專利名稱：治療炎癥性關(guān)節(jié)炎的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
當(dāng)前的公開(kāi)一般地涉及利用三氧化二砷治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和其他炎癥性關(guān)節(jié)炎的方法的領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)是與全身的炎癥性表現(xiàn)相關(guān)的自體免疫性關(guān)節(jié)病。在RA中，滑膜關(guān)節(jié)的內(nèi)襯，滑膜是異常的。存在著急性炎性細(xì)胞在滑膜中的浸潤(rùn)，其經(jīng)歷過(guò)度生長(zhǎng)，引起關(guān)節(jié)的滲漏。增生的滑膜還可能導(dǎo)致鄰近的軟骨和骨的侵蝕，引起關(guān)節(jié)破壞。最終結(jié)果是關(guān)節(jié)炎癥、滲漏、關(guān)節(jié)和鄰近韌帶的破壞、關(guān)節(jié)變形以及最后功能的損失。RA是最常見(jiàn)的炎癥性關(guān)節(jié)疾病，在世界上影響了基本上所有的群體。它是嚴(yán)重的世界范圍的健康難題。傳統(tǒng)的RA治療集中于使用抗炎性藥物來(lái)抑制關(guān)節(jié)炎癥和細(xì)胞因子的產(chǎn)生。免疫調(diào)節(jié)藥物也可能是有效的，包括免疫抑制藥物，例如皮質(zhì)類固醇、甲氨蝶呤和環(huán)孢霉素 (Tarner, et al. , Nat. Clin. Pract. Rheumatol. , 3:336-45 (2007))。也可以使用其他疾病調(diào)修藥物，包括青霉胺和金。RA的病理是復(fù)雜的，沒(méi)有被完全確定。然而，許多細(xì)胞因子，包括白細(xì)胞介素 (IL)-6、IL-15、IL-17和腫瘤壞死因子已經(jīng)與引起關(guān)節(jié)和全身性炎癥相聯(lián)系(Tarner，et al. , Nat. Clin. Pract. Rheumatol. , 3:336-45 (2007))。涉及 RA 病理的細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑包括腫瘤壞死因子α (TNF-α )途徑、分裂素活化的蛋白激酶(MAPK)途徑、Janus 激酶(JAK)途徑、以及轉(zhuǎn)錄作用的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)物和激活物(STAT)途徑。TNF-α途徑的重要的下游分子是轉(zhuǎn)錄因子核因子kappa B (NFkB)0這些途徑在RA特征性的滑膜增殖以及隨后的關(guān)節(jié)破壞中起到重要的作用。(Tarner, et al.，Nat. Clin. Pract. Rheumatol., 3:336-45 (2007))。近來(lái)，還已經(jīng)顯示的是滑膜在關(guān)節(jié)炎癥中起到活躍作用。成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞是滑膜的最重要的細(xì)胞成分?；ぜ?xì)胞是RA中觀察到的炎癥的起始和增殖所必需的，調(diào)節(jié)軟骨破壞以及急性和慢性炎癥(Lipsky，N. Engl. J. Med. , ；356:對(duì)19-20 (2007))?；ぜ?xì)胞的重要性由以下發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步顯示，其中功能性滑膜有缺陷的小鼠模型對(duì)實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎有抗個(gè)生(Amano， et al. , Genes Dev. , 172436-49 (2003) ；Lee, et al. , Science, 315:1006-10 (2007))。推測(cè)地涉及RA病理的兩個(gè)關(guān)鍵途徑的靶向顯示了這可能是潛在的治療策略 (Choy, et al.，N. Engl. J. Med. , 344:907-16(2001))。用英夫利昔單抗(infliximab)， 一種針對(duì)TNF-α的嵌合單克隆抗體治療，引起了關(guān)節(jié)炎癥的顯著改善，停止了關(guān)節(jié)破壞的發(fā)展(Lisky, et al. , N. Engl. J. Med. , 343:1594-602(2000))。用 tocilizumab，一種針對(duì)IL-6受體(IL-6R)的抗體治療，引起了 RA患者中癥狀的顯著的控制(Smolen，et al., Lancet, 371:987-97 (2008))。然而，英夫利昔單抗的使用已經(jīng)與肺結(jié)核(Keane，et al. , N. Engl. J. Med., 345:1098-104(2001))和其他機(jī)會(huì)性感染包括卡氏肺囊蟲(chóng)病(Harigai，et al.，N. Engl. J. Med. , 357:1874-6 (2007))以及腦弓形體病(Young, et al.，N. Engl. J. Med.,；353:1530-1(2005))相關(guān)聯(lián)。tocilizumab治療的患者碰巧也具有嚴(yán)重的感染(Nishimoto， et al., Ann. Rheum Dis. , (2008))。這些藥物也是昂貴的。此外，由于它們是靜脈內(nèi)地給予的，它們對(duì)于患者是昂貴的和麻煩的。因此，本發(fā)明的目的是提供用于抑制類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中滑膜細(xì)胞的生長(zhǎng)和活性的組合物和方法。由于滑膜細(xì)胞還在其他炎癥性關(guān)節(jié)炎中起到重要的致病作用，本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供用于抑制其他炎癥性關(guān)節(jié)炎中滑膜細(xì)胞的生長(zhǎng)和活性的組合物和方法。本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供用于治療炎癥性關(guān)節(jié)炎的組合物和方法。發(fā)明概述
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的是，As2O3降低與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)的滑膜細(xì)胞的生長(zhǎng)。通過(guò)將gpl30靶向溶酶體中破壞，As2O3引起gpl30水平的降低，gpl30是IL-6受體復(fù)合物的成分，從而破壞滑膜細(xì)胞中自分泌IL-6環(huán)路。提供了使用Ai^2O3抑制或降低滑膜細(xì)胞生長(zhǎng)的方法。還提供的是使用含有As2O3的組合物治療或預(yù)防類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和其他炎癥性關(guān)節(jié)炎的一種或更多種癥狀的方法。具體地，當(dāng)前的應(yīng)用提供了以下的實(shí)施方式
實(shí)施方式1. 一種治療或預(yù)防類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和其他炎癥性關(guān)節(jié)炎的一種或更多種癥狀的方法，包括向需要它的受試者以有效量施用包含三氧化二砷的組合物，來(lái)降低或治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的一種或更多種癥狀。實(shí)施方式2. —種降低或抑制滑膜細(xì)胞的增殖或促進(jìn)滑膜細(xì)胞的細(xì)胞凋亡的方法，包括使滑膜細(xì)胞與有效地降低或抑制它們的增殖或促進(jìn)它們的細(xì)胞凋亡的量的三氧化二砷接觸。實(shí)施方式3. —種降低細(xì)胞中IL-6受體的細(xì)胞表面表達(dá)的方法，包括使所述細(xì)胞與通過(guò)將IL-6受體靶向溶酶體而有效地促進(jìn)IL-6受體降解的量的三氧化二砷接觸。實(shí)施方式4.實(shí)施方式3的方法，其中所述IL-6受體在滑膜細(xì)胞中表達(dá)。實(shí)施方式5.實(shí)施方式2或4的方法，其中所述滑膜細(xì)胞處在患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的患者中。
患者中
實(shí)施方式6.實(shí)施方式2或4的方法，其中所述滑膜細(xì)胞處在患有炎癥性關(guān)節(jié)炎的
實(shí)施方式7.實(shí)施方式5的方法，其中所述三氧化二砷口服地施用給所述患者。 實(shí)施方式8.實(shí)施方式5的方法，其中所述三氧化二砷向滑膜關(guān)節(jié)局部地施用。 實(shí)施方式9.實(shí)施方式1的方法，進(jìn)一步包括施用留族的或非留族的抗炎癥試劑。 實(shí)施方式10. —種用于治療受試者中類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或其他炎癥性關(guān)節(jié)炎的一種或更多種癥狀的藥物組合物，包括抑制滑膜細(xì)胞的增殖或促進(jìn)滑膜細(xì)胞的細(xì)胞凋亡有效量的三氧化二砷，以及任選地，藥學(xué)上可接受的賦形劑。實(shí)施方式11.實(shí)施方式10的藥物組合物，其中所述三氧化二砷處于用于口服施用的藥學(xué)上可接受的載體中。實(shí)施方式12.實(shí)施方式10的藥物組合物，其中所述三氧化二砷處于用于向滑膜關(guān)節(jié)局部施用的藥學(xué)上可接受的載體中。實(shí)施方式13.實(shí)施方式10-12的任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述三氧化二砷以1 到10 mg的量存在。
實(shí)施方式14.實(shí)施方式13的藥物組合物，其中所述三氧化二砷以5到10 mg的量存在。實(shí)施方式15.實(shí)施方式10的藥物組合物，處于用于口服施用的單位劑型中，其中所述單位劑型選自由溶液、懸浮液、乳劑、糖漿、片劑和膠囊構(gòu)成的組。實(shí)施方式16.三氧化二砷在制備用于治療或預(yù)防類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和其他炎癥性關(guān)節(jié)炎的一種或更多種癥狀的藥物中的用途。實(shí)施方式17.三氧化二砷在制備用于降低或抑制滑膜細(xì)胞的增殖或促進(jìn)滑膜細(xì)胞的細(xì)胞凋亡的藥物中的用途。實(shí)施方式18.三氧化二砷在制備用于降低細(xì)胞中IL-6受體的細(xì)胞表面表達(dá)的藥物中的用途。實(shí)施方式19.實(shí)施方式18的用途，其中所述IL-6受體在滑膜細(xì)胞中表達(dá)。實(shí)施方式20.實(shí)施方式17或19的用途，其中所述滑膜細(xì)胞處在患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的患者中。附圖的簡(jiǎn)要描述
附圖IA是線形圖，顯示了通過(guò)MTT分析評(píng)估的，當(dāng)處理M (-·-),48 (-▲-)或72 (-■“)小時(shí)時(shí)，濃度提高的三氧化二砷(As2O3)對(duì)MH7A細(xì)胞的生長(zhǎng)的作用。數(shù)據(jù)表示為細(xì)胞生存力(％)作為As2O3濃度(μ M)的函數(shù)。誤差線代表平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM) (η=3) (# = Ρ<0· 001)。附圖IB是柱形圖，顯示了不存在或存在5 μΜ As2O3的情況下細(xì)胞凋亡的百分比， 在碘化丙錠(PI)和膜聯(lián)蛋白-V染色之后ΜΗ7Α細(xì)胞的FACS分析所測(cè)定的。附圖IC是線形圖，顯示了存在(-·-)或不存在(-■ -) pan-胱天蛋白酶 (pan-caspase)抑制物Z-VAD-FMK (25 μ M)的情況下，以及在存在濃度提高的As2O3的情況下72小時(shí)ΜΗ7Α細(xì)胞的生存力，通過(guò)MTT分析評(píng)估的。數(shù)據(jù)表示為細(xì)胞生存力(％)作為 As2O3濃度(μ Μ)的函數(shù)。誤差線代表平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM) (n=3) = Ρ<0.01)。附圖2Α是柱形圖，顯示了在存在濃度提高的IL-6的情況下72小時(shí)ΜΗ7Α細(xì)胞的生存力，通過(guò)MTT分析評(píng)估的。數(shù)據(jù)表示為細(xì)胞生存力(％)作為IL-6濃度(ng/ml)的函數(shù)。 誤差線代表平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM) (n=3)。附圖2B是柱形圖，顯示了在存在濃度提高的抗-IL-6 Ab的情況下6天MH7A細(xì)胞的生存力，通過(guò)MTT分析評(píng)估的。數(shù)據(jù)表示為細(xì)胞生存力(％)作為抗-IL-6 Ab濃度(yg/ ml)的函數(shù)。誤差線代表平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM) (n=3) = P<0.001)。附圖2C是線形圖，顯示了當(dāng)處理M小時(shí)時(shí)濃度提高的As2O3對(duì)gpl30表達(dá)的作用，通過(guò)Wfestern印跡評(píng)估的。數(shù)據(jù)表示為gpl30表達(dá)(％)作為As2O3濃度(μ M)的函數(shù)。 誤差線代表平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM) (n=3) (# = Ρ<0. 001 ；** = Ρ<0.01)。附圖2D是線形圖，顯示了當(dāng)處理0、3、6、12或M小時(shí)時(shí)5 μ M的Aii2O3對(duì)gpl30 表達(dá)的作用，通過(guò)Western印跡評(píng)估的。數(shù)據(jù)表示為gpl30表達(dá)(％)作為時(shí)間(小時(shí))的函數(shù)。誤差線代表平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM) (n=3) (** = P<0.01)。附圖2E是柱形圖，顯示了當(dāng)處理0、3、6、12或?qū)πr(shí)時(shí)，5 μ M Aii2O3對(duì)gpl30的表達(dá)的作用，通過(guò)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Q-PCR)評(píng)估的。誤差線代表平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM) (n=3)。
附圖3A是柱形圖，顯示了溶酶體抑制物NH4C1 (2. 5 mM)對(duì)5 μ M As2O3的gpl30 表達(dá)抑制的作用。誤差線代表平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM) (n=3) (* = P<0.05)。附:3B是線形圖，顯示了在用100 μΜ As2O3處理0、4或6小時(shí)之后從MH7A細(xì)胞免疫沉淀(IP)的gpl30的水平。針對(duì)gpl30的抗體用于總細(xì)胞溶胞產(chǎn)物的免疫沉淀(IP)，隨后是用抗遍在蛋白抗體πα和的Wfestern印跡分析。使用非免疫性兔血清(NIS)的IP 充當(dāng)對(duì)照。As2O3-誘導(dǎo)的gpl30遍在化由Π(2顯示，F(xiàn)K2識(shí)別單體和聚合的遍在化的蛋白質(zhì)，πα沒(méi)有顯示，πα識(shí)別聚合的遍在化的蛋白質(zhì)。誤差線代表平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM) (n=3) (* = Ρ<0. 05 ；# = P<0.001)。附圖4A是線形圖，顯示了當(dāng)用5 μΜ的Ai^2O3處理MH7A細(xì)胞0、3、6、12或?qū)πr(shí)后JNK的磷酸化，通過(guò)Wfestern印跡測(cè)定的。值代表平均信號(hào)密度士SEM (n = 3) (* = Ρ<0. 05 ；** = Ρ<0. 01)。附圖4Β是柱形圖，顯示了在存在或缺少JNK抑制物SP600125 (30 μ Μ)的情況下和在存在0、30或100 μ M As2O3的情況下超過(guò)M小時(shí)ΜΗ7Α細(xì)胞的生存力，通過(guò)MTT分析評(píng)估的。數(shù)據(jù)表示為細(xì)胞生存力(％)。誤差線代表平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM) (η=3) (** = Ρ<0·01)。附圖5Α是柱形圖，顯示了溶酶體抑制物NH4C1 (2. 5 mM)對(duì)5 μ M As2O3的JNK磷酸化的活化的作用。誤差線代表平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM) (n=3) (* = Ρ<0.05)。附圖5Β是線形圖，顯示了 ΜΗ7Α細(xì)胞用0. 5 μ g/ml抗_IL_6 Ab處理M小時(shí)對(duì) JNK的磷酸化的影響，通過(guò)Wfestern印跡測(cè)定的。誤差線代表使用Dunnett，s post-tests 的單向 ANOVA (η=3) (* = Ρ<0· 05)。附圖5C是柱形圖，顯示了 JNK抑制物SP600125 (30 μ M)對(duì)5 PMAs2O3的絲氨酸-46上ρ53的磷酸化的影響，通過(guò)Wfestern印跡測(cè)定的。誤差線代表使用Durmett，s post-tests 的單向 ANOVA (n=3) (* = Ρ<0· 05)。附圖6Α是線形圖，顯示了當(dāng)處理M小時(shí)時(shí)濃度提高的As2O3對(duì)NF κ B表達(dá)的作用，通過(guò)Wfestern印跡評(píng)估的。數(shù)據(jù)表示為作為As2O3濃度(μ Μ)的函數(shù)的NF κ B表達(dá)(％)。 誤差線代表平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM) (n=3) (# = Ρ<0. 001 ；** = Ρ<0.01)。附圖6Β是線形圖，顯示了當(dāng)處理0、6、12或?qū)πr(shí)時(shí)，5 μ M Aii2O3對(duì)NF κ B的表達(dá)的影響，通過(guò)Western印跡評(píng)估的。數(shù)據(jù)表示為作為時(shí)間(小時(shí))的函數(shù)的NF κ B表達(dá)(％)。 誤差線代表平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM) (n=3) (# = Ρ<0. 001 ；** = Ρ<0.01)。發(fā)明的詳細(xì)說(shuō)明
I.包含三氧化二砷的組合物 Α.三氧化二砷
三氧化二砷在急性骨髓性白血病的難治的早幼粒細(xì)胞(Μ3)亞型的治療中是非常有用的?？诜趸?As2O3)對(duì)于復(fù)發(fā)的急性早幼粒細(xì)胞白血病是高度有效的。(Au，et al. , Blood, 112:3587-90 (2008)) 口服As2O3引起QT間隔時(shí)間的較少的延長(zhǎng)，因而是治療白血病的安全得多的藥物。近來(lái)，還展現(xiàn)了的是，口服As2O3產(chǎn)生心臟中最小的QT延長(zhǎng)， 意味著對(duì)于延長(zhǎng)的使用它是安全的(Siu，et al. , Blood, 108:103-6 (2006))。B.組合物
以下遞送系統(tǒng)是用于施用As2O3的組合物的代表。
1.胃腸外的組合物
可注射的藥物遞送系統(tǒng)包括藥學(xué)上可接受的溶液、懸浮液、凝膠、微球體和植入物。一般地，這些將是蒸餾水、磷酸鹽緩沖鹽水或用于靜脈內(nèi)或皮下注射的其他載體的形式。2.腸內(nèi)的組合物
口服遞送系統(tǒng)包括溶液、懸浮液和固體劑型，例如片劑(例如，壓制片齊U、糖包被的片劑、膜包被的片劑和腸溶包被的片劑)、膠囊劑(例如，硬或軟的明膠或非明膠膠囊)、發(fā)泡藥和扁囊劑。這些可以含有賦形劑，例如粘合劑(例如，羥丙基甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、 其他纖維素材料和淀粉)、稀釋劑(例如，乳糖和其他糖類、淀粉、磷酸二鈣和纖維素材料)、 崩解劑(例如，淀粉聚合物和纖維素材料)以及潤(rùn)滑劑(例如，硬脂酸酯和滑石粉)。固體劑型可以使用本領(lǐng)域公知的包被物和技術(shù)來(lái)包被?？诜后w劑型包括溶液、糖漿、懸浮液、乳劑、酏劑(例如，水醇的溶液)以及用于可重建的遞送系統(tǒng)的粉劑。組合物可以含有一種或更多種載體或賦形劑，例如，懸浮劑(例如，膠、zanthans、纖維素塑料和糖類)、濕潤(rùn)劑(例如，山梨醇)、增溶劑(例如，乙醇、水、PEG、 甘油和丙二醇)、表面活性劑(例如，十二烷基硫酸鈉、Spans、TWEENs和十六烷基吡啶)、乳化劑、防腐劑、和抗氧化劑(例如，對(duì)羥苯甲酸、維生素E和C、以及抗壞血酸)、抗結(jié)塊試劑、包被試劑、螯合劑(例如，EDTA)、香味素、著色劑，以及其組合。3.外用(topical)組合物
穿粘膜的遞送系統(tǒng)包括貼片、片劑、栓劑、陰道栓劑、凝膠和乳膏劑，可以含有賦形劑例如增溶劑和增強(qiáng)劑(例如，丙二醇、膽汁鹽和氨基酸)以及其他載體(例如，聚乙二醇、脂肪酸酯和衍生物，以及親水性聚合物，例如羥丙基甲基纖維素和透明質(zhì)酸)。真皮的遞送系統(tǒng)包括，例如，水性和非水性的凝膠、乳膏劑、多重乳劑、微乳劑、脂質(zhì)體、軟膏劑、水性和非水性的溶液、洗液、氣霧劑、烴基質(zhì)和粉劑，可以含有賦形劑例如增溶劑、滲透增強(qiáng)劑(例如，脂肪酸、脂肪酸酯、脂肪醇和氨基酸)以及親水性聚合物(例如，聚卡波非和聚乙烯吡咯烷酮)。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述藥學(xué)上可接受的載體是脂質(zhì)體或穿表皮的增強(qiáng)劑。II.處理方法
A.類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的處理
包含As2O3的組合物以有效量施用給患有RA的個(gè)體來(lái)抑制或降低滑膜細(xì)胞的增殖、抑制或降低滑膜細(xì)胞中IL-6受體的細(xì)胞表面表達(dá)，或以有效量來(lái)處理或降低發(fā)生類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的一種或更多種癥狀的風(fēng)險(xiǎn)。包含As2O3的公開(kāi)的組合物可以治療性地或預(yù)防性地施用。包含As2O3的公開(kāi)的組合物的治療有效量是指有效延遲發(fā)展、加快癥狀緩解、誘導(dǎo)癥狀緩解、加強(qiáng)癥狀緩解、加快恢復(fù)、提高可選擇的治療劑的效力或降低對(duì)其的抗性或這些的組合的量。治療有效量可以是在降低癥狀的嚴(yán)重度、降低急性發(fā)作的嚴(yán)重度、減低癥狀的量、降低疾病相關(guān)癥狀的發(fā)生率、降低癥狀的潛伏期、改善癥狀、降低次級(jí)癥狀、降低次級(jí)感染、延長(zhǎng)患者存活、或這些的組合方面有效的。包含As2O3的組合物的預(yù)防有效量是指延遲癥狀的發(fā)作、阻止疾病的復(fù)發(fā)、降低復(fù)發(fā)發(fā)作的量或頻率、提高癥狀發(fā)作之間的潛伏期、或它們的組合的有效量。以下的實(shí)施例使用MH7A作為RA滑膜的模型，因?yàn)镸H7A保持了成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞的大部分生物學(xué)性質(zhì)，包括表面免疫表型和對(duì)細(xì)胞因子的應(yīng)答(MiyazawEi，et al., J. Biochem. , 124:1153-62( 1998))。MH7A細(xì)胞的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因表達(dá)模式也類似于原代 RA 滑膜細(xì)胞(Kitano, et al.，Arthritis Rheum. , 54:742-53 (2006))。使用這個(gè)模型，發(fā)現(xiàn)的是，As2O3對(duì)抑制類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生中涉及的成纖維細(xì)胞滑膜細(xì)胞的增殖是有效的。以下的實(shí)施例也展現(xiàn)了，通過(guò)IL-6和IL-6受體兩者的表達(dá)所顯示的，在MH7A細(xì)胞中自分泌IL-6循環(huán)起作用，以及IL-6中和顯著地抑制MH7A細(xì)胞增殖。IL-6通過(guò)與IL-6 受體復(fù)合物結(jié)合來(lái)發(fā)出信號(hào)，IL-6受體復(fù)合物包含80-kDa的IL-6結(jié)合蛋白(IL-6受體 α)禾Π 130 kDa 的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)物 gpl30 (Naka and Kishimoto, Arthritis Res. , 4:154-6 (2002))。實(shí)施例還展現(xiàn)了，通過(guò)IL-6和IL-6受體兩者的表達(dá)所顯示的，在MH7A細(xì)胞中自分泌IL-6循環(huán)起作用，以及IL-6中和顯著地抑制MH7A細(xì)胞增殖。IL-6通過(guò)與IL-6受體復(fù)合物結(jié)合來(lái)發(fā)出信號(hào)，IL-6受體復(fù)合物包含80-kDa的IL-6結(jié)合蛋白(IL-6受體α )和130 kDa 的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)物 gpl30 (Naka and Kishimoto, Arthritis Res. , 4:154-6 (2002))。實(shí)施例展現(xiàn)了，As2O3處理引起轉(zhuǎn)錄后gpl30細(xì)胞表面表達(dá)的時(shí)間和劑量依賴性的降低。通過(guò)使用特異性抑制物，實(shí)施例顯示了，As2O3介導(dǎo)的gpl30降低受到溶酶體的調(diào)節(jié)，不受蛋白酶體或胱天蛋白酶系統(tǒng)的調(diào)節(jié)。實(shí)施例還顯示了，gpl30降解由單-遍在化所啟動(dòng)，單-遍在化是一種提供生物信號(hào)的過(guò)程，引起對(duì)于溶酶體中的降解的受體分選(Marmor and Yarden, Oncogene, 23:2057-70 (2004))。B.施用方法
包含As2O3的組合物可以在與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)的癥狀開(kāi)始之前、期間或之后施用。 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的任何可接受的方法可以用于向受試者施用所公開(kāi)的包含As2O3 的組合物。施用可以是局部的(localized)(即，向特定的區(qū)域、生理學(xué)系統(tǒng)、組織、器官或細(xì)胞類型)或全身性的。包含As2O3的組合物可以通過(guò)不同的途徑，例如，口服、胃腸外和外用的途徑來(lái)施用。包含As2O3的組合物還可以直接向關(guān)節(jié)，特別是滑膜關(guān)節(jié)施用。選擇的特定施用途徑將取決于一些因素，例如，特定的組合物、要治療的受試者的狀態(tài)的嚴(yán)重度，以及誘導(dǎo)有效的免疫反應(yīng)所需的劑量。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，包含As2O3的組合物口服地施用。 As2O3的實(shí)際口服劑量從約0. 5 mg到約1到10 mg，一般地約5到10 mg，取決于年齡，如果受試者和他們的腎臟有功能。As2O3通過(guò)腎臟分泌，因而必需根據(jù)腎臟的功能調(diào)整As2O3劑量，當(dāng)患者的腎臟功能受損時(shí)降低劑量。包含As2O3的組合物的有效水平理想地可以在單次施用之后獲得。在某些情況下， 有益地是施用兩次或更多次劑量的包含As2O3的組合物。C.組合治療
包含As2O3的組合物可以單獨(dú)地或與一種或更多種其他治療或預(yù)防試劑組合地施用， 或可以與外科的、放射的或其他療法組合以實(shí)現(xiàn)處理。例如，包含As2O3的組合物可以與一種或更多種抗炎癥試劑組合施用?？寡装Y試劑可以是非留族的、留族的，或其組合。非留族抗炎癥試劑的代表性的實(shí)施例包括，無(wú)限制地，昔康類，例如，吡羅昔康、伊索昔康、替諾昔康、舒多昔康；水楊酸類，例如，阿司匹林、disalcid、撲炎痛、曲利塞特、safapryn、solprin、二氟尼柳和芬度柳；乙酸衍生物，例如，雙氯芬酸、芬氯酸、吲哚美辛、舒林酸、托美汀、伊索克酸、呋羅芬酸、硫平酸、 齊多美辛、阿西美辛、芬替酸、佐美酸、clindanac、奧昔平酸、聯(lián)苯乙酸和酮咯酸；芬那酯類， 例如，甲芬那酸、甲氯芬那酸、氟芬那酸、尼氟酸和托芬那酸；丙酸衍生物，例如，布洛芬、萘普生、苯琦洛芬、氟比洛芬、酮洛芬、非諾洛芬、芬布芬、indopropfen、吡洛芬、卡洛芬、奧沙普秦、普拉洛芬、咪洛芬、硫琦洛芬、舒洛芬、阿明洛芬和tiaprofenic ；吡唑類，，例如，保泰松、羥布宗、非普拉宗、阿扎丙宗和三甲保泰松。也可以采用這些非甾族抗炎癥試劑的混合物。留族抗炎性藥物的代表性的實(shí)例包括，無(wú)限制地，皮質(zhì)類固醇類，例如氫化可的松、羥基-曲安西龍、α -甲基地塞米松、磷酸地塞米松、二丙酸氯地米松、戊酸氯倍他索、地奈德、去氧米松、醋酸去氧皮質(zhì)酮、地塞米松、二氯松、雙醋酸二氟拉松、戊酸二氟可龍、fluadrenolone、氟氯奈德、氟氫可的松、戊酸氟米松特、fluosinolone丙酮化合物、氟新諾龍酯、flucortine butylesters、氟可龍、乙酸氟潑尼定(氟潑尼立定)、氟氫縮松、哈西奈德、醋酸氫化可的松、丁酸氫化可的松、甲潑尼龍、曲安奈德、可的松、可托多松、flucetonide、氟氫可的松、雙醋酸difluorosone、fluradrenolone、氟氫可的松、 雙醋酸diflurosone、fluradrenolone丙酮化合物、甲羥松、amcinafel、安西非特、倍他米松和其酯的平衡物、氯潑尼松、乙酸氯潑尼松、clocortelone, clescinolone、二氯松、 diflurprednate、氟氯奈德、氟尼縮松、氟米龍、氟培龍、氟潑尼龍、戊酸氫化可的松、環(huán)戊基丙酸氫化可的松、氫可他酯、甲潑尼松、帕拉米松、潑尼松龍、潑尼松、二丙酸氯地米松、曲安西龍和其混合物。
實(shí)施例實(shí)施例1. As2O3的MH7A細(xì)胞增殖抑制作用材料和方法
成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞MH7A細(xì)胞系
MH7A 購(gòu)自 Riken BioResource Center (Tsukuba, Japan)。細(xì)胞在 37°C、5 % C02 下維持在補(bǔ)充有10%熱滅活的胎兒牛血清(FBS Jnvitrogen)的RPMI1640 (Invitrogen， Carlsbad，CA，USA)中。試劑和抗體
試劑包括 As2O3 和二甲基亞砜(DMSO) (Sigma, St. Louis, M0，USA)、氯化銨(NH4C1) (Amresco, Solon, OH, USA)、蛋白酶體抑制物MG115、pan_胱天蛋白酶抑制物Z-VAD-FMK、 JNK抑制物SP600125和它的陰性對(duì)照(Merck, Darmtadt, Germany)和重組人類IL-6 (Peprotech, Rocky Hill, NJ, USA)。初級(jí)抗體包括兔抗 IL-6 受體 α (IL_6Ra)和 gpl30 (C-20)抗體(Santa-Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA , USA)、兔-IL-6 抗體(Merck)、兔抗-磷酸化的JNK (Thr187Tyr185)、抗-胱天蛋白酶3、抗-β -肌動(dòng)蛋白和抗 NFkB 抗體(Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA)，以及小鼠抗-遍在蛋白抗體和Π(2 (Biomol, Plymouth Meeting, PA, USA)。次級(jí)抗體包括辣根過(guò)氧化物軛合的山羊抗-兔IgG和兔抗-小鼠IgG (Invitrogen)0MTT 分析通過(guò)MTT分析評(píng)估細(xì)胞增殖(GE Healthcare, Piscataway, NJ, USAXCheung et al.， Cancer Lett., 246:122-8(2007))。細(xì)胞(96孔平板中2 X IO4個(gè)細(xì)胞/反應(yīng)孔)孵育過(guò)夜， 之后用對(duì)照或試劑處理2-6天。處理的細(xì)胞然后與MTT標(biāo)記溶液(10 yL/反應(yīng)孔)孵育。 在4小時(shí)孵育之后，裂解細(xì)胞，在37°C下formazan晶體溶解過(guò)夜。在570 nm ( μ -quant 微板光譜儀，Bio-Tek Instruments Inc. , VT, USA)檢測(cè)R)rmazean信號(hào)。獲得的數(shù)據(jù)通過(guò) KC junior 軟件(BLD Science, Garner, NC, USA)分析。Western 印跡分析
進(jìn)行 Western 印跡分析(Pang et al. , Gastroenterology, 132:1088-103 (2007))。 細(xì)胞裂解和蛋白質(zhì)采集根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案進(jìn)行。蛋白質(zhì)樣品(一般30 μ g)通過(guò)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)在1 分辨凝膠中分離，電轉(zhuǎn)移到硝化纖維膜上 (400 mA 2小時(shí))。在用含有5%無(wú)脂奶的Tris-緩沖鹽水-TWEEN (TBS-T)在室溫下阻斷 30分鐘之后，膜與初級(jí)抗體和具有5%牛血清白蛋白的TBS-T在4°C孵育過(guò)夜。膜然后用 TBS-T洗滌三次，在室溫下與1 2000辣根過(guò)氧化酶軛合的次級(jí)抗體(Amersham-Pharmacia Biotechnology, Piscataway, NJ, USA)孵育 1 小時(shí)。免疫反應(yīng)性條帶使用 SuperSignal West Pico化學(xué)發(fā)光底物(Pierce Chemical Co. , Rockford, IL, USA)用化學(xué)發(fā)光來(lái)檢測(cè)， 顯現(xiàn)在X射線底片上。條帶信號(hào)的密度定量使用ImageJ 1. 36b軟件(National Institutes of Health, USA)進(jìn)行。所有實(shí)驗(yàn)一式三份進(jìn)行。膜聯(lián)蛋白V細(xì)胞凋亡分析
對(duì)于細(xì)胞凋亡分析，ι χ IO6個(gè)細(xì)胞在 ο-cm平板中孵育過(guò)夜，之后用對(duì)照或試劑處理 24小時(shí)。細(xì)胞然后胰蛋白酶化，用冰冷的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌兩次，重懸浮在500 μ L結(jié)合緩沖液中，在冰上與FITC軛合的膜聯(lián)蛋白-V和碘化丙錠(PI) (Immunotech ； Fullerton, CA, USA)孵育10分鐘。細(xì)胞凋亡的細(xì)胞(膜聯(lián)蛋白-V-陽(yáng)性，PI-陰性)在合適的補(bǔ)色下通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)(Epics, Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA) —式三份地計(jì)數(shù)。數(shù)據(jù)分析通過(guò) WinMDI 2. 8 軟件(The Scripps Research Institute, La Jolla, CA, USA)進(jìn)行。結(jié)果:
As2O3誘導(dǎo)了 MH7A細(xì)胞的劑量和時(shí)間依賴性抑制作用(附

圖1A)，50%抑制濃度是約5 μ M0流式細(xì)胞計(jì)分析確認(rèn)了，細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用是由細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)所介導(dǎo)的。ΜΗ7Α細(xì)胞與As2O3 (5 μ Μ)孵育O-M小時(shí)，用碘化丙錠(PI)和膜聯(lián)蛋白-V染色以區(qū)分細(xì)胞凋亡的細(xì)胞和死亡的細(xì)胞。在代表性的分析中，13%的對(duì)照細(xì)胞是膜聯(lián)蛋白-V陽(yáng)性、碘化丙錠陰性的(細(xì)胞凋亡的)，2. 36%是膜聯(lián)蛋白-V陽(yáng)性、碘化丙錠陽(yáng)性的(死亡的)，而38. 2%的處理的細(xì)胞是膜聯(lián)蛋白-V陽(yáng)性、碘化丙錠陰性的(細(xì)胞凋亡的)，5. 76%是膜聯(lián)蛋白-V陽(yáng)性、碘化丙錠陽(yáng)性的(死亡的)。FACS分析的結(jié)果顯示了在As2O3處理之后細(xì)胞凋亡細(xì)胞的提高。Western印跡分析顯示了，As2O3誘導(dǎo)了胱天蛋白酶3的劑量和時(shí)間依賴性的活化。 胱天蛋白酶3被胱天蛋白酶抑制物Z-VAD-FMK (25 μ M)的抑制顯著地降低了，但是不能完全地改善As2O3的細(xì)胞毒性效應(yīng)(附圖1Β)。結(jié)果意味著，ΜΗ7Α中As2O3誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性同時(shí)涉及胱天蛋白酶依賴性和胱天蛋白酶獨(dú)立性的途徑。實(shí)施例2. IL-6中和抗體的ΜΗ7Α細(xì)胞增殖抑制作用材料和方法逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)總RNA使用TRIzol (Invitrogen)制備。進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄 PCR (RT-PCR) (Cheung, et al. , Cancer Lett. , 246:122-8 (2007))。根據(jù)廠家的說(shuō)明書(shū)，用Superscript III第一鏈合成系統(tǒng)(Invitrogen)逆轉(zhuǎn)錄RNA。反應(yīng)混合物含有 1.2 yL 的 cDNA、18 μ L 的 Platinum PCR Supermix Gnvitrogen)和 200 nM 每對(duì)引物。 對(duì)于每組引物，退火溫度和進(jìn)行的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)在下表中列出。
表1. RT-PCR的引物和條件。免疫印跡分析
用gpl30遍在化進(jìn)行免疫印跡分析。MH7A細(xì)胞與100 μ M As2O3孵育0、4或6小時(shí)。 針對(duì)gpl30的抗體用于總細(xì)胞溶胞產(chǎn)物的免疫沉淀(IP)，隨后是用抗遍在蛋白抗體HQ和 FK2的Western印跡分析。非免疫性兔血清(NIS)的IP充當(dāng)對(duì)照。定量的RT-PCR
根據(jù)廠家的說(shuō)明書(shū)，用Assays-on - Demand 基因表達(dá)系統(tǒng)(AssayID Hs00174360_ml, PE Biosystems, Foster City，CA, USA)進(jìn)行 GP130 的定量 RT-PCR (Q-PCR)。反應(yīng)混合物含有 2 μ L cDNAUO μ L TaqMan Universal PCR 主混合物、1 μ L Assay-on - demand 基因表達(dá)分析混合物和無(wú)RNase的水到體積20 μ L。用ABI Prism 7700序列檢測(cè)器(PE Biosystems)進(jìn)行Q-PCR。用50°C的起始設(shè)置啟動(dòng)熱循環(huán)2分鐘，隨后在95°C的首次變性步驟10分鐘，然后是95°C 15秒(變性)和60°C 1分鐘(退火和延伸) 的40個(gè)循環(huán)。GAPDH用作cDNA輸入的內(nèi)部對(duì)照物。對(duì)于GAPDH，用50°C 2分鐘的起始步驟進(jìn)行擴(kuò)增，首次變性步驟加熱到95°C 10分鐘，然后95°C 20秒(變性)和62°C 1分鐘(退火和延伸)的40個(gè)循環(huán)。實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增數(shù)據(jù)用ABI Prism 7700序列檢測(cè)器連續(xù)地采集和分析。針對(duì)內(nèi)部對(duì)照物標(biāo)準(zhǔn)化的、與對(duì)照校準(zhǔn)物的相對(duì)基因表達(dá)通過(guò)Δ ACt方法(ABI user bulletin number 2, PE Biosystem)計(jì)算(Cheung, et al. , Cancer Lett. , 246:122-8(2007))。所有實(shí)驗(yàn)一式三份進(jìn)行。結(jié)果
為了研究MH7A增殖是否可能是IL-6依賴性的，研究IL-6對(duì)細(xì)胞增殖的作用。外源的 IL-6不提高M(jìn)H7A細(xì)胞的增殖(附圖2A)。然后研究IL-6中和抗體對(duì)細(xì)胞增殖的作用。有趣地，結(jié)果表明，IL-6中和引起了 MH7A增殖的顯著的抑制(附圖2B)。As2O3-誘導(dǎo)的gpl30 遍在化由顯示，Π(2識(shí)別單體和聚合的遍在化的蛋白質(zhì)，πα沒(méi)有顯示，識(shí)別聚合的遍在化的蛋白質(zhì)。這些結(jié)果展現(xiàn)了，gpl30是單-遍在化的。半定量的逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)確認(rèn)了 IL-6基因在MH7A細(xì)胞中活躍地轉(zhuǎn)錄。這些結(jié)果表明，自分泌IL-6回路可能涉及MH7A的增殖。實(shí)施例3. As2O3轉(zhuǎn)錄后地減量調(diào)節(jié)IL-6受體復(fù)合物的gpl30 材料和方法
材料和方法是如上文的實(shí)施例1-3中描述的。結(jié)果
為了研究As2O3的抑制作用是否可以通過(guò)IL-6自分泌途徑的靶向來(lái)介導(dǎo)，首先研究了 As2O3對(duì)IL-6轉(zhuǎn)錄作用的影響。結(jié)果顯示，As2O3不影響IL-6基因轉(zhuǎn)錄作用。然后檢查了 As2O3對(duì)IL-6受體，包括兩種亞基IL-6受體α和gpl30的作用。Western印跡分析顯示了兩種亞基都表達(dá)。用As2O3處理引起gpl30的劑量和時(shí)間依賴性的降低，IL-6 α保持不變。 半定量的RT-PCR顯示了，IL-6受體α和gp130活躍地轉(zhuǎn)錄，用As2O3處理對(duì)于兩種基因的轉(zhuǎn)錄沒(méi)有影響。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這些結(jié)果，進(jìn)行了 GP130基因的實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。 結(jié)果確認(rèn)了，As2O3處理對(duì)于GP130基因轉(zhuǎn)錄作用沒(méi)有影響(附圖2E)。這些發(fā)現(xiàn)意味著，通過(guò)在轉(zhuǎn)錄后水平上減量調(diào)節(jié)IL-6受體復(fù)合物的gpl30成分，As2O3靶向MH7A中的IL-6信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。實(shí)施例4. As2O3通過(guò)溶酶體途徑誘導(dǎo)gpl30的降解材料和方法
材料和方法如上文實(shí)施例1-3描述的。結(jié)果
As2O3介導(dǎo)的gpl30轉(zhuǎn)錄后減量調(diào)節(jié)提示了 gpl30的降解可能被增強(qiáng)。為了解決這個(gè)問(wèn)題，檢查了三種蛋白質(zhì)降解途徑，溶酶體、蛋白酶體和胱天蛋白酶依賴性蛋白水解作用。 MH7A細(xì)胞與溶酶體抑制物2. 5 mM NH4C1的預(yù)孵育顯著地阻止了 gpl30的As2O3誘導(dǎo)的降低 (附圖3A)。另一方面，與蛋白酶體抑制物MG115 (10 μ M)和胱天蛋白酶抑制物Z-VAD-FMK (25 μ Μ)預(yù)孵育對(duì)As2O3誘導(dǎo)的gpl30降低沒(méi)有作用。這些發(fā)現(xiàn)表明，As2O3誘導(dǎo)的gpl30降低中涉及溶酶體降解。實(shí)施例5. As2O3誘導(dǎo)gpl30的遍在化材料和方法
免疫沉淀
通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行免疫沉淀(Pang et al.，Gastroenterology, 132:1088-103 (2007))。細(xì)胞用補(bǔ)充有1 mM原釩酸鈉和Complete蛋白酶抑制物混合物(Complete ；Roche Molecular Biochemicals)的冰冷的PBS洗滌，用緩沖液(50 mM Tris-HCl, pH 7.5，100 mM NaCl, 1% Triton X-100, 4 yg/mL抑肽酶，100 μ M苯甲基磺基氟化物，200 μ M原釩酸鈉，2 yg/mL亮抑酶肽，ImM 二硫蘇糖醇和IX Complete)在4°C裂解15分鐘。采集溶胞產(chǎn)物并離心。分析蛋白質(zhì)(Bio-Rad Protein Assay Kit, Philadelphia, PA, USA)，調(diào)節(jié)到1 μ g/ μ L (—般800到1000 μ g)。通過(guò)與合適的抗體(一般4 μ g)或?qū)φ辗敲庖咝匝逶?°C柔和搖動(dòng)過(guò)夜孵育蛋白質(zhì)樣品，預(yù)先形成免疫沉淀。抗體-蛋白質(zhì)復(fù)合物通過(guò)與 30 μ L 的 rec-Protein G SEPHAR0SE 珠子 Gnvitrogen)在 4°C柔和搖動(dòng)孵育 2 小時(shí)來(lái)沉淀。蛋白質(zhì)G珠子然后用500 μ L冰冷的裂解緩沖液洗滌3次。吸出上清液，添加50 yL的2Χ Laemmli緩沖液。通過(guò)在95°C加熱10分鐘從珠子釋放抗體-蛋白質(zhì)復(fù)合物。然后通過(guò)Western印跡一式三份地分析免疫沉淀。結(jié)果
單-遍在蛋白部分向蛋白質(zhì)的添加允許它分選到溶酶體中，在此它最終被降解。為了研究As2O3是否提高gpl30遍在化，來(lái)自As2O3處理之前和之后的MH7A細(xì)胞的細(xì)胞溶胞產(chǎn)物用抗_gpl30抗體免疫沉淀，隨后用識(shí)別聚合-遍在化的蛋白質(zhì)的抗體Π(1，以及同時(shí)識(shí)別單-遍在化的和聚合-遍在化的蛋白質(zhì)的冊(cè)2來(lái)Wfestern印跡。結(jié)果顯示，僅在Π(2的免疫印跡中檢出遍在化的gpl30(作為高分子量污斑)，而用沒(méi)有。因而，As2O3誘導(dǎo)gpl30 的單-遍在化。此外，用更久的As2O3處理獲得了提高量的遍在化的gpl30，表明時(shí)間依賴性的單-遍在化(附圖3B)。這些發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步確認(rèn)了 As2O3誘導(dǎo)gpl30的溶酶體降解。實(shí)施例6. IL-6信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制涉及C-Jun-末端-N激酶(JNK)的As2O3活化材料和方法
材料和方法是如上文實(shí)施例1-5所描述的。結(jié)果
重要的IL-6信號(hào)級(jí)聯(lián)之一是MAPK途徑，包括JNK的活化(Heinrich，et al.， Biochem. J. , 374:1-20 (2003))。有趣地，在其他細(xì)胞系統(tǒng)中，也已經(jīng)顯示了砷活化JNK (Davison, et al.，Blood, 103:3496-502(2004))。因而，研究了在 MH7A 細(xì)胞中 Aii2O3 誘導(dǎo)的IL-6信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制中可能涉及的JNK活化。Ai^2O3處理引起了 JNK磷酸化的顯著的提高，因此JNK活化(附圖4A)。用JNK抑制物SP600125 (30 μ M)預(yù)處理阻止了 As2O3誘導(dǎo)的JNK磷酸化提高。JNK活化是生物學(xué)相關(guān)的，因?yàn)閷?duì)As2O3誘導(dǎo)的JNK活化的抑制作用顯著地阻止了 As2O3介導(dǎo)的對(duì)ΜΗ7Α細(xì)胞增殖的抑制(附圖4Β)。為了檢查JNK活化是否與IL-6信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制相關(guān)，ΜΗ7Α細(xì)胞用溶酶體抑制物 NH4Cl (2. 5 mM)處理，早先顯示了 NH4Cl將gpl30從As2O3誘導(dǎo)的抑制中拯救出來(lái)。在存在 NH4Cl的情況下，As2O3誘導(dǎo)的JNK活化幾乎被完全地消除(附圖5A)，表明經(jīng)由gpl30降解的IL-6信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制是JNK活化所必需的。通過(guò)用IL-6中和抗體(0. 5 μ g/mL)處理MH7A細(xì)胞直接地展現(xiàn)了這一點(diǎn)。如附圖5B中所示，IL-6中和誘導(dǎo)了 JNK活化。這些結(jié)果表明，IL-6信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的破壞是MH7A細(xì)胞中JNK活化所需的。實(shí)施例7. As2O3誘導(dǎo)的JNK活化可能通過(guò)p53途徑誘導(dǎo)生長(zhǎng)延滯材料和方法
細(xì)胞周期分析
如所描述的進(jìn)行細(xì)胞周期分析(Pang et al.，J. Pathol. 210:19-25，(2006))。細(xì)胞被胰蛋白酶化，用冰冷的PBS洗滌兩次，重新懸浮在500 μ L PBS中，在冰上用PI染色10 分鐘(DNA Prep , Beckman Coulter)。細(xì)胞周期通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定，通過(guò)WinMDI 2.8軟件分析數(shù)據(jù)。結(jié)果
為了研究As2O3誘導(dǎo)的JNK活化的生長(zhǎng)抑制效果是否可能通過(guò)胱天蛋白酶-3介導(dǎo)， 在As2O3處理之前用JNK抑制物SP600125 (30 μ M)處理ΜΗ7Α細(xì)胞。JNK抑制作用不影響 As2O3誘導(dǎo)的胱天蛋白酶-3活化，表明As2O3誘導(dǎo)的JNK活化中可能涉及引起生長(zhǎng)抑制的胱天蛋白酶獨(dú)立性的途徑。這些觀察結(jié)果與附圖1顯示的結(jié)果一致。由于已知JNK使ρ53磷酸化，Ρ53的磷酸化是誘導(dǎo)生長(zhǎng)延滯中的關(guān)鍵步驟(mi, Cancer Biol. Ther., 3:156-61 (2004))，檢查了 As2O3對(duì)p53磷酸化的影響。如附圖5C中所示，As2O3處理顯著地提高了 p53 在絲氨酸46處的磷酸化，絲氨酸46是促細(xì)胞凋亡基因的反式激活的重要位點(diǎn)(mi，Cancer Biol. Ther., 3:156-61(2004))。SP600125 對(duì) JNK 活化的抑制作用顯著地抑制了 As2O3 介導(dǎo)的P53磷酸化，確認(rèn)了 p53磷酸化是As2O3誘導(dǎo)的JNK活化的下游效應(yīng)。細(xì)胞周期分析顯示了，As2O3處理引起顯著的G2M延滯(附圖5D)。直方圖用于顯示用5 μ M As2O3處理MH7A 細(xì)胞M小時(shí)的作用，通過(guò)用PI標(biāo)記細(xì)胞和流式細(xì)胞術(shù)來(lái)測(cè)定的。實(shí)施例8. As2O3抑制JNK的交叉對(duì)話(cross-talk)配體核因子kappaB (NFk B)。材料和方法
材料和方法是如上文實(shí)施例1-7所描述的。結(jié)果
JNK的另一個(gè)重要的交叉對(duì)話配體是NF κ B (Liu and Lin, Oncogene, 26:3267-78 (2007))。NFk B也是關(guān)節(jié)炎中重要的促炎性因子(Simmonds, et al.，Rheumatology, 47:584-90(2008))。如附圖6中所示，NF κ B在MH7A中組成型表達(dá)。As2O3處理以劑量(附圖6Α)和時(shí)間(附圖6Β)依賴性方式顯著地降低NFk B的水平。修飾和改變對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是明顯的，意圖被包括在附隨的權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種治療或預(yù)防類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和其他炎癥性關(guān)節(jié)炎的一種或更多種癥狀的方法， 包括向需要它的受試者以有效量施用包含三氧化二砷的組合物，來(lái)降低或治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的一種或更多種癥狀。
2.一種降低或抑制滑膜細(xì)胞的增殖或促進(jìn)滑膜細(xì)胞的細(xì)胞凋亡的方法，包括使滑膜細(xì)胞與有效地降低或抑制它們的增殖或促進(jìn)它們的細(xì)胞凋亡的量的三氧化二砷接觸。
3.一種降低細(xì)胞中IL-6受體的細(xì)胞表面表達(dá)的方法，包括使所述細(xì)胞與通過(guò)將IL-6 受體靶向溶酶體而有效地促進(jìn)IL-6受體降解的量的三氧化二砷接觸。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述IL-6受體在滑膜細(xì)胞中表達(dá)。
5.權(quán)利要求2或4的方法，其中所述滑膜細(xì)胞處在患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的患者中。
6.權(quán)利要求2或4的方法，其中所述滑膜細(xì)胞處在患有炎癥性關(guān)節(jié)炎的患者中。
7.權(quán)利要求5的方法，其中所述三氧化二砷口服地施用給所述患者。
8.權(quán)利要求5的方法，其中所述三氧化二砷向滑膜關(guān)節(jié)局部地施用。
9.權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括施用留族的或非留族的抗炎癥試劑。
10.一種用于治療受試者中類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或其他炎癥性關(guān)節(jié)炎的一種或更多種癥狀的藥物組合物，包括抑制滑膜細(xì)胞的增殖或促進(jìn)滑膜細(xì)胞的細(xì)胞凋亡的有效量的三氧化二砷，以及任選地，藥學(xué)上可接受的賦形劑。
11.權(quán)利要求10的藥物組合物，其中所述三氧化二砷處于用于口服施用的藥學(xué)上可接受的載體中。
12.權(quán)利要求10的藥物組合物，其中所述三氧化二砷處于用于向滑膜關(guān)節(jié)局部施用的藥學(xué)上可接受的載體中。
13.權(quán)利要求10-12的任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述三氧化二砷以1到10mg的量存在。
14.權(quán)利要求13的任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述三氧化二砷以5到10mg的量存在。
15.權(quán)利要求10的藥物組合物，處于用于口服施用的單位劑型中，其中所述單位劑型選自由溶液、懸浮液、乳劑、糖漿、片劑和膠囊構(gòu)成的組。
16.三氧化二砷在制備用于治療或預(yù)防類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和其他炎癥性關(guān)節(jié)炎的一種或更多種癥狀的藥物中的用途。
17.三氧化二砷在制備用于降低或抑制滑膜細(xì)胞的增殖或促進(jìn)滑膜細(xì)胞的細(xì)胞凋亡的藥物中的用途。
18.三氧化二砷在制備用于降低細(xì)胞中IL-6受體的細(xì)胞表面表達(dá)的藥物中的用途。
19.權(quán)利要求18的用途，其中所述IL-6受體在滑膜細(xì)胞中表達(dá)。
20.權(quán)利要求17或19的用途，其中所述滑膜細(xì)胞處在患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的患者中。
21.權(quán)利要求17或19的用途，其中所述滑膜細(xì)胞處在患有炎癥性關(guān)節(jié)炎的患者中。
22.權(quán)利要求20的用途，其中所述三氧化二砷口服地施用給所述患者。
23.權(quán)利要求20的用途，其中所述三氧化二砷局部地向滑膜關(guān)節(jié)施用。
24.權(quán)利要求16的用途，進(jìn)一步包括施用留族的或非留族的抗炎癥試劑。
全文摘要
治療或預(yù)防類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或其他類型的炎癥性關(guān)節(jié)炎的一種或更多種癥狀的方法，涉及向受影響的患者施用含有有效量三氧化二砷的組合物。包含三氧化二砷的組合物可以口服地施用，例如，作為溶液、懸浮液、糖漿、乳劑、片劑或膠囊劑。
文檔編號(hào)A61P29/00GK102427822SQ201080021634
公開(kāi)日2012年4月25日 申請(qǐng)日期2010年5月17日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月18日
發(fā)明者鄺沃林 申請(qǐng)人:香港大學(xué)