專利名稱：脂質(zhì)化腫瘤相關(guān)抗原及其免疫治療的組成物及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明關(guān)于多肽及脂質(zhì)化融合蛋白質(zhì)。本發(fā)明還揭示與這些多肽及融合蛋白質(zhì)相關(guān)于免疫治療的組成物及方法。
背景技術(shù)：
相關(guān)申請(qǐng)案本發(fā)明對(duì)于2009年6月22日提出申請(qǐng)的美國臨時(shí)申請(qǐng)案No. 61/219，301主張優(yōu)先權(quán)；該先申請(qǐng)案的內(nèi)容皆以引用方式納入本文做為參考。
背景技術(shù)：
病毒感染會(huì)引起各種病癥，包括癌癥。舉例而言，人類乳頭狀瘤病毒(HPVs)感染會(huì)造成數(shù)種癌癥發(fā)展，尤其是成為世界婦女第二大癌癥死因的子宮頸癌，且其已經(jīng)決定性證實(shí)HPV 為子宮頸癌的病原體(Schwarz，T. F. ,Expert RevVaccines 7 :1465_73，2008)。據(jù)估計(jì)，每年有大約493，000件新的子宮頸癌個(gè)案被診斷出來(Parkin，D.M.等人，CA Cancer J Clin 55 :74-108, 2005)。已研發(fā)用于預(yù)防引起癌癥的病毒感染、治療已存在癌癥、或防止于高危險(xiǎn)群個(gè)體內(nèi)發(fā)展成癌癥的疫苗。然而，其中有許多并不具有功效。故仍需要有效的疫苗與相關(guān)的試劑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明關(guān)于新穎多肽、脂質(zhì)化融合蛋白質(zhì)、免疫治療的組成物及方法。據(jù)此，本發(fā)明的一方面關(guān)于一種具有SEQ ID NO 2所述序列的單離的多肽(其序列列示于圖2B)。本發(fā)明還關(guān)于一種具有編碼該多肽的序列，或其互補(bǔ)序列的單離的核酸。 該核酸的實(shí)例包括SEQ ID N0:13所述的序列(如下所示)，及其中一或多個(gè)密碼子被其他編碼相同殘基的密碼子取代的簡并性變體(degenerate variants) 0ATGCATGGCGATACCCCGACCCTGCATGAATATATGCTGGATCTGCAGCCGGAAACCACCGATCTGTATGGCTATCAGCAGCTGAACGATAGCAGCGAAGAAGAAGATGAAATTGATGGCCCGGCGGGCCAGGCGGAACCGGATCGCGCGCA
TTAIAACATTGTGACCTTTGCGAGCAAAGCGGATAGCACCCTGCGCCTGAGCGTGCAGAGCACCCATGTGGATATTCGCACCCTGGAAGATCTGCTGATGGGCACCCTGGGCATTGTGGCGCCGATTGCGAGCCAGAAACCG (SEQ IDNO. :13)。本發(fā)明還關(guān)于一種單離的融合蛋白，其包含具有脂質(zhì)化序列的第一片段，及具有腫瘤相關(guān)抗原序列的第二片段。于該融合蛋白中，第一片段位于第二片段的N-端。于一項(xiàng)實(shí)例，該融合蛋白為脂質(zhì)化。脂質(zhì)化序列包括Met Lys Lys LeuLeu lie Ala Ala Met Met Ala Ala Ala Leu Ala Ala Cys Ser Gln Glu Ala Lys Gln GluVal Lys Glu Ala Val Gln Ala Val Glu Ser Asp Val Lys Asp Thr Ala (SEQ ID NO :12)。腫瘤相關(guān)抗原可為衍生自一種與人類慢性疾病或癌癥(例如子宮頸癌)關(guān)連的病毒的病毒抗原。于一項(xiàng)實(shí)例，該病毒抗原衍生自人類皰疹病毒第四型(EBV)、人類乳頭狀瘤病毒(HPV)、C型肝炎病毒(HCV)、B型肝炎病毒(HBV)或巨細(xì)胞病毒(CMV)。于一項(xiàng)具體態(tài)樣，該病毒抗原為去活化HPV致癌蛋白E5、E6或E7。于一項(xiàng)較佳具體態(tài)樣，該病毒抗原為去活化HPV 16 E7致癌蛋白，例如 SEQ IDNO :1或2。融合蛋白的實(shí)例包括，于下述實(shí)施例中所描述的rlip0_E7m融合蛋白。 以下列示rlipo-E7m融合蛋白的胺基酸序列，及編碼此融合蛋白的核酸序列(SEQ ID NOs 14 及 15)MET LYS LYS LEU LEU ILE ALA ALA MET MET ALA ALA ALA LEU ALAALA CYS SER GLN GLU ALA LYS GLN GLU VAL LYS GLU ALA VAL GLNALA VAL GLU SER ASP VAL LYS ASP THR ALA GLY SER MET HIS GLY ASPTHR PRO THR LEU HIS GLU TYR MET LEU ASP LEU GLN PRO GLU THRTHR ASP LEU TYR GLY TYR GLN GLN LEU ASN ASP SER SER GLU GLUGLU ASP GLU ILE ASP GLY PRO ALA GLY GLN ALA GLU PRO ASP ARG ALAHIS TYR ASN ILE VAL THR PHE ALA SER LYS ALA ASP SER THR LEU ARGLEU SER VAL GLN SER THR HIS VAL ASP ILE ARG THR LEU GLU ASP LEULEU MET GLY THR LEU GLY ILE VAL ALA PRO ILE ALA SER GLN LYS PRO(SEQ ID NO 14)。ATGAAAAAACTGCTGATTGCGGCGATGATGGCGGCGGCGCTGGCGGCGTGCAGCCAGGAAGCGAAACAGGAAGTGAAAGAAGCGGTGCAGGCGGTGGAAAGCGATGTGAAAGATACCGCGGGATCCATGCATGGCGATACCCCGACCCTGCATGAATATATGCTGGATCTGCAGCCGGAAACCACCGATCTGTATGGCTATCAGCAGCTGAACGATAGCAGCGAAGAAGAAGATGAAATTGATGGCCCGGCGGGCCAGGCGGAACCGGATCGTGCGCATTATAACATTGTGACCTTTGCGAGCAAAGCGGATAGCACCCTGCGTCTGAGCGTGCAGAGCACCCATGTGGATA
TTCGTACCCTGGAAGATCTGCTGATGGGCACCCTGGGCATTGTGGCGCCGATTGCGAGCCAGAAACCG(SEQ ID NO :15)。本發(fā)明還關(guān)于一種單離的核酸，其含有編碼上述融合蛋白的核酸序列，或該核酸的互補(bǔ)序列。該核酸的實(shí)例包括SEQ ID NO :15，及其中一或多個(gè)密碼子被其他編碼相同殘基的密碼子取代的簡并性變體。核酸是指一種DNA分子(例如cDNA或基因組DNA)、RNA分子(例如mRNA)、或是 DNA或RNA類似物。DNA或RNA類似物可自核苷酸類似物合成得。核酸分子可為單股或雙股，但較佳為雙股DNA?！皢坞x的核酸”是一種其構(gòu)造不與任何天然核酸的，或天然基因組核酸的任何片段的構(gòu)造相同的核酸。因此該術(shù)語含括(例如)(a)具有天然基因組DNA分子的部分序列的DNA，但其編碼序列兩端所銜接的片段并非該分子部分序列存在生物體基因組中的天然狀態(tài)下的兩端所銜接的片段；(b)以一種使所成的分子不與任何天然載體或基因組DNA相同的方式并入一載體中，或并入一原核或真核生物的基因組DNA中的核酸；(c) 一種分離的分子例如cDNA、基因組片段、經(jīng)由聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)制得的片段或限制酶切割片段；及(d)其為雜合基因(也即編碼融合蛋白的基因)的一部份的重組核苷酸序列。上述核酸可用于表現(xiàn)本發(fā)明的多肽或蛋白質(zhì)。為此目的，習(xí)于該項(xiàng)技藝的人可將該核酸操作性連接至適宜調(diào)節(jié)序列，以產(chǎn)生表現(xiàn)載體。載體是指一種能夠傳送另一已與其連接的核酸的核酸分子。載體能自我復(fù)制或整合到宿主DNA中。載體的實(shí)例包括質(zhì)體、黏質(zhì)體或病毒載體。本發(fā)明的載體包括，以適于在宿主細(xì)胞中表現(xiàn)該核酸的形式存在的核酸。較佳地該載體包括一或多種調(diào)節(jié)序列，其經(jīng)操作性連接至欲被表現(xiàn)的核酸。調(diào)節(jié)序列包括啟動(dòng)子、增效子及其他表現(xiàn)調(diào)控組件(例如，T7 啟動(dòng)子、花椰菜鑲嵌病毒35S啟動(dòng)子序列或聚腺化訊號(hào)序列)。調(diào)節(jié)序列包括這些直接固有性表現(xiàn)一核酸序列的序列，以及組織特異性調(diào)節(jié)與/或可誘導(dǎo)序列。表現(xiàn)載體的設(shè)計(jì)可取決于，諸如所選擇欲轉(zhuǎn)形的宿主細(xì)胞、所希望的蛋白質(zhì)表現(xiàn)程度等因素。表現(xiàn)載體可引導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，用以制造本發(fā)明的多肽或融合蛋白。本發(fā)明的范圍還包含一種含有前述核酸的宿主細(xì)胞。實(shí)例包括大腸桿菌細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞(例如使用桿狀病毒表現(xiàn)載體)、植物細(xì)胞、酵母細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞。參見(例如) Goeddel, (1990)基因表現(xiàn)技術(shù)酵素學(xué)方法185，學(xué)院出版，圣地亞哥，CA。為制造本發(fā)明的融合蛋白/多肽，習(xí)于該項(xiàng)技藝的人可將宿主細(xì)胞培養(yǎng)于允許由本發(fā)明核酸編碼的融合蛋白/多肽表現(xiàn)的條件下，及將該融合蛋白/多肽自所培養(yǎng)細(xì)胞或培養(yǎng)基純化出來?；蛘?，本發(fā)明的核酸可于活體外，例如使用T7啟動(dòng)子調(diào)節(jié)序列與T7聚合酶，于得自(例如)大腸桿菌的細(xì)胞溶解產(chǎn)物中進(jìn)行轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)譯作用。脂質(zhì)化融合蛋白可包括(從N-端至C-端)Ag473的Dl片段與標(biāo)靶蛋白，例如抗原性病毒蛋白。于另一方面，本發(fā)明關(guān)于一種包含前述多肽或融合蛋白的免疫原組成物。免疫原組成物可與或不與醫(yī)藥上可接受的佐劑調(diào)配。于又一方面，本發(fā)明關(guān)于一種誘發(fā)對(duì)于病毒(例如HPV)的免疫反應(yīng)的方法。該方法包括將有效量的上述免疫原組成物投藥予有其需要的個(gè)體的步驟?！皞€(gè)體”是指人類及非人類動(dòng)物。非人類動(dòng)物包括所有脊椎動(dòng)物，例如哺乳動(dòng)物如非人類靈長類(尤其是高等靈長類)、狗、嚙齒類(例如小鼠或大鼠)、天竺鼠、貓及非哺乳動(dòng)物，例如鳥類、兩棲類等。于一項(xiàng)較佳具體態(tài)樣，該個(gè)體為人類。于另一項(xiàng)具體態(tài)樣，該個(gè)體為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物或適宜做為疾病模式的動(dòng)物。下述所提供的圖式與詳細(xì)說明例舉本發(fā)明之一或多項(xiàng)具體態(tài)樣的詳細(xì)內(nèi)容。本發(fā)明的其他特色、目的及優(yōu)點(diǎn)方面將由下列說明與圖示，以及由申請(qǐng)專利范圍彰顯出。


圖IA與IB為野生型HPV16 E7蛋白(1A ;SEQ ID NO :1)及去活化E7蛋白E7m(lB ； SEQ ID NO 2)的胺基酸序列。圖2A 與 2B 為顯示重組 E7m (rE7m ；2A)與重組脂蛋白 1 ipo_E7m (r 1 ipo_E7m ；2B)，經(jīng)由IMAC純化及以15% SDS-PAGE于還原條件下進(jìn)行偵測(cè)并以考馬斯藍(lán)(Coomassie Blue) 染色(左圖)，或使用抗-(His) 6抗體進(jìn)行免疫轉(zhuǎn)漬偵測(cè)(右圖)而得到的圖片。(A)列1 經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后的細(xì)胞溶解產(chǎn)物；列2 于IPTG誘導(dǎo)前的細(xì)胞溶解產(chǎn)物；列3 經(jīng)誘導(dǎo)細(xì)胞的可溶部份；列4 經(jīng)純化的rE7m ；列5_8 免疫轉(zhuǎn)漬；⑶列1 經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后的細(xì)胞溶解產(chǎn)物；列2 于IPTG誘導(dǎo)前的細(xì)胞溶解產(chǎn)物；列3 經(jīng)純化的rlipo-E7m ；列4_6 免疫轉(zhuǎn)漬。圖3A與;3B為鑒定完整rlip0_E7m蛋白及其N-端片段的圖表。圖4為顯示于C57BL/6小鼠中由rlip0_E7m誘發(fā)的腫瘤-特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)反應(yīng)。圖5A與5B為顯示rlipo_E7m于保護(hù)小鼠對(duì)抗腫瘤的功效，相較于rE7m。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明(至少一部份)為基于意外發(fā)現(xiàn)一種新穎的腫瘤相關(guān)抗原變體，及腫瘤相關(guān)抗原與脂質(zhì)化序列的融合蛋白。該融合蛋白(意外地)可被脂質(zhì)化，并以高產(chǎn)量表現(xiàn)于諸如大腸桿菌等細(xì)菌細(xì)胞中。其一旦經(jīng)投藥予個(gè)體后，二者皆會(huì)誘發(fā)對(duì)抗腫瘤的免疫反應(yīng) (例如，細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞或抗體)。本發(fā)明特征在于一種對(duì)抗病毒感染，及/或所相關(guān)的其他病癥(例如，癌癥)的免疫原組成物，例如疫苗。如前所述，免疫原組成物可含有重組型融合蛋白。該融合蛋白具有一段含脂質(zhì)化序列的第一片段，及一段有腫瘤相關(guān)抗原的序列的第二片段。腫瘤相關(guān)抗原可為一種衍生自與人類慢性疾病或癌癥(例如子宮頸癌)關(guān)連的病毒的病毒抗原。于一項(xiàng)實(shí)例，該病毒抗原衍生自人類皰疹病毒第四型(EBV)、人類乳頭狀瘤病毒(HPV)、C型肝炎病毒(HCV)、B型肝炎病毒(HBV)或巨細(xì)胞病毒(CMV)。以下列示例舉性病毒抗原的序列。有數(shù)種蛋白質(zhì)及其抗原性片段可用于制備本發(fā)明的免疫原組成物。人類皰疹病毒第四型(Epstein-Barr病毒)，潛伏性膜蛋白_1 (LMPl)LeuSerSerSerIIeGlyLeuAlaLeuLeuLeuLeuLeuLeuAlaLeuLeuPheTrpLeuTyrlleValMetSerAspTrpThrGlyGlyAlaLeuLeuValLeuTyrSerPheAlaLeuMetLeuIleIleIleIleLeuIleIlePheIlePheArgArgAspLeuLeuCysProLeuGlyGlyLeuGlyLeuLeuLeuLeuMetlleThrLeuLeuLeulleAlaLeuTrpAsnLeuHisGlyGlnAlaLeuTyrLeuGlylleValLeuPhellePheGlyCysLeuLeuValLeuGlyLeuTrpIIeTyrPheLeuGluIIeLeuTrpArgLeuGlyAlaThrLeuTrpGlnLeuLeuAlaPheIIeLeuAlaPhePheLeuAlaIIeIIeLeuLeuIIeIIeAlaLeuTyrLeuGlnGlnAsnTrpTrpThrLeuLeuvalAspLeuLeuTrpLeuLeuLeuPheMetAlaIleLeuIleTrpMetTyrTyrHisGlyProArgHisThrAspGluHisHisHisAspAspSerLeuProHisProGlnGlnAlaThrAspAspSerSerHisGluSerAspSerAsnSerAsnGluGlyArgHisHisLeuLeuValSerGlyAlaGlyAspGlyProProLeuCysSerGlnAsnLeuGlyAlaProGlyGlyGlyProAspAsnGlyProGlnAspProAspAsnThrAspAspAsnGlyProGlnAspProAspAsnThrAspAspAsnGlyProGlnAspProAspAsnThrAspAspAsnGlyProGlnAspProAspAsnThrAspAspAsnGlyProGlnAspProAspAsnThrAspAspAsnGlyProGlnAspProAspAsnThrAspAspAsnGlyProGlnAspProAspAsnThrAspAspAsnGlyProHisAspProLeuProHisAsnProSerAspSerAlaGlyAsnAspGlyGlyProProAsnLeuThrGluGluValAlaAsnLysGlyGlyAspArgGlyProProSerMetThrAspGlyGlyGlyGlyAspProHisLeuProThrLeuLeuLeuGlyThrSerGlySerGlyGlyAspAspAspAspProHisGlyProValGlnLeuSerTyrTyrAsp人類皰疹病毒第四型(Epstein-Barr病毒)，終端蛋白LMP-2A MetGlySerLeuGluMetValProMetGlyAlaGlyProProSerProGlyGlyAspProAspGlyAspAspGlyGlyAsnAsnSerGlnTyrProSerAlaSerGlySerSerGlyAsnThrProThrProProAsnAspGluGluArgGluSerAsnGluGluProProProProTyrGluAspProTyrTrpGlyAsnGlyAspArgHisSerAspTyrGlnProLeuGlyThrGln
7
AspGlnSerLeuTyrLeuGlyLeuGlnHisAspGlyAsnAspGlyLeuProProProProTyrSerProArgAspAspSerSerGlnHisiIeTyrGluGluAlaGlyArgGlySerMetAsnProValCysLeuProVallleValAlaProTyrLeuPheTrpLeuAlaAlalleAlaAlaSerCysPheThrAlaSerValSerThrValValThrAlaThrGlyLeuAlaLeuSerLeuLeuLeuLeuAlaAlaValAlaSerSerTyrAlaAlaAlaGlnArgLysLeuLeuThrProValThrValLeuThrAlaValValThrPhePheAlaIIeCysLeuThrTrpArgIIeGluAspProProPheAsnSerLeuLeuPheAlaLeuLeuAlaAlaAlaGlyGlyLeuGlnGlyIleTyrValLeuValMetLeuValLeuLeuIIeLeuAlaTyrArgArgArgTrpArgArgLeuThrValCysGlyGlylleMetPheLeuAlaCysValLeuValLeuIleValAspAlaValLeuGlnLeuSerProLeuLeuGlyAlaValThrValValSerMetThrLeuLeuLeuLeuAlaPheValLeuTrpLeuSerSerProGlyGlyLeuGlyThrLeuGlyAlaAlaLeuLeuThrLeuAlaAlaAlaLeuAlaLeuLeuAlaSerLeuIIeLeuGlyThrLeuAsnLeuThrThrMetPheLeuLeuMetLeuLeuTrpThrLeuValValLeuLeuIIeCysSerSerCysSerSerCysProLeuSerLysIIeLeuLeuAlaArgLeuPheLeuTyrAlaLeuAlaLeuLeuLeuLeuAlaSerAlaLeuIIeAlaGlyGlySerIIeLeuGlnThrAsnPheLysSerLeuSerSerThrGluPhelleProAsnLeuPheCysMetLeuLeuLeuIleValAlaGlyIIeLeuPheIIeLeuAlaIIeLeuThrGluTrpGlySerGlyAsnArgThrTyrGlyProValPheMetCysLeuGlyGlyLeuLeuThrMetValAlaGlyAlaValTrpLeuThrValMetThrAsnThrLeuLeuSerAlaTrpIIeLeuThrAlaGlyPheLeuIIePheLeuIleGlyPheAlaLeuPheGlyVallleArgCysCysArgTyrCysCysTyrTyrCysLeuThrLeuGluSerGluGluArgProProThrProTyrArgAsnThrVal人類皰疹病毒第四型(Epstein-Barr病毒)，終端蛋白LMP-2B MetAsnProValCysLeuProVallleValAlaProTyrLeuPheTrpLeuAlaAlalleAlaAlaSerCysPheThrAlaSerValSerThrValValThrAlaThrGlyLeuAlaLeuSerLeuLeuLeuLeuAlaAlaValAlaSerSerTyrAlaAlaAlaGlnArgLysLeuLeuThrProValThrValLeuThrAlaValValThrPhePheAlalleCysLeuThrTrpArgIleGluAspProProPheAsnSerLeuLeuPheAlaLeuLeuAlaAlaAlaGlyGlyLeuGlnGlyIleTyrValLeuValMetLeuValLeuLeuIIeLeuAlaTyrArgArgArgTrpArgArgLeuThrValCysGlyGlylleMetPheLeuAlaCysValLeuValLeuIleValAspAlaValLeuGlnLeuSerProLeuLeuGlyAlaValThrValValSerMetThrLeuLeuLeuLeuAlaPheValLeuTrpLeuSerSerProGlyGlyLeuGlyThrLeuGlyAlaAlaLeuLeuThrLeuAlaAlaAlaLeuAlaLeuLeuAlaSerLeuIIeLeuGlyThrLeuAsnLeuThrThrMetPheLeuLeuMetLeuLeuTrpThrLeuValValLeuLeuIIeCysSerSerCysSerSerCysProLeuSerLysIIeLeuLeuAlaArgLeuPheLeuTyrAlaLeuAlaLeuLeuLeuLeuAlaSerAlaLeuIIeAlaGlyGlySerIIeLeuGlnThrAsnPheLysSerLeuSerSerThrGluPhelleProAsnLeuPheCysMetLeuLeuLeuIleValAlaGlyIIeLeuPheIIeLeuAlaIIeLeuThrGluTrpGlySerGlyAsnArgThrTyrGlyProValPheMetCysLeuGlyGlyLeuLeuThrMetValAlaGlyAlaValTrpLeuThrValMetSerAsnThrLeuLeuSerAlaTrpIIeLeuThrAlaGlyPheLeuIIe
PheLeuIleGlyPheAlaLeuPheGlyValIIeArgCysCysArgTyrCysCysTyrTyrCysLeuThrLeuGluSerGluGluArgProProThrProTyrArgAsnThrVal人類皰疹病毒第四型(Epstein-Barr病毒)，外膜醣蛋白gp350 MetGluAlaAlaLeuLeuValCysGlnTyrThrlleGlnSerLeuIleGlnLeuThrArgAspAspProGlyPhePheAsnValGluIleLeuGluPheProPheTyrProAlaCysAsnValCysThrAlaAspValAsnAlaThrlleAsnPheAspValGlyGlyLysLysHisLysLeuAsnLeuAspPheGlyLeuLeuThrProHisThrLysAlaValTyrGlnProArgGlyAlaPheGlyGlySerGluAsnAlaThrAsnLeuPheLeuLeuGluLeuLeuGlyAlaGlyGluLeuAlaLeuThrMetArgSerLysLysLeuProIleAsnlleThrThrGlyGluGluGlnGlnValSerLeuGluSerValAspValTyrPheGlnAspValPheGlyThrMetTrpCysHisHisAlaGluMetGlnAsnProValTyrLeuIleProGluThrValProTyrlleLysTrpAspAsnCysAsnSerThrAsnIIeThrAlaValValArgAlaGlnGlyLeuAspValThrLeuProLeuSerLeuProThrSerAlaGlnAspSerAsnPheSerValLysThrGluMetLeuGlyAsnGluIleAspIleGluCysIleMetGluAspGlyGluIleSerGlnValLeuProGlyAspAsnLysPheAsnlIeThrCysSerGlyTyrGluSerHisValProSerGlyGlyIleLeuThrSerThrSerProValAlaThrProIIeProGlyThrGlyTyrAlaTyrSerLeuArgLeuThrProArgProValSerArgPheLeuGlyAsnAsnSerlleLeuTyrValPheTyrSerGlyAsnGlyProLysAlaSerGlyGlyAspTyrCysIIeGlnSerAsnlleValPheSerAspGluIleProAlaSerGlnAspMetProThrAsnThrThrAspIleThrTyrValGlyAspAsnAlaThrTyrSerValProMetValThrSerGluAspAlaAsnSerProAsnValThrValThrAlaPheTrpAlaTrpProAsnAsnThrGluThrAspPheLysCysLysTrpThrLeuThrSerGlyThrProSerGlyCysGluAsnlIeSerGlyAlaPheAlaSerAsnArgThrPheAspIleThrValSerGlyLeuGlyThrAlaProLysThrLeullelleThrArgThrAlaThrAsnAlaThrThrThrThrHisLysValIlePheSerLysAlaProGluSerThrThrThrSerProThrLeuAsnThrThrGlyPheAlaAlaProAsnThrThrThrGlyLeuProSerSerThrHisValProThrAsnLeuThrAlaProAlaSerThrGlyProThrValSerThrAlaAspValThrSerProThrProAlaGlyThrThrSerGlyAlaSerProValThrProSerProSerProArgAspAsnGlyThrGluSerLysAlaProAspMetThrSerProThrSerAlaValThrThrProThrProAsnAlaThrSerProThrProAlaValThrThrProThrProAsnAlaThrSerProThrLeuGlyLysThrSerProThrSerAlaValThrThrProThrProAsnAlaThrSerProThrProAlaValThrThrProThrProAsnAlaThrIIeProThrLeuGlyLysThrSerProThrSerAlaValThrThrProThrProAsnAlaThrSerProThrValGlyGluThrSerProGlnAlaAsnThrThrAsnHisThrLeuGlyGlyThrSerSerThrProValValThrSerProProLysAsnAlaThrSerAlaValThrThrGlyGlnHisAsnIIeThrSerSerSerThrSerSerMetSerLeuArgProSerSerlleSerGluThrLeuSerProSerThrSerAspAsnSerThrSerHisMetProLeuLeuThrSerAlaHisProThrGlyGlyGluAsnIleThrGlnValThrProAlaSerThrSerThrHisHisValSerThrSerSerProAlaProArgProGlyThrThrSerGlnAlaSerGlyProGlyAsnSerSerThrSerThrLys
ProGlyGluValAsnValThrLysGlyThrProProLysAsnAlaThrSerProGlnAlaProSerGlyGlnLysThrAlaValProThrValThrSerThrGlyGlyLysAlaAsnSerThrThrGlyGlyLysHisThrThrGlyHisGlyAlaArgThrSerThrGluProThrThrAspTyrGlyGlyAspSerThrThrProArgThrArgTyrAsnAlaThrThrTyrLeuProProSerThrSerSerLysLeuArgProArgTrpThrPheThrSerProProValThrThrAlaGlnAlaThrValProValProProThrSerGlnProArgPheSerAsnLeuSerMetLeuValLeuGlnTrpAlaSerLeuAlaValLeuThrLeuLeuLeuLeuLeuValMetAlaAspCysAlaPheArgArgAsnLeuSerThrSerHisThrTyrThrThrProProTyrAspAspAlaGluThrTyrVal人類皰疹病毒第四型(Epstein-Barr病毒)，EBNA-2核蛋白MetProThrTyrTyrLeuAlaLeuHisGlyGlyGlnSerTyrAsnLeuIIeValAspThrAspMetSerGlyAsnProSerLeuSerVallleProThrAsnProTyrGlnGluGlnLeuSerAsnAsnProLeuIleGlnLeuGlnlleValValGlyGluAsnThrGlyAlaProAlaProProGlnProProProProProProProProProProProGluArgArgAspAlaTrpThrGlnGluProLeuProLeuAspMetAsnProLeuGlySerAspAlaSerGlnGlyProLeuAlaSerSerIIeArgMetLeuCysMetAlaGlnTyrLeuLeuArgAsnAlaArgGlyGlnGlnGlyLeuLeuArgProLeuGlyProGlnThrArgSerGlnValThrLeuGluArgGlnProValHisAsnProArgGlnGluAlaProIlelleLeuLeuGlnSerProAlaProProArgPheThrProValProMetValAlaLeuGlyHisThrLeuGlnProThrProProProArgProThrLeuProGlnProArgI1eProLeuIleIleProProArgHisThrAsnGlnProAlaThrThrProProThrAlaProGlnArgLeuThrLeuGlyHisGlnLeuSerLeuProProHisProProProHisGlnSerThrProHisCysSerSerAspSerThrGlyLeuProProProProThrSerTyrSerlleProSerMetThrLeuSerProGluProLeuProProProAlaAlaProAlaHisProLeuProGlyVallleTyrAspGlnGlnAlaLeuProProThrProGlyProProTrpTrpProProValArgAspProThrProThrThrGlnThrProProThrAsnThrLysGlnGlyProAspGlnGlyGlnGlyArgGlyArgTrpArgGlyArgGlyArgSerLysGlyArgGlyArgMetHisLysLeuProGluProArgArgProGlyProAspThrSerSerProSerMetProGlnLeuSerProValValSerLeuHisGlnGlyGlnGlyProGluAsnSerProThrProGlyProSerThrAlaGlyProValCysArgValThrProSerAlaThrProAspIIeSerProIIeHisGluProGluSerSerAspSerGluGluProProPheLeuPheProSerAspTrpTyrProProThrLeuGluProAlaGluLeuAspGluSerTrpGluGlyIIePheGluThrThrGluSerHisSerSerAspGluGluAsnValGlyGlyProSerLysArgProArgThrSerThrGln人類皰疹病毒第四型(Epstein-Barr病毒)，EBNA-3C核蛋白MetGluSerPheGluGlyGlnGlyAspSerArgGlnSerProAspAsnGluArgGlyAspAsnValGlnThrThrGlyGluHisAspGlnAspProGlyProGlyProProSerSerGlyAlaSerGluArgLeuValProGluGluSerTyrSerArgAspGlnGlnProTrpGlyGlnSerArgGlyAspGluAsnArgGlyTrpMetGlnArgIleArgArgArgArgArgArgArgAlaAlaLeuSerGlyHisLeuLeuAspThrGluAspAsnValProProTrpLeuProPro
10
HisAspI IeThrProTyrThrAlaArgAsnI IeArgAspAlaAlaCysArgAlaValLysGlnSerHisLeuGlnAlaLeuSerAsnLeuIIeLeuAspSerGlyLeuAspThrGlnHisIIeLeuCysPheValMetAlaAlaArgGlnArgLeuGlnAspIIeArgArgGlyProLeuValAlaGluGlyGlyValGlyTrpArgHisTrpLeuLeuThrSerProSerGlnSerTrpProMetGlyTyrArgThrAlaThrLeuArgThrLeuThrProValProAsnArgValGlyAlaAspSerlleMetLeuThrAlaThrPheGlyCysGlnAsnAlaAlaArgThrLeuAsnThrPheSerAlaThrValTrpThrProProHisAlaGlyProArgGluGlnGluArgTyrAlaArgGluAlaGluValArgPheLeuArgGlyLysTrpGlnArgArgTyrArgArgIIeTyrAspLeuIIeGluLeuCysGlySerLeuHisHisiIeTrpGlnAsnLeuLeuGlnThrGluGluAsnLeuLeuAspPheValArgPheMetGlyValMetSerSerCysAsnAsnProAlaValAsnTyrTrpPheHisLysThrIIeGlyAsnPheLysProTyrTyrProTrpAsnAlaProProAsnGluAsnProTyrHisAlaArgArgGlylleLysGluHisVallleGlnAsnAlaPheArgLysAlaGlnlleGlnGlyLeuSerMetLeuAlaThrGlyGlyGluProArgGlyAspAlaThrSerGluThrSerSerAspGluAspThrGlyArgGlnGlySerAspValGluLeuGluSerSerAspAspGluLeuProTyrlleAspProAsnMetGluProValGlnGlnArgProValMetPheValSerArgValProAlaLysLysProArgLysLeuProTrpProThrProLysThrHisProValLysArgThrAsnValLysThrSerAspArgSerAspLysAlaGluAlaGlnSerThrProGluArgProGlyProSerGluGlnSerSerValThrValGluProAlaHisProThrProValGluMetProMetVallleLeuHisGlnProProProValProLysProValProValLysProThrProProProSerArgArgArgArgGlyAlaCysValValTyrAspAspAspValIleGluValIleAspValGluThrThrGluAspSerSerSerValSerGlnProAsnLysProHisArgLysHisGlnAspGlyPheGlnArgSerGlyArgArgGlnLysArgAlaAlaProProThrValSerProSerAspThrGlyProProAlaValGlyProProAlaAlaGlyProProAlaAlaGlyProProAlaAlaGlyProProAlaAlaGlyProProAlaAlaGlyProProAlaAlaGlyProArgIIeLeuAlaProLeuSerAlaGlyProProAlaAlaGlyProHisIleValThrProProSerAlaArgProArgIIeMetAlaProProValValArgMetPheMetArgGluArgGlnLeuProGlnSerThrGlyArgLysProGlnCysPheTrpGluMetArgAlaGlyArgGluIleThrGlnMetGlnGlnGluProSerSerHiSLeuGlnSerAlaThrGlnProThrThrProArgProSerTrpAlaProSerValCysAlaLeuSerValMetAspAlaGlyLysAlaGlnProIleGluSerSerHisLeuSerSerMetSerProThrGlnProIleSerHisGluGluGlnProArgTyrGluAspProAspAlaProLeuAspLeuSerLeuHisProAspValAlaAlaGlnProAlaProGlnAlaProTyrGlnGlyTyrGlnGluProProAlaProGlnAlaProTyrGlnGlyTyrGlnGluProProProProGlnAlaProTyrGlnGlyTyrGlnGluProProAlaHisGlyLeuGlnSerSerSerTyrProGlyTyrAlaGlyProTrpThrProArgSerGlnHisProCysTyrArgHisProTrpAlaProTrpSerGlnAspProValHisGlyHisThrGlnGlyProTrpAspProArgAlaProHisLeuProProGlnTrpAspGlySerAlaGlyHisGlyGlnAspGlnValSerGlnPheProHisLeuGlnSerGluThrGlyProProArgLeuGlnLeuSerLeuValProLeuValSerSerSerAlaProSerTrpSerSerPro
GlnProArgAlaProI1eArgProI1eProThrArgPheProProProProMetProLeuGlnAspSerMetAlaValGlyCysAspSerSerGlyThrAlaCysProSerMetProPheAlaSerAspTyrSerGlnGlyAlaPheThrProLeuAspIleAsnAlaThrThrProLysArgProArgValGluGluSerSerHisGlyProAlaArgCysSerGlnAlaThrAlaGluAlaGlnGluIleLeuSerAspAsnSerGluIleSerValPheProLysAspAlaLysGlnThrAspTyrAspAlaSerThrGluSerGluLeuAspNS3 (C型肝炎病毒)AlaProIIeThrAlaTyrAlaGlnGlnThrArgGlyLeuLeuGlyCysIIeIIeThrGlyLeuThrGlyArgAspLysAsnGlnValGluGlyGluValGlnlleValSerThrAlaAlaGlnThrPheLeuAlaThrCysIleAsnGlyValCysTrpThrValTyrHisGlyAlaGlyThrArgThrIleAlaSerSerLysGlyProValIIeGlnMetTyrThrAsnValAspGlnAspLeuValGlyTrpProAlaProGlnGlyAlaArgSerLeuThrProCysThrCysGlySerSerAspLeuTyrLeuValThrArgHisAlaAspValIIeProValArgArgArgGlyAspGlyArgGlySerLeuLeuSerProArgProIleSerTyrLeuLysGlySerSerGlyGlyProLeuLeuCysProAlaGlyHisAlaValGlyllePheArgAlaAlaValCysThrArgGlyValAlaLysAlaValAspPhelleProValGluGlyLeuGluThrThrMetArgSerProValPheSerAspAsnSerSerProProAlaValProGlnSerTyrGlnValAlaHisLeuHisAlaProThrGlySerGlyLysSerThrLysValProAlaAlaTyrAlaAlaGlnGlyTyrLysValLeuValLeuAsnProSerValAlaAlaThrLeuGlyPheGlyAlaTyrMetSerLysAlaHisGlylleAspProAsnlleArgThrGlyValArgThrlleThrThrGlySerProIleThrTyrSerThrTyrGlyLysPheLeuAlaAspGlyGlyCysSerGlySerAlaTyrAspIlellelleCysAspGluCysHisSerThrAspAlaThrSerlleLeuGlylleGlyThrValLeuAspGlnAlaGluThrAlaGlyAlaArgLeuThrValLeuAlaThrAlaThrProProGlySerValThrValProHisProAsnlleGluGluValAlaLeuSerThrThrGlyGluIleProPheTyrGlyLysAlalleProLeuGluAlalIeLysGlyGlyArgHisLeuIlePheCysHisSerLysLysLysCysAspGluLeuAlaAlaLysLeuValAlaLeuGlyValAsnAlaValAlaTyrTyrArgGlyLeuAspValSerVallleProAlaSerGlyAspValValValValAlaThrAspAlaLeuMetThrGlyPheThrGlyAspPheAspSerValIleAspCysAsnThrCysValThrGlnThrValAspPheSerLeuAspProThrPheThrlleGluThrThrThrLeuProGlnAspAlaValSerArgThrGlnArgArgGlyArgThrGlyArgGlyLysProGlyIleTyrArgPheValThrProGlyGluArgProSerGlyMetPheAspSerSerValLeuCysGluCysTyrAspAlaGlyCysAlaTrpTyrGluLeuThrProAlaGluThrThrValArgLeuArgAlaTyrMetAsnThrProGlyLeuProValCysGlnAspHisLeuGluPheTrpGluGlyValPheThrGlyLeuThrHisiIeAspAlaHisPheLeuSerGlnThrLysGlnSerGlyGluAsnLeuProTyrLeuValAlaTyrGlnAlaThrValCysAlaArgAlaGlnAlaProProProSerTrpAspGlnMetTrpLysCysLeuIleArgLeuLysProThrLeuHisGlyProThrProLeuLeuTyrArgLeuGlyAlaValGlnAsnGluIleThrLeuThrHisProIleThrLysTyrlleMetThrCysMetSerAlaAspLeuGluValValThr
NS5B(C型肝炎病毒)GluValTyrGlnCysCysAspLeuGluProGluAlaArgLysValIIeSerAlaLeuThrGluArgLeuTyrValGlyGlyProMetTyrAsnSerArgGlyAspLeuCysGlyThrArgArgCysArgAlaSerGlyValPheThrThrSerPheGlyAsnThrLeuThrCysTyrLeuLysAlaSerAlaAlalleArgAlaAlaGlyLeuLysAspCysThrMetLeuValCysGlyAspAspLeuValValIleAlaGluSerAspGlyValGluGluAspLysArgAlaLeuGlyAlaPheThrGluAlaMetThrArgTyrSerAlaProProGlyAspAlaProGlnProAlaTyrAspLeuGluLeuIleThrSerCysSerSerAsnValSerValAlaHisAspGlyThrGlyLysArgValTyrTyrLeuThrArgAspProGluThrProLeuAlaArgAlaAlaTrpGluThrAlaArgHisThrProValAsnSerTrpLeuGlyAsnllellelleTyrAlaProThrlleTrpValArgMetValLeuMetThrHisPhePheSerlleLeuGlnSerGlnGluAlaLeuGluLysAlaLeuAsppheAspMetTyrGlyValThrTyrSerIleThrEl (C型肝炎病毒)TyrGlnValArgAsnSerSerGlyLeuTyrHisValThrAsnAspCysProAsnSerSerIleValTyrGluThrAlaAspIleLeuHisSerProGlyCysValProCysValArgGluGlyAsnThrSerLysCysTrpValAlaValAlaProThrValAlaThrLysAspGlyLysLeuProThrThrGlnLeuArgHisiIeAspLeuLeuvalGlyAlaThrLeuCysSerAlaLeuTyrValGlyAspLeuCysGlySerValPheLeuValSerGlnLeuPheThrPheSerProArgHisTrpThrThrGlnAspCysAsnCysSerIleTyrProGlyHisValThrGlyHisArgMetAlaTrpAspMetMetMetAsnTrpSerProThrThrAlaLeuValValAlaGlnLeuLeuArgValProGlnAlalleLeuAspMetlleAlaGlyAlaHisTrpGlyValLeuAlaGlylleAlaTyrPheSerMetValGlyAsnTrpAlaLysValLeuValValLeuLeuLeuPheAlaGlyValAspAlaE2 (C型肝炎病毒)HisTrpGlyValMetPheGlyLeuAlaTyrPheSerMetGlnGlyAlaTrpAlaLysValIleVallleLeuLeuLeuThrAlaGlyValAspAlaSerSerHisAsnThrArgThrValGlyGlyGlnlleAlaArgGlnLeuGlnProPheThrArgLeuPheSerValGlyProAsnGlnAsnlleGlnLeulleAsnThrAsnGlySerTrpHisHBsAg (B型肝炎病毒)SerThrThrSerThrGlyProCysArgThrCysMetThrThrAlaGlnGlyThrSerMetTyrProSerCysCysCysThrLysProSerAspGlyAsnCysThrCysIIeProIIePro
SerSerTrpAlaPheGlyLysPheLeuTrpGluTrpAlaSerAlaArgPhepre-Sl蛋白(B型肝炎病毒):MetGlyGlnAsnLeuSerValSerAsnProLeuGlyPhePheProGluHisGlnLeuAspProLeuPheLysAlaAsnSerAsnAsnProAspTrpAspPheAsnProAsnLysAspAsnTrpProGluAlaThrGlnValGlyValGlyAlaPheGlyProGlyPheThrProProHisGlyGlyLeuLeuGlyTrpSerSerGlnAlaGlnGlyAlalleThrThrLeuProAlaValProProSerAlaAlaThrAsnArgpre_S2蛋白(B型肝炎病毒)
IIeSerSerIIePheSerArgIIeGlyAspproAlaLeuAsnMetGluAsnIIeThrSerGlyPheLeuGlyProLeuLeuValLeuGlnAlaGlyPhePheLeuLeuThrArgIleLeuThrIleProGlnSerLeuAspSerTrpTrpThrSerLeuAsnPheLeuGlyGlyThrThrValCysLeuGlyGlnAsnSerGlnSerProThrSerAsnHisSerProThrSerCysProProThrCysProGlyTyrArgTrpMetCysLeuArgArgPheIleIlePheLeuPheIleLeuLeuLeuCysLeuIlePheLeuLeuValLeuLeuAspTyrGlnGlyMetLeuProValCysProLeuIIeProGlySerSerThrThrSerThrGlyProCysArgThrCysThrThrProAlaGlnGlyThrSerMetTyrProSerCysCysCysThrLysProSerAspGlyAsnCysThrCysIIeProIleProSerSerTrpAlaPheGlyLysPheLeuTrpGluTrpAlaSerAlaArgPheSerTrpLeuSerLeuLeuValProPheValGlnTrpPheValGlyLeuSerProThrValTrpLeuSerValIIeTrpMetMetTrpTyrTrpGlyProSerLeuTyr外膜醣蛋白B，gB (人類巨細(xì)胞病毒CMV)TyrAsnLysProIleAlaAlaArgPheMetGlyAspValLeuGlyLeuAlaSerCysValThrlleAsnGlnThrSerValLysValLeuArgAspMetAsnValLysGluSerProGlyArgCysTyrSerArgProValValllePheAsnPheValAsnSerSerTyrValGlnTyrGlyGlnLeuGlyGluAspAsnGlulleLeuLeuGlyAsnHisArgThrGluGluCysGlnPheProSerLeuLysIIePheIIeAlaGlyAsnserAlaTyrGluTyrValAspTyrLeuPheLysArgMetIIeAspLeuSerSerIIeTyrThrValAspSerMetIIeAlaLeuAspIleAspProLeuGluAsnThrAspPheArgValLeuGluLeuTyrSerGlnLysGluLeuArgSerSerAsnValPheAspLeuGluGluIIeMetArgGluPheAsnSerTyrLysGlnArgValLysTyrValGluAspLysValValAspProLeuProPropp65(人類皰疹病毒第五型與人類巨細(xì)胞病毒CMV)MetAlaSerValLeuGlyProIleSerGlyHisValLeuLysAlaValPheSerArgGlyAspThrProValLeuProHisGluThrArgLeuLeuGlnThrGlylleHisValArgValSerGlnProSerLeuIleLeuValSerGlnTyrThrProAspSerThrProCysHisArgGlyAspAsnGlnLeuGlnValGlnHisThrTyrPheThrGlySerGluValGluAsnValSerValAsnValHisAsnProThrGlyArgSerlleCysProSerGlnGluProMetSerIleTyrValTyrAlaLeuProLeuLysMetLeuAsnlIeProSerIIeAsnValHisHisTyrProSerAlaAlaGluArgLysHisArgHisLeuProValAlaAspAlaVallleHisAlaSerGlyLysGlnMetTrpGlnAlaArgLeuThrValSerGlyLeuAlaTrpThrArgGlnGlnAsnGlnTrpLysGluProAspValTyrTyrThrSerAlaPheValPheProThrLysAspValAlaLeuArgHisValValCysAlaHisGluLeuValCysSerMetGluAsnThrArgAlaThrLysMetGlnValIleGlyAspGlnTyrValLysValTyrLeuGluSerPheCysGluAspValProSerGlyLysLeuPheMetHisValThrLeuGlySerAspValGluGluAspLeuThrMetThrArgAsnProGlnProPheMetArgProHisGluArgAsnGlyPheThrValLeuCysProLysAsnMetllelleLysProGlyLysIleSerHisIleMetLeuAspValAlaPheThrSerHisGluHisPheGlyLeuLeuCysProLysSerlleProGlyLeuSerIIeSerGlyAsnLeuLeuMetAsnGlyGlnGlnlIePheLeuGluValGlnAlalleArgGluThrValGluLeuArgGlnTyrAspProValAlaAlaLeuPhePhe
PheAspIIeAspLeuLeuLeuGlnArgGlyProGlnTyrSerGluHisProThrPheThrSerGlnTyrArglleGlnGlyLysLeuGluTyrArgHisThrTrpAspArgHisAspGluGlyAlaAlaGlnGlyAspAspAspValTrpThrSerGlySerAspSerAspGluGluLeuValThrThrG1UArgLysThrProArgVa1ThrGIyGlyGlyAlaMetAlaGlyAlaSerThrSerAlaGlyArgLysArgLysSerAlaSerSerAlaThrAlaCysThrAlaGlyValMetThrArgGlyArgLeuLysAlaGluSerThrValAlaProGluGluAspThrAspGluAspSerAspAsnGluIleHisAsnProAlaValPheThrTrpProProTrpGlnAlaGlyIleLeuAlaArgAsnLeuValProMetValAlaThrValGlnGlyGlnAsnLeuLysTyrGlnGluPhePheTrpAspAlaAsnAspIIeTyrArgIlePheAlaGluLeuGluGlyValTrpGlnProAlaAlaGlnProLysArgArgArgHisArgGlnAspAlaLeuProGlyProCysIIeAlaSerThrProLysLysHisArgGlyIE-I蛋白(人類皰疹病毒第五型，與人類巨細(xì)胞病毒CMV)MetGluSerSerAlaLysArgLysMetAspProAspAsnProAspGluGlyProSerSerLysValProArgProGluThrProValThrLysAlaThrThrPheLeuGlnThrMetLeuArgLysGluValAsnSerGlnLeuSerLeuGlyAspProLeuPheProGluLeuAlaGluGluSerLeuLysThrPheGluGlnValThrGluAspCysAsnGluAsnProGluLysAspValLeuAlaGluLeuValLysGlnIleLysValArgValAspMetValArgHisArglIeLysGluHisMetLeuLysLysTyrAlaGlnThrGluGluLysPheThrGlyAlaPheAsnMetMetGlyGlyCysLeuGlnAsnAlaLeuAspIleLeuAspLysValHisGluProPheGluGluMetLysCysIIeGlyLeuThrMetGlnSerMetTyrGluAsnTyrIIeValProGluAspLysArgGluMetTrpMetAlaCysIleLysGluLeuHisAspValSerLysGlyAlaAlaAsnLysLeuGlyGlyAlaLeuLysAlaLysAlaArgAlaLysLysAspGluLeuArgArgLysMetMetTyrMetcysTyrArgAsnlleGluPhePheThrLysAsnSerAlaPheProLysThrThrAsnGlyCysSerGlnAlaMetAlaAlaLeuGlnAsnLeuProGlnCysSerProAspGluIIeMetSerTyrAlaGlnLysIIePheLysIIeLeuAspGluGluArgAspLysValLeuThrHisI1eAspHisI1ePheMetAspI1eLeuThrThrCysValGluThrMetCysAsnGluTyrLysValThrSerAspAlaCysMetMetThrMetTyrGlyGlylleSerLeuLeuSerGluPheCysArgValLeuCysCysTyrValLeuGluGluThrSerValMetLeuAlaLysArgProLeuIIeThrLysProGluValIIeSerValMetLysArgArgIIeGluGluIleCysMetLysValPheAlaGlnTyrlIeLeuGlyAlaAspProLeuArgValCysSerProSerValAspAspLeuArgAlaIIeAlaGluGluSerAspGluGluAspAlalleAlaAlaTyrThrLeuAlaThrAlaGlyAlaSerSerSerAspSerLeuValSerProProGluSerProValProAlaThrlleProLeuSerSerValIleValAlaGluAsnSerAspGlnGluGluSerGluGlnSerAspGluGluGlnGluGluGlyAlaGlnGluGluArgGluAspThrValSerValLysSerGluProValSerGluIleGluGluValAlaSerGluLysGluGluAspGlyAlaGluGluProThrThrSerGlyGlyLysSerThrHisProMetValThrArgSerLysAlaAspGlnIE-2蛋白(人類皰疹病毒第五型，與人類巨細(xì)胞病毒CMV)MetLysProValLeuValLeuAlalleLeuAlaValLeuPheLeuArgLeuAlaAspSer
ValProArgProLeuAspValValValSerGluIleArgSerAlaHisPheArgValGluGluAsnGlnCysTrpPheHisMetGlyMetLeuTyrPheLysGlyArgMetSerGlyAsnPheThrGluLysHisPheValAsnValGlylleValSerGlnSerTyrMetAspArgLeuGlnValSerGlyGluGlnTyrHisHisAspGluArgGlyAlaTyrPheGluTrpAsnlle 前述任一種具有Ag473的N-端部分的融合蛋白，可以令人意外的高產(chǎn)量于大腸桿菌表現(xiàn)系統(tǒng)中制得。還意外發(fā)現(xiàn)，該重組型融合蛋白可誘發(fā)對(duì)抗該抗原及相關(guān)病癥(例如癌癥)的免疫反應(yīng)。上述的Ag473為一種腦膜炎雙球菌Neisseria Mengitidis的脂蛋白，其是由四個(gè)功能域(SP及功能域1-3)所組成。以下列示其具有四個(gè)已確定功能域的胺基酸序列Met Lys Lys Leu Leu lie Ala Ala Met Met Ala Ala Ala Leu Ala Ala
-ScKilll
Alii Lys (iln (ilu Val l.ys (ilu Alii Vnl (iln Ala Vnl Cilu Scr Asp Viil Lys Asp l hr Ala Ala Ser Ala Ala Glu Ser Ala Ala Ser Ala Val Glu Glu Ala Lys Asp Gln
Val Lys Asp Ala Ala Ala Asp Ala Lys Ala Ser Ala Glu Glu Ala Val Thr Glu Ala
Lys Glu Ala Val Thr Glu Ala Lys Glu Ala Val Thr Glu Ala Lys Glu Ala Val Thr
Glu Ala Ala Lys Asp Thr Leu Asn Lys Ala Ala Asp Ala Thr Gln Glu Ala Ala Asp Lys Met Lys Asp Ala Ala Lys (SEQ ID NO :7)SP =SEQ ID NO :8中的胺基酸殘基1_17(以下劃線示出)功能域1 :SEQ ID NO :9中的胺基酸殘基18-40 (以高亮標(biāo)示)功能域2 =SEQ ID NO 10中的胺基酸殘基41-71 (以粗體標(biāo)示)功能域3 =SEQ ID NO 11中的胺基酸殘基72-121 (以斜體標(biāo)示)術(shù)語“脂質(zhì)化序列”如用于本文意指一種非天然胺基酸序列，其(a)包括與Ag473 的SP具有同一性至少達(dá)80% (85 % ,90^^95%或99% )的第一片段，及與Ag473的功能域1具有同一性至少達(dá)80% (85^^90^^95%或99%)的第二片段，第一片段位于該脂質(zhì)化序列的N-端；且(b)有助于在大腸桿菌中將在其N-端帶有該脂質(zhì)化序列的多肽脂質(zhì)化。 于脂質(zhì)化序列中，第一片段直接或經(jīng)由連接肽而連接至第二片段。較佳地，此序列具有最大長度為40-100(例如，40-80)個(gè)胺基酸。于一項(xiàng)實(shí)例，該脂質(zhì)化序列包括SP與功能域1，也即SEQ IDNO 7的胺基酸1-40 (SEQ ID NO 12)。脂質(zhì)化序列的另外實(shí)例包括，SEQ ID NO 7的包括有SEQ ID NO 7胺基酸1-40的任何其他片段，例如1-41、1-45、1-50、1-60、1-80、 1-100 及 1-121。如用于本文，兩種胺基酸序列的“百分比同源性”是使用經(jīng)描述于Karlin與 Altschul, Proc, Natl. Acad. Sci. USA 87 :2264-2268,1990 的算法(其修改描述于 Karlin 與 Altschul，Proc，Natl. Acad. Sci. USA 90 :5873-5877,1993)而測(cè)定得。此種算法被納入 Altschul 等人，J. Mol. Biol. 215 :403-410,1990 所述的 NBLAST 及 XBLAST 程序中。BLAST 蛋白質(zhì)搜尋是以XBLAST程序來執(zhí)行，分?jǐn)?shù)=50，字長=3，而獲得相對(duì)于參考多肽的序列同
16源性。為達(dá)比較目的而得到具有空隙的比對(duì)，遂使用如Altschul等人，于Nucleic Acids Res. 25 :3389-3402,1997 所述的具空隙 BLAST(Gapped BLAST)。當(dāng)利用 BLAST 與具空隙 BLAST程序時(shí)，是使用這些各別程序(例如，與)的不履行參數(shù)。參見，www.ncbi.nlm.nih. gov ο本發(fā)明的多肽或融合蛋白可呈合成型多肽，或呈重組型多肽的形式獲得。關(guān)于重組型多肽的制備，可將編碼它的核酸與另一編碼融合伙伴，例如谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶 (GST)、6x-His表位標(biāo)簽或M13基因3蛋白的核酸連接。所成的融合核酸于適宜宿主細(xì)胞中表現(xiàn)，得一種能藉由該項(xiàng)技藝已知的方法單離的融合蛋白。單離的融合蛋白可進(jìn)一步(例如)以酵素分解進(jìn)行處理，去除融合伙伴而得到本發(fā)明的重組型多肽。異源多肽、核酸或基因是指其源自外來物種，或(若來自同一物種)實(shí)質(zhì)上已從其原始形式修飾過的。兩種經(jīng)融合的功能域或序列，若它們?cè)谔烊坏鞍踪|(zhì)或核酸中彼此不相鄰，則其對(duì)彼此而言為異源的。術(shù)語“重組型”當(dāng)用于引述(例如)細(xì)胞，或核酸、蛋白質(zhì)或載體時(shí)，意指該細(xì)胞、核酸、蛋白質(zhì)或載體已經(jīng)由導(dǎo)入異源核酸或蛋白質(zhì)，或藉由改變天然核酸或蛋白質(zhì)而受修飾，或指該細(xì)胞是衍生自經(jīng)由此類修飾的細(xì)胞。因此，舉例而言，重組型細(xì)胞可表現(xiàn)未存在于該細(xì)胞的天然形式中的基因，或表現(xiàn)天然基因的被正常或異常表現(xiàn)、表現(xiàn)不足或不被表現(xiàn)的第二復(fù)本。于本發(fā)明，是將前述所提及的脂質(zhì)化序列連接至腫瘤相關(guān)抗原，例如衍生自HPV 的病毒性抗原(例如，HPV E7)而形成一種融合蛋白質(zhì)，當(dāng)其藉由習(xí)知重組技術(shù)在大腸桿菌中進(jìn)行表現(xiàn)時(shí)，是呈脂質(zhì)化形式。以下描述一種實(shí)例。將編碼脂質(zhì)化序列的DNA片段，與編碼E7m的DNA片段，插入一種表現(xiàn)載體(其較佳地帶有強(qiáng)啟動(dòng)子，例如T7、T5、T3或SP6)中， 而構(gòu)筑得表現(xiàn)質(zhì)體。強(qiáng)啟動(dòng)子可為可誘導(dǎo)性，例如可被異丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG) 誘導(dǎo)。接著將該表現(xiàn)質(zhì)體導(dǎo)入大腸桿菌宿主菌株中，并將陽性轉(zhuǎn)形株培養(yǎng)于適于蛋白質(zhì)表現(xiàn)的條件下。較佳地，該大腸桿菌宿主菌株對(duì)于因過度表現(xiàn)外源性蛋白質(zhì)所誘導(dǎo)的毒性作用具有抗性。此類大腸桿菌株可經(jīng)由美國專利案號(hào)6，361，966中所描述的方法鑒定/產(chǎn)生。此等大腸桿菌株的實(shí)例包括(但不限定于)C43(DE!3) (ECCCB96070445),C41(DE3) (ECCC B96070444)、C0214(DE3)、DK8 (DE3)S(NCIMB40885)及 C2014(DE3)(NCIMB 40884)。較佳地，為將經(jīng)此所表現(xiàn)得到的融合蛋白質(zhì)從大腸桿菌宿主細(xì)胞分離出，并且經(jīng)由該項(xiàng)技藝已知的方法，例如以抗-脂蛋白抗體進(jìn)行的免疫轉(zhuǎn)漬法，或質(zhì)譜分析法確認(rèn)其脂質(zhì)化狀態(tài)。本發(fā)明的多肽或融合蛋白可用于制備免疫原組成物(例如，疫苗)，其供于易受病毒感染的個(gè)體(例如，人類個(gè)體)中產(chǎn)生對(duì)抗(例如)HPV的抗體。此類組成物可以(例如)下述的方法，或藉由該項(xiàng)技藝中已知的任何其他相當(dāng)方法制備得到。本發(fā)明的多肽或融合蛋白可與醫(yī)藥上可接受的載體，例如磷酸鹽緩沖食鹽水、 碳酸氫鹽溶液或佐劑混合，而制得一種醫(yī)藥組成物。載體必須為“可接受的”意指，其可與組合物中的活性成份兼容，且較佳地，能夠使活性成份安定，而不會(huì)對(duì)受治療個(gè)體產(chǎn)生有害影響。載體是以投藥模式與途徑，以及標(biāo)準(zhǔn)制藥操作為基礎(chǔ)而進(jìn)行選擇。適宜的醫(yī)藥載體與稀釋劑，及供它們使用的必需品，經(jīng)描述于雷明頓氏制藥科學(xué)(Remington' s Pharmaceutical Sciences)中。于一項(xiàng)實(shí)例，是將融合蛋白質(zhì)與佐劑混合而形成可用于免疫調(diào)節(jié)的組成物。此組成物可制備呈可注射液，呈液態(tài)溶液或乳液。參見，美國專利案4，601，903,4, 599，231,4, 599，230 及 4，596，792?！白魟币庵柑砑又撩庖咴M成物(例如，疫苗)的物質(zhì)，其雖然本身不具有特異性抗原功效，但能刺激免疫系統(tǒng)并增加對(duì)該免疫原組成物的免疫反應(yīng)。佐劑的實(shí)例包括(但不限定于)明礬沉淀物、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、單磷氧基-脂質(zhì)A/海藻糖二霉菌酸酯佐劑、含有棒狀桿菌(Corynebacteriumparvum)與tRNA的油包水乳液、及其他可藉由模擬特定組演化固有分子而執(zhí)行增加免疫反應(yīng)的任務(wù)的物質(zhì)，包括脂質(zhì)體、脂多醣(LPS)、 對(duì)應(yīng)抗原的分子籠(molecular cage)、細(xì)菌細(xì)胞壁組成、被細(xì)胞吞噬的核酸例如雙股RNA、 單股DNA及含有未甲基化CpG 二核苷酸的DNA。其他實(shí)例包括霍亂毒素、大腸桿菌熱不安定性內(nèi)毒素、脂質(zhì)體、免疫刺激復(fù)合體(ISCOM)、免疫刺激性序列寡脫氧核苷酸及氫氧化鋁。組成物還可包括有助于活體內(nèi)遞送的聚合物。參見Audran R.等人，疫苗21 :1250_5，2003 ； 及 Denis-Mize 等人 Cell Immunol.，225 12-20，2003。有效量的前述組成物可以非經(jīng)腸道方式，例如藉由皮下注射或肌肉內(nèi)注射進(jìn)行投藥。或者，可希望呈其他投藥形式，包括栓劑與口服調(diào)配物。對(duì)于栓劑，可包括黏著劑與載體，例如聚烷二醇類或三酸甘油酯類?？诜{(diào)配物可包括正常使用的賦形劑，例如制藥級(jí)糖精、纖維素、碳酸鎂等類。此等組成物采取溶液、懸浮液、片劑、丸劑、膠囊、持續(xù)釋放調(diào)配物或粉末的形式?！坝行Я俊币庵冈摻M成物可于個(gè)體的組織系統(tǒng)，或于個(gè)體中引起生物學(xué)或醫(yī)學(xué)反應(yīng)的量，它是由研究人員、醫(yī)師或其他臨床醫(yī)療人員探究得。前述的多肽或及融合蛋白可用于制備免疫原組成物(例如，疫苗)，以供于易受病毒感染的個(gè)體中產(chǎn)生對(duì)抗病毒的抗體。疫苗可以與其劑量調(diào)配物兼容的方式，及以治療上有效、具保護(hù)性且可產(chǎn)生免疫的量進(jìn)行投藥。欲投藥的量視受治療個(gè)體而定，包括(例如) 該個(gè)體的免疫系統(tǒng)合成抗體，及(若需要)產(chǎn)生細(xì)胞-介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的能力?；钚猿煞炙枰端幍膶?shí)際劑量，取決于開業(yè)醫(yī)師的專業(yè)判斷。然而，熟悉該項(xiàng)技藝的人可容易地測(cè)定得適宜的劑量范圍，且其層級(jí)可為數(shù)微克的本發(fā)明多肽。對(duì)于起始投藥及追加劑量的適當(dāng)用藥療程也可有所差異，但可包括起始投藥隨后施予后續(xù)的投藥。疫苗的劑量可視投藥途徑而定，且依據(jù)宿主的大小而變化。術(shù)語“免疫反應(yīng)”或“免疫原反應(yīng)”是指于一個(gè)體中，其免疫系統(tǒng)在對(duì)某一種抗原反應(yīng)時(shí)所產(chǎn)生的任何反應(yīng)。脊椎動(dòng)物的免疫反應(yīng)實(shí)例包括(但不限定于)制造抗體、誘導(dǎo)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫作用及活化補(bǔ)體。對(duì)于由同一抗原的后續(xù)刺激產(chǎn)生的免疫反應(yīng)(也稱為次級(jí)免疫反應(yīng))，較于初級(jí)免疫中所發(fā)生的情況快速。術(shù)語“免疫原性”是指，于宿主動(dòng)物中產(chǎn)生對(duì)抗一或多種抗原的免疫反應(yīng)的能力。此免疫反應(yīng)是構(gòu)成，由對(duì)抗特定感染性生物體所引發(fā)的保護(hù)性免疫作用的基礎(chǔ)?！翱乖笔侵敢环N含有一或多個(gè)會(huì)刺激宿主的免疫系統(tǒng)制造體液，及/或細(xì)胞抗原專一性反應(yīng)的抗原表位的分子。術(shù)語“抗原”可與“免疫原”互換使用。與適當(dāng)細(xì)胞接觸后的結(jié)果，抗原會(huì)誘發(fā)一種敏感或免疫反應(yīng)的狀態(tài)，并以可論證的方式與受敏化個(gè)體的抗體或免疫細(xì)胞，于活體內(nèi)或活體外進(jìn)行反應(yīng)?？贵w可被生物個(gè)體內(nèi)的抗體專一地辨識(shí)及結(jié)合。 與主要組織兼容性復(fù)合體(MHC)締合的抗原，也可被位于T淋巴細(xì)胞(T-細(xì)胞)表面上的受體辨識(shí)及結(jié)合，而導(dǎo)致T-細(xì)胞活化。術(shù)語“抗原表位”用于本文是指于抗原上，一特定抗原分子或T-細(xì)胞受體與其結(jié)合的部位。該術(shù)語可與“抗原決定基”或“抗原決定部位”互換使用。
“抗體”是指一種具有特定胺基酸序列，且僅和一種或一群密切相關(guān)的抗原結(jié)合的免疫球蛋白分子，或免疫球蛋白分子的至少一具有免疫活性的部份?？贵w的實(shí)例包括IgG、 IgM、IgA、IgD及IgE。免疫球蛋白分子的具有免疫活性的部份實(shí)例包括Fab及F(ab) ‘ 2， 其可藉由將抗體以諸如胃蛋白酶的酵素處理而產(chǎn)生?？贵w可為單株抗體或多株抗體。術(shù)語 “單株抗體”是指一群僅含有一種抗原結(jié)合部位，且能夠與特別抗原表位進(jìn)行免疫反應(yīng)的抗體分子族群。術(shù)語“多株抗體”是指一群含有一種以上抗原結(jié)合部位，且能夠與多肽上一個(gè)以上抗原表位進(jìn)行免疫反應(yīng)的抗體分子族群?？山逵稍擁?xiàng)技藝已知的方法鑒定出容易受病毒感染的個(gè)體，并投藥予本發(fā)明的組成物。組成物的劑量取決于(例如)特別的多肽/蛋白質(zhì)、是否有佐劑共同投藥、及共同投藥的佐劑類型、投藥形式與頻數(shù)等，其可由熟習(xí)該項(xiàng)技藝的人測(cè)定得。若需要可進(jìn)行重復(fù)投藥，其可由熟習(xí)該項(xiàng)技藝的人決定。舉例而言，在第一次免疫后4至8周可給予追加劑量， 且于8至12周可給予第二次追加(使用相同的調(diào)配物)?？蓮膫€(gè)體采集血清或T細(xì)胞，以測(cè)試由對(duì)抗該病毒的組成物所引起的免疫反應(yīng)。分析對(duì)抗某一種蛋白質(zhì)或感染的抗體或細(xì)胞毒性T細(xì)胞的方法，為該項(xiàng)技藝已熟知。若需要可給與額外的追加免疫。藉由改變多肽/ 蛋白質(zhì)的用量、組成物的劑量及投藥的頻數(shù)，而可將免疫程序最適化以引起最大免疫反應(yīng)。 于大規(guī)模投藥前，可希望進(jìn)行功效測(cè)試。于功效測(cè)試中，可將非人類個(gè)體(例如，小鼠、大鼠、兔子、馬、豬、?；蚝镒?經(jīng)由口服或非經(jīng)腸道途徑，投藥予本發(fā)明的組成物。在最初投藥之后，或在視需要而追加投藥后，可將測(cè)試個(gè)體與對(duì)照組個(gè)體(接受偽裝投藥)皆以病毒進(jìn)行攻毒，以測(cè)試該組成物的有效性。可使用各種抗原。于某些具體態(tài)樣，抗原可為一種腫瘤相關(guān)抗原、癌癥抗原或腫瘤抗原。術(shù)語癌癥抗原與腫瘤抗原可互換使用，且是指一種由癌細(xì)胞差異表現(xiàn)的抗原。于是，可將癌癥抗原利用于差異靶定一種對(duì)抗癌細(xì)胞的免疫反應(yīng)。因此癌癥抗原可能刺激腫瘤-特異性免疫反應(yīng)。某些癌癥抗原是由正常細(xì)胞所編碼，雖然不是必然會(huì)被表現(xiàn)。有些此等抗原的特征可能是，其在正常細(xì)胞中正常狀態(tài)下為緘默的(也即，不被表現(xiàn))，有些只在分化的某些階段被表現(xiàn)，而有些是暫時(shí)被表現(xiàn)(例如，胚胎與胎兒抗原)。其他癌癥抗原可由突變型細(xì)胞基因，例如致癌基因(例如經(jīng)活化的ras致癌基因)、抑制因子基因(例如突變型Ρ5!3)，或因內(nèi)部缺失或染色體異位產(chǎn)生的融合蛋白。又，其他癌癥抗原可由病毒基因，例如RNA及DNA腫瘤病毒所攜帶的基因編碼。腫瘤抗原的實(shí)例包括MAGE、MART-1/Melan-A、gplOO、二肽基肽酶 IV(DPPUV)、腺苷脫胺酶結(jié)合蛋白(ADAbp)、親環(huán)蛋白(cyclophilirOb、結(jié)直腸相關(guān)抗原(CRC)-CO17-IA/ GA733、癌胚性抗原(CEA)及其抗原性表位CAP-I與CAP-2、etv6、ami 1、前列腺專一性抗原(PSA)及其抗原性表位PSA-I、PSA-2與PSA-3、前列腺專一性膜抗原(PSMA)、T-細(xì)胞受體 /CD3-. zeta.鏈、腫瘤抗原的 MAGE-家族(例如 MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、 MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-AlO, MAGE-AlU MAGE-Al2, MAGE-Xp2 (MAGE-B2)、MAGE_Xp3 (MAGE-B3)、MAGE_Xp4 (MAGE-B4)、MAGE-Cl、MAGE-C2、 MAGE-C3、MAGE-C4、MAGE-C5)、腫瘤抗原的 GAGE-家族(例如 GAGE-I、GAGE-2、GAGE-3、 GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7、GAGE-8、GAGE-9)、BAGE、RAGE、LAGE-1、NAG、GnT-V、MUM-1、 CDK4、酪胺酸酶、p53、MUC家族、HER2/neu、p21ras、RCASl、α -胎蛋白、E-鈣黏著蛋白、α -連環(huán)蛋白、β-連環(huán)蛋白、Y連環(huán)蛋白、pl20ctn、PRAME、NY-ES0-l、cdc27、腺腫瘤性大腸息肉蛋白(APC)、胞襯蛋白(fodrin)、連接蛋白(Connexin) 37、Ig-個(gè)體遺傳型、pl5、gp75、GM2與 GD2神經(jīng)節(jié)苷脂、病毒產(chǎn)物例如人類乳頭狀瘤病毒蛋白、腫瘤抗原的Smad家族、Imp-1、P1A、 EBV-編碼的核抗原 ΦΒΝΑ) -1、腦肝糖磷酸化酶、SSX-I、SSX-2 (H0M-MEL-40)、SSX-3、SSX-4、 SSX-5、SCP-I 與 CT-7 及 c-erbB-2。癌癥或腫瘤及與此類腫瘤(非排他地)相關(guān)的特定腫瘤抗原，包括急性淋巴性白血癥(etV6、amll、親環(huán)蛋白b)、細(xì)胞淋巴瘤(Ig-個(gè)體遺傳型)、神經(jīng)膠瘤(E-鈣黏著蛋白、 α-連環(huán)蛋白、β-連環(huán)蛋白、Y-連環(huán)蛋白、pl20ctn)、膀胱癌(p21ras)、膽管癌(p21ras)、 乳癌(MUC 家族、HER2/neu、c-erbB-2)、子宮頸癌(p53、p2Iras)、結(jié)腸癌(p21ras、HER2/ neu、c-erbB-2、MUC家族)、結(jié)直腸癌(結(jié)直腸相關(guān)抗原(CRC)-C017-1A/GA733、APC)、絨毛膜癌(CEA)、上皮細(xì)胞癌(親環(huán)蛋白b)、胃癌(HER2/neu、c-erbB-2、ga733醣蛋白)、肝細(xì)胞癌(α-胎蛋白)、哈金氏淋巴瘤(Imp-1、ΕΒΝΑ-1)、肺癌(CEA, MAGE-3、NY-ES0-1)、淋巴細(xì)胞衍生的白血病(親環(huán)蛋白b)、黑色素瘤(p5蛋白、gp75、癌胚胎抗原、GM2與⑶2神經(jīng)節(jié)苷脂、Melan-A/MART-1、cdc27、MAGE-3, p21ras、gplOO)、骨髓瘤(MUC 家族、p21ras)、非小細(xì)胞肺癌(HER2/neu、c-erbB-2)、鼻咽癌(Imp-1、EBNA-1)、卵巢癌(MUC 家族、HER2/neu、 c-erbB-2)、前列腺癌(前列腺專一性抗原(PSA)及其抗原性表位PSA-I、PSA-2與PSA-3、 PSMA、HER2/neu、c-erbB-2、ga733 醣蛋白)、腎癌(HER2/neu、c_erbBD、子宮頸與食道的鱗狀細(xì)胞癌(NY-ES0-1)、與T細(xì)胞白血病(HTLV-1抗原表位)，及病毒性產(chǎn)物或蛋白質(zhì)。如前所述，病毒感染會(huì)引起各種病癥，包括癌癥。引起癌癥的病毒實(shí)例包括EBV、 HPV、HCV、HBV及CMV。其中，HPV已知會(huì)引起包括疣(例如生殖器疣)、子宮頸細(xì)胞分化不良及癌癥(例如，子宮頸癌)。于是，本發(fā)明的范圍包含一種對(duì)抗感染及相關(guān)病癥的免疫原組成物。可利用許多種HPV抗原。與其致癌能力有關(guān)連的HPV基因型歸類為高危險(xiǎn)型，包括 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73 及 82 型(Munoz 等人，N Engl J Med 348 518-27，2003)。其中以HPV16與HPV18特別有用，因?yàn)樗鼈優(yōu)樵谇秩胄宰訉m頸癌中具有高流行率的兩型(Bosch等人，J Natl Cancer Inst 87 :796_802，1995)。于50%子宮頸癌中有偵測(cè)到HPV16，而HPV18與18%子宮頸癌有關(guān)。于腺癌及鱗狀腺癌中，HPV流行率(76. 4% ) 明顯較其于鱗狀細(xì)胞癌中的(87.3% )低，且HPV18為占優(yōu)勢(shì)型( 40% ) (Clifford等人，Br J Cancer 89 101-5，2003)。在治療罹患HPV-相關(guān)腫瘤的患者方面，已針對(duì)疫苗療法進(jìn)行數(shù)種臨床試驗(yàn)。其中大多數(shù)是以E7或E7/E6致癌蛋白為基礎(chǔ)，因?yàn)樵谇皭盒园┘皭盒园┲幸恢碌乇憩F(xiàn)E6與E7。而且，有許多報(bào)導(dǎo)指出細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)對(duì)此等患者的重要性(Moscicki，JAdolesc Health 43 :S26_40，2008)。如以下的實(shí)施例所述，可將去活性HPV致癌蛋白(例如去活性E7(E7m))與Ag473 的Dl融合，而制得重組型脂質(zhì)-免疫原(rlipo-E7m)。于TC-I小鼠模式中，lipo_E7m可保護(hù)該小鼠對(duì)抗腫瘤細(xì)胞的攻毒。此等結(jié)果清楚證明，lipo-E7m可用做為一種對(duì)抗HPV-相關(guān)腫瘤的有效疫苗，且暗示脂質(zhì)-免疫原策略可應(yīng)用于諸如E7與E6等HPV致癌蛋白對(duì)抗 HPV-相關(guān)腫瘤。下述的特別實(shí)施例僅供做為說明范例，而非用以限制本發(fā)明揭示的其他部分。無需進(jìn)行過度實(shí)驗(yàn)，相信熟悉該項(xiàng)技藝具有通常知識(shí)的人可基于本說明書的敘述，將本發(fā)明利用至其最完整的程度。本文中所引用的公開文獻(xiàn)，皆完整地以參考方式納入本文。此外， 下文中所推論的任何機(jī)制不會(huì)限制本發(fā)明的申請(qǐng)專利范圍。
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實(shí)施例脂質(zhì)化融合蛋白rlipo-E7m的表現(xiàn)使用以重迭引子進(jìn)行的組合PCR方法獲得E7m基因。然后將組合PCR的產(chǎn)物藉由習(xí)知 PCR 擴(kuò)增(Dillon PJjRosen CA. Biotechniques 1990 ；9 :298,300) 用于此步驟的前向引子(5’ -GGAATTCCATATGCACGGCGATACCCCGACCCTGC-3’ (SEQ ID NO :3))包括一個(gè) Nde I 切位(以下劃線標(biāo)示)，而反向引子(5，-AGAGCCGCTCGAGCGGTTTCTGGCTCGCAATCGG-3’ (SEQ ID NO 4))包括一個(gè)Β ο I切位(以下劃線標(biāo)示)。將PCR產(chǎn)物利用Nde I與Β ο I切位選殖入表現(xiàn)載體pET-22b (+) (NOVAGEN,Madison, WI)中，而制得pE7m質(zhì)體。結(jié)果，該重組蛋白的C-端含有額外的六組胺酸標(biāo)簽(HisTag)。將表現(xiàn)質(zhì)體pE7m轉(zhuǎn)形至大腸桿菌株BL21Mar(DE3) (INVITROGEN，USA)中，以供進(jìn)行蛋白質(zhì)表現(xiàn)。將經(jīng)轉(zhuǎn)形的細(xì)胞于37°C下培養(yǎng)過夜，然后以ImM的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)3小時(shí)。 為獲得用于表現(xiàn)脂質(zhì)化免疫原的質(zhì)體，我們遂將能夠被轉(zhuǎn)形至CD43(DE!3)菌株中，用以表現(xiàn)重組型脂蛋白 rlipo-DlE3(Chen et al. ,Vaccine 2009 ；27 :1400-9)的質(zhì)體 pDlE3 加以修改。用于此步驟的前向引子(5，-CGCGGATCCATGCACGGCGATACCCCGACCCT-3‘ (SEQ ID NO: 5))包括一個(gè)Bam HI切位(以下劃線標(biāo)示)，而反向引子(5’ -AGAGCCGCTCGAGCGGTTTCTGG CTCGCAATCGG-3，(SEQ ID NO :6))包括一個(gè)Xho I切位(以下劃線標(biāo)示)。利用Bam HI與 Xho I切位，將PCR產(chǎn)物選殖入pDlE3中，而制得plipo-E7m質(zhì)體。結(jié)果，該重組蛋白的C-端含有額外的六組胺酸標(biāo)簽(HisTag)。將表現(xiàn)質(zhì)體plipo-E7m轉(zhuǎn)形至大腸桿菌株C43(DE3) (INVITROGEN,Carlsbad,CA)中，以供進(jìn)行脂質(zhì)-蛋白表現(xiàn)。將經(jīng)轉(zhuǎn)形的細(xì)胞于37°C下培養(yǎng)過夜，然后以ImM的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)3小時(shí)。rlipo_E7m 的特征化藉由如下述的固定化金屬親合性層析術(shù)(IMAC)，將自pE7m表現(xiàn)的重組型 E7m(rE7m)與自plipoE7m表現(xiàn)的重組型rlipo_E7m從C43 (DE3)細(xì)胞分離出。藉由離心 (8000xg，20分鐘)自4-升細(xì)胞培養(yǎng)物采收大腸桿菌細(xì)胞，并將藉此收集得到的細(xì)胞沉淀再懸浮于 IOOml 含有 50mM Tris (pH 8.0)的均質(zhì)化緩沖液(homogenization buffer)中。然后使用 French Press (Constant Systems, Daventry, UK)于 27Kpsi.下,將大腸桿菌細(xì)胞在有清潔劑存在下打破，并將因此所得的細(xì)胞溶解產(chǎn)物于80，OOOxg下離心60分鐘。收集沉淀物，并使用萃取緩沖液(1% TRITON X-100/50mM Tris (PH8. 9))使其溶解。于80，OOOxg 下離心40分鐘后，將上清液與5ml Ni-NTA樹脂Oliagen，圣地亞哥，CA，USA)于冷房下培育過夜。將經(jīng)過培育的樣本與樹脂漿液加樣至管柱(1.6cm i.d.x 2. 7cm)上。首先將該管柱以50mL萃取緩沖液沖洗。待以緩沖液(1% TRITON X_100，50mM Tris (PH8. 9))溶析出重組蛋白質(zhì)后，將它們并藉由SDS-PAGE與免疫轉(zhuǎn)漬法進(jìn)行特征化。結(jié)果指出，分離得的重組型lipo-E7m具有高純度(如圖2所示)。使用與銅離子偶合的IMAC，并以IOOOmL溶析緩沖液與 300mL 清洗緩沖液(IOOmM 咪唑，TRITON X-100,50mM Tris (PH8. 9))充分沖洗， 以去除脂多醣(LPS)。于所得制劑中的殘留量少于30EU/mg。然后將融合蛋白質(zhì)lipo-E7m依如下所述進(jìn)行質(zhì)譜術(shù)(MQ分析。特別是，將純化的 rlipo-E7m使用手動(dòng)擷取模式，灌流入WATERS SYNAPT HDMS質(zhì)譜儀中。使用最大熵?cái)?shù)算法進(jìn)行15重復(fù)次計(jì)算，而計(jì)算得分子質(zhì)量。為鑒定rlipo-E7m的N-端片段，首先將rlipo-E7m 對(duì)5mM碳酸氫銨(于pH8. 5)進(jìn)行透析，然后以胰蛋白酶(Promega Co.，Madison, WI)，于lipo-E7m:胰蛋白酶為50 1 (wt/wt)的比例下，于25mM碳酸氫銨(pH8. 5)中于室溫下處理5分鐘。藉由添加甲酸(終濃度為1. 2% )終止該酵素反應(yīng)。使用ZIPTIP(MILLIP0RE) 將反應(yīng)混合物進(jìn)一步研磨。將一微升經(jīng)胰蛋白酶分解的蛋白質(zhì)與1μ Ia-氰基-4-羥基肉桂酸(Sigma)溶于乙腈/0. 三氟乙酸(1 3, vol/vol)的飽和溶液混合。將一微升混合物置于基質(zhì)輔助雷射脫附游離/飛行時(shí)間(MALDI-T0F)質(zhì)譜儀(Burker)的標(biāo)的平盤上進(jìn)行分析。從MALDI-T0F分析得到的結(jié)果指出，部份胰蛋白酶分解作用產(chǎn)物相當(dāng)于lipo-E7m 的N-端片段，且此等肽類是經(jīng)脂質(zhì)化。如圖3A中所示，結(jié)果證明純化的rlipo-E7m具有至少五個(gè)不同修飾，且各修飾相差14amu。藉由最大熵?cái)?shù)算法(MaxEntl)測(cè)得分子質(zhì)量(以道耳頓為單位)。已證明有五個(gè)分別位于15384. 5、15400、15412. 5、巧似6及15439的主要高峰。如圖所示，為經(jīng)由 Bruker AutoFlex III質(zhì)譜儀進(jìn)行分析的10分鐘-分解樣本。MALDI-TOF MS光譜也證明， 有五個(gè)分別位于m/z 1452、1466、1480、1492及1506的高峰，其為脂質(zhì)化衍生物的特征。上述結(jié)果實(shí)屬意外，因?yàn)榇竽c桿菌一般不適合用于制造經(jīng)修飾的蛋白質(zhì)，特別是脂質(zhì)化蛋白質(zhì)。細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞分析為研究rlipo-E7m致免作用是否會(huì)于活體內(nèi)誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞，遂將 C57BL/6小鼠以rE7m或rlip0_E7m蛋白進(jìn)行免疫，并使用如下述的鉻釋出分析法來分析細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞活性。簡述之，將C57BL/6 小鼠以 PBS、rE7m(30mg)或 rlipo-E7m(30mg)，于第 0 天及第 14天經(jīng)皮下進(jìn)行免疫接種。于第21天，收集各組小鼠的脾臟細(xì)胞，并以溶于10% FBS RPMI 的lmg/ml RAH于10U/ml IL-2存在下進(jìn)行再刺激5天供做為效應(yīng)細(xì)胞。于進(jìn)行最后一次免疫后七天，將紅血球-耗盡的脾臟細(xì)胞(IxlO6細(xì)胞/mL)與lmg/mL的HPV16 E7-衍生肽RAH(RAHYSIVTF)，及TC-I 10U/mL重組型人類IL-2于24-孔平盤中進(jìn)行活體外培養(yǎng)5 天。將細(xì)胞(5xl05)以 IOOmCi 的 51Cr(Na251CrC)4 ；PERKINELMER, ffaltham, MA, USA)于下進(jìn)行標(biāo)定小時(shí)，以供做為標(biāo)靶細(xì)胞。將經(jīng)肽刺激的脾臟細(xì)胞與經(jīng)標(biāo)定的標(biāo)靶細(xì)胞，以各種如所指定的效應(yīng)細(xì)胞-對(duì)-標(biāo)靶細(xì)胞比例混合。經(jīng)于37°C下培育4小時(shí)后，使用加瑪計(jì)數(shù)器 (PERKINELMER)測(cè)量上清液的放射活性。使用下列公式計(jì)算比溶解的百分比值100X〔(實(shí)驗(yàn)釋出量-自發(fā)釋出量)/(最大釋出量-自發(fā)釋出量)〕。如圖4所示，于100及50的E/T比例下，rlipo_E7m能對(duì)E7-表現(xiàn)的腫瘤(TC-1細(xì)胞)誘發(fā)rE7m較強(qiáng)的殺死效應(yīng)。此等結(jié)果指出，rlip0_E7m致免作用可于活體內(nèi)誘導(dǎo)CTL 反應(yīng)?；铙w內(nèi)腫瘤保護(hù)實(shí)驗(yàn)關(guān)于活體內(nèi)腫瘤保護(hù)實(shí)驗(yàn)，是將C57BL/6小鼠(每組六只)以30 □ g rE7m或 rlipo-E7m進(jìn)行免疫。以與用于第一次疫苗接種相同的程序，對(duì)小鼠施予兩次追加免疫。于最后一次疫苗接種后兩周，將小鼠以MlO5TC-I腫瘤細(xì)胞/小鼠，經(jīng)皮下注射于右大腿內(nèi)進(jìn)行攻毒，并以視診及觸診每周進(jìn)行檢測(cè)兩次。將另一動(dòng)物模式首先注射以^cIO5TC-I腫瘤細(xì)胞/小鼠。在第七天，將30 □ g rE7m或rlip0_E7m投藥予C57BL/6小鼠(每組六只)。 以視診及觸診對(duì)此等小鼠每周進(jìn)行檢測(cè)兩次。如圖5A所示，小鼠是以免疫原進(jìn)行疫苗接種，然后使用TC-I腫瘤細(xì)胞攻毒。待以rlipo-E7m疫苗接種，100%的小鼠在腫瘤接種后歷經(jīng)60天仍保持無腫瘤產(chǎn)生，而這些注射以PBS的小鼠于20天內(nèi)即發(fā)展出腫瘤，且67%的小鼠在以rE7m疫苗接種后有發(fā)展出腫瘤。 圖5B證明，于注射以腫瘤細(xì)胞的小鼠在投藥予免疫原之前，rlipo-E7m仍顯示具有較其非脂質(zhì)化對(duì)應(yīng)物(rE7m)更為優(yōu)良的功效。特別是，83%接受rlipo-E7m的小鼠仍保持無腫瘤產(chǎn)生，而所有注射以PBS的小鼠在20天內(nèi)皆發(fā)展出腫瘤，且僅有18%接受rE7m的小鼠仍保持無腫瘤產(chǎn)生。此等結(jié)果證明，于該二種小鼠模式中，去活化-E7的功效在其呈現(xiàn)脂質(zhì)化形式時(shí)有顯著被增加。經(jīng)rlipo-E7m疫苗接種的小鼠，當(dāng)相較于以rE7m疫苗接種的小鼠，可提供顯著的對(duì)抗TC-I細(xì)胞攻毒的保護(hù)作用。
其他具體態(tài)樣
本說明書中所揭示的全部特征可以任何組合方式組合。本說明書中所揭示的各別特征可由依相同、相等或類似目的的替代特征取代。因此，除非另行清楚地指示，所揭示的各特征僅為一系列同等物或類似特征的實(shí)例。前述的說明已描述本發(fā)明的許多較佳實(shí)施例。習(xí)于該項(xiàng)技藝人士應(yīng)了解，在未偏離本發(fā)明的精神及范圍下可進(jìn)行各種改變與修飾，以使其適于各種不同用途與狀況。因此，于申請(qǐng)專利范圍內(nèi)也包含其他具體態(tài)樣。
權(quán)利要求
1.一種單離的多肽，其特征在于，具有SEQ ID NO :2的序列。
2.一種單離的核酸，其特征在于，包含編碼權(quán)利要求1所述的多肽的序列，或其互補(bǔ)序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的核酸，其特征在于，核酸含有SEQID N0:13的序列。
4.一種表現(xiàn)載體，其特征在于，包含權(quán)利要求2所述的核酸。
5.一種宿主細(xì)胞，其特征在于，包含權(quán)利要求2所述的核酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，為大腸桿菌。
7.一種免疫原組成物，其特征在于，包含權(quán)利要求1所述的多肽。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的免疫原組成物，其特征在于，該組成物進(jìn)一步包含醫(yī)藥上可接受的佐劑。
9.一種于個(gè)體中誘發(fā)對(duì)抗人類乳頭狀瘤病毒(HPV)的免疫反應(yīng)的方法，其特征在于， 包含將有效量的含有權(quán)利要求1所述的多肽的組成物投藥予有其需要的個(gè)體。
10.一種制造多肽的方法，其特征在于，包含將包含權(quán)利要求2所述的核酸的宿主細(xì)胞培養(yǎng)于允許由該核酸編碼的多肽表現(xiàn)的條件下，及將該多肽自所培養(yǎng)的細(xì)胞或培養(yǎng)基純化出。
11.一種單離的融合蛋白質(zhì)，其特征在于，包含具有脂質(zhì)化序列的第一片段，及具有腫瘤相關(guān)抗原序列的第二片段，其中于該融合蛋白質(zhì)中該第一片段是位于該第二片段的N-端。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的融合蛋白質(zhì)，其特征在于，該融合蛋白質(zhì)為脂質(zhì)化。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的融合蛋白質(zhì)，其特征在于，該脂質(zhì)化序列包括SEQID NO 12的序列。
14.根據(jù)權(quán)利要求11所述的融合蛋白質(zhì)，其特征在于，該腫瘤相關(guān)抗原可為衍生自一種與人類慢性疾病或癌癥關(guān)連的病毒的病毒抗原。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的融合蛋白質(zhì)，其特征在于，該病毒抗原是衍生自選自由人類皰疹病毒第四型(EBV)、人類乳頭狀瘤病毒(HPV)、C型肝炎病毒(HCV)、B型肝炎病毒 (HBV)與巨細(xì)胞病毒(CMV)所成的組群的病毒。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的融合蛋白質(zhì)，其特征在于，該病毒抗原是選自由為去活化 HPV致癌蛋白E5、E6與E7所成的組群。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的融合蛋白質(zhì)，其特征在于，該病毒抗原為去活化HPV16 E7 致癌蛋白。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的融合蛋白質(zhì)，其特征在于，該病毒抗原含有SEQID N0:1或 2的序列。
19.一種單離的核酸，其特征在于，包含編碼權(quán)利要求11所述的融合蛋白質(zhì)的序列，或其互補(bǔ)序列。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的核酸，其特征在于，核酸含有SEQID NO 15的序列。
21.一種表現(xiàn)載體，其特征在于，包含權(quán)利要求19所述的核酸。
22.—種宿主細(xì)胞，其特征在于，包含權(quán)利要求19所述的核酸。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，為大腸桿菌。
24.一種免疫原組成物，其特征在于，包含權(quán)利要求11所述的融合蛋白質(zhì)。
25.根據(jù)權(quán)利要求23所述的免疫原組成物，其特征在于，該組成物進(jìn)一步包含醫(yī)藥上可接受的佐劑。
26.一種于個(gè)體中誘發(fā)對(duì)抗腫瘤相關(guān)抗原的免疫反應(yīng)的方法，其特征在于，包含將有效量的含有權(quán)利要求11所述的融合蛋白質(zhì)的組成物投藥予有其需要的個(gè)體。
27.根據(jù)權(quán)利要求沈所述的方法，其特征在于，該腫瘤相關(guān)抗原為去活化HPV16 E7致癌蛋白。
28.—種制造融合蛋白質(zhì)的方法，其特征在于，包含將包含權(quán)利要求19所述的核酸的宿主細(xì)胞培養(yǎng)于允許由該核酸編碼的融合蛋白質(zhì)表現(xiàn)的條件下，及將該融合蛋白質(zhì)自所培養(yǎng)細(xì)胞或培養(yǎng)基純化出。
全文摘要
本發(fā)明揭示了一種新穎多肽及融合蛋白質(zhì)，所述融合蛋白質(zhì)包含具有脂質(zhì)化序列的第一片段，及具有腫瘤相關(guān)抗原序列的第二片段。該融合蛋白質(zhì)可被脂質(zhì)化并表現(xiàn)于細(xì)菌細(xì)胞中。一旦經(jīng)投藥予個(gè)體后，所述融合蛋白質(zhì)可誘發(fā)對(duì)抗癌癥的免疫反應(yīng)。
文檔編號(hào)A61K39/12GK102482327SQ201080027969
公開日2012年5月30日 申請(qǐng)日期2010年6月22日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月22日
發(fā)明者冷治湘, 劉士任, 莊再成, 陳信偉 申請(qǐng)人:財(cái)團(tuán)法人衛(wèi)生研究院