封藥劑。還提供了制取和使用這些脂質(zhì)體的方法。
文檔編號(hào)A61K9/127GK102596179SQ201080048954
公開日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2010年8月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月27日
發(fā)明者托梅爾·布龍施泰因, 瑪塞勒·馬克魯夫 申請(qǐng)人:工業(yè)研究與發(fā)展基金會(huì)有限公司