專利名稱：Nkg2d抑制劑在治療心血管和代謝疾病如2型糖尿病中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及治療2型糖尿病和/或可通過抑制NKG2D來調(diào)節(jié)或正?；牟“Y如心血管病的方法。
背景技術(shù)：
深受糖尿病困擾的人群數(shù)量大且不斷增加。糖尿病是胰腺激素胰島素相對或絕對缺陷引起的血糖水平升高導(dǎo)致的代謝疾病。胰島素響應(yīng)血糖水平而由胰腺分泌到血液中， 其主要功能是將血糖導(dǎo)入機體儲備，從而控制血糖水平。已知糖尿病分為1型和2型。1型糖尿病的特征是靶向β細胞的破壞性自身免疫過程和這些細胞的再生能力之間失衡所致的胰腺β細胞進行性損失。這種失衡最終導(dǎo)致完全喪失β細胞和內(nèi)源性胰島素分泌。1型糖尿病占糖尿病總數(shù)的5-10%。2型糖尿病的特征是胰島素抗性和β細胞功能受損，包括第一期胰島素釋放受損、β細胞脈沖質(zhì)量降低和胰島素缺陷。2型糖尿病是最常見的糖尿病形式，占糖尿病總數(shù)的90-95%。糖尿病患者發(fā)生心血管病的概率是未患糖尿病的人群的2-4倍。盡管在過去幾十年治療取得很大進步，但心血管病仍然是2型糖尿病患者的主要并發(fā)癥和主要致死原因。心臟病發(fā)作、中風(fēng)和下肢截肢的風(fēng)險增加是糖尿病患者過早死亡的主要原因。在2型糖尿病患者中，包括肥胖、高血壓、血脂異常和缺乏運動在內(nèi)的心血管病風(fēng)險因素通常更為
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曰 JM- O心血管病是最嚴重的人類健康問題并且是美國的第一大死亡原因。根據(jù)美國心臟協(xié)會的報道，單單在美國，2008年心血管病預(yù)防和治療的花費將達到令人驚訝的4485億美元，形成巨大的社會財政負擔(dān)。動脈粥樣硬化是動脈血管內(nèi)壁上形成由脂肪物質(zhì)和細胞組分構(gòu)成的斑塊的心血管病形式。該疾病由功能障礙性代謝疾病，如糖尿病患者動脈的易患區(qū)域上沉積異常代謝物引發(fā)，并且隨著包括免疫激活和炎癥在內(nèi)多種因素的卷入而不斷進展。異常代謝疾病如糖尿病引發(fā)多種細胞應(yīng)激反應(yīng)，誘導(dǎo)組織炎癥和免疫細胞激活， 進而加重代謝功能障礙，產(chǎn)生惡性循環(huán)持續(xù)造成諸如心血管病進展等失調(diào)的下游后果。然而，我們尚未徹底了解聯(lián)接這些過程的分子事件，這阻礙了我們通過調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)治療代謝功能障礙和心血管病并發(fā)癥的努力。
因此，需要有效的方法來預(yù)測、預(yù)防和治療代謝功能障礙相關(guān)疾病，如糖尿病以及心血管疾病和失調(diào)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及在患有2型糖尿病和/或代謝功能障礙的患者和動物中上調(diào)，和可能對血管和肝臟炎癥、代謝功能障礙和心血管病發(fā)生中的免疫細胞激活起到重要作用的免疫刺激分子家族的發(fā)現(xiàn)。具體說，在2型糖尿病患者以及脂質(zhì)代謝功能障礙和動脈粥樣硬化的動物模型中檢測到NKG2D (—種強效免疫激活受體)的刺激配體水平升高。因此，本發(fā)明提供治療2型糖尿病和可通過抑制NKG2D來調(diào)節(jié)或正?；牟“Y如心血管病的新方法、組合物和藥盒。本發(fā)明也提供檢測和診斷2型糖尿病或心血管病發(fā)生傾向或者2型糖尿病或心血管病的存在的新方法。在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種治療2型糖尿病的方法，所述方法包括給予需要的對象治療有效量的抑制NKG2D激活或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的藥劑。在另一實施方式中，本發(fā)明提供一種治療2型糖尿病的方法，所述方法包括給予需要的對象治療有效量的阻斷NKG2D 配體結(jié)合作用的藥劑。在另一實施方式中，本發(fā)明提供一種治療可通過抑制NKG2D來調(diào)節(jié)或正?；牟“Y的方法，所述方法包括給予需要的對象治療有效量的抑制NKG2D激活或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的藥劑，其中所述病癥選自2型糖尿病、心血管病、炎性疾病和代謝功能障礙相關(guān)疾病。在另一實施方式中，本發(fā)明提供一種治療可通過抑制NKG2D來調(diào)節(jié)或正?；牟“Y的方法，所述方法包括給予需要的對象治療有效量的阻斷NKG2D配體結(jié)合作用的藥劑，其中所述病癥選自2型糖尿病、心血管病、炎性疾病和代謝功能障礙相關(guān)疾病。在另一實施方式中，本發(fā)明涉及治療有效量的在對象中抑制NKG2D激活或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的藥劑在治療2型糖尿病中的用途。在另一實施方式中，本發(fā)明涉及治療有效量的在對象中阻斷NKG2D配體結(jié)合作用的藥劑在治療2型糖尿病中的用途。在另一實施方式中，本發(fā)明涉及治療有效量的在對象中抑制NKG2D激活或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的藥劑在治療可通過抑制NKG2D 來調(diào)節(jié)或正?；牟“Y中的用途，其中所述病癥選自2型糖尿病、心血管病、炎性疾病和代謝功能障礙相關(guān)疾病。在另一實施方式中，本發(fā)明涉及治療有效量的在對象中阻斷NKG2D 配體結(jié)合作用的藥劑在治療可通過抑制NKG2D來調(diào)節(jié)或正?；牟“Y中的用途，其中所述病癥選自2型糖尿病、心血管病、炎性疾病和代謝功能障礙相關(guān)疾病。在一些實施方式中，可通過抑制NKG2D來調(diào)節(jié)或正常化的病癥是2型糖尿病。在一些實施方式中，所述病癥是心血管病。在一些實施方式中，所述對象是人。在一些實施方式中，所述藥劑選自可溶性NKG2D、特異性結(jié)合NKG2D的抗體或其抗原結(jié)合片段、NKG2D配體和NKG2D配體活性或表達的抑制劑。在一些實施方式中，所述藥劑是特異性結(jié)合NKG2D的抗體或其抗原結(jié)合片段。在一些實施方式中，所述抗體或其抗原結(jié)合片段是人或人源化的。在一些實施方式中，所述抗體或其抗原結(jié)合片段結(jié)合人 NKG2D(hNKG2D)。在一些實施方式中，所述抗體或其抗原結(jié)合片段降低NKG2D介導(dǎo)的NKG2D 表達細胞的激活或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。在一些實施方式中，所述抗體或其抗原結(jié)合片段與至少一種 NKG2D配體競爭結(jié)合NKG2D。在一些實施方式中，所述NKG2D配體是MICA/B。在一些實施方式中，給予所述藥劑導(dǎo)致對象出現(xiàn)下述反應(yīng)中至少一種血糖水平降低、葡萄糖耐受提高、胰島素抗性降低、體重降低、血壓降低、炎癥減輕或代謝功能障礙減輕。在一些實施方式中，通過靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)或皮下途徑給予所述藥劑。在一些實施方式中，本發(fā)明方法還包括至少一種選自下組的額外藥劑抗糖尿病藥、抗肥胖藥、食欲調(diào)節(jié)藥、抗高血壓藥、治療和/或預(yù)防糖尿病導(dǎo)致或與糖尿病相關(guān)的并發(fā)癥的藥劑、和治療和/或預(yù)防肥胖導(dǎo)致或與肥胖相關(guān)的并發(fā)癥和失調(diào)的藥劑。在一些實施方式中，所述額外藥劑選自(a)選自下組的降血糖藥GLP-1和GLP-I衍生物和類似物、重組促胰島素分泌肽(Exendin)-4和重組促胰島素分泌肽-4衍生物和類似物、糊精和糊精衍生物和類似物、磺脲、雙胍、氯茴苯酸(如那格列奈和瑞格列奈)、葡糖苷酶抑制劑、 DPP-IV (二肽基肽酶-IV)抑制劑、SGLT2抑制劑、SGLTl抑制劑或激動劑、胃泌素和胃泌素類似物和衍生物、FGF-21 (成纖維細胞生長因子21)和FGF-21衍生物和類似物、質(zhì)子泵抑制劑如蘭索拉唑、奧美拉唑、右旋蘭索拉唑、艾美拉唑、泮托拉唑和雷貝拉唑、R)(R激動劑、考來烯胺、考來替泊、普羅布考、右旋甲狀腺素、PPAR激動劑、脂連蛋白和脂連蛋白衍生物和類似物；(b)選自下組的降血脂劑或脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)劑抗高血脂藥，HMG CoA抑制劑(他汀類) 如洛伐他汀、帕伐他丁和斯伐他汀，以及貝特類藥物如吉非貝齊和氯貝丁酯；(c)選自下組的降低食物攝入或提高能量消耗的藥劑NPY(神經(jīng)肽Y)拮抗劑、PYY(多肽YY)激動劑、 PP(胰多肽)激動劑、Y2受體激動劑、W受體激動劑、混合的Υ2Λ4受體激動劑、MC4(黑皮質(zhì)素4)激動劑、阿立新拮抗劑、胰高血糖素和胰高血糖素衍生物和類似物、CRF(促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子)激動劑、CRF BP(促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子結(jié)合蛋白)拮抗劑、尿皮質(zhì)素激動劑、β 3激動劑、MSH(促黑色素細胞激素)激動劑、MCH(黑色素細胞聚集激素)拮抗劑、CCK(膽囊收縮素)激動劑、血清素再攝取抑制劑、血清素和去甲腎上腺素再攝取抑制齊U、混合的血清素和去甲腎上腺素能化合物、5HT(血清素)激動劑、鈴蟾肽激動劑、甘丙肽拮抗劑、生長激素、生長激素釋放化合物、TRH(促甲狀腺激素釋放激素)激動劑、UCP 2或 3(非偶聯(lián)的蛋白質(zhì)2或幻調(diào)節(jié)劑、瘦激素激動劑、DA激動劑(溴隱亭、多普辛(doprexin))、 脂肪酶/淀粉酶抑制劑、RXR(類視黃醇X受體)調(diào)節(jié)劑、組胺H3拮抗劑和CART (可卡因安非他明調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄物)激動劑；和(d)選自下組的降血壓藥β -阻斷劑如阿普洛爾、阿替洛爾、噻嗎洛爾、吲哚洛爾、普萘洛爾和美托洛爾，ACE(血管緊張素轉(zhuǎn)化酶)抑制劑如貝那普利、卡托普利、依那普利、福辛普利、賴諾普利、阿拉普利(alatriopril)、喹那普利和雷米普利，鈣通道阻斷劑如硝苯地平、非洛地平、尼卡地平、伊拉地平、尼莫地平、地爾硫卓和維拉帕米，以及α -阻斷劑如多沙唑嗪、烏拉地爾、哌唑嗪和特拉唑嗪。在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種組合物，其包含治療有效量的抑制NKG2D激活或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的藥劑和藥學(xué)上可接受的運載體。在另一實施方式中，本發(fā)明提供一種組合物，其包含治療有效量的阻斷NKG2D配體結(jié)合作用的藥劑和藥學(xué)上可接受的運載體。在一些實施方式中，所述藥劑可用于治療2型糖尿病。在一些實施方式中，所述藥劑用于治療可通過抑制NKG2D來調(diào)節(jié)或正常化的病癥。在一些實施方式中，所述病癥選自2型糖尿病、心血管病、炎性疾病和代謝功能障礙相關(guān)疾病。在一些實施方式中，所述病癥是2型糖尿病。在一些實施方式中，所述病癥是心血管病。在一些實施方式中，所述藥劑選自可溶性NKG2D、特異性結(jié)合NKG2D的抗體或其抗原結(jié)合片段、NKG2D配體和NKG2D配體活性或表達的抑制劑。在一些實施方式中，所述藥劑是特異性結(jié)合NKG2D的抗體或其抗原結(jié)合片段。在一些實施方式中，所述抗體或其抗原結(jié)合片段是人或人源化的。在一些實施方式中，所述抗體或其抗原結(jié)合片段結(jié)合人 NKG2D(hNKG2D)。在一些實施方式中，所述藥劑是NKG2D配體活性或表達的抑制劑。在一些實施方式中，所述NKG2D配體活性或表達的抑制劑是MICA/B抑制劑。在一些實施方式中，所述 MICA/B抑制劑是MICA/B-特異性siRNA。在一些實施方式中，本發(fā)明組合物還包含至少一種選自下組的額外藥劑抗糖尿病藥、抗肥胖藥、食欲調(diào)節(jié)藥、抗高血壓藥、治療和/或預(yù)防糖尿病導(dǎo)致或與糖尿病相關(guān)的并發(fā)癥的藥劑、和治療和/或預(yù)防肥胖導(dǎo)致或與肥胖相關(guān)的并發(fā)癥和失調(diào)的藥劑。在一些實施方式中，所述額外藥劑選自(a)選自下組的降血糖藥GLP-1和GLP-I衍生物和類似物、重組促胰島素分泌肽(Exendin)-4和重組促胰島素分泌肽_4衍生物和類似物、糊精和糊精衍生物和類似物、磺脲、雙胍、氯茴苯酸(如那格列奈和瑞格列奈)、葡糖苷酶抑制劑、 DPP-IV(二肽基肽酶-IV)抑制劑、SGLT2抑制劑、SGLTl抑制劑或激動劑、胃泌素和胃泌素類似物和衍生物、FGF-21 (成纖維細胞生長因子21)和FGF-21衍生物和類似物、質(zhì)子泵抑制劑如蘭索拉唑、奧美拉唑、右旋蘭索拉唑、艾美拉唑、泮托拉唑和雷貝拉唑、R)(R激動劑、考來烯胺、考來替泊、普羅布考、右旋甲狀腺素、PPAR激動劑、脂連蛋白和脂連蛋白衍生物和類似物；(b)選自下組的降血脂劑或脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)劑抗高血脂藥，HMG CoA抑制劑(他汀類) 如洛伐他汀、帕伐他丁和斯伐他汀，以及貝特類藥物如吉非貝齊和氯貝丁酯；(c)選自下組的降低食物攝入或提高能量消耗的藥劑NPY(神經(jīng)肽Y)拮抗劑、PYY(多肽YY)激動劑、 PP(胰多肽)激動劑、Y2受體激動劑、W受體激動劑、混合的Υ2Λ4受體激動劑、MC4(黑皮質(zhì)素4)激動劑、阿立新拮抗劑、胰高血糖素和胰高血糖素衍生物和類似物、CRF(促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子)激動劑、CRF BP(促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子結(jié)合蛋白)拮抗劑、尿皮質(zhì)素激動劑、β 3激動劑、MSH(促黑色素細胞激素)激動劑、MCH(黑色素細胞聚集激素)拮抗劑、CCK(膽囊收縮素)激動劑、血清素再攝取抑制劑、血清素和去甲腎上腺素再攝取抑制劑、混合的血清素和去甲腎上腺素能化合物、5HT(血清素)激動劑、鈴蟾肽激動劑、甘丙肽拮抗劑、生長激素、生長激素釋放化合物、TRH(促甲狀腺激素釋放激素)激動劑、UCP 2或 3(非偶聯(lián)的蛋白質(zhì)2或幻調(diào)節(jié)劑、瘦激素激動劑、DA激動劑(溴隱亭、多普辛(doprexin))、 脂肪酶/淀粉酶抑制劑、RXR(類視黃醇X受體)調(diào)節(jié)劑、組胺H3拮抗劑和CART (可卡因安非他明調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄物)激動劑；和(d)選自下組的降血壓藥β -阻斷劑如阿普洛爾、阿替洛爾、噻嗎洛爾、吲哚洛爾、普萘洛爾和美托洛爾，ACE(血管緊張素轉(zhuǎn)化酶)抑制劑如貝那普利、卡托普利、依那普利、福辛普利、賴諾普利、阿拉普利(alatriopril)、喹那普利和雷米普利，鈣通道阻斷劑如硝苯地平、非洛地平、尼卡地平、伊拉地平、尼莫地平、地爾硫卓和維拉帕米，以及α -阻斷劑如多沙唑嗪、烏拉地爾、哌唑嗪和特拉唑嗪。在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種藥盒，其包含(a)治療有效量的抑制NKG2D 激活或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的藥劑以及藥學(xué)上可接受的運載體；和(b)使用說明書。在另一實施方式中，本發(fā)明提供一種藥盒，其包含(a)治療有效量的阻斷NKG2D配體結(jié)合作用的藥劑以及藥學(xué)上可接受的運載體；和(b)使用說明書。在一些實施方式中，所述藥劑可用于治療2型糖尿病。
在一些實施方式中，所述藥劑用于治療可通過抑制NKG2D來調(diào)節(jié)或正?；牟“Y。在一些實施方式中，所述病癥選自2型糖尿病、心血管病、炎性疾病和代謝功能障礙相關(guān)疾病。在一些實施方式中，所述病癥是2型糖尿病。在一些實施方式中，所述病癥是心血管病。在一些實施方式中，所述藥劑選自可溶性NKG2D、特異性結(jié)合NKG2D的抗體或其抗原結(jié)合片段、NKG2D配體和NKG2D配體活性或表達的抑制劑。在一些實施方式中，所述藥劑是特異性結(jié)合NKG2D的抗體或其抗原結(jié)合片段。在一些實施方式中，所述抗體或其抗原結(jié)合片段是人或人源化的。在一些實施方式中，所述抗體或其抗原結(jié)合片段結(jié)合人 NKG2D(hNKG2D)。在一些實施方式中，本發(fā)明藥盒還包括至少一種選自下組的額外藥劑抗糖尿病藥、抗肥胖藥、食欲調(diào)節(jié)藥、抗高血壓藥、治療和/或預(yù)防糖尿病導(dǎo)致或與糖尿病相關(guān)的并發(fā)癥的藥劑、和治療和/或預(yù)防肥胖導(dǎo)致或與肥胖相關(guān)的并發(fā)癥和失調(diào)的藥劑。在一些實施方式中，所述額外藥劑選自(a)選自下組的降血糖藥GLP-1和GLP-I衍生物和類似物、重組促胰島素分泌肽(Exendin)-4和重組促胰島素分泌肽_4衍生物和類似物、糊精和糊精衍生物和類似物、磺脲、雙胍、氯茴苯酸(如那格列奈和瑞格列奈)、葡糖苷酶抑制劑、 DPP-IV (二肽基肽酶-IV)抑制劑、SGLT2抑制劑、SGLTl抑制劑或激動劑、胃泌素和胃泌素類似物和衍生物、FGF-21 (成纖維細胞生長因子21)和FGF-21衍生物和類似物、質(zhì)子泵抑制劑如蘭索拉唑、奧美拉唑、右旋蘭索拉唑、艾美拉唑、泮托拉唑和雷貝拉唑、R)(R激動劑、考來烯胺、考來替泊、普羅布考、右旋甲狀腺素、PPAR激動劑、脂連蛋白和脂連蛋白衍生物和類似物；(b)選自下組的降血脂劑或脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)劑抗高血脂藥，HMG CoA抑制劑(他汀類) 如洛伐他汀、帕伐他丁和斯伐他汀，以及貝特類藥物如吉非貝齊和氯貝丁酯；(c)選自下組的降低食物攝入或提高能量消耗的藥劑NPY(神經(jīng)肽Y)拮抗劑、PYY (多肽YY)激動劑、 PP (胰多肽)激動劑、Y2受體激動劑、Y4受體激動劑、混合的Υ2Λ4受體激動劑、MC4(黑皮質(zhì)素4)激動劑、阿立新拮抗劑、胰高血糖素和胰高血糖素衍生物和類似物、CRF(促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子)激動劑、CRF BP(促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子結(jié)合蛋白)拮抗劑、尿皮質(zhì)素激動劑、β 3激動劑、MSH(促黑色素細胞激素)激動劑、MCH(黑色素細胞聚集激素) 拮抗劑、CCK(膽囊收縮素)激動劑、血清素再攝取抑制劑、血清素和去甲腎上腺素再攝取抑制劑、混合的血清素和去甲腎上腺素能化合物、5HT(血清素)激動劑、鈴蟾肽激動劑、甘丙肽拮抗劑、生長激素、生長激素釋放化合物、TRH(促甲狀腺激素釋放激素)激動劑、UCP 2或 3(非偶聯(lián)的蛋白質(zhì)2或幻調(diào)節(jié)劑、瘦激素激動劑、DA激動劑(溴隱亭、多普辛(doprexin))、 脂肪酶/淀粉酶抑制劑、RXR(類視黃醇X受體)調(diào)節(jié)劑、組胺H3拮抗劑和CART (可卡因安非他明調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄物)激動劑；和(d)選自下組的降血壓藥β -阻斷劑如阿普洛爾、阿替洛爾、噻嗎洛爾、吲哚洛爾、普萘洛爾和美托洛爾，ACE(血管緊張素轉(zhuǎn)化酶)抑制劑如貝那普利、卡托普利、依那普利、福辛普利、賴諾普利、阿拉普利(alatriopril)、喹那普利和雷米普利，鈣通道阻斷劑如硝苯地平、非洛地平、尼卡地平、伊拉地平、尼莫地平、地爾硫卓和維拉帕米，以及α -阻斷劑如多沙唑嗪、烏拉地爾、哌唑嗪和特拉唑嗪。在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種在對象中檢測2型糖尿病發(fā)生傾向或2型糖尿病的存在的方法，所述方法包括(a)由所述對象獲得樣品；(b)將所述樣品與檢測是否存在MICA/B表達的至少一種試劑相接觸；(c)測定所述樣品中的MICA/B表達水平；和(d) 將MICA/B過度表達與所述對象的2型糖尿病發(fā)生傾向或存在2型糖尿病相關(guān)聯(lián)。在另一實施方式中，本發(fā)明提供一種在對象中檢測心血管病發(fā)生傾向或心血管病的存在的方法， 所述方法包括(a)由所述對象獲得樣品；(b)將所述樣品與檢測是否存在MICA/B表達的至少一種試劑相接觸；(c)測定所述樣品中的MICA/B表達水平；和(d)將MICA/B過度表達與所述對象的心血管病發(fā)生傾向或存在心血管病相關(guān)聯(lián)。在一些實施方式中，所述試劑是MICA/B抗體。在一些實施方式中，所述樣品是血清。在一些實施方式中，所述對象是人。在一些實施方式中，本發(fā)明方法還包括測定所述樣品中不是MICA/B的心血管病標記物的表達水平，并將心血管病標記物的過度表達或表達不足與所述對象的心血管病發(fā)生傾向或存在心血管病相關(guān)聯(lián)。附圖簡要說明

圖1是顯示在2型糖尿病患者血清中檢測的可溶性MICA蛋白和其與其他促炎細胞因子表達的相關(guān)性的一系列圖。(A)檢測2型糖尿病患者血液中的可溶性MICA。利用 ELISA試劑盒(明尼蘇達州明尼阿波利斯的R&D系統(tǒng)公司(R&D Systems，Minneapolis，麗)) 測定糖尿病患者血清中的MICA蛋白。重組MICA蛋白用作標準品，根據(jù)它計算血清MICA水平。X軸的每個數(shù)字代表一位患者。(B和C)通過人促炎4重組(IL-6、TNF- α、IL-I β和 IFN-γ)(馬里蘭州蓋瑟斯堡的美索發(fā)現(xiàn)公司(Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD)) 分析同一患者血清中的IL-6和TNF-α水平。⑶通過CRP ELISA試劑盒(加州春谷的凱爾生物技術(shù)公司(Calbiotech Inc. Spring Valley, CA))分析2型糖尿病患者血清中的C-反應(yīng)性蛋白(CRP)的血清水平。(E)平均來看，糖尿病患者的血清MICA水平高于所檢測的50 位癌癥患者。將2型糖尿病患者的數(shù)據(jù)分組，并與50位癌癥患者的數(shù)據(jù)作比較。圖2是一系列冰凍切片的顯微照片，顯示通過免疫組化染色在人主動脈斑塊上檢測到MICA/B。用抗-MICA/B抗體對斑塊的冰凍切片染色(A、C、E、G)。用抗-Mac-3或CD31 抗體對相鄰切片進行染色，以顯示巨噬細胞或內(nèi)皮細胞(B、D、F、H)。正常主動脈的切片用作MICA染色對照(I)。圖3是一系列電泳凝膠照片和一系列免疫組化染色的冰凍切片照片，顯示在 ApoE-/"小鼠的動脈粥樣硬化斑塊中NKG2D配體上調(diào)。(A)對主動脈斑塊病變的RNA中 NKG2D配體Rae-I δ、Rae-I ε和H60b的轉(zhuǎn)錄物進行半定量RT-PCR分析。(B)在飼喂西方飲食(WD)的ApoE-/-和年齡匹配的飼喂西方飲食的野生型小鼠和飼喂正常食物的野生型小鼠中，對分離自主動脈弓區(qū)域的RNA樣品中的Rae-I δ ,Rae-I ε和H60b轉(zhuǎn)錄物進行實時 RT-PCR分析。實驗進行兩次。(C)對自然產(chǎn)生斑塊的(右側(cè))或STZ-誘導(dǎo)型糖尿病加速的(左側(cè))ApoE-/_小鼠的斑塊冰凍切片進行免疫組化染色。切片用抗-Rae-I或H60抗體 (褐色)和抗-CD68抗體(藍色)進行復(fù)染。(D)免疫組化染色飼喂西方飲食的ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化主動脈中的NKG2D配體Rae-I和H60。同一飼喂西方飲食的ApoE-/-小鼠的動脈粥樣硬化主動脈弓區(qū)域(上圖和中圖)和“無斑塊”胸部區(qū)域(下圖)的冰凍切片用多克隆山羊抗-小鼠抗-Rae-I (R&D系統(tǒng)公司)或H60抗體(圣克魯茲生物技術(shù)公司 (Santa Cruz Biotechnology))進行染色。中部照片為上圖(100X)中方框區(qū)域的高倍放大圖G00X)。(E)流式細胞術(shù)分析分離自ApoE+小鼠的動脈粥樣硬化主動脈或野生型小鼠的正常主動脈的巨噬細胞和內(nèi)皮細胞上的細胞表面Rae-I表達。在⑶45+⑶Ilb+⑶16/32+ 細胞群上門選巨噬細胞，CD45—CD31+細胞群上門選內(nèi)皮細胞?；疑珔^(qū)域是同種型匹配的對照抗體染色。(F)對體外處理的野生型巨噬細胞中的總Rae-I蛋白進行蛋白質(zhì)印跡分析。 (G)對僅在培養(yǎng)基中和在額外oxLDL、天然LDL(nLDL)和LPS(作為對照)存在下培養(yǎng)的野生型巨噬細胞中的不同NKG2D配體上調(diào)進行半定量RT-PCR分析。(H)對氧化LDL (oxLDL) 或晚期糖基化終產(chǎn)物(AGE)存在下體外培養(yǎng)的野生型巨噬細胞上的Rae-I表達進行流式細胞術(shù)分析。巨噬細胞分離自腹腔，并在含5 μ g/mloxLDL或200 μ g/ml AGE的培養(yǎng)基中體外培養(yǎng)2天，然后通過類似于圖E的流式細胞術(shù)進行分析，不同之處在于虛線代表在10倍過量的未標記的抗-泛Rae-I抗體存在下染色。圖4是ApoE缺失小鼠的主動脈的一系列照片，顯示在有糖尿病的ApoE缺失小鼠中抗-NKG2D抗體抑制斑塊形成。(A)代表性抗-NKG2D或?qū)φ湛贵w處理的患有糖尿病的 ApoE缺失小鼠的主動脈中的斑塊形成。主動脈用PBS灌注，并在解剖顯微鏡下觀察明顯的不透明斑塊。需要注意的是，在抗-NKG2D抗體治療小鼠中斑塊顯著縮小(圓圈區(qū)域)。(B) 對來自一個代表性實驗的抗-NKG2D(MI-6)和對照抗體(對照)處理的ApoE-/-小鼠的主動脈中的沉積脂類物質(zhì)進行正面油紅O(En face Oil red 0)染色。打開主動脈，用10%福爾馬林固定，并用油紅0染料染色。脂類物質(zhì)染成深紅色。需要注意的是，在抗-NKG2D抗體處理小鼠的主動脈弓區(qū)域油紅0染色明顯較少。圖5是表明在各種小鼠模型中靶向NKG2D/配體相互作用能防止動脈粥樣硬化的一系列圖片。(A)在鏈脲霉素誘導(dǎo)的糖尿病ApoE-/-小鼠中抗-NKG2D抗體阻斷對動脈粥樣硬化發(fā)生的影響。根據(jù)油紅0陽性染色面積占總弓面積的比例計算對照和抗-NKG2D處理的糖尿病ApoE-/-小鼠的主動脈上的斑塊大小。(B和C)在鏈脲霉素誘導(dǎo)的患有糖尿病 (B)或飼喂西方飲食(C)的KLRKl-/-ApoE-/-小鼠中(KLRK1基因編碼NKG2D蛋白)，NKG2D 敲除對動脈粥樣硬化發(fā)生的影響。斑塊大小的計算方法與圖A相同。ApoE-/-小鼠用作對照。圖6是顯示抗-NKG2D抗體處理的患有糖尿病的ApoE缺失小鼠的血清中促炎細胞因子減少的一系列圖片。用小鼠促炎-7重試劑盒(IL-6、TNF-a、IFN-γ、IL_12p70、IL-10、 IL-I β和KC/CXCL1)(馬里蘭州蓋瑟斯堡的美索發(fā)現(xiàn)公司)直接分析四只抗-NKG2D(MI-6 Ab)-處理的和三只對照抗體(Con Ab)處理的糖尿病ApoE缺失小鼠以及年齡匹配的野生型 B6(野生型)各兩只，一月齡(幼年ApoE)或八月齡(老年ApoE) ApoE-/-小鼠的血清。星號*表明抗-NKG2D抗體和對照抗體處理的糖尿病ApoE-/-小鼠之間的數(shù)值有統(tǒng)計學(xué)顯著差異。圖7是顯示KLRKl-/-ApoE-/-小鼠(具有缺陷型NKG2D基因)的血清中促炎細胞因子減少的一系列圖片。通過如圖6所示的小鼠促炎-7重試劑盒(IL-6、TNF-a、 IFN-γ、IL-12p70、IL-10、IL-l β和KC/CXCL1)(馬里蘭州蓋瑟斯堡的美索發(fā)現(xiàn)公司)直接分析飼喂西方飲食(12只小鼠/組)(圖A)或STZ誘導(dǎo)型糖尿病G只小鼠/組)(圖B) KLRKl-/"ApoE-/-和ApoE-/-小鼠的血清。星號表明抗-NKG2D抗體和對照抗體處理的糖尿病ApoE-/"小鼠之間的數(shù)值有統(tǒng)計學(xué)顯著差異(***P < 0. 01 ;*p < 0. 05)。圖8是顯示KLRKl-/-ApoE-/-小鼠的代謝疾病緩解的一對血清照片和一對圖片。(A)飼喂西方飲食的KLRKl-/-ApoE-/-的血清比飼喂類似飲食的ApoE-/-小鼠的血清表觀更澄清。(B)KLRKl-/-ApoE-/-小鼠血液中膽固醇和甘油三酯水平降低。分析圖A中血清的總膽固醇和甘油三酯。星號**表明KLRKl/ApoE雙敲除和ApoE-敲除小鼠之間的數(shù)值有統(tǒng)計學(xué)顯著差異(**P < 0. 05)。每組使用至少5只小鼠。圖9是顯示NKG2D-敲除KLRKl-/-ApoE-/-小鼠的血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)活性相較ApoE-/-小鼠降低的圖片。每組使用至少5只小鼠。圖10是顯示防止NKG2D/配體相互作用能減輕飼喂西方飲食的ApoE-/-小鼠的肝臟炎癥的一對圖片。(A) NKG2D-敲除KLRKl-/-ApoE-/-小鼠的離體培養(yǎng)的肝臟外植體的IL-6產(chǎn)量降低。從飼喂西方飲食的ApoE-/-或NKG2D-敲除KLRKl-/-ApoE-/-小鼠中切除PBS-灌注的肝臟。將相同重量的切除肝臟切成大約Imm3wS塊，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)1或3天?；厥张囵B(yǎng)基，通過ELISA分析細胞因子。該實驗重復(fù)兩次。(B)在飼喂西方飲食的NKG2D-敲除 KLRKl-/"ApoE-/-小鼠的肝臟中，免疫細胞浸潤減少。數(shù)量是每個肝臟中每種免疫細胞類型的數(shù)量，根據(jù)從肝臟中分離的總單核細胞和每種類型的百分數(shù)計算。每組使用至少3只小鼠。顯示三次獨立實驗中的一次代表性實驗。圖11是一系列圖片和熒光活化細胞分選分析圖，顯示飼喂西方飲食的ApoE-/-小鼠的肝臟細胞中NKG2D配體上調(diào)，以及防止NKG2D/配體相互作用能減少肝臟中表達NKG2D 的免疫細胞的激活。(A)對飼喂西方飲食8周的12周齡雄性ApoE-/-小鼠和相同年齡的野生型小鼠的肝臟和其他器官中的Rae-I δ轉(zhuǎn)錄物進行實時RT-PCR分析。(B)對從飼喂西方飲食的ApoE-/-小鼠和野生型小鼠的肝臟中純化的巨噬細胞的Rae-I δ轉(zhuǎn)錄物進行實時 RT-PCR分析。(C和D)對飼喂西方飲食的ApoE-/-小鼠的肝臟巨噬細胞(C)和肝細胞⑶ 的Rae-I表達進行流式細胞術(shù)分析。(E) NKG2D-敲除KLRKl-/-ApoE-/-小鼠的肝臟NKT細胞的IFN-γ和IL-4產(chǎn)量降低。(F)與ApoE-/-小鼠相比，NKG2D-敲除KLRKl-/-ApoE-/_小鼠的肝臟NK細胞的IFN- γ產(chǎn)量較低。(G) NKG2D-敲除KLRKl-/-ApoE-/-和ApoE-/-小鼠的肝臟巨噬細胞的IL-6產(chǎn)量沒有差異。圖12是顯示靶向NKG2D會抑制2型糖尿病的圖片。向8周齡的ApoE-/-和NKG2D 缺陷型ApoE-/-KLRKl-/-小鼠飼喂西方飲食3個月。然后采集血清并評估葡萄糖水平。 ApoE-/"和ApoE-/-KLRKl-/-小鼠的葡萄糖水平是每組六只小鼠的平均值。兩組的差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P < 0. 05)。圖13顯示在2型糖尿病動物模型肥沙鼠(Psammomys obesus)(也稱為沙鼠(sand rats))中，抗-NKG2D抗體對糖尿病發(fā)生的影響。雄性和雌性肥沙鼠(P. obesus,以色列耶路撒冷的哈倫公司(Harlan，Jerusalem, Israel))飼喂低能量(2. 4kcal/g)飲食直到9周齡后，將它們轉(zhuǎn)移到隨意高能量(3. lkcal/g)飲食條件下，期間跟蹤檢測至多10天(誘導(dǎo)期) 的體重(BW)和清晨血糖(mBG)。將mBG水平升高(定義為連續(xù)兩個mBG讀數(shù)> lOmmol/L) 的動物轉(zhuǎn)移回低能量飲食，并于10天后當(dāng)其mBG水平恢復(fù)非糖尿病水平時將其用于實際研究(預(yù)防模式)。將誘導(dǎo)期mBG沒有增加的動物處死，不繼續(xù)使用。(數(shù)據(jù)未顯示)。用載體(N= 19)或NKG2D-PE抗體(克隆CX5) (N = 9)處理肥沙鼠，每周一次腹膜內(nèi)注射。該項研究進行六周，期間有規(guī)律地跟蹤監(jiān)測mBG和BW。載體組的所有動物都患上嚴重的糖尿病，平均mBG為14. 5 士 2. 6mM(平均值士標準誤)，而用NKG2D抗體處理的動物仍然保持正常血糖水平(mBG < 8mM)并且具有顯著較低的mBG (8. 0 士 1. 9mM，p < 0. 0001(平均值士標準誤))。在肥沙鼠中NKG2D抗體處理完全抑制了 2型糖尿病的發(fā)生，在研究過程中由于出現(xiàn)嚴重的糖尿病酮酸中毒而不得不處死載體組的五只動物。兩個治療組的BW增加沒有差
已圖14顯示NKG2D抗體結(jié)合肥沙鼠(沙鼠，2型糖尿病動物模型)的血細胞的流式細胞術(shù)分析。觀察到抗-小鼠NKG2D-PE抗體(克隆CX5)與沙鼠血液中的NK細胞發(fā)生劑量依賴性結(jié)合。這種結(jié)合有特異性，因為同種型對照抗體(大鼠IgGl-PE同種型對照(R3-34) 和小鼠IgGl-PE同種型對照(M0PC-21))或抗-人NKG2D抗體(克隆IDll和克隆0N72)沒有結(jié)合。定義除非另外定義，本文中使用的所有技術(shù)術(shù)語具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常所理解的同樣含義。本文所用的“蛋白質(zhì)”和“多肽”是同義詞，指不考慮長度或翻譯后修飾如糖基化或磷酸化時的任何肽連接的氨基酸鏈。本文所用術(shù)語"MICA/B蛋白"或"MICA/B多肽"指I類MHC鏈相關(guān)的A或B基因的表達產(chǎn)物，如天然人MICA蛋白(登錄號L14848)，或與上述蛋白質(zhì)具有至少65% (優(yōu)選75、80、85、90、95、96、97、98或99% )氨基酸序列相同性且顯示天然MICA蛋白的功能活性的蛋白質(zhì)，或天然人MICB蛋白(登錄號NM_005931)，或與上述蛋白質(zhì)具有至少65% (優(yōu)選75、80、85、90、95、96、97、98或99% )氨基酸序列相同性且顯示天然MICB蛋白的功能活性的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)的"功能活性"是與蛋白質(zhì)的生理功能有關(guān)的任何活性。例如，天然 MICA/B蛋白的功能活性可包括結(jié)合NKG2D和誘導(dǎo)免疫激活，例如分泌細胞因子。本文所用術(shù)語“NKG2D蛋白”或“NKG2D多肽”指KLRKl基因的表達產(chǎn)物，如天然人NKG2D蛋白(登錄號574240)或與上述蛋白質(zhì)具有至少65% (優(yōu)選75、80、85、90、95、96、 97、98或99%)氨基酸序列相同性且顯示天然NKG2D蛋白的功能活性的蛋白質(zhì)。例如，天然 NKG2D蛋白的功能活性可包括結(jié)合其配體和將信號轉(zhuǎn)導(dǎo)到免疫細胞內(nèi)以調(diào)節(jié)其基因表達和激活。本文所用術(shù)語“基因”指編碼特定蛋白質(zhì)，或者在某些情況下編碼功能或結(jié)構(gòu)RNA 分子的的核酸分子。 本文所用術(shù)語“MICA/B基因”、"MICA基因”、"MICB基因”、"MICA/B多核苷酸”、 "MICA多核苷酸”、“MICB多核苷酸”、“MICA/B核酸”、“MICA核酸”、或“MICB核酸”指天然人 MICA或MICB編碼核酸序列，如天然人MICA基因(登錄號L14848)；如天然人MICB基因(登錄號匪005931)，具有可轉(zhuǎn)錄成MICA或MICB cDNA的序列的核酸；和/或上述物質(zhì)的等位基因變體和同源物。該術(shù)語包括雙鏈DNA、單鏈DNA和RNA。本文所用術(shù)語“KLRKl”、“Klrkl”、“KLRKl基因”、“Klrkl 基因”、“NKG2D 基因”、 "NKG2D多核苷酸”或“NKG2D核酸”指天然的人NKG2D編碼核酸序列，如天然人KLRKl基因 (登錄號574240)；具有可轉(zhuǎn)錄成KLRKlcDNA的序列的核酸；和/或上述物質(zhì)的等位基因變體和同源物。該術(shù)語包括雙鏈DNA、單鏈DNA和RNA。本文所用術(shù)語“核酸”或“核酸分子”指兩種或多種核苷酸鏈，如RNA(核糖核酸) 和DNA(脫氧核糖核酸)。本文所述的核酸分子可以是RNA形式或DNA形式(如cDNA、基因
11組DNA和合成DNA)。DNA可以是雙鏈或單鏈，如果是單鏈，可以是編碼(有義)鏈或非編碼 (反義)鏈。本文所用術(shù)語“患者”、“對象”和“個體”在本文中可互換使用，指治療和/或從中獲得生物樣品的哺乳動物(如人)對象。本文所用術(shù)語“結(jié)合”、“結(jié)合于”或“相互作用”指一種分子識別和粘附于樣品或生物體中特定的第二種分子，但不顯著識別或粘附于樣品中的其他結(jié)構(gòu)不相關(guān)的分子。涉及探針或抗體時，本文所用術(shù)語“標記”旨在包括通過將可檢測物質(zhì)偶聯(lián)(即物理連接)于該探針或抗體，對探針或抗體進行直接標記。涉及核酸分子或多肽時，本文所用術(shù)語“天然”指天然產(chǎn)生的(如WT)核酸或多肽。本文所用術(shù)語“診斷的”、“診斷”、“診斷為”指鑒定病理學(xué)狀況的存在或特性。本文所用術(shù)語“樣品”在本文中以最廣義使用。包含多核苷酸、肽、抗體等的樣品可包括體液、細胞制品的可溶性組分或培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)基、基因組DNA、RNA或cDNA、細胞、 組織、皮膚、毛發(fā)等。樣品的例子包括唾液、血清、活檢樣品、血液、尿液和血漿。本文所用術(shù)語“序列相同性”指比對兩條序列以最大程度提高亞基匹配，即考慮缺口和插入時，兩條序列中相應(yīng)位置上相同亞基的百分數(shù)。兩條序列中的亞基位置被同一核苷酸或氨基酸占據(jù)時存在序列相同性，例如，若兩個DNA分子的某個給定位置都被腺嘌呤占據(jù)，則這兩個分子在該位置上相同。例如，若在長度為10個氨基酸的序列中有7個位置與長度為10個氨基酸的第二序列的相應(yīng)位置相同，則這兩個序列具有70%序列相同性。通常采用序列分析軟件(例如，位于威斯康星州麥迪遜53705大學(xué)大道1710號的威斯康星大學(xué)生物技術(shù)中心的遺傳計算機組(Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705) J^WMfiWii^ 包)，測定序列相同性。涉及核酸分子中的突變時，“沉默”改變是取代該核苷酸序列中的一個或多個堿基對，但不改變該序列編碼多肽的氨基酸序列?！氨Ｊ匦浴备淖兪呛怂岬牡鞍踪|(zhì)編碼區(qū)中的至少一個密碼子發(fā)生改變，使得該核酸序列編碼多肽的至少一個氨基酸被具有相似特性的另
一氨基酸取代。本文所用術(shù)語〃寡核苷酸〃、“siRNA"、“ SiRNA寡核苷酸〃和〃 siRNA"在本說明書中可互換使用，包括天然和/或修飾單體或連接的線型或環(huán)狀寡聚體，包括脫氧核糖核苷、核糖核苷、其取代和α-異頭形式、肽核酸(PNA)、鎖定核酸(LNA)、硫代磷酸酯、 甲基膦酸酯等。寡核苷酸能夠通過單體-單體相互作用的規(guī)律模式，如沃森克里克型堿基配對、哈斯汀(HoSgsteen)或反向哈斯汀型堿基配對等特異性結(jié)合靶多核苷酸。本文所用術(shù)語"抗體"以最廣義使用，具體包括全長單克隆抗體、多克隆抗體，和 (除非另有說明或與上下文抵觸)其抗原結(jié)合片段、抗體變體和多特異性分子，只要它們具有所需的生物學(xué)活性。通常，全長抗體是含有二硫鍵交聯(lián)的至少兩條重鏈(H)和兩條輕鏈(L)的糖蛋白。每一重鏈由重鏈可變區(qū)(本文簡寫為Vh)和重鏈恒定區(qū)組成。重鏈恒定區(qū)由三種結(jié)構(gòu)域CH1、C02和Ch3組成。每一輕鏈由輕鏈可變區(qū)(本文簡寫為和輕鏈恒定區(qū)組成。輕鏈恒定區(qū)由一個結(jié)構(gòu)域Q構(gòu)成。V1^nt區(qū)域還可進一步細分為超變區(qū)，稱為互補決定區(qū)(⑶R)，其間間插更保守的構(gòu)架區(qū)(FR)。每一 Vh和八由三個⑶R和四個FR組成，從氨基端到羧基端按照以下順序排列FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈和輕鏈的可變區(qū)包含與抗原相互作用的結(jié)合域。抗體分子結(jié)構(gòu)和與產(chǎn)生抗體有關(guān)的各種技術(shù)的基本原理可參見，例如，Harlow和Lane，ANTIBODIES :A LABORATORY MANUAL (抗體實驗室手冊)，紐約冷泉港的冷泉港實驗室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.) (1988)。例如，本文所述的抗-NKG2D抗體能夠結(jié)合干擾NKG2D激活和/或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的NKG2D部分。本文所述抗-NKG2D抗體還能夠結(jié)合干擾NKG2D配體結(jié)合相互作用的NKG2D部分。本文所用術(shù)語抗體的"抗原結(jié)合片段"是包含能夠可檢測地結(jié)合抗原的部分全長抗體的分子，通常至少包含Vh區(qū)域的一個或多個部分?？乖Y(jié)合片段包括含有一個、兩個、三個或更多抗體的抗原結(jié)合部分的多價分子，和所述\和Vh區(qū)域或其所選部分通過合成接頭或重組方法連接形成功能性抗原結(jié)合分子的單鏈構(gòu)建物。雖然抗體的一些抗原結(jié)合片段可通過對較大抗體分子進行實際片段化(如酶切)獲得，但通常大部分通過重組技術(shù)產(chǎn)生。本文所用術(shù)語“人抗體”旨在包括具有構(gòu)架區(qū)和CDR區(qū)均衍生自(即相同或基本相同)人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)的抗體。而且，如果抗體含有恒定區(qū)，則該恒定區(qū)也 “衍生自”人種系免疫球蛋白序列。本發(fā)明的人抗體可包含并非由人種系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基(例如，隨機或定點體外誘變引入的突變或體內(nèi)體細胞突變)。然而，本文所用術(shù)語"人抗體"不應(yīng)包括衍生自另一哺乳動物如小鼠種系的CDR序列被嫁接到人框架序列上的抗體。本文所用術(shù)語"人源化"抗體是含有衍生自非人免疫球蛋白的最小序列的人/ 非人嵌合抗體。多數(shù)情況下，人源化抗體是人免疫球蛋白(接受抗體)，其中接受者的高變區(qū)的殘基被非人物種，如小鼠、大鼠、兔或非人靈長類的高變區(qū)(供體抗體)的殘基取代， 具有所需特異性、親和力和性能。在一些情況下，人免疫球蛋白的FR殘基被相應(yīng)的非人殘基所替換。而且，人源化抗體可包含在受體抗體或供體抗體中沒有的殘基。進行這些修飾以進一步改善抗體性能。通常，人源化抗體將基本上包含至少一個、通常兩個可變區(qū)的全部，其中全部或基本上全部的高變環(huán)對應(yīng)于非人免疫球蛋白的高變環(huán)，全部或基本上全部的FR殘基是人免疫球蛋白序列的FR殘基。人源化抗體也可任選包含至少一部分免疫球蛋白恒定區(qū)(Fe)，一般是人免疫球蛋白的Fe。更多詳情可參見例如，Jones等，Nature 321 522-525(1986) ；Riechmann 等，Nature 332:323—329(1988)；禾口 Presta，Curr. Op. Struct. Biol. 2 :593-596(1992)，WO 92/02190，美國專利申請 20060073137 和美國專利 6750325、 6632927,6639055,6548640,6407213,6180370,6054297,5929212,5895205,5886152, 5877293,5869619,5821337,5821123,5770196,5777085,5766886,5714350,5693762, 5693761,5530101,5585089 和 5225539。本文所用術(shù)語"構(gòu)架區(qū)"或"FR"殘基是除本文定義的⑶R以外的VH或VL殘基。本文所用術(shù)語“表位”或“結(jié)合位點”是抗原結(jié)合肽(如抗體)特異性結(jié)合的抗原的某個區(qū)或區(qū)域。蛋白質(zhì)表位可包含直接參與結(jié)合的氨基酸殘基(也稱為該表位的免疫顯性組件)和不直接參與結(jié)合的其他氨基酸殘基，如被特異性抗原結(jié)合肽有效阻斷的氨基酸殘基(換言之，該氨基酸殘基位于特異性抗原結(jié)合肽的“溶劑排除表面”和/或“足跡”之內(nèi))。本文所用術(shù)語表位包括特異性結(jié)合抗_hNKG2D抗體或本發(fā)明另一 hNKG2D特異性物質(zhì)的hNKG2D的任何特定區(qū)域內(nèi)兩種類型的氨基酸結(jié)合位點，除非另有說明(例如，在某些地方，本發(fā)明涉及直接結(jié)合特定氨基酸殘基的抗體)。NKG2D可包含多個不同表位，它們可包括但不限于，(1)線性肽抗原決定簇，(2)由成熟NKG2D構(gòu)象中位置相鄰的一個或多個非毗連氨基酸構(gòu)成的構(gòu)象抗原決定簇；和(3)翻譯后抗原決定簇，其完全或部分由共價連接于NKG2D的分子結(jié)構(gòu)如糖基團構(gòu)成。除非上下文另有說明或發(fā)生矛盾，構(gòu)象抗原決定簇包括與抗原結(jié)合肽的原子的距離在約4A內(nèi)的NKG2D氨基酸殘基。本文所用術(shù)語與感興趣抗體(如MS或21F2)“結(jié)合基本相同的表位或決定簇”指抗體與感興趣抗體“競爭”感興趣抗體特異性結(jié)合的NKG2D分子。如本文所述，抗-NKG2D抗體“阻斷” NKG2D分子與天然NKG2D-配體(如MICA)結(jié)合的能力指在利用可溶性或細胞表面相關(guān)NKG2D和配體分子進行的試驗中，抗體可檢測地以劑量依賴方式降低NKG2D分子與配體的結(jié)合，其中在該抗體缺失時，NKG2D分子可檢測地結(jié)合該配體。本文所用術(shù)語“NKG2D配體結(jié)合相互作用”指NKG2D與其配體(如MICA/B、ULBP/ RAETUMultURae-I δ ,Rae-I ε和H60b)之間的特異性識別和結(jié)合相互作用?？烧{(diào)節(jié)NKG2D 配體結(jié)合相互作用的物質(zhì)示例包括可溶性NKG2D、特異性結(jié)合NKG2D的抗體或其抗原結(jié)合片段、NKG2D配體和NKG2D配體活性或表達的抑制劑。膽固醇和甘油三酯水平高被認為是增加心血管病和2型糖尿病風(fēng)險的脂質(zhì)代謝失調(diào)。本文所用術(shù)語“糖尿病”指胰腺激素胰島素相對或絕對缺陷引起的血糖水平升高導(dǎo)致的代謝疾病。糖尿病有兩種形式1型糖尿病和2型糖尿病。1型糖尿病的特征是靶向 β細胞的破壞性自身免疫過程和這些細胞的再生能力之間失衡所致的胰腺β細胞進行性損失。這種失衡最終導(dǎo)致完全喪失β細胞和內(nèi)源性胰島素分泌。2型糖尿病的特征是胰島素抗性和β細胞功能受損，包括第一期胰島素釋放受損、β細胞脈沖質(zhì)量降低和胰島素缺陷。在優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明涉及2型糖尿病的治療。本文所用術(shù)語“2型糖尿病”指機體抵抗胰島素作用或不產(chǎn)生足量胰島素來維持正常葡萄糖水平的慢性病癥。此外，它也指處于疾病早期的人群中出現(xiàn)的代謝功能障礙，如血脂異常。本文所用術(shù)語“心血管病”指影響心臟和血管相關(guān)功能的異常病癥。本文所用術(shù)語“安全和有效量”指足以產(chǎn)生所需的治療反應(yīng)而不產(chǎn)生過度的不良副作用(如毒性、刺激或變態(tài)反應(yīng))某組分的用量，如本文所述使用時該用量應(yīng)與合理的益處/風(fēng)險比相稱。本文所用術(shù)語"治療有效量"指能有效產(chǎn)生所需治療反應(yīng)的本文所述組合物的用量，例如，有效延遲動脈粥樣硬化斑塊出現(xiàn)的用量或在糖尿病患者中有效降低血糖水平和促進體重降低的用量。具體的安全和有效量或治療有效量取決于多種因素，例如所治療的具體病癥、患者身體狀況、治療的哺乳動物或動物類型、治療持續(xù)時間、同時進行的治療(如果有)的性質(zhì)和采用的具體制劑和化合物或其衍生物的結(jié)構(gòu)。本文所用術(shù)語“治療”定義為將治療劑施加或給予患者，或?qū)⒅委焺┦┘踊蚪o予由患者分離的組織或細胞系，該患者患有疾病、具有疾病癥狀或疾病傾向，其目的是治療、治愈、減輕、緩解、改變、補救、改善、提高或影響該疾病、疾病癥狀或疾病傾向。例如，尚未鑒定到疾病或失調(diào)的癥狀或臨床相關(guān)表現(xiàn)的患者的“治療”是預(yù)防性或防止性治療，而鑒定到疾病或失調(diào)的癥狀或臨床相關(guān)表現(xiàn)的患者的臨床、治愈性或緩解性“治療”通常不構(gòu)成預(yù)防性或防止性治療。例如，在對象中治療2型糖尿病包括降低血糖水平和降低對象的體重。抑制 2型糖尿病疾病進展包括防止或抑制脂質(zhì)代謝病癥、降低胰島素抗性、防止或抑制脂質(zhì)代謝失調(diào)、提高葡萄糖耐受等。治療2型糖尿病和抑制2型糖尿病疾病進展可包括緩解或防止糖尿病相關(guān)的癥狀、失調(diào)或疾病，如代謝綜合征、糖尿病性視網(wǎng)膜病、腎衰竭、血液循環(huán)不暢和與其相關(guān)的肢體疾病。各治療形式可被認為是本發(fā)明的不同方面。本文描述了包括常規(guī)分子生物學(xué)技術(shù)的方法。這些技術(shù)通常是本領(lǐng)域已知的， 詳見方法學(xué)著作，如Molecular Cloning =A Laboratory Manual (《分子克隆實驗室手冊》)，第3版，第1-3卷，Sambrook等編，紐約冷泉港的冷泉港實驗室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. ),2001 ；禾口 Current Protocols in Molecular Biology (《新編分子生物學(xué)實驗指南》)，Ausubel等編，格林出版和韋利科學(xué)公司(Greene Publishing and Wiley-Interscience)，紐約，1992 (定期更新)。也可調(diào)整基因轉(zhuǎn)移和基因治療的常規(guī)方法，以便用于本發(fā)明。參見例如，Gene Therapy Principles and Applications (《基因治療原理和應(yīng)用》)，Τ· Blackenstein編，施普林格公司(Springer Verlag), 1999 ；Gene Therapy Protocols (《基因治療方案》)(刊于 Methods in Molecular Medicine (分子醫(yī)學(xué)方法))，P. D. Robbins 編，休曼出版社(Humana Press)，1997 ；禾口 Retro-vectors for Human Gene Therapy (《人基因治療的逆轉(zhuǎn)錄載體》)，C. P. Hodgson編，施普林格公司，1996。免疫學(xué)技術(shù)通常是本領(lǐng)域已知的，詳見方法學(xué)著作，如Advances in Immunology (《免疫學(xué)進展》)，第93卷，F(xiàn)rederick W. Alt編，馬薩
(Academic Press, Burlington, ΜΑ), 2007 ；Making and Using Antibodies :A Practical Handbook (《制備和使用抗體實踐手冊》)，Gary C. Howard 和 Matthew R. Kaser編，佛羅里達州伯克萊屯的CRC出版社(CRC Press, Boca Raton, Fl), 2006 ；Medical Immunology (《醫(yī)學(xué)免疫學(xué)》)，第6版，Gabriel Virella編，英國倫敦的 IHP 出版社(Informa Healthcare Press, London, England), 2007 ；以及 Harlow 禾口 Lane, ANTIBODIES =A Laboratory Manual (《抗體實驗室手冊》)，紐約州冷泉港的冷泉港實驗室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY), 1988。雖然在本發(fā)明的實施或測試中可以采用類似于或等同于本文所述的那些方法、組合物和藥盒/試劑盒，但是下面描述了合適的方法、組合物和藥盒/試劑盒。本文引用的所有出版物、專利申請和專利均通過引用全文納入本文。在抵觸的情況下，以本說明書(包括定義在內(nèi))為準。下文討論的具體實施方式
僅為說明性，不構(gòu)成限制。發(fā)明詳述本發(fā)明基于以下發(fā)現(xiàn)某免疫刺激分子家族在糖尿病或脂質(zhì)代謝功能障礙的患者和動物中上調(diào)，該家族對于心血管病的發(fā)生至關(guān)重要。本文所述的數(shù)據(jù)提供第一手證據(jù)表明MICA/B蛋白在2型糖尿病人類患者的血清中升高，并且將抗-NKG2D抗體注射到糖尿病小鼠中阻斷NKG2D配體相互作用并顯著抑制動脈粥樣硬化斑塊形成。本文所述數(shù)據(jù)還顯示NKG2D/配體介導(dǎo)的免疫激活參與了 2型糖尿病的疾病進展。將抗-NKG2D抗體注射到2型糖尿病動物模型中能夠治療糖尿病并顯著降低血糖水平。阻斷NKG2D/配體相互作用也能減輕異常的代謝病癥，包括降低膽固醇和甘油三酯水平。因此，MICA/B和其他NKG2D配體是預(yù)測糖尿病患者發(fā)生2型糖尿病以及心血管病的新分子標記物，它們和NKG2D/配體相互作用是預(yù)防或治療2型糖尿病以及其他異常代謝病癥或疾病(如血脂異常、糖尿病性視網(wǎng)膜病、血液循環(huán)不暢、肢體失調(diào))和心血管病(如動脈粥樣硬化)的新靶點。因此，本發(fā)明提供檢測和治療2型糖尿病和其他異常代謝病癥如心血管疾病或失調(diào)的新的方法、組合物和藥盒/試劑盒。NKG2D是多種免疫細胞如NK、NKT、ab T和gd T細胞表達的免疫刺激分子。通過關(guān)聯(lián)配體刺激NKG2D引起表達NKG2D的免疫細胞的激活。存在多種分子可用作NKG2D配體， 它們包括小鼠中的Rae-1、H60和Multl的成員，以及人體中的MICA/B和ULBP/RAET1蛋白質(zhì)家族。大多數(shù)NKG2D配體在正常細胞中不表達或低水平表達，但在各種疾病狀況下上調(diào)， 進而激活表達NKG2D的免疫細胞。雖然這種免疫激活在宿主防御如微生物免疫和腫瘤監(jiān)控中起到重要作用，但它也可能產(chǎn)生免疫介導(dǎo)的疾病。在一個實施方式中，本發(fā)明提供檢測來自對象的生物樣品中的MICA/B蛋白，以檢測該對象的2型糖尿病、心血管病、炎性疾病或代謝功能障礙相關(guān)疾病的存在或預(yù)測發(fā)病的方法和藥盒/試劑盒。代謝功能障礙相關(guān)疾病包括高血糖、糖尿病性視網(wǎng)膜病、血液循環(huán)不暢、肢體失調(diào)和血脂異常(如高膽固醇和高甘油三酯)。本文實施例1中所示的數(shù)據(jù)表明，NKG2D配體在2型糖尿病患者中上調(diào)，其促進器官炎癥和相關(guān)并發(fā)癥。本文所述數(shù)據(jù)說明，在2型糖尿病人類患者的血清和動脈粥樣硬化斑塊中檢測到MICA/B蛋白水平升高。還發(fā)現(xiàn)在糖尿病或非糖尿病ApoE-/-小鼠(脂質(zhì)代謝功能障礙和動脈粥樣硬化的動物模型)的血管(特別是動脈粥樣硬化病變區(qū)域)和肝臟中H60和Rae-I (視黃酸早期誘導(dǎo)基因_1)蛋白上調(diào)，以及在這些動物的血清中Multl上調(diào) (參見實施例2)。因此，可利用NKG2D配體(如MICA/B蛋白或ULBP/RAET1蛋白)上調(diào)檢測2型糖尿病、心血管病、炎性疾病或代謝功能障礙相關(guān)疾病的存在或預(yù)測發(fā)病。檢測2型糖尿病、心血管病、炎性疾病或代謝功能障礙相關(guān)疾病發(fā)生傾向或者2型糖尿病、心血管病、炎性疾病或代謝功能障礙相關(guān)疾病的存在的典型方法包括從對象獲得生物樣品；使該生物樣品與檢測NKG2D配體表達(如MICA/B表達)的至少一種試劑相接觸； 測定該生物樣品中NKG2D配體的表達水平；和將NKG2D配體過度表達與該對象的2型糖尿病、心血管病、炎性疾病或代謝功能障礙相關(guān)疾病發(fā)病傾向相關(guān)聯(lián)。如實施例1所述數(shù)據(jù)所示，測定可溶性MICA/B的表達。然而，在一些實施方式中，可檢測MICA/B表達的膜形式。 代替MICA/B或除MICA/B外，可分析任何NKG2D配體的表達。例如，ULBP/RAET1蛋白質(zhì)家族是NKG2D配體并發(fā)現(xiàn)其流入和存在于血清中，正如MICA/B那樣，因此使得這些蛋白質(zhì)成為本文所述方法、組合物和藥盒/試劑盒的合適標記物。NKG2D配體描述于例如，Waldhauer， I.和 A. Steinle, Oncogene, 27 :5932-5943(2008)。在一些實施方式中，檢測NKG2D配體表達(如MICA/B表達)的試劑可包括任何合適試劑，如MICA/B抗體和可溶性NKG2D。生物樣品通常是血清。然而，可使用任何合適的生物樣品。其他生物樣品的例子包括生物活檢樣品、血漿、尿、皮膚、血液和唾液?？刹捎萌魏魏线m的方法或試驗來檢測對象生物樣品中NKG2D配體(如MICA/B)的表達水平。許多基于抗體的檢測形式是本領(lǐng)域眾所周知的，包括ELISA(酶聯(lián)免疫吸附實驗)、放射性免疫實驗、免疫印跡、蛋白質(zhì)印跡、流式細胞術(shù)、免疫熒光實驗、免疫沉淀、蛋白 A實驗、免疫電泳實驗和其他相關(guān)技術(shù)。在一些實施方式中，通過檢測第一抗體上的標記測得抗體的結(jié)合。在另一實施方式中，通過檢測第二抗體或試劑與第一抗體的結(jié)合測得第一抗體。在另一實施方式中，所述第二抗體帶有標記。本領(lǐng)域已知并在本發(fā)明的組合物、藥盒 /試劑盒和方法范圍內(nèi)有多種方法用于在免疫試驗中檢測結(jié)合。可以在包括至少一種這些方法來檢測NKG2D配體(如MICA/B)表達的診斷試劑盒中提供MICA/B或其他NKG2D配體的特異性抗體。該試劑盒可包含其他組件，包裝、說明書或輔助進行蛋白質(zhì)檢測和試劑盒使用的其他材料。在對象中檢測2型糖尿病、心血管病、炎性疾病或代謝功能障礙相關(guān)疾病的發(fā)病傾向或2型糖尿病、心血管病、炎性疾病或代謝功能障礙相關(guān)疾病的存在的方法包括將 MICA/B或其他NKG2D配體的過度表達與該對象2型糖尿病、心血管病、炎性疾病或代謝功能障礙相關(guān)疾病發(fā)生傾向或患有2型糖尿病、心血管病、炎性疾病或代謝功能障礙相關(guān)疾病相關(guān)聯(lián)?？赏ㄟ^將生物樣品中NKG2D配體(如MICA/B)的表達水平與NKG2D配體(如MICA/ B)表達的基線水平(也稱為對照水平)作比較，確定該生物樣品中是否過度表達一種或多種NKG2D配體(如MICA/B)?！盎€水平”是對照水平，在一些實施方式中，是正常水平或在患有2型糖尿病、炎性疾病或其他代謝功能障礙相關(guān)疾病和具有心血管病傾向的對象中未觀察到的水平。因此，可根據(jù)NKG2D配體(如MICA/B)表達的對照或基線水平確定待分析2型糖尿病、心血管病、炎性疾病或代謝功能障礙相關(guān)疾病發(fā)生情況的樣品中NKG2D配體表達與基線水平相比是可檢測地提高(即過度表達、上調(diào))、降低或是基本不變。在某些實施方式中，可由測試對象的早先樣品建立基線水平，以便隨時間監(jiān)控該對象的疾病狀態(tài)和/ 或隨時間評估給定治療方案的功效。在檢測對象中2型糖尿病、心血管病、炎性疾病或代謝功能障礙相關(guān)疾病發(fā)病傾向或者2型糖尿病、心血管病、炎性疾病或代謝功能障礙相關(guān)炎性疾病的存在的方法的一些實施方式中，還分析除NKG2D配體(如MICA/B)外的一種或多種標記物的表達。所述一種或多種標記物也可以是NKG2D配體；可分析任何NKG2D配體的表達。可檢測的其他標記物的例子包括C反應(yīng)性蛋白、IL-6、TNF-α、sICAM-1、sCD40、ULBP/RAET1蛋白質(zhì)家族(如 ULBP1、ULBP2、ULBP3、ULBP4、RAET1G、RAET1L)等等。在分析除 NKG2D 配體(如 MICA/B)外的一種或多種標記物表達的實施方式中，NKG2D配體(如MICA/B)和其他生物標記物的組合可用于更可靠地預(yù)測血管疾病和/或代謝功能障礙相關(guān)疾病的發(fā)生。在這類實施方式中， 將生物樣品分別與檢測NKG2D配體表達的至少一種試劑和檢測除NKG2D配體(如MICA/B) 外的一種或多種標記物表達的兩種或多種試劑相接觸。測定NKG2D配體(如MICA/B)和所述兩種或多種其他標記物在生物樣品中的表達水平；并將NKG2D配體(如MICA/B)的過度表達與所述對象的2型糖尿病、心血管病、炎性疾病和/或代謝功能障礙相關(guān)疾病(如血脂異常、糖尿病性視網(wǎng)膜病、血液循環(huán)不暢、肢體失調(diào)等)發(fā)生傾向相關(guān)聯(lián)。根據(jù)特定的兩種或多種其他標記物，可將它們的表達不足或過度表達與所述對象的2型糖尿病、心血管病、 炎性疾病和/或代謝功能障礙相關(guān)疾病發(fā)生傾向相關(guān)聯(lián)。
在另一實施方式中，本發(fā)明提供調(diào)節(jié)NKG2D配體(如MICA/B或ULBP/RAET1蛋白) 表達(如抑制MICA/B或ULBP/RAET1表達)和活性(如與NKG2D結(jié)合)，以治療患有2型糖尿病、心血管病、炎性疾病或代謝功能障礙相關(guān)疾病的對象的組合物或方法。本文所述組合物也可用于治療傾向于發(fā)生和/或已發(fā)生心血管病(如動脈粥樣硬化)和/或患有代謝功能障礙相關(guān)疾病如高膽固醇或高甘油三酯、糖尿病、血脂障礙、糖尿病性視網(wǎng)膜病、血液循環(huán)不暢、肢體失調(diào)等的對象。這類組合物通常包含治療有效量的調(diào)節(jié)一種或多種NKG2D 配體(如MICA/B或ULBP/RAET1)表達或活性/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的藥劑和藥學(xué)上可接受的運載體。 NKG2D配體(如MICA/B或ULBP/RAET1)的抑制劑有效降低細胞中NKG2D配體水平和/或降低細胞中NKG2D配體活性。有效降低細胞中NKG2D配體水平的NKG2D配體(如MICA/B或 ULBP/RAET1)抑制劑可以是NKG2D配體編碼基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯抑制劑。此外，有效降低細胞中NKG2D配體水平的NKG2D配體抑制劑可刺激NKG2D配體和/或NKG2D配體編碼RNA的降解。轉(zhuǎn)錄和/或翻譯抑制劑可以是基于核酸的抑制劑，如與靶NKG2D配體mRNA互補的反義寡核苷酸，以及具有切割靶mRNA的催化活性的核酶和DNA酶。在一些實施方式中，本文所述組合物包含NKG2D配體編碼基因的特異性siRNA。序列特異性siRNA結(jié)合靶核酸分子，抑制其表達。提供了遞送siRNA的組合物和治療方法。 構(gòu)建和使用核酶、siRNA和反義分子的方法是本領(lǐng)域眾所周知的(例如，Isaka Y.，Curr Opin Mol Ther,9 :132-136(2007) ；Sioud M.禾口 Iversen P.O.，Curr Drug Targets,6 647-653(2005) ；Mouldy Sioud 的 Ribozymes and siRNA Protocols (核酶和 siRNA 方法) (Methods in Molecular Biology (分子生物學(xué)方法))，第2版，2004，紐約州紐約市的休曼出版社)?！胺戳x”核酸可包含與編碼蛋白質(zhì)的“有義”核酸互補的核苷酸序列，例如，與雙鏈 eDNA分子的編碼鏈互補或與mRNA序列互補。反義核酸可以與整個MICA/B編碼鏈互補，或者僅與其一部分互補。在另一實施方式中，反義核酸分子與編碼NKG2D配體的核苷酸序列編碼鏈的“非編碼區(qū)”(如5'和3'非翻譯區(qū))反義。反義物質(zhì)可包括例如，約8-80個核堿基(即約8-80個核苷酸)，例如，約8-50個核堿基，或約12-30個核堿基。反義化合物包括核酶、外部導(dǎo)向序列(EGQ寡核苷酸(寡酶(oligozymes))和與靶核酸雜交并調(diào)節(jié)其表達的其他短催化RNA或催化寡核苷酸。反義化合物可包括與靶基因序列互補的至少8個連續(xù)核堿基的臂。寡核苷酸不需要與其特異性雜交的靶核酸序列100%互補。在需要特異性結(jié)合的條件下，即，在體內(nèi)測定或治療性處理情況下處于生理條件，或者體外測定情況下處于進行該測定的條件，當(dāng)寡核苷酸與靶點結(jié)合干擾該靶分子的正常功能導(dǎo)致可用性喪失， 和有足夠的互補程度以避免寡核苷酸與非靶序列的非特異性結(jié)合時，該寡核苷酸為可特異性雜交。在一些實施方式中，調(diào)節(jié)NKG2D配體表達(如抑制MICA/B或ULBP/RAET1表達)和活性(如與NKG2D結(jié)合)以治療患有代謝功能障礙相關(guān)性炎性疾病如2型糖尿病，傾向于發(fā)生和/或已發(fā)生心血管病(如動脈粥樣硬化)和/或患有異常代謝病癥如高膽固醇或甘油三酯水平、血脂異常、糖尿病性視網(wǎng)膜病等的對象的組合物包含治療有效量的阻斷NKG2D 與其一種或多種配體相互作用(如NKG2D/MICA/B相互作用)的藥劑、藥學(xué)上可接受的運載體和治療NKG2D/配體相互作用途徑以外途徑引起的心血管病、高血壓或代謝失調(diào)的已知藥物。治療心血管病的已知藥物的例子是3-羥基-3-甲基戊二?；o酶A還原酶抑制劑 (他汀類)中任何一種。他汀類的例子包括西立伐他汀、氟伐他汀、阿托伐他汀、斯伐他汀、普伐他汀或洛伐他汀，或其藥學(xué)上可接受的鹽。包括他汀類的組合物和方法是本領(lǐng)域眾所周知的(參見例如，美國專利號6，465，454)。在另一實施方式中，本發(fā)明提供一種治療2型糖尿病、心血管病、炎性疾病和/或異常代謝病癥(如高膽固醇水平、高甘油三酯水平、血脂異常、血液循環(huán)不暢、肢體失調(diào)、 糖尿病性視網(wǎng)膜病等)的組合物，其包含阻斷NKG2D與其一種或多種配體相互作用(如 NKG2D/MICA/B相互作用)的藥劑和藥學(xué)上可接受的運載體。在另一實施方式中，所述組合物包含抑制NKG2D激活或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的藥劑和藥學(xué)上可接受的運載體。本文實施例3所示數(shù)據(jù)表明，用抗-NKG2D抗體阻斷NKG2D配體結(jié)合相互作用能夠抑制糖尿病ApoE-/-小鼠的斑塊形成，而不改變NKG2D表達細胞的數(shù)量?？刹捎萌魏芜m合阻斷NKG2D與其一種或多種配體相互作用(如NKG2D/MICA/B 相互作用)或者抑制NKG2D激活或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的藥劑。例如，所述藥劑可選自下組可溶性 NKG2D、特異性結(jié)合NKG2D的抗體或其抗原結(jié)合片段、NKG2D配體和NKG2D配體活性或表達的抑制劑。抑制NKG2D激活或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)或者阻斷NKG2D與其一種或多種配體相互作用的典型藥劑是特異性結(jié)合NKG2D的抗體。在一些實施方式中，所述抗體或其抗原結(jié)合片段結(jié)合人 NKG2D(hNKG2D)?？刹捎萌魏魏线m的特異性結(jié)合NKG2D的抗體。本文所述的抗-NKG2D抗體包括多克隆和單克隆人抗體，或具有免疫球蛋白可變區(qū)的至少一個抗原結(jié)合區(qū)的抗原結(jié)合片段部分，所述抗體特異性結(jié)合NKG2D。如果用該多肽的表位產(chǎn)生抗體且至少與天然或重組蛋白的一部分結(jié)合，則該抗體對NKG2D有特異性。抑制NKG2D激活或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的另一藥劑例子是特異性結(jié)合NKG2D配體(如MICA/B、ULBP)的抗體?？刹捎萌魏魏线m的特異性結(jié)合NKG2D 配體的抗體。通過競爭性抑制確定單克隆抗體特異性和親和力的方法可參見Harlow等， Antibodies =A Laboratory Manual (《抗體實驗室手冊》)，紐約冷泉港的冷泉港實驗室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.), 1988, Colligan等編，Current Protocols in Immunology (《新編免疫學(xué)實驗指南》)，紐約的格林出版聯(lián)合公司禾口韋利禾斗學(xué)公司(Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience, N. Y.)，(1992，1993)和 Muller，Meth. Enzymo 1. 92 :589-601 (1983)，所述參考文獻通過引用全文納入本文。在一些實施方式中，特異性結(jié)合NKG2D的抗體是具有下述序列的人單克隆抗體 16F16、16F31、MS和21F2。在一些實施方式中，所述抗體是人單克隆抗體MS。這些抗體的全長、可變和CDR序列見表1。表1. 16F16、16F31、MS和21F2的全長、可變和CDR氨基酸序列
權(quán)利要求
1.治療有效量的抑制對象中NKG2D激活或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的藥劑在治療2型糖尿病中的用途。
2.治療有效量的阻斷對象中NKG2D配體結(jié)合相互作用的藥劑在治療2型糖尿病中的用途。
3.治療有效量的抑制對象中NKG2D激活或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的藥劑在治療可通過抑制NKG2D來調(diào)節(jié)或正常化的病癥中的用途，其中所述病癥選自2型糖尿病、心血管病、炎性疾病和代謝功能障礙相關(guān)疾病。
4.治療有效量的阻斷對象中NKG2D配體結(jié)合相互作用的藥劑在治療可通過抑制NKG2D 來調(diào)節(jié)或正?；牟“Y中的用途，其中所述病癥選自2型糖尿病、心血管病、炎性疾病和代謝功能障礙相關(guān)疾病。
5.如權(quán)利要求1-4中任一項所述的用途，其特征在于，所述對象是人。
6.如權(quán)利要求1-5中任一項所述的用途，其特征在于，所述藥劑選自可溶性NKG2D、特異性結(jié)合NKG2D的抗體或其抗原結(jié)合片段、NKG2D配體和NKG2D配體活性或表達的抑制劑。
7.如權(quán)利要求6所述的用途，其特征在于，所述藥劑是特異性結(jié)合NKG2D的抗體或其抗原結(jié)合片段。
8.如權(quán)利要求7所述的用途，其特征在于，所述抗體或其抗原結(jié)合片段是人或人源化的。
9.如權(quán)利要求7所述的用途，其特征在于，所述抗體或其抗原結(jié)合片段結(jié)合人 NKG2D(hNKG2D)。
10.如權(quán)利要求7所述的用途，其特征在于，所述抗體或其抗原結(jié)合片段降低NKG2D介導(dǎo)的NKG2D表達細胞的激活或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。
11.如權(quán)利要求7所述的用途，其特征在于，所述抗體或其抗原結(jié)合片段與至少一種 NKG2D配體競爭結(jié)合NKG2D。
12.如權(quán)利要求11所述的用途，其特征在于，所述NKG2D配體是MICA/B。
13.如權(quán)利要求1-12中任一項所述的用途，其特征在于，所述藥劑給予導(dǎo)致所述對象出現(xiàn)下述反應(yīng)中至少一種血糖水平降低、葡萄糖耐受提高、胰島素抗性降低、體重降低、血壓降低、炎癥減輕或代謝功能障礙減輕。
14.如權(quán)利要求1-13中任一項所述的用途，其特征在于，所述藥劑經(jīng)靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)或皮下途徑給予。
15.如權(quán)利要求1-13中任一項所述的用途，其特征在于，所述用途還包括至少一種選自下組的額外藥劑抗糖尿病藥、抗肥胖藥、食欲調(diào)節(jié)藥、抗高血壓藥、治療和/或預(yù)防糖尿病導(dǎo)致或與糖尿病相關(guān)的并發(fā)癥的藥劑、和治療和/或預(yù)防肥胖導(dǎo)致或與肥胖相關(guān)的并發(fā)癥和失調(diào)的藥劑。
全文摘要
本發(fā)明提供治療和檢測2型糖尿病和/或可通過抑制NKG2D來調(diào)節(jié)或正?；牟“Y如心血管病的方法、組合物和藥盒/試劑盒。
文檔編號A61K39/395GK102548573SQ201080034480
公開日2012年7月4日 申請日期2010年8月16日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月17日
發(fā)明者D·H·羅萊, J·S·彼得森, T·B·博德瓦爾斯多坦, 夏明燦, 熊那 申請人:加利福尼亞大學(xué)董事會, 賓州研究基金會