專利名稱：脂質(zhì)組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用脂質(zhì)顆粒(lipid particle)遞送治療劑的領(lǐng)域。特別地，本發(fā)明提供包括這些脂質(zhì)的陽離子脂質(zhì)和脂質(zhì)顆粒，這些對(duì)于核酸的體內(nèi)遞送以及適合體內(nèi)治療用途的核酸-脂質(zhì)顆粒組合物是有利的。另外，本發(fā)明提供制備這些組合物的方法，以及使用這些組合物將核酸引入細(xì)胞中的方法，例如，用于治療各種疾病的癥狀。
背景技術(shù)：
治療性核酸包括例如小干擾RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)、反義寡核苷酸、核酶、質(zhì)粒和免疫刺激核酸。這些核酸通過多種機(jī)制起作用。在siRNA或miRNA的情況下，這些核酸可通過被稱作RNA干擾(RNAi)的過程下調(diào)特異性蛋白的細(xì)胞內(nèi)水平。在將siRNA或miRNA 引入到細(xì)胞質(zhì)后，這些雙鏈RNA構(gòu)建體可結(jié)合至被稱作RISC的蛋白。從RISC復(fù)合物中置換 siRNA或miRNA的有義鏈，從而在RISC中提供可識(shí)別和結(jié)合具有與結(jié)合的siRNA或miRNA 的序列互補(bǔ)的mRNA的模板。在結(jié)合互補(bǔ)mRNA后，RISC復(fù)合物切割mRNA并且釋放切割的鏈。RNAi可通過靶向編碼蛋白合成的相應(yīng)mRNA的特異性破壞來提供特異性蛋白的下調(diào)。RNAi的治療性應(yīng)用非常廣泛，這是因?yàn)閟iRNA和miRNA的構(gòu)建體可用任何一種針對(duì)靶蛋白的核苷酸序列合成。迄今為止，siRNA在體外和體內(nèi)模型中都已顯示出特異性下調(diào)靶蛋白的能力。另外，目前在臨床研究中評(píng)估siRNA構(gòu)建體。然而，當(dāng)前siRNA或miRNA構(gòu)建體面臨的兩個(gè)問題是首先，它們?cè)谘獫{中對(duì)核酸酶酶解的敏感性以及，其次，它們有限的進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)區(qū)室(當(dāng)以游離siRNA或miRNA全身性施用時(shí)它們可在所述區(qū)室中結(jié)合RIST)的能力。通過在分子內(nèi)引入化學(xué)修飾的核苷酸接頭 (例如，硫代磷酸酯基團(tuán))可穩(wěn)定這些雙鏈構(gòu)建體。然而，這些化學(xué)修飾只提供有限的免受核酸酶酶解的保護(hù)作用并且可降低構(gòu)建體的活性?？赏ㄟ^使用載體系統(tǒng)(如聚合物、陽離子脂質(zhì)體)或者通過化學(xué)修飾構(gòu)建體(例如通過共價(jià)連接膽固醇分子)來促進(jìn)siRNA或 miRNA的細(xì)胞內(nèi)遞送。然而，需要改進(jìn)的遞送系統(tǒng)來增加siRNA和miRNA分子的效力以及減少或消除對(duì)化學(xué)修飾的需求。反義寡核苷酸和核酶還可抑制mRNA翻譯成蛋白質(zhì)。在反義構(gòu)建體的情況下，這些單鏈脫氧核糖核酸具有與靶蛋白mRNA的序列互補(bǔ)的序列，并且可按照沃森-克里克堿基配對(duì)結(jié)合至mRNA。這種結(jié)合可防止靶mRNA的翻譯和/或觸發(fā)mRNA轉(zhuǎn)錄物的RNA酶H降解。 因此，反義寡核苷酸對(duì)于作用特異性(即特異性疾病相關(guān)蛋白的下調(diào))具有巨大潛力。迄今為止，這些化合物在體內(nèi)和體外模型中顯示出了前景，這些模型包括炎癥性疾病、癌癥和 HIV 的模型(評(píng)論于 Agrawal，Trends in Biotech. 14 :376-387 (1996))。反義鏈還可通過與染色體DNA的特異性雜交影響細(xì)胞活性。目前正在進(jìn)行幾個(gè)反義藥物的晚期人體臨床評(píng)估。這些藥物的靶包括bcl2和載脂蛋白B基因以及mRNA產(chǎn)品。使用治療性核酸的一個(gè)眾所周知的問題涉及磷酸二酯核苷酸間鍵合的穩(wěn)定性以及這個(gè)接頭對(duì)核酸酶的敏感性。血清中核酸外切酶和核酸內(nèi)切酶的存在導(dǎo)致含有磷酸二酯接頭的核酸快速降解并且，因此，在血清的存在下或在細(xì)胞中，治療性核酸具有非常短的半衰期(Zelphati, 0.等人，Antisense. Res. Dev. 3 :323-338 (1993)；以及 Thierry，A. R.等人，第 147-161 頁，Gene Regulation =Biology of Antisense RNA and DNA(編者Erickson， RP和Izant, JG ；Raven Press, NY(1992))。由于這些和其他已知的問題，目前正在開發(fā)的治療性核酸并沒有采用建立在天然核酸上的堿性磷酸二酯化學(xué)。這種問題已通過降低血清或細(xì)胞內(nèi)降解的化學(xué)修飾得到部分解決。對(duì)核苷酸間磷酸二酯橋(例如，使用硫代磷酸酯、甲基膦酸酯或氨基磷酸酯鍵合)、核苷酸堿基(例如 5-丙炔基-嘧啶)或糖(例如，2'-修飾的糖)(Uhlmann E.等人，Antisense =Chemical Modifications. Encyclopedia of Cancer, Vol.Χ. , pp 64—81 Academic Press Inc. (1997))修飾進(jìn)行測試。其他人試圖使用2' -5'糖鍵來改善穩(wěn)定性(參見，例如，美國專利No. 5，532，130)。還試過其他改變。然而，這些解決方案沒有一個(gè)完全令人滿意并且體內(nèi)游離的治療性核酸仍然只有有限的效力。此外，如上有關(guān)SiRNA和miRNA所述，問題仍然存在于治療性核酸跨細(xì)胞膜的能力有限(參見 Vlassov 等人，Biochim. Biophys. Acta 1197 :95-1082(1994))以及與全身毒性相關(guān)的問題，例如補(bǔ)體介導(dǎo)的過敏反應(yīng)、改變凝血性能和血細(xì)胞減少癥(Galbraith等人， Antisense Nucl. Acid DrugDes. 4 :201-206 (1994))。盡管最近取得了進(jìn)展，但是本領(lǐng)域仍需要適于一般治療用途的改進(jìn)的脂質(zhì)-治療性核酸組合物，這些組合物可高效地封裝核酸、具有高的藥物脂質(zhì)比、保護(hù)封裝的核酸在血清中不被降解和清除、適于全身遞送以及提供封裝的核酸的細(xì)胞內(nèi)遞送。此外，這些脂質(zhì)-核酸顆粒應(yīng)耐受性好并且提供足夠的治療指數(shù)，以至于采用有效劑量的核酸的患者治療沒有顯著的毒性和/或?qū)颊邲]有風(fēng)險(xiǎn)。本發(fā)明提供了此類組合物及其制備方法以及使用此類組合物將核酸引入細(xì)胞中的方法，包括用于治療疾病的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供脂質(zhì)組合物，該組合物包括式⑴的陽離子脂質(zhì)、中性脂質(zhì)、甾醇以及
PEG或PEG修飾的脂質(zhì)，其中式(I)為
權(quán)利要求
1. 一種組合物，包括留醇、中性脂質(zhì)、PEG或PEG修飾的脂質(zhì)、以及式(I)的脂質(zhì)
2.如權(quán)利要求1所述的組合物，包含留醇、PEG或PEG修飾的脂質(zhì)、中性脂質(zhì)以及式 (II)的脂質(zhì)
3. 一種組合物，包含甾醇；中性脂質(zhì)；PEG或PEG修飾的脂質(zhì)；以及式(III)的化合物、式(VI)的化合物或其混合物
4.如權(quán)利要求3所述的組合物，其中1 為
5.如權(quán)利要求3所述的組合物，其中η為2或3，1 為
6.如權(quán)利要求3所述的組合物，其中η為3，R為
7.如權(quán)利要求3所述的組合物，其中Y為0或NR4。
8.如權(quán)利要求3所述的組合物，其中Y為0。
9.如權(quán)利要求3所述的組合物，其中Y對(duì)于每次出現(xiàn)為0。
10.如權(quán)利要求3所述的組合物，其中R1為H。
11.如權(quán)利要求3所述的組合物，其中R1為
12.如權(quán)利要求3所述的組合物，其中R1為
13.如權(quán)禾Ij要求3所述的組合物，其中R1為R3、
14.如權(quán)利要求3所述的組合物，其中R2為烷基、鏈烯基或炔基。
15.如權(quán)利要求3所述的組合物，其中R2為烷基(例如C6-C18烷基，例如C8-C12烷基， 例如C10烷基)。
16.如權(quán)利要求3所述的組合物，其中R為
17.如權(quán)利要求3所述的組合物，包含式(V)的化合物
18.如權(quán)利要求3所述的組合物，包含式(VI)的化合物
19.如權(quán)利要求1、2、3、17或18所述的組合物，其中式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)或 (VI)的化合物為其無機(jī)鹽或有機(jī)鹽，例如氫商化物鹽，如鹽酸鹽。
20.如權(quán)利要求1、2、3、17或18所述的組合物，其中式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)或 (VI)的化合物為有機(jī)酸的鹽，例如，醋酸鹽或甲酸鹽。
21.如權(quán)利要求1、2、3、17或18所述的組合物，其中式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)或 (VI)的化合物為水合物形式。
22.如權(quán)利要求1、2或3所述的組合物，其中所述留醇為膽固醇。
23.如權(quán)利要求1、2或3所述的組合物，其中所述脂質(zhì)為PEG修飾的脂質(zhì)。
24.如權(quán)利要求23所述的組合物，其中所述PEG修飾的脂質(zhì)為PEG-DMG。
25.如權(quán)利要求1、2或3所述的組合物，其中所述中性脂質(zhì)為DSPC。
26.如權(quán)利要求1、2、3、17或18所述的組合物，其中該組合物包括約25-75%的式(I)、 (II) > (HI) > (IV)、(V)或(VI)的化合物或其混合物、約5-50%的甾醇、約0. 5-20%的PEG 或PEG修飾的脂質(zhì)以及約0. 1-15%的中性脂質(zhì)。
27.如權(quán)利要求1、2、3、17或18所述的組合物，其中該組合物包括約35-65%的式(I)、 (II)、(III)、(IV)、(V)或(VI)的化合物或其混合物、約15-45%的甾醇和約0.5-10%的 PEG或PEG修飾的脂質(zhì)以及約3-15%的中性脂質(zhì)。
28.如權(quán)利要求1、2、3、17或18所述的組合物，其中該組合物包括約40-65%的式(I)、 (II) > (HI) > (IV)、(V)或(VI)的化合物或其混合物、約25-40%的甾醇、約0. 5-5%的PEG 或PEG修飾的脂質(zhì)以及約5-10 %的中性脂質(zhì)。
29.如權(quán)利要求1、2、3、17或18所述的組合物，其中該組合物包括約50%的式(I)、 (II)、(HI)、(IV)、(V)或(VI)的化合物或其混合物、約38. 5%的甾醇和約1. 5%的PEG或 PEG修飾的脂質(zhì)以及約10%的中性脂質(zhì)。
30.如權(quán)利要求四所述的組合物，其中該組合物包括約50%的式(V)的化合物或其混合物、約38. 5%的甾醇和約1. 5%的PEG或PEG修飾的脂質(zhì)以及約10%的中性脂質(zhì)。
31.如權(quán)利要求四所述的組合物，其中該組合物包括約50%的式(VI)的化合物或其混合物、約38. 5%的甾醇和約1. 5%的PEG或PEG修飾的脂質(zhì)以及約10%的中性脂質(zhì)。
32.如權(quán)利要求1、2、3、17或18所述的組合物，進(jìn)一步包括含有作為靶向部分的N-乙?；肴樘前返陌邢蛑|(zhì)。
33.如權(quán)利要求32所述的組合物，其中所述靶向脂質(zhì)包含多個(gè)N-乙酰基半乳糖胺部分。
34.如權(quán)利要求32所述的組合物，其中所述靶向脂質(zhì)以按摩爾計(jì)約0.001%至約5%的量存在于制劑中。
35.如權(quán)利要求32所述的組合物，其中所述靶向脂質(zhì)以按摩爾計(jì)約0.005%至約1. 5% (例如，約0.3%)的量存在于制劑中。
36.如權(quán)利要求32所述的組合物，其中所述靶向脂質(zhì)為選自由式2、式3、式6和式7的化合物組成的組的化合物
37.如權(quán)利要求1、2或3所述的組合物，其中該組合物為締合絡(luò)合物。
38.如權(quán)利要求1、2或3所述的組合物，其中該組合物為脂質(zhì)體。
39.如權(quán)利要求1、2或3所述的組合物，進(jìn)一步包括核酸劑。
40.如權(quán)利要求39所述的組合物，進(jìn)一步包括一種或多種核酸劑。
41.如權(quán)利要求40所述的組合物，進(jìn)一步包括五種或更多種核酸劑。
42.如權(quán)利要求41所述的組合物，進(jìn)一步包括十種或更多種核酸劑。
43.如權(quán)利要求1、2或3所述的組合物，進(jìn)一步包括RNA劑。
44.如權(quán)利要求1、2或3所述的組合物，進(jìn)一步包括單鏈RNA劑。
45.如權(quán)利要求1、2或3所述的組合物，進(jìn)一步包括雙鏈RNA劑。
46.一種制備如權(quán)利要求1、2或3所述的組合物的方法，該方法包括擠出法或線上混合法。
47.如權(quán)利要求46所述的組合物，其中脂質(zhì)核酸的比率為約3至約15。
48.如權(quán)利要求46所述的組合物，其中脂質(zhì)核酸的比率為至少約5至約13。
49.如權(quán)利要求1、2或3所述的組合物，進(jìn)一步包括至少一種載脂蛋白。
50.如權(quán)利要求49所述的組合物，其中載脂蛋白選自由ApoA-I、ApoA-II,ApoA-IV, ApoA-V和ApoE以及它們的活性多晶型物、同工型、變體和突變體、片段或截短形式構(gòu)成的組。
51.如權(quán)利要求49所述的組合物，其中載脂蛋白選自ApoA-I及其活性多晶型物、同工型、變體和突變體以及片段或截短形式。
52.一種制備式(IV)的化合物的方法，
53.如權(quán)利要求52所述的方法，其中式(VIII)化合物為
54.如權(quán)利要求53所述的方法，其中所述富含對(duì)映體的羥烷基合成等價(jià)物含有富含對(duì)映體的1，2_環(huán)氧烷烴。
55.如權(quán)利要求討所述的方法，其中所述富含對(duì)映體的1，2_環(huán)氧烷烴為(R)-l，2-環(huán)氧十二烷。
56.如權(quán)利要求52所述的方法，其中所述富含對(duì)映體的β-羥烷基合成等價(jià)物包括受保護(hù)的α-醇醛。
57.如權(quán)利要求56所述的方法，其中所述受保護(hù)的α-醇醛包括2-(O-Pg)-十二醛，其中，O-I^g表示受保護(hù)的羥基。
58.如權(quán)利要求52所述的組合物，進(jìn)一步包括將伯醇捕集試劑與在所述富含對(duì)映體的 β-羥烷基合成等價(jià)物和式(VIII)化合物之間反應(yīng)得到的產(chǎn)物接觸。
59.一種制備化合物的方法，包括將1-O-(苯二甲酰亞氨基)乙基)_哌嗪和1-(2-氯乙基)咪唑烷-2-酮接觸。
60.一種具有式
61.一種具有式
62.一種制備化合物的方法，包括將1-氰甲基-4-(2-((氰甲基)氨基)乙基)哌嗪和還原劑接觸。
63.如權(quán)利要求62所述的方法，其中所述還原劑不是H2。
64.如權(quán)利要求63所述的方法，其中所述還原劑包括NaBH4。
65.如權(quán)利要求62所述的方法，進(jìn)一步包括將氰甲基-4-(2-((氰甲基)氨基)乙基) 哌嗪與還原劑和氨基保護(hù)劑同時(shí)接觸。
66.如權(quán)利要求65所述的方法，其中所述還原劑包括NaBH4。
67.如權(quán)利要求66所述的方法，其中所述氨基保護(hù)劑包括(Boc)20。
全文摘要
本發(fā)明公開了含有式(I)的陽離子脂質(zhì)、中性脂質(zhì)、甾醇以及PEG或PEG修飾的脂質(zhì)的脂質(zhì)組合物，其中，式(I)為(F)。本發(fā)明還公開了制備式(I)的陽離子脂質(zhì)的方法。
文檔編號(hào)A61K31/50GK102421417SQ201080020203
公開日2012年4月18日 申請(qǐng)日期2010年5月5日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月5日
發(fā)明者卡蘭特赫塔西爾·G·拉吉夫, 大衛(wèi)·邦克洛特, 穆圖薩米·賈亞拉曼, 穆希亞·曼努哈蘭, 邁克爾·E·榮格 申請(qǐng)人:阿爾尼拉姆醫(yī)藥品有限公司