專利名稱：藥用植物的提取物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及包含中藥植物提取物的組合物、用于制備中藥植物提取物的方法及其在治療HIV感染中的應(yīng)用。背景和概要
高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法(HAART)是現(xiàn)行的HIV/AIDS治療方式。盡管HAART很有效地抑制HIV-I復(fù)制和降低HIV/AIDS患者的死亡率這一事實，但HAART不能根治HIV/AIDS已日益清晰。HAART方案的昂貴的費(fèi)用阻礙了它傳送給全世界超過90%的HIV/AIDS群體。這個事實強(qiáng)調(diào)了開發(fā)便宜的抗HIV/AIDS替代療法的迫切需求?？笻IV-I疫苗和殺微生物劑最近的臨床試驗失敗進(jìn)一步表明此需求。本文描述的是傳統(tǒng)中藥草本植物的提取物組的抗HIV活性及其抗HIV-I復(fù)制的活性，所述植物自中國海南島獲得，海南島是一個生物多樣的熱帶/亞熱帶島嶼。I型人免疫缺陷病毒(HIV-I)引發(fā)獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)。在全身水平，HIV-I初次感染始于其與上皮樹突細(xì)胞的初接觸，接著是其感染這些細(xì)胞和/或傳送到淋巴結(jié)中的⑶4+T細(xì)胞。接著是HIV-I的快速病毒復(fù)制和進(jìn)一步傳播到其它淋巴樣器官中，臨床上稱為病毒血癥，此時HIV-I感染的個體呈現(xiàn)出由發(fā)熱、頭痛等表明的流感樣疾病。臨床癥狀的嚴(yán)重程度和持續(xù)時間在個體間不同?？笻IV-I抗體通常在感染后3-6星期出現(xiàn)，同時活化⑶4+T細(xì)胞開始減少。在數(shù)周或數(shù)月之內(nèi)，外周血中的⑶4+T細(xì)胞數(shù)和HIV-I病毒水平(病毒載量)穩(wěn)定，并建立慢性無癥狀的潛伏性感染。在疾病晚期將活化潛伏感染的細(xì)胞，而且臨床表現(xiàn)變得有癥狀，典型地表現(xiàn)出疲勞、體重減輕以及發(fā)熱。HIV-I復(fù)制和CD4+T細(xì)胞減少在有癥狀階段加速，這使HIV-I感染的對象易于受各種機(jī)會性感染，例如假絲酵母、肺囊蟲(Pneumocystis)、弓形體和分枝桿菌(mycobacteria)。⑶4+T細(xì)胞計數(shù)低于200/Ul和機(jī)會性感染是AIDS患者的兩個重要的特征。在缺乏醫(yī)學(xué)干預(yù)的情況下，⑶4+T細(xì)胞減少和免疫系統(tǒng)的破壞會持續(xù)，最終導(dǎo)致死亡。⑶4+T淋巴細(xì)胞是HIV-I感染的天然靶標(biāo)。在細(xì)胞水平，HIV-I的生命周期始于HIV-I gpl20與表達(dá)于HIV-I靶細(xì)胞表面的細(xì)胞受體⑶4及趨化因子受體CCR5或CXCR4結(jié)合，接著是gp41的構(gòu)象變化，其又導(dǎo)致病毒-細(xì)胞膜融合和病毒核心(核殼體)進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。病毒體核心經(jīng)歷脫殼，病毒編碼的酶逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)將病毒的RNA基因組轉(zhuǎn)化成前病毒DNA。所述DNA進(jìn)入細(xì)胞核并通過第二種病毒編碼的酶整合酶(IN)共價整合到宿主細(xì)胞的基因組中。所述整合的病毒DNA作為用于病毒轉(zhuǎn)錄和合成子代病毒的各種組分的模板。子代病毒在質(zhì)膜上裝配及通過質(zhì)膜出芽。結(jié)果，所述子代病毒被一層膜包裹，所述膜亦包埋病毒包膜糖蛋白。伴隨著出芽，第三種病毒編碼的酶蛋白酶(PR)將核心蛋白加工成它們的最終形式，病毒體經(jīng)歷被稱為成熟的形態(tài)變化。該最后一步為所述子代病毒的下一輪感染作準(zhǔn)備?？笻IV-I療法的開發(fā)已與在對HIV-I感染和發(fā)病機(jī)理的基本理解上取得的進(jìn)展并行?？笻IV-I治療開發(fā)的主要靶標(biāo)是兩種病毒編碼的酶逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)和HIV蛋白酶(PR)。食品及藥物管理局(FDA)已批準(zhǔn)總共21種抗HIV-I藥物，這些藥物大部分是HIV-I RT和PR的抑制劑。高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法(HAART)，即多種抗HIV-I藥物的聯(lián)合，有效地抑制病毒復(fù)制并已引起所述疾病死亡率的顯著下降、HIV/AIDS患者壽命的延長以及這些患者生命質(zhì)量的改善。然而，諸如病毒儲藏庫、藥物抗性 、高劑量和高頻率以及高昂的成本等問題已引起HIV/AIDS患者管理的重要危機(jī)，尤其是在有最大需求的發(fā)展中國家中。HAART不能完全解決問題已顯而易見。同時，已將相對較少數(shù)的抗HIV-I療法發(fā)展到靶向包括進(jìn)入、融合和整合在內(nèi)的HIV-I生命周期的其它階段。另一方面，最近關(guān)于抗HIV-I疫苗和殺微生物劑的試驗已表明一些當(dāng)前的疫苗和殺微生物劑策略不但不能預(yù)防反而實際上增加了 HIV-I感染和傳播的風(fēng)險。因此，亟需另外的和替代的抗HIV-I治療策略，以抑制此病毒破壞受感染個體的免疫系統(tǒng)以及向他人傳播。所有當(dāng)前FDA批準(zhǔn)的抗HIV藥物均是化學(xué)合成的。這些藥物的開發(fā)包括長周期的研究、設(shè)計和最優(yōu)化，因此這些藥物是非常昂貴的。這些藥物中的許多是宿主代謝組分的結(jié)構(gòu)類似物；因此，副作用和不黏附問題常常限制這些藥物的使用。相反，天然起源的藥物(例如草藥)常常具有更短的開發(fā)周期而且可相對便宜。此外，自然起源的藥療法的毒性較不常是問題。最近的研究表明那些在進(jìn)行抗HIV藥療法的人中多于三分之二亦在進(jìn)行替代療法，包括將近25%在進(jìn)行源自植物性藥材和中草藥的那些替代療法。因為其對于使抗HIV療法對包括發(fā)展中國家和欠發(fā)達(dá)國家的那些在內(nèi)的所有HIV/AIDS受累個體而言最終負(fù)擔(dān)得起及可獲得的貢獻(xiàn)，無疑地有需要進(jìn)一步研究及開發(fā)此抗HIV的替代療法。已進(jìn)行一些努力以鑒定在臨床環(huán)境下抵抗HIV/AIDS的天然藥物。許多天然產(chǎn)物，包括得自微生物、海洋生物和植物的那些，已顯示具有抗HIV-I活性，據(jù)認(rèn)為這些天然產(chǎn)物在HIV-I生命周期的各個階段抑制HIV-I復(fù)制。目前，已從海洋生物中分離的多于150種天然產(chǎn)物顯示有希望的抗HIV-I活性。一個實例是藍(lán)藻抗病毒蛋白N，一種最初從藍(lán)藻類細(xì)菌(藍(lán)-綠藻)橢孢念珠藻(Nostoc el Iipsosporum)中分離的IlKDa的抗HIV-1蛋白。據(jù)認(rèn)為，藍(lán)藻抗病毒蛋白N通過與HIV-I gpl20結(jié)合來抑制HIV-I復(fù)制，因此其使病毒失活和阻斷病毒與細(xì)胞膜的融合。此蛋白目前正在進(jìn)行用作抗HIV-I殺微生物劑的II期臨床試驗。傳統(tǒng)中藥(Traditional Chinese Medicine, TCM)有非常悠久的歷史。它們已用于治療多種人類疾病而且中國政府視之為國家文化寶藏。TCM的發(fā)展和標(biāo)準(zhǔn)化最近已提議為中華人民共和國下一個5-10年的頂尖生物醫(yī)藥研究重點。關(guān)于TCM的抗HIV活性和機(jī)理的研究是非常有限的并預(yù)期加速。目前，HIV-I抑制性TCM據(jù)報道包括黃岑(Scutellariabaicalensis Georgi)、夏枯草(Prunella vulgaris)、牡丹(Paeonia Suffruticosa)、虎杖(Rhizoma Polygoni Cuspidati)、三七(Radix Notoginseng)、懈寄生(Ramulus Visci)和金瘡小草(Ajuga Decumbens Thumb)。在本發(fā)明的一個實施方案中，描述了用于制備包含活性級分的可用于治療HIV感染的藥物組合物的方法，所述方法包括從植物材料中獲取活性級分的步驟，所述植物材料獲自大戟科(Euphorbiaceae)劍葉三寶木(Trigonostema xyphophylloides)、龍腦香科(Dipterocarpaceae)青梅(Vatica astrotricha)、番蒸枝科(Annonaceae)毛葉鷹爪花(Artabotrys piIosus)或番蒸枝科_果阜帽花(Dasymaschalon rostratum)。在另一個實施方案中，描述了用于制備包含活性級分的可用于治療HIV感染的藥物組合物的方法，所述方法包括從獲自大戟科劍葉三寶木或龍腦香科青梅的植物材料中獲取活性級分的步驟。在另一個實施方案中，描述了用于制備包含活性級分的可用于治療HIV感染的藥物組合物的方法，所述方法包括下述步驟a)干燥獲自大戟科劍葉三寶木、龍腦香科青梅、番荔枝科毛葉鷹爪花或番荔枝科喙果皂帽花的植物材料；b)研磨所述經(jīng)干燥的植物材料；以及
c)用第一提取劑提取所述經(jīng)研磨的植物材料以產(chǎn)生包含活性級分的植物提取物。在另一個實施方案中，描述了前述實施方案的方法，其還包括下述步驟d)除去基本上所有的第一提取劑以產(chǎn)生第一剩余物；以及e)用第二提取劑提取第一剩余物以產(chǎn)生包含活性級分的第二提取物。在另一個實施方案中，描述了用于制備包含活性級分的可用于治療HIV感染的藥物組合物的方法，所述方法包括下述步驟a)干燥獲自大戟科劍葉三寶木或龍腦香科青梅的植物材料；b)研磨所述經(jīng)干燥的植物材料；以及c)用第一提取劑提取所述經(jīng)研磨的植物材料以產(chǎn)生包含活性級分的植物提取物。在另一個實施方案中，描述了由前述方法實施方案的任一個產(chǎn)生的藥物組合物。
在另一個實施方案中，描述了治療需要緩解HIV感染的患者的方法，所述方法包括向所述患者給予治療有效量的任一前述實施方案所描述的藥物組合物的步驟。在另一個實施方案中，描述了可用于治療HIV感染的活性級分，其通過以下方法從包含至少一種選自大戟科劍葉三寶木、龍腦香科青梅、番荔枝科毛葉鷹爪花和番荔枝科喙果皂帽花的植物的一個或多個植物部分的植物材料中得到，所述方法包括用第一提取劑提取所述植物材料的步驟。在另一個實施方案中，描述了用于制備可用于治療HIV感染的活性級分的方法，其中所述方法包括用第一提取劑提取來自大戟科劍葉三寶木、龍腦香科青梅、番荔枝科毛葉鷹爪花或番荔枝科喙果皂帽花的植物材料的步驟。在另一個實施方案中，一種包含活性級分的可用于治療HIV感染的藥物組合物，其中通過包括用第一提取劑提取來自大戟科劍葉三寶木、龍腦香科青梅、番荔枝科毛葉鷹爪花或番荔枝科喙果皂帽花的植物材料的步驟的方法制備所述活性級分。一種用于治療需要緩解HIV感染的患者的方法，所述方法包括向所述患者給予治療有效量的任一種本文描述的活性級分或者藥物組合物的步驟。附圖簡述圖IA :來自TXE和VAD的提取物對HIV復(fù)制的作用。將Jurkat細(xì)胞用HIV-1 HXB2感染，然后在感染24小時后暴露于所述提取物。每隔一天加入新鮮提取物。同時，收集培養(yǎng)上清液用于RT活性測定。DMSO為所述提取物的溶劑，并將其包括為陰性對照，而包括AZT作為陽性對照。另外，也包括沒有HIV感染的Jurkat細(xì)胞[對照，(-HIV)]和有HIV感染但沒有任何處理的Jurkat細(xì)胞[對照，(+HIV) ]。a)對照(沒有HIV感染)，b)陰性對照(HIV 感染，沒有處理)，c)DMSO(l% )，d) DMSO (0. 1% ), e)DMS0(0. 01% )，f) AZT (IOuM),g) AZT (I u M), h) TXE (100 u g/ml), i) TXE (10 u g/ml), j) TXE (I u g/ml), k) VAD (100 u g/ml)，DVADdOu g/ml)，m)AD(l u g/ml)。這些數(shù)據(jù)是三次獨立實驗的代表。圖IB :來自TXE和VAD的提取物對細(xì)胞存活的作用。將Jurkat細(xì)胞用HIV-1 HXB2感染，然后在感染24小時后暴露于所述提取物。每隔一天加入新鮮提取物。用臺盼藍(lán)染料染細(xì)胞的等分試樣并計數(shù)活細(xì)胞。DMSO為所述提取物的溶劑，并將其包括為陰性對照，而包括AZT作為陽性對照。另外，也包括沒有HIV感染的Jurkat細(xì)胞[對照，(-HIV)]和有HIV感染但沒有任何處理的Jurkat細(xì)胞[對照，(+HIV) ]，a)對照(沒有HIV感染)，b)陰性對照(HIV 感染，沒有處理)，c) DMSO (I % ),d) DMSO (0. 1% ),e) DMSO (0. 01 % ), f) AZT (10 u M),g) AZT (I u M), h) TXE (100 u g/ml), i) TXE (10 u g/ml), j) TXE (I u g/ml), k) VAD (100 u g/ml)，DVADdOu g/ml)，m)AD(l u g/ml)。這些數(shù)據(jù)是三次獨立實驗的代表。 圖2 :所述提取物對細(xì)胞增殖和細(xì)胞存活的作用。如所示將Jurkat細(xì)胞暴露于所述提取物達(dá)不同時間長度。每隔一天加入新鮮提取物。將沒有任何處理的細(xì)胞、用DMSO或AZT處理的細(xì)胞包括為對照。使用臺盼藍(lán)染料染色測定活細(xì)胞。這些數(shù)據(jù)是三次獨立實驗的代表。圖3 :所述提取物對受HIV-I感染的Jurkat細(xì)胞中的合胞體形成的作用。將Jurkat細(xì)胞用HIV-I感染，然后暴露于10 u g/mL提取物、0. I % DMSO或5 y M AZT。在2星期感染的過程中在光學(xué)顯微鏡下從來自一式三份樣品的每一份的4個隨機(jī)視野中計數(shù)每一種這些處理中的合胞體。數(shù)據(jù)表示感染后第7天的合胞體的數(shù)量，在第7天時在沒有接受處理(未處理)或接受DMSO處理的感染中記錄到合胞體的最大數(shù)量。包括沒有HIV-I感染的Jurkat細(xì)胞作為對照(模擬的)。數(shù)據(jù)為三次重復(fù)實驗的平均值土SEM。圖4 :所述提取物對RT活性的直接作用。在存在10 U g/mL提取物的情況下測定HIV-I病毒體的RT活性。包括AZT-TP (5 PM)作為陽性對照。將DMS0(0. 1% )和磷酸緩沖鹽水(PBS)包括分別作為提取物和AZT的溶劑對照。也將沒有任何輸入HIV-I病毒體的RT反應(yīng)包括作為測定對照。數(shù)據(jù)為三次重復(fù)實驗的平均值土SEM。圖5 :所述提取物對HIV-I進(jìn)入的作用。用10 ii g/mL濃度的TXE (圖A)或VAD (圖B)處理U87.⑶4. CXCR4細(xì)胞30分鐘，然后用HIV-Luc病毒感染2小時，所述HIV-Luc病毒用T向性HIV-1 HXB2包膜(HXB2)假型包裝(pseudotyped)或沒有包膜(-)。感染48小時后收獲細(xì)胞用于Luc活性測定。包括用VSV-G包膜(VSV-G)假型包裝的HIV-Lus病毒作為對照。也包括DMSO (0. 1%)作為提取物的溶劑對照。數(shù)據(jù)是三次重復(fù)實驗的平均值土SEM。圖6 :所述提取物對HIV-I和HIV-I基因表達(dá)的作用。圖A :用10 y g/mL提取物孵育T向性HIV-1 HXB2包膜(HXB2)假型包裝的HIV-Luc病毒2小時，然后用于感染U87.⑶4.CXCR4細(xì)胞。感染48小時后收獲48小時的細(xì)胞用于Luc活性測定。包括用熱滅活的HIV-Luc/HXB2病毒(A病毒)的感染作為對照。圖B :用T向性HIV-1 HXB2包膜(HXB2)假型包裝的或沒有包膜(_)的HIV-Luc病毒感染U87.⑶4. CXCR4細(xì)胞2小時，然后通過用新鮮培養(yǎng)基反復(fù)洗滌除去剩余的輸入病毒。然后，在所述提取物(lOyg/mL)存在的情況下培養(yǎng)受感染細(xì)胞48小時，然后收獲用于Luc活性測定。也包括DMS0(0. 1%)作為所述提取物的溶劑對照，并包括0. 5 i! M AZT作為陽性對照。數(shù)據(jù)是三次重復(fù)實驗的平均值土SEM。圖7 :所述提取物對初級HIV-I分離群89. 6的作用。圖A :首先用10 U g/mL提取物處理U87.⑶4. CXCR4和U87.⑶4. CCR5細(xì)胞，然后用由89. 6包膜假型包裝的HIV-Luc病毒感染。包括無包膜的HIV-Luc病毒的感染作為模擬感染對照。圖B:首先，用lOiig/mL提取物孵育89. 6包膜假型包裝的HIV-Lus病毒，然后將其用于感染U87.⑶4. CXCR4細(xì)胞和U87 ⑶4. CCR5細(xì)胞。包括用熱滅活的HIV-Luc/89.6病毒(A病毒)的感染作為對照。圖C :將U87. CD4. CXCR4和U87. CD4. CCR5首先用由89. 6包膜假型包裝的HIV-Luc病毒感染，然后用10 U g/mL提取物或者5 ii M AZT處理。A-C :對于U87.⑶4. CXCR4細(xì)胞為空心柱；對于U87.⑶4. CCR5細(xì)胞為實心柱。圖D :用10 ii g/mL提取物或者5 u M AZT-TP直接處理用89. 6包膜假型包裝的HIV-Luc病毒，確定RT活性。數(shù)據(jù)是三次重復(fù)實驗的平均值土SEM。圖8 :TXE提取物和VAD提取物的抗HIV組分。將Jurkat細(xì)胞用HIV-1 HXB2感染，然后在感染24小時后暴露于IOii g/mL TXE (圖A)、VAD (圖B)或其來自石油醚(PE)、氯仿(CF)、醋酸乙酯(EA)和正丁醇(BT)的分配亞級分的每一種。每隔一天加入新鮮提取物或者亞級分。同時，收集培養(yǎng)上清液用于RT活性測定，并且用臺盼藍(lán)染料染細(xì)胞的等分 試樣以及計數(shù)活細(xì)胞。DMSO是所述提取物和亞級分的溶劑，將其包括作為溶媒對照。呈現(xiàn)來自在病毒復(fù)制高峰的第9天收集的上清液的RT數(shù)據(jù)。提取物及其亞級分不顯示對所述細(xì)胞明顯的細(xì)胞毒性作用。數(shù)據(jù)是三次重復(fù)實驗的平均值土SEM。圖9 :提取物對HIV-I復(fù)制的作用。用相當(dāng)于10，OOOcpm RT活性的HIV-1 HXB2感染一百萬個Jurkat細(xì)胞24小時,然后每隔一天用10 U g/mL新鮮提取物處理,所述新鮮提取物來自番荔枝科毛葉鷹爪花的葉、莖和根，a) AAP-葉提取物(AAP-I)、b)AAP-莖提取物(AAP-s)和c) AAP-根提取物(AAP-r);以及番荔枝科喙果皂帽花的根，d) ADR-根(ADR_r)提取物。在標(biāo)明的時間點收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液用于RT活性測定。所有的提取物均溶于DMS0，以及將DMSO用作溶媒對照(e)。也包括模擬感染的Jurkat細(xì)胞(g)和不經(jīng)任何處理的HIV感染的細(xì)胞作為對照(f)。這些數(shù)據(jù)是三次獨立實驗的代表。

圖10 :提取物 a) AAP-I、b) AAP_s、c) AAP_r、d) ADR_r、e)和對照 DMSO 對 Jurkat 細(xì)胞存活的作用。感染Jurkat細(xì)胞并按照圖9處理。在每一個時間點，將細(xì)胞等分試樣收集、用臺盼藍(lán)染料染色，然后針對細(xì)胞存活力計數(shù)。這些數(shù)據(jù)是三次獨立實驗的代表。條目f)表示不經(jīng)處理的模擬感染的細(xì)胞，條目g)表示未受感染的細(xì)胞。圖11 :提取物對HIV-I長末端重復(fù)序列(LTR)啟動子活性的作用。用10 ii g/mL各種提取物處理⑶4+T淋巴細(xì)胞CEM 3天(圖A)和7天(圖B)，CEM在HIV-1 LTR啟動子調(diào)控下穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)。然后，收集所述細(xì)胞用于通過流式細(xì)胞術(shù)測量GFP表達(dá)。數(shù)據(jù)是GFP表達(dá)水平的幾何平均值以及是三次重復(fù)實驗的平均值土SEM。圖12 :提取物對HIV-1 RT活性的作用。用10 ii g/mL各種提取物孵育經(jīng)純化的HIV-I病毒體用于RT活性測定。包括RT抑制劑AZT (5 u M)作為陽性對照，而DMSO用作提取物的溶媒對照。也包括沒有任何處理的樣品(模擬的)。圖13 :提取物對HIV-I進(jìn)入的作用。圖A :將U87. CD4. CXCR4細(xì)胞用10 u g/mL各種提取物處理I小時，然后用由T向性HIV-1 HXB2包膜假型包裝的HIV-Luc病毒感染。圖B :用U87. CD4. CCR5細(xì)胞以及M向性HIV-1 YU-2包膜假型包裝的HIV-Luc病毒進(jìn)行類似實驗。包括用VSV-G包膜假型包裝的和無包膜的HIV-Luc病毒分別作為陽性感染對照和陰性感染對照(數(shù)據(jù)未顯示)。數(shù)據(jù)是三次重復(fù)實驗的平均值土SEM。圖14 :提取物對HIV-I感染性的作用。首先在37°C下用10 U g/mL各種提取物孵育用HXB2包膜(圖A)或YU-2包膜(圖B)假型包裝的HIV-Luc病毒2小時。通過離心回收所述病毒，然后用于感染U87.⑶4. CXCR4細(xì)胞(對于HXB2)或U87.⑶4. CCR5細(xì)胞(對于YU-2)。感染48小時后將所述細(xì)胞收獲用于螢光素酶報道基因測定。數(shù)據(jù)是三次重復(fù)實驗的平均值土 SEM。圖15 :提取物對HIV-I進(jìn)入后的作用。首先用由HXB包膜(圖A)或YU-2包膜(圖B)假型包裝的HIV-Luc假型病毒感染U87. CD4. CXCR4細(xì)胞和U87. CD4. CCR5細(xì)胞。接著改變培養(yǎng)基，將細(xì)胞用IOu g/mL各種提取物處理48小時，然后收獲用于螢火素酶報道基因測定。數(shù)據(jù)是三次重復(fù)實驗的平均值土SEM。詳述傳統(tǒng)中藥(TCM)回溯至2000到3000年前。草藥是TCM的主要成分。據(jù)估計超過 600種不同的草藥已用于治療多種人類疾病包括那些由病毒感染引起的疾病。海南島是中國離岸的第二大島，其位于南海和大約北緯18°的熱帶。有大約4，200種植物品種，其中630種列為該島嶼的特產(chǎn)，而且一些瀕臨滅絕。本文描述的是對12種草藥植物的選擇，中國海南島上的當(dāng)?shù)厝A人已將所述草藥植物用于治療各種人類疾病(表I);用乙醇對這些植物的提?。灰约皩μ崛∥锏目笻IV活性的測試。用復(fù)制型T向性HIV-I毒株HXB2感染⑶4+T淋巴細(xì)胞Jurkat，然后在2周的過程中在存在濃度為l、10、100ii g/mL的植物提取物的情況下監(jiān)控HIV-I復(fù)制。這些實驗中包括所述提取物的溶劑DMSO和HIV-1 RT的抑制劑AZT。該初始測試重復(fù)三次。與未處理的對照或DMSO處理相比，這17種提取物中的6種來自大戟科劍葉三寶木(TXE)的莖、來自龍腦香科青梅(VAD)的莖、來自番荔枝科毛葉鷹爪花的葉(AAP-I)、來自番荔枝科毛葉鷹爪花的莖(AAP-s)、來自番荔枝科毛葉鷹爪花的根(AAP-r)以及來自番荔枝科喙果皂帽花的根(ADR-r)，顯示在lOyg/mL或更高的濃度下在感染后第9天(dpi)抑制HIV-I復(fù)制(圖IA和圖10)。處理的對照AZT抑制HIV-I復(fù)制。I u g/mL提取物VAD和TXE顯示幾乎對HIV-I復(fù)制無作用，但在10 u g/mL或更高濃度下則顯示劑量依賴的抗HIV活性。在整個實驗全程通過臺盼藍(lán)染料染色監(jiān)控所有處理的細(xì)胞存活。與沒有處理的對照相比，TXE和VAD處理均顯示類似于DMSO處理的細(xì)胞以及沒有處理的對照的細(xì)胞生長動力學(xué)(圖1B)。在HIV-I感染的細(xì)胞中活細(xì)胞數(shù)量的減少可能由感染引起的細(xì)胞死亡所導(dǎo)致，因為細(xì)胞數(shù)量因AZT處理而開始恢復(fù)直至處理結(jié)束。這些結(jié)果提供了 TXE和VAD抑制HIV-I復(fù)制的最初證據(jù)。來自大戟科劍葉三寶木(TXE)和龍腦香科青梅(VAD)的提取物抑制⑶4+T細(xì)胞中的HIV-I復(fù)制以及合胞體形成，并對宿主細(xì)胞增殖和存活具有很少的不利作用。TXE和VAD不顯示對HIV-1 RT酶活性的任何直接的抑制作用。為確定抑制機(jī)制，使用單輪用T向性或M向性HIV-I包膜假型包裝的HIV-螢光素酶報道基因病毒系統(tǒng)(HIV-Luc)感染靶細(xì)胞。使用這些提取物預(yù)處理病毒對HIV-Luc病毒的感染性的作用很小，這些提取物對HIV-Luc感染的細(xì)胞的處理不引起Luc基因表達(dá)的任何顯著改變。不受限于理論，據(jù)認(rèn)為這些結(jié)果表明這些提取物通過阻斷HIV-I與靶細(xì)胞的相互作用(即gpl20和⑶4/CCR5之間的相互作用或者gpl20和⑶4/CXCR4之間的相互作用)來阻斷HIV-I復(fù)制。為確定和建立提取物的無毒使用濃度，在無HIV-I感染的情況下測定這些提取物對細(xì)胞存活和細(xì)胞生長動力學(xué)的作用。用I、10和100 i! g/mL的TXE或VAD處理Jurkat細(xì)胞，以及每隔一天加入新鮮的提取物并監(jiān)控細(xì)胞存活和細(xì)胞生長。在這些實驗中包括DMSO和AZT作為對照。亦包括沒有任何處理的Jurkat細(xì)胞作為對照。在沒有接受處理的細(xì)胞、接受AZT (10 u M)的細(xì)胞以及接受10 u g/mL TXE和VAD的細(xì)胞及接受其對應(yīng)的DMSO濃度(即0.1%)的細(xì)胞之間，細(xì)胞的存活和生長動力學(xué)似乎難以區(qū)別(圖2)。在lyg/mL和100 u g/mL的TXE和VAD以及它們各自的溶劑DMSO濃度I %和0. 01 %之間得到類似的結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)，這表明TXE和VAD在高達(dá)IOOy g/ml的濃度下是無毒的?；谶@些結(jié)果，選擇10 u g/mL濃度的TXE和VAD提取物用于以下所有的機(jī)理研究。體外⑶4+T細(xì)胞的生產(chǎn)性HIV-I感染特征在于形成多核巨細(xì)胞(所謂的合胞體)，其可能導(dǎo)致HIV-I感染的受試者中CD4+T細(xì)胞的耗竭。描述了這兩種提取物對合胞體形成的作用。將Jurkat細(xì)胞感染，用IOii g/mL TXE或VAD處理，并在2周的過程中監(jiān)控合胞體形成。包括AZT(5iiM)和DMSO(0. 1% )處理作為對照。沒有感染的和HIV-I感染的Jurkat細(xì)胞也存在，作為對照。在感染后第7天合胞體的數(shù)量達(dá)到最大值。與沒有處理的和經(jīng)DMSO處理的HIV-I感染的Jurkat細(xì)胞相比，TXE、VAD和AZT的處理均顯示合胞體數(shù) 量的減少(圖3)。在不接受HIV-I感染的Jurkat細(xì)胞中有很少合胞體。這些結(jié)果與這些提取物對HIV-I復(fù)制的抑制作用(圖1A) —致。HIV-I是逆轉(zhuǎn)錄病毒家族的一個成員。這些病毒的重要特征是這些病毒復(fù)制涉及它們的RNA病毒基因組向前病毒DNA的轉(zhuǎn)變，其由稱為逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)的獨有的病毒編碼酶催化。在這里描述的是在存在和缺少提取物的情況下HIV-I病毒體的RT酶活性的比較。裂解HIV-I病毒體以釋放RT，并在TXE和VAD (10 u g/mL)存在的情況下進(jìn)行RT活性測定。在這些實驗中，包括RT抑制物AZT(5 u M)作為對照。另外，包括PBS和DMS0(0. 1% )分別作為AZT以及TXE和VAD的溶劑對照。使用不含任何HIV-I病毒體的RT反應(yīng)作為測定的空白對照。與預(yù)期一樣，AZT有效抑制HIV-1 RT的活性。然而，在RT反應(yīng)中包含TXE和VAD并未顯示在RT活性上與PBS對照和DMSO對照的任何顯著性差異(圖4)。不受限于理論，據(jù)認(rèn)為，這些結(jié)果表明TXE和VAD誘導(dǎo)的HIV-I復(fù)制的抑制并非因為它們對RT活性的作用，而是因為它們對HIV生命周期的其他階段的作用。AAP的葉提取物(AAP-I)和AAP的莖提取物(AAP-s)表現(xiàn)出對RT活性的某種抑制(圖12)。HIV-I感染始于HIV-I包膜gpl20與HIV-1靶細(xì)胞細(xì)胞表面上的⑶4和趨化因子共同受體CCR5(對于M向性毒株)或CXCR4(對于T向性毒株)的結(jié)合。在這里描述的是提取物對HIV-I進(jìn)入細(xì)胞的作用。復(fù)制缺陷型HIV-Luc報道基因系統(tǒng)滅活了 HIV-1 env基因，并用螢火蟲螢光素酶(Luc)基因替代了 HIV-1 nefo這樣的設(shè)計允許反式互補(bǔ)任何病毒包膜蛋白包括HIV-I包膜蛋白以及單輪病毒感染通過靈敏的Luc活性測定準(zhǔn)確測定HIV-I的進(jìn)入。制備用T向性HIV-1 HXB2包膜假型包裝的HIV-Luc報道基因病毒。為測定這些提取物對HIV-I進(jìn)入的作用，用10 u g/mL的這些提取物預(yù)孵育U87.⑶4. CXCR4細(xì)胞，然后用這些病毒感染這些細(xì)胞。測定這些細(xì)胞的Luc活性。在這些實驗中也制備了用血管口炎病毒包膜糖蛋白(VSV-G)假型包裝的HIV-Luc報道基因病毒或沒有任何病毒包膜的HIV-Luc病毒，所述病毒分別為陽性對照和陰性對照。包括DMS0(0. 1% )作為這些提取物的溶劑對照。與DMSO對照相比，用TXE預(yù)孵育U87.⑶4. CXCR4幾乎完全阻斷用HIV-1 HXB2包膜假型包裝的HIV-Luc的感染，但對用VSV-G假型包裝的HIV-Luc沒有作用(圖5，圖A)。使用VAD提取物得到類似的結(jié)果(圖5，圖B)。提取物AAP-I、AAP-s, AAPt和ADR_r顯示抑制用HIV-1 HXB2包膜假型包裝的HIV-Luc對U87.⑶4. CXCR4細(xì)胞的感染(圖13，圖A)，以及抑制M向性HIV-1 YU-2包膜假型包裝的HIV-Luc病毒對U87. CD4. CCR5細(xì)胞的感染。不受限于理論，這些結(jié)果表明AAP-I、AAP-s、AAP-r、ADR-r、TXE和VAD通過阻斷HIV-I進(jìn)入靶細(xì)胞而抑制HIV-I復(fù)制。在此描述的是改良的實驗方案，其使用相同的復(fù)制缺陷型單輪HIV-Luc報道基因系統(tǒng)以進(jìn)一步確定TXE和VAD在進(jìn)入階段抑制HIV-I復(fù)制，以測定TXE和VAD是否直接滅活HIV-I或?qū)IV-I生命周期的其它階段有任何作用。首先在37°C下用10 u g/ml TXE、VAD或0. 1% DMSO孵育相同量的用HXB2包膜假型包裝的HIV-Luc病毒2小時。通過離心回收所述病毒，然后用于感染U87. CD4. CXCR4細(xì)胞。將所述細(xì)胞培養(yǎng)48小時，然后收獲用于Luc活性測定。Luc活性顯示在DMSO處理對照和TXE或VAD處理之間在病毒感染性方面沒有明顯的差異，而熱滅活的病毒具有很少感染性(圖6，圖A)。在37°C下用HIV-1 HXB2包膜假型包裝的HIV-Luc病毒感染U87.⑶4. CXCR4細(xì)胞2小時。通過用新鮮的培養(yǎng)基反復(fù)洗滌除、去剩余的輸入病毒，然后在這些TXE或VAD提取物(10 u g/mL)或5 y M AZT存在的情況下培養(yǎng)這些細(xì)胞48小時。針對Luc活性測定測定所述細(xì)胞。與AZT對照相比，TXE和VAD處理HIV感染的細(xì)胞的Luc活性方面不顯示與DMSO處理的任何差異(圖6，圖B)。不受限于理論，據(jù)認(rèn)為，總之，這些結(jié)果顯示所觀察到的TRX和VAD對HIV-I復(fù)制的抑制并不歸因于這些提取物對HIV-I的滅活或在進(jìn)入后階段的阻斷，這進(jìn)一步支持TRE和VAD在病毒生命周期的進(jìn)入階段抑制HIV-I復(fù)制的可能性。用HXB2假型包裝的HIV-Luc病毒或用YU-2假型包裝的HIV-Luc病毒與AAP-I、AAP-s、AAP-r或ADR_r的孵育，并不抑制經(jīng)處理的病毒分別感染U87. CD4. CXCR4或U87. CD4. CCR5細(xì)胞的能力(圖14，圖A和圖B)。在此描述的是使用雙向性初級HIV-I分離群89. 6 [Doranz BJ，等，Cell 1996,85 1149-1158]進(jìn)行的類似實驗，以研究TXE和VAD是否也能夠阻斷該病毒進(jìn)入其靶細(xì)胞。用10 u g/mL TXE 或 VAD 處理 U87. CD4. CXCR4 和 U87. CD4. CCR5 細(xì)胞，然后用 HIV-1 89. 6 包膜假型包裝的HIV-Luc病毒感染所述細(xì)胞。與DMSO處理對照相比，TXE和VAD處理都顯示在U87.⑶4. CXCR4和U87.⑶4. CCR5細(xì)胞二者中明顯較低的Luc活性(圖7，圖A)，這表示它們阻斷HIV-I 89. 6感染。如所述確定所述提取物對HIV-I 89.6自身以及在進(jìn)入后階段的作用。類似于HXB2病毒，當(dāng)89. 6病毒在感染之前暴露于所述提取物時，其感染性上不顯示任何改變(圖7，圖B)。同樣，當(dāng)89. 6感染發(fā)生在所述提取物處理之前時，89. 6病毒在它們進(jìn)入后的復(fù)制中不顯示任何改變(圖7，圖C)。此外，這些提取物對HIV-I 89. 6病毒的RT酶活性不具有任何直接的抑制作用(圖7，圖D)。不受限于理論，相信這些數(shù)據(jù)證明了 TXE和VAD均具有阻斷初級HIV-I分離群89. 6進(jìn)入的類似活性。接下來，使用不同的疏水性和極性的有機(jī)溶劑把這兩種提取物分成4種亞級分，這些有機(jī)溶劑即石油醚(PE)、氯仿(CF)、醋酸乙酯(EA)和正丁醇(BT)。在此描述的是，這些亞級分對HIV-I復(fù)制的作用。如上所示，TXE處理以明顯的方式抑制HIV-I復(fù)制(圖8，圖A)。與DMSO處理的對照相比，用CF亞級分和BU亞級分處理的細(xì)胞中HIV復(fù)制較低，而用其PE亞級分和EA亞級分處理的細(xì)胞中HIV復(fù)制顯示很少改變。相反，VAD提取物的PE亞級分、CF亞級分和EA亞級分具有比DMSO對照低的HIV-I復(fù)制，而其BT亞級分沒有顯示出抗HIV活性(圖8，圖B)。自單輪感染測定得到類似的結(jié)果(數(shù)據(jù)沒有顯示)。這些結(jié)果表明，活性抗HIV組分可進(jìn)一步從TXE和VAD提取物中分離，并可在這兩種提取物中不同。使用良好建立的HIV-I復(fù)制系統(tǒng)針對其抗HIV活性篩選傳統(tǒng)中藥草本植物的提取物(表I)。來自大戟科劍葉三寶木(TXE)的莖和龍腦香科青梅(VAD)的莖的提取物抑制HIV-I復(fù)制，而不明顯影響細(xì)胞增殖和細(xì)胞存活(圖I和圖2)。這兩種提取物防止HIV感染的細(xì)胞形成合胞體的發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步確證它們的抑制作用(圖3)。檢測不到這些提取物對HIV-1 RT酶活性的作用(圖4)。不受限于理論，據(jù)認(rèn)為本文描述的觀察結(jié)果表明，這些提取物有效地阻斷HIV-I進(jìn)入其靶細(xì)胞(圖5)。這些提取物幾乎不作用于進(jìn)入后的HIV-I基因表達(dá)(圖6)。利用CXCR4和CCR5兩者用于進(jìn)入細(xì)胞，使用顯示雙向性的初級分離群HIV-I89. 6得到類似的結(jié)果，HIV-I 89. 6(圖7)?？傊?，這些研究揭示這兩種植物提取物的抗HIV活性，并表明它們的抗HIV活性因干擾HIV-I進(jìn)入引起。AAP-I、AAP-s、AAP-r、ADR-r、TXE 和 VAD 提取物具有有效的針對 T 和 M 向性 HIV-I分離群兩者的HIV-I復(fù)制和進(jìn)入的抑制活性。
在本發(fā)明的一個實施方案中，一種用于制備包含活性級分的可用于治療HIV感染的藥物組合物的方法，所述方法包括從植物材料中獲取活性級分的步驟，所述植物材料獲自大戟科劍葉三寶木或龍腦香科青梅。在本發(fā)明的另一個實施方案中，一種用于制備包含活性級分的可用于治療HIV感染的藥物組合物的方法，所述方法包括從植物材料中獲取活性級分的步驟，所述植物材料獲自大戟科劍葉三寶木、龍腦香科青梅、番荔枝科毛葉鷹爪花或番荔枝科喙果皂帽花。在另一個實施方案中，描述了用于制備包含活性級分的可用于治療HIV感染的藥物組合物的方法，所述方法包括下述步驟 a)干燥獲自大戟科劍葉三寶木或龍腦香科青梅的植物材料；b)研磨所述經(jīng)干燥的植物材料；以及c)用第一提取劑提取所述經(jīng)研磨的植物材料以產(chǎn)生包含活性級分的植物提取物。在另一個實施方案中，描述了用于制備包含活性級分的可用于治療HIV感染的藥物組合物的方法，所述方法包括下述步驟a)干燥獲自大戟科劍葉三寶木、龍腦香科青梅、番荔枝科毛葉鷹爪花或番荔枝科喙果皂帽花的植物材料；b)研磨所述經(jīng)干燥的植物材料；以及c)用第一提取劑提取所述經(jīng)研磨的植物材料以產(chǎn)生包含活性級分的植物提取物。在另一個實施方案中，描述了前述實施方案的任一個所描述的方法，其中所述植物是大戟科劍葉三寶木。在另一個實施方案中，描述了上述方法，其中所述植物是龍腦香科青梅。在另一個實施方案中，描述了上述方法，其中所述植物是番荔枝科毛葉鷹爪花。在另一個實施方案中，描述了上述方法，其中所述植物是番荔枝科喙果皂帽花。在另一個實施方案中，所述植物材料是葉材料。在另一個實施方案中，所述植物材料是莖材料。在備選實施方案中，所述植物材料是根材料。在又一個實施方案中，描述了前述實施方案中任一個的方法，其中第一提取劑是極性或非極性溶劑或它們的混合物。在另一個實施方案中，描述了前述實施方案中的任一個方法，其中第一提取劑是乙醇和水的混合物。在一些說明性的實施方案中，混合物為約70%-約80%乙醇約30%-約20%水，或混合物為約75%乙醇約25%水。在另一個實施方案中，描述了前述實施方案中的任一個的方法,其中提取在約80°C下進(jìn)行。在另一個實施方案中，描述了前述實施方案中的任一個的方法，其還包括以下步驟d)除去基本上所有的第一提取劑以產(chǎn)生第一剩余物；以及e)用第二提取劑提取第一剩余物以產(chǎn)生包含活性級分的第二提取物。在另一個實施方案中，描述了前述實施方案的方法，其中第二提取劑是極性溶劑、非極性溶劑或它們的組合，即石油醚、二氯甲烷、醋酸乙酯、正丁醇或它們的組合等。在另一個實施方案中，描述了由前述實施方案中的任一個的方法產(chǎn)生的藥物組合物。在另一個實施方案中，描述了前述實施方案的藥物組合物，其還包含藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑、稀釋劑或它們的組合。在另一個實施方案中，描述了治療需要緩解HIV感染的患者的方法，所述方法包括向所述患者給予治療有效量的前述實施方案之一中所描述的藥物組合物。在另一個實施 方案中，描述了預(yù)防HIV感染的方法，所述方法包括給予前述實施方案的任一個中描述的藥物組合物的步驟。在下述條款中也描述了本發(fā)明的實施方案。I. 一種可用于治療HIV感染的活性級分，其通過以下方法從包含至少一種選自大戟科劍葉三寶木、龍腦香科青梅、番荔枝科毛葉鷹爪花和番荔枝科喙果皂帽花的植物的一個或多個植物部分的植物材料中獲得，所述方法包括用第一提取劑提取所述植物材料的步驟。2.條款I(lǐng)的活性級分，其中所述方法還包括干燥所述植物材料和研磨所述植物材料的步驟，其中所述干燥步驟在所述提取步驟之前。3.條款I(lǐng)或2的活性級分，其中第一提取劑包含極性或非極性溶劑或它們的混合物。4.條款1-3中任一項的活性級分，其中第一提取劑包含乙醇和水的混合物。5.條款1-4中任一項的活性級分，其中所述提取劑包含70% -95%乙醇和30% -5%水的混合物。6.條款1-5中任一項的活性級分，其中所述提取在75°C -85°C的溫度下進(jìn)行。7.呈濃縮物形式的條款1-6中任一項的活性級分，其中所述方法還包括通過蒸發(fā)除去第一提取劑的步驟。8.通過以下方法獲得的第二活性級分，所述方法包括用第二提取劑提取條款1-7中任一項的濃縮物的步驟。9.條款1-8中任一項的第二活性級分，其中第二提取劑是極性溶劑、非極性溶劑或它們的組合。10.條款1-9中任一項的第二活性級分，其中第二提取劑是石油醚、二氯甲烷、醋酸乙酯、正丁醇或它們的組合。11.條款1-10中任一項的活性級分，其中所述植物是大戟科劍葉三寶木。12.條款1-11中任一項的活性級分，其中所述植物是龍腦香科青梅。13.條款1-12中任一項的活性級分，其中所述植物是番荔枝科毛葉鷹爪花。14.條款1-13中任一項的活性級分，其中所述植物是番荔枝科喙果皂帽花。15.條款1-14中任一項的活性級分，其中所述植物部分為根。
16.條款1-15中任一項的活性級分，其中所述植物部分為莖。17.條款1-16中任一項的活性級分，其中所述植物部分為葉。18. 一種用于制備可用于治療HIV感染的活性級分的方法，其中所述方法包括用第一提取劑提取來自大戟科劍葉三寶木、龍腦香科青梅、番荔枝科毛葉鷹爪花或番荔枝科喙果皂帽花的植物材料的步驟。19.條款18的方法，其中所述方法還包括干燥所述植物材料的步驟，其中所述干燥步驟在所述提取步驟之前。20.條款18或19的方法，其中所述方法還包括研磨所述植物材料的步驟。21.條款18-20中任一項的方法，其中第一提取劑包含極性或非極性溶劑或它們的組合。
22.條款18-21中任一項的方法，其中第一提取劑包含乙醇和水的混合物。23.條款18-22中任一項的方法，其中所述提取劑包含70% -95%乙醇和30% -5%水的混合物。24.條款18-23中任一項的方法，其中所述提取在75°C _85°C的溫度下進(jìn)行。25.條款18-24中任一項的方法，其中所述方法還包括通過蒸發(fā)除去第一提取劑以產(chǎn)生濃縮物的步驟。26.條款18-25中任一項的方法，其中所述方法還包括用第二提取劑提取所述濃縮物的步驟。27.條款18-26中任一項的方法，其中第二提取劑是極性溶劑、非極性溶劑或它們的組合。28.條款18-27中任一項的方法，其中第二提取劑是石油醚、二氯甲烷、醋酸乙酯、正丁醇或它們的組合。29.條款18-28中任一項的方法，其中所述植物材料來自大戟科劍葉三寶木。30.條款18-29中任一項的方法，其中所述植物材料來自龍腦香科青梅。31.條款18-30中任一項的方法，其中所述植物材料來自番荔枝科毛葉鷹爪花。32.條款18-31中任一項的方法，其中所述植物材料來自番荔枝科喙果皂帽花。33.條款18-32中任一項的方法，其中所述植物材料包括選自根、莖、葉、種子和花的植物部分。34. 一種包含活性級分的可用于治療HIV感染的藥物組合物，其中所述活性級分通過以下方法制備，所述方法包括用第一提取劑提取來自大戟科劍葉三寶木、龍腦香科青梅、番荔枝科毛葉鷹爪花或番荔枝科喙果皂帽花的植物材料的步驟。35.條款34的組合物，其中所述方法還包括干燥所述植物材料的步驟，其中所述干燥步驟在所述提取步驟之前。36.條款34或35的組合物，其中所述方法還包括研磨所述植物材料的步驟。37.條款34-36中任一項的組合物，其中第一提取劑包含極性或非極性溶劑或它們的混合物。38.條款34-37中任一項的組合物，其中第一提取劑包含乙醇和水的混合物。39.條款34-38中任一項的組合物，其中所述提取劑包含70%-95%乙醇和30% -5%水的混合物。
40.條款34-39中任一項的組合物，其中所述提取是在75°C _85°C溫度下進(jìn)行的。41.條款34-40中任一項的組合物，其中所述方法還包括通過蒸發(fā)除去第一提取劑以產(chǎn)生濃縮物的步驟。42.條款34-41中任一項的組合物，其中所述方法還包括用第二提取劑提取所述濃縮物的步驟。43.條款34-42中任一項的組合物，其中第二提取劑是極性溶劑、非極性溶劑或它們的組合。44.條款34-43中任一項的組合物，其中第二提取劑是石油醚、二氯甲烷、醋酸乙酯、正丁醇或它們的組合。45.條款34-44中任一項的組合物，其中所述植物來自龍腦香科青梅。
46.條款34-45中任一項的組合物，其中所述植物材料來自番荔枝科毛葉鷹爪花。47.條款34-46中任一項的組合物，其中所述植物材料來自番荔枝科喙果皂帽花。48.條款34-47中任一項的組合物，其中所述植物材料包括選自根、莖、葉、種子和花的植物部分。49. 一種用于治療需要緩解HIV感染的患者的方法，所述方法包括向所述患者給予治療有效量的前述條款中任一項的活性級分或前述條款中任一項的藥物組合物的步驟。在備選實施方案中，可將所述活性級分配制用于口服給藥、直腸給藥、陰道給藥、胃腸外給藥(包括皮下給藥、肌內(nèi)給藥、靜脈內(nèi)給藥和鞘內(nèi)給藥)以及口服給藥。本文所用的術(shù)語“活性級分”通常是指包含顯示抗HIV活性的藥理學(xué)活性劑(不論是組分、組分的組合、生物代謝物、它們的衍生物還是上述的組合)的級分或提取物。應(yīng)理解的是，所述抗HIV活性可歸因于單一組分、組分的組合或者其生物代謝物或衍生物。應(yīng)理解的是，當(dāng)從植物的部分(例如莖、葉、根、花、種子等)中制備提取物時，某種量的來自植物的一個或多個其它部分的植物材料可與目標(biāo)植物部分相混合。應(yīng)理解的是，在從植物中獲得活性級分之前可進(jìn)行一個或多個以下步驟培育植物、收獲植物或收集植物或收集植物部分或者清洗植物材料以除去外來的材料。應(yīng)理解的是，研磨植物材料的步驟可在提取步驟之前或者在提取步驟期間進(jìn)行。本文所用的術(shù)語“除去基本上所有的”通常是指除去不少于90%，或不少于95%，或不少于98%，或不少于99%，或不少于99. 5%的所除去的材料。在另一個實施方案中，描述了制備提取物的常規(guī)方法，所述方法基于使用提取劑處理植物材料以獲得未加工的或初始的提取物，其在除去細(xì)料的任選處理(例如，通過沉降或過濾)之后，包含所述提取劑和可溶于所述提取劑中的植物成分。在另一個實施方案中，描述了包含極性或非極性溶劑或其組合的提取劑?？捎米魈崛┑娜軇┑恼f明性實例是水、醇(例如，甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇、仲丁醇、異丁醇、叔丁醇，等等)、乙腈、醋酸乙酯、醋酸丙酯、醋酸正丁酯、醋酸異丙酯等、戊烷、石油醚、己烷、庚烷、甲苯、二氯甲烷、氯仿、醋酸、四氫呋喃、乙醚、叔丁基甲基醚等等，或它們的組合。在另一個實施方案中，所述提取劑包含乙醇和水的混合物。本文所用的術(shù)語“提取物”在無進(jìn)一步說明的情況下，通常是指使用或不使用提取劑的提取產(chǎn)物的任何形式，與物理形式(即粘性的、糊狀的或固體)無關(guān)?？稍趶募s_30°C至約所述提取劑沸點的任何溫度范圍下進(jìn)行本文所述的提取。應(yīng)理解的是，可在改良的壓力下進(jìn)行所述提取以提高或降低所述提取劑的沸點。在另一個實施方案中，然后通過部分地蒸發(fā)提取劑濃縮初級提取物以除去其揮發(fā)性更高的組分，從而形成所謂的濃縮提取物，其典型地包含5-50%體積的剩余溶劑(例如，水)。在進(jìn)一步除去溶劑后，獲得基本上不含用于提取所述植物材料的溶劑的固體、糊狀或液體材料。然后該產(chǎn)物(也稱為“提取物”或“活性級分”)可像這樣使用，或任選加入輔料、添加劑、包衣組分、稀釋劑、賦形劑等等而加工以制備具體的應(yīng)用形式。本文所描述的活性級分也可直接給予至血流、肌肉或內(nèi)臟內(nèi)。這樣的胃腸外給藥的適合的途徑包括靜脈內(nèi)的、動脈內(nèi)、腹膜內(nèi)的、尿道內(nèi)的、胸骨內(nèi)的、肌內(nèi)的以及皮下的遞送。用于胃腸外給藥的合適的手段包括針(包括顯微針)注射器、無針注射器以及輸注技術(shù)。胃腸外制劑典型地為水溶液，所述水溶液可包含賦形劑(例如鹽、碳水化合物和緩沖劑(優(yōu)選PH 3-9))，但是就某些應(yīng)用而言，它們可更適合地配制為無菌的非水溶液或為干燥的形式以與合適的溶媒(例如無菌無熱原的水)聯(lián)用。 使用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)技術(shù)可容易地實現(xiàn)在無菌條件下胃腸外制劑的制備(例如，通過冷凍干燥)。可通過使用合適的配制技術(shù)(例如摻入增溶劑)增加在胃腸外制劑的制備中所用的活性級分的溶解性?？蓪⒂糜谖改c外給藥的制劑配制成立即釋放和/或修飾釋放。修飾釋放制劑包括延遲釋放制劑、緩釋制劑、脈沖釋放制劑、控釋制劑、靶向釋放制劑和程序釋放制劑。因此，可將活性級分配制為固體、半固體或觸變性液體，以作為提供活性級分的修飾釋放的植埋庫給藥。這樣的制劑的實例包括藥物包被的支架和dl-乳酸-乙醇酸共聚物(PGLA)微球體。包含活性級分的藥物組合物可呈適合口服使用的形式，例如，作為片劑、含片、錠齊IJ、水性混懸劑或油性混懸劑、可分散散劑或顆粒劑、乳劑、硬膠囊或軟膠囊或者糖漿劑或酏劑?？筛鶕?jù)本領(lǐng)域所知的任何用于制備藥物組合物的方法制備預(yù)期用于口服使用的組合物，這樣的組合物可包含一種或多種選自甜味劑、調(diào)味劑、著色劑和防腐劑的物質(zhì)以提供藥學(xué)上優(yōu)美和可口的制劑。用于口服使用的制劑包括片劑，所述片劑包含與無毒的藥學(xué)上可接受的賦形劑混合的活性級分。這些賦形劑可為，例如，惰性稀釋劑(例如碳酸鈣、氯化鈉、乳糖、磷酸鈣或磷酸鈉)、成粒劑和崩解劑(例如，玉米淀粉或藻酸)、粘合劑(例如，淀粉、明膠或者阿拉伯膠)以及潤滑劑(例如，硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石)。所述片劑可為無包衣的或可將其通過已知技術(shù)包衣以延遲在胃腸道的崩解和吸收，因此提供在較長時間內(nèi)的持續(xù)作用。例如，可使用延時材料(例如單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯)。用于口服使用的制劑也可提供為硬明膠膠囊，其中活性級分與惰性固體稀釋劑(例如，碳酸鈣、磷酸鈣或高嶺土)混合；或提供為軟明膠膠囊，其中活性級分與水或油介質(zhì)(例如花生油、液態(tài)石蠟或橄欖油)混合。水性混懸劑通常包含與適當(dāng)賦形劑混合的活性材料。這樣的賦形劑是助懸劑(例如，羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、海藻酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮、西黃蓍膠和阿拉伯樹膠)；分散劑或潤濕劑，其可為天然存在的磷脂，例如，卵磷脂；氧化烯與脂肪酸的縮合產(chǎn)物(例如，聚氧乙烯硬脂酸酯)；氧化乙烯與長鏈脂族醇的的縮合產(chǎn)物(例如，十七燒乙烯氧基鯨臘醇(heptadecaethyleneoxycetanol));氧化乙烯與衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯的縮合產(chǎn)物(例如，聚氧乙烯山梨糖醇單油酸酯)；或氧化乙烯與衍生脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的縮合產(chǎn)物(例如聚氧乙烯山梨糖醇酐單油酸酯)。所述水性混懸劑也可包含一種或多種防腐劑(例如乙基、正丙基或?qū)αu基苯甲酸酯)；一種或多種著色劑；一種或多種調(diào)味劑；以及一種或多種甜味劑(例如蔗糖或糖精)?？赏ㄟ^在植物油(例如花生油、橄欖油、芝麻油或椰子油)或礦物油(例如液態(tài)石蠟)中懸浮活性級分來配制油性混懸劑。所述油性混懸劑可包含增稠劑(例如蜂蠟、固體石蠟或鯨蠟醇)。可加入甜味劑(例如上文提出的 那些)以及調(diào)味劑以提供可口的口服制齊IJ。可通過加入抗氧化劑(例如抗壞血酸)保存這些組合物。適用于通過加入水制備水性混懸劑的可分散散劑和顆粒劑，提供與分散劑或潤濕齊U、助懸劑以及一種或多種防腐劑混合的活性級分。上文已提及的那些例示了合適的分散劑或潤濕劑以及助懸劑。也可存在其它賦形劑(例如甜味劑、調(diào)味劑和著色劑)。本文所描述的活性級分的藥物組合物也可呈水包油乳劑的形式。油相可為植物油(例如橄欖油或花生油)或礦物油(例如液態(tài)石蠟)或這些的混合物。合適的乳化劑可為天然存在的樹膠(例如阿拉伯樹膠或西黃蓍膠)；天然存在的磷脂(例如大豆卵磷脂)；以及酯類，包括衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯(例如，山梨糖醇酐單油酸酯)以及所述偏酯與氧化乙烯的縮合產(chǎn)物(例如聚氧乙烯山梨糖醇酐單油酸酯)。所述乳劑也可包含甜味劑和調(diào)味劑。可用甜味劑(例如甘油、山梨糖醇或蔗糖)配制糖漿劑和酏劑。這樣的制劑也可包含緩和劑、防腐劑、調(diào)味劑和著色劑。藥物組合物可呈無菌可注射水性或油性混懸劑的形式?？筛鶕?jù)已知的技術(shù)使用已在上文提及的那些合適的分散劑或潤濕劑和助懸劑配制該混懸劑。無菌可注射的制劑可為在無毒的胃腸外可接受的稀釋劑或溶劑中的無菌可注射的溶液劑或混懸劑。在可使用的可接受的溶媒和溶劑中的是水、1，3-丁二醇、林格氏溶液和等張氯化鈉溶液。另外，無菌不揮發(fā)油通常用作溶劑或懸浮介質(zhì)。為了這個目的，包括合成的甘油一酸酯或甘油二酯在內(nèi)的任何溫和的不揮發(fā)油均可使用。脂肪酸(例如油酸)也在可注射制劑(injectibles)的制備中具有應(yīng)用。本文所描述的活性級分也可以栓劑、陰道栓劑或灌腸劑的形式給予用于直腸或陰道給藥?？赏ㄟ^將藥物和合適的非刺激性賦形劑(例如可可油和聚乙二醇)混合來制備這些組合物，所述賦形劑在常溫下為固體而在直腸或陰道溫度下為液體，因而融化以釋放所述藥物?？蓪⒂糜谥蹦c給藥/陰道給藥的制劑配制為立即釋放和/或修飾釋放。修飾釋放制劑包括延遲釋放制劑、緩釋制劑、脈沖釋放制劑、控釋制劑、靶向釋放制劑和程序釋放制劑。本文所用的術(shù)語“處理”包括治愈性、姑息和預(yù)防性處理。亦應(yīng)理解的是，在前述實施方案中，本發(fā)明的某些方面是以備選提供。本領(lǐng)域的技術(shù)人員亦容易地意識到，當(dāng)成員以常見方式(例如以Markush組)分組在一起時，本發(fā)明不僅包括作為整體羅列的整個組，而且還單獨地包括該組中的每一個成員以及還包括主組的所有可能的亞組。因此，對于所有目的，本發(fā)明不僅包括主組，而且還包括缺少一個或多個組成員的主組。本發(fā)明也設(shè)想明確排除所要求保護(hù)的發(fā)明中的任何組成員中的一個或多個。實施例和方法實施例I植物提取物的制備。所有的植物均在中華人民共和國(中國)的海南島的國家熱帶森林公園(包括尖峰嶺、霸王嶺或者吊羅山(表I))采集。中國海口的海南師范大學(xué)生物學(xué)系的一位植物分類學(xué)者鐘瓊芯教授確認(rèn) 了這些植物的學(xué)名和分類。這些植物的樣品保存在中國?？诘暮Ｄ鲜釒幱弥参锘瘜W(xué)重點實驗室。首先將植物樣品風(fēng)干、研磨并持續(xù)在加壓烘箱中于40°C和0. OSMPa下干燥。然后將經(jīng)干燥和研磨的材料在80°C下75%乙醇中進(jìn)行3輪回流提取。然后將乙醇提取物在55°C下在旋轉(zhuǎn)減壓真空蒸發(fā)儀中濃縮成為軟膏。進(jìn)一步將所述軟膏凍干成為最終形式粉末并保存在干燥器中。將所述粉末在室溫下輕微振蕩過夜以100mg/mL的濃度溶解在二甲基亞砜(DMSO)中。然后,通過以3，OOOrpm離心10分鐘，接著通過0. 4 y m注射器式濾器過濾，來除去混合物中任何殘余的不溶物。在所有實驗中均使用經(jīng)澄清的混合物。表I.針對制備用于抗HIV篩選的提取物選擇的熱帶植物
權(quán)利要求
1.一種可用于治療HIV感染的活性級分，其通過以下方法從包含至少一種選自大戟科劍葉三寶木、龍腦香科青梅、番荔枝科毛葉鷹爪花和番荔枝科喙果皂帽花的植物的一個或多個植物部分的植物材料中獲得，所述方法包括用第一提取劑提取所述植物材料的步驟。
2.權(quán)利要求I的活性級分，其中所述方法還包括干燥所述植物材料和研磨所述植物材料的步驟，其中所述干燥步驟在所述提取步驟之前。
3.權(quán)利要求2的活性級分，其中第一提取劑包含極性或非極性溶劑或它們的混合物。
4.權(quán)利要求2的活性級分，其中第一提取劑包含乙醇和水的混合物。
5.權(quán)利要求2的活性級分，其中所述提取劑包含70%-95%乙醇和30% -5%水的混合 物。
6.權(quán)利要求2的活性級分，其中所述提取在75°C_85°C的溫度下進(jìn)行。
7.呈濃縮物形式的權(quán)利要求2的活性級分，其中所述方法還包括通過蒸發(fā)除去第一提取劑的步驟。
8.—種通過以下方法獲得的第二活性級分，所述方法包括用第二提取劑提取權(quán)利要求7的濃縮物的步驟。
9.權(quán)利要求8的第二活性級分，其中第二提取劑是極性溶劑、非極性溶劑或它們的組八口 o
10.權(quán)利要求8的第二活性級分，其中第二提取劑為石油醚、二氯甲烷、醋酸乙酯、正丁醇或它們的組合。
11.權(quán)利要求1-10中任一項的活性級分，其中所述植物為大戟科劍葉三寶木。
12.權(quán)利要求1-10中任一項的活性級分，其中所述植物為龍腦香科青梅。
13.權(quán)利要求1-10中任一項的活性級分，其中所述植物為番荔枝科毛葉鷹爪花。
14.權(quán)利要求1-10中任一項的活性級分，其中所述植物為番荔枝科喙果皂帽花。
15.權(quán)利要求1-10中任一項的活性級分，其中所述植物部分為根。
16.權(quán)利要求1-10中任一項的活性級分，其中所述植物部分為莖。
17.權(quán)利要求1-10中任一項的活性級分，其中所述植物部分為葉。
18.一種用于制備可用于治療HIV感染的活性級分的方法，其中所述方法包括用第一提取劑提取來自大戟科劍葉三寶木、龍腦香科青梅、番荔枝科毛葉鷹爪花或番荔枝科喙果皂帽花的植物材料的步驟。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述方法還包括干燥所述植物材料的步驟，其中所述干燥步驟在所述提取步驟之前。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述方法還包括研磨所述植物材料的步驟。
21.權(quán)利要求20的方法，其中第一提取劑包含極性或非極性溶劑或它們混合物。
22.權(quán)利要求20的方法，其中第一提取劑包含乙醇和水的混合物。
23.權(quán)利要求20的方法，其中所述提取劑包含70%-95%乙醇和30% -5%水的混合物。
24.權(quán)利要求20的方法，其中所述提取在75°C_85°C的溫度下進(jìn)行。
25.權(quán)利要求20的方法，其中所述方法還包括通過蒸發(fā)除去第一提取劑以產(chǎn)生濃縮物的步驟。
26.權(quán)利要求25的方法，其中所述方法還包括用第二提取劑提取所述濃縮物的步驟。
27.權(quán)利要求26的方法，其中第二提取劑為極性溶劑、非極性溶劑或它們的組合。
28.權(quán)利要求26的方法，其中第二提取劑為石油醚、二氯甲烷、醋酸乙酯、正丁醇或它們的組合。
29.權(quán)利要求18-28中任一項的方法，其中所述植物材料來自大戟科劍葉三寶木。
30.權(quán)利要求18-28中任一項的方法，其中所述植物材料來自龍腦香科青梅。
31.權(quán)利要求18-28中任一項的方法，其中所述植物材料來自番荔枝科毛葉鷹爪花。
32.權(quán)利要求18-28中任一項的方法，其中所述植物材料來自番荔枝科喙果皂帽花。
33.權(quán)利要求18-28中任一項的方法，其中所述植物材料包括選自根、莖、葉、種子和花的植物部分。
34.一種包含活性級分的可用于治療HIV感染的藥物組合物，其中所述活性級分通過以下方法制備，所述方法包括用第一提取劑提取來自大戟科劍葉三寶木、龍腦香科青梅、番荔枝科毛葉鷹爪花或番荔枝科喙果皂帽花的植物材料的步驟。
35.權(quán)利要求34的組合物，其中所述方法還包括干燥所述植物材料的步驟，其中所述干燥步驟在所述提取步驟之前。
36.權(quán)利要求35的組合物，其中所述方法還包括研磨所述植物材料的步驟。
37.權(quán)利要求36的組合物，其中第一提取劑包含極性或非極性溶劑或它們的混合物。
38.權(quán)利要求36的組合物，其中第一提取劑包含乙醇和水的混合物。
39.權(quán)利要求36的組合物，其中所述提取劑包含70%-95%乙醇和30% -5%水的混合物。
40.權(quán)利要求36的組合物，其中所述提取在75°C_85°C的溫度下進(jìn)行。
41.權(quán)利要求36的組合物，其中所述方法還包括通過蒸發(fā)除去第一提取劑以產(chǎn)生濃縮物的步驟。
42.權(quán)利要求41的組合物，其中所述方法還包括用第二提取劑提取所述濃縮物的步驟。
43.權(quán)利要求42的組合物，其中第二提取劑為極性溶劑、非極性溶劑或它們的組合。
44.權(quán)利要求42的組合物，其中第二提取劑為石油醚、二氯甲烷、醋酸乙烷、正丁醇或它們的組合。
45.權(quán)利要求34-44中任一項的組合物，其中所述植物材料來自龍腦香科青梅。
46.權(quán)利要求34-44中任一項的組合物，其中所述植物材料來自番荔枝科毛葉鷹爪花。
47.權(quán)利要求34-44中任一項的組合物，其中所述植物材料來自番荔枝科喙果皂帽花。
48.權(quán)利要求34-44中任一項的組合物，其中所述植物材料包括選自根、莖、葉、種子和花的植物部分。
49.一種用于治療需要緩解HIV感染的患者的方法，所述方法包括向所述患者給予治療有效量的權(quán)利要求1-10中任一項的活性級分或權(quán)利要求34-48中任一項的藥物組合物的步驟。
全文摘要
本發(fā)明描述了傳統(tǒng)中藥植物番荔枝科毛葉鷹爪花、番荔枝科喙果皂帽花、大戟科劍葉三寶木和龍腦香科青梅的提取物。本發(fā)明描述了包含所述提取物的藥物組合物和對HIV感染的治療。
文檔編號A61P31/18GK102724990SQ201080044700
公開日2012年10月10日 申請日期2010年7月28日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月29日
發(fā)明者I-W·樸, J·J·何, 宋小平, 陳光英, 韓長日 申請人:印第安納大學(xué)研究及科技有限公司, 海南師范大學(xué)